（分析化学专业论文）中华常春藤中皂苷类成分和挥发油分离分析研究.pdf

硕士学位论文摘要 摘要 本文研究了中华常春藤中皂苷类化合物的提取、纯化与测定方 法，并对中华常春藤中挥发油成分进行了分析鉴定。 总皂苷的提取。以总皂苷的得率为检测指标，分别采用了溶剂提 取法，微波提取法，生物酶提取法进行提取。通过单因素实验以及正 交实验，确定了各种提取法的最佳提取工艺，溶剂提取法总皂苷得率 最高，达到1 0 2 。 总皂苷的纯化。采用a b 8 型大孔吸附树脂纯化皂苷类化合物， 使用8 0 甲醇洗脱，回流干燥得到总皂苷，产品纯度为7 9 4 2 ，总 回收率达到7 4 1 1 。 常春藤皂苷c 的分离。采用制备型反相高效液相色谱分离常春 藤皂苷c 。确定了最佳分离条件，高效液相色谱法检测产品纯度为 8 7 8 3 ，收率为8 2 5 2 。 总皂苷的分析测定。建立了香草醛浓硫酸显色分光光度法测定 中华常春藤中总皂苷的含量，确定了最佳测定条件。总皂苷的浓度在 1 2 9 1 8 0 7 1 a g m l 之间线性关系良好，线性方程为y = 0 0 0 3 6 + 0 0 6 4 1 x ，相关系数r = 0 9 9 9 7 。 常春藤皂苷c 的分析测定。建立了以甲醇水( 6 5 ：3 5 ，v v ) 为流动相 的h p l c 法测定常春藤皂苷c 含量的方法，常春藤皂苷c 的浓度在 0 2 0 o 8 5m g m l 之间线性关系良好，线性方程为： y 三0 8 7 2 6 7 + 0 0 5 0 7 6 x 相关系数r = 0 9 9 9 6 。 挥发油的提取及鉴定。采用单因素试验法对水蒸气蒸馏提取中华 常春藤挥发油的提取条件进行了研究，确定了最佳提取条件。用气相 色谱一质谱联用技术测定了所得挥发油的化学成分，鉴定出其中2 1 种成分，主要是萜烯类化合物以及环氧化合物。 关键词：中华常春藤，总皂苷，常春藤皂苷c ，高效液相色谱法 ( h p l c ) ，挥发油 硕士学位论文a b s t r a c t a b s t r a c t t h ee x t r a c t i o n ，p u r i f i c a t i o na n dd e t e r m i n a t i o no ft o t a ls a p o n i n si n h e d e r an e p a l e n s i sv a r s i n e n s i sw e r es t u d i e d a n dt h ev o l a t i l eo i l sf r o m h e d e r an e p a l e n s i sv a t s i n e n s i sw e r ea n a l y z e d e x t r a c t i o no ft h et o t a ls a p o n i n s t h es o l v e n te x t r a c t i o nw a sa p p l i e d t oe x t r a c ts a p o n i n sf r o mh e d e r an e p a l e n s i sv a t s i n e n s i s a n dt h eb e s t e x t r a c t i o np r o c e s sw a so b t a i n e db yt h eo r t h o g o n a lt e s t , w i t ht h ey i e l do f 1 0 2 p u r i f i c a t i o no ft h et o t a ls a p o n i n s t h et o t a ls a p o n i n sw e r ep u r i f i e d b ya b 一8m a e r o p o r o u sa d s o r p t i o nr e s i n 1 1 1 et o t a ls a p o n i n sw a sw a s h e d d o w nb v8 0 e t h a n o la n dw a so b t a i n e da f t e rd e s i c c a t i o n t h ep u r i t yo f t o t a ls a p o n i n sw a s7 9 4 2 a n dt h er e c o v e r yr a t ew a s7 4 1 1 s e p a r a t i o no ft h eh e d e r a c o s i d ec h e d e r a c o s i d ecw a ss e p a r a t e db y p r e p a r a t i v eh j i g hp e r f o r m a n c el i q u i dc h r o m a t o g r a p h y a n dt h e b e s t s e p a r a t i o nc o n d i t i o nw a sa b t a i n e d t h ep u r i t yo fh e d e r a c o s i d ecw a s 8 7 8 3 a n dt h er e c o v e r yr a t ew a s8 2 5 2 d e t e r m i n a t i o no ft h et o t a ls a p o n i n s v a n i l l i n a - c o n c e n t r a t e ds u l f u r i c a c i ds p e c t r o p h o t o m e t r i cm e t h o dw a su s d e dt od e t e r m i n et h et o t a l s a p o n i n s t h em e t h o dw a sl i n e a ri nt h er a n g eo f1 2 9 l8 0 7 1 x g m l d e t e r m i n a t i o no fh p l cw i t ht h em o b i l ep h a s eo fm e t h a n o la n d w a t e r ( 6 5 ：3 5 v v ) w a su s d e dt od e t e r m i n eh e d e r a c o s i d ec t h em e t h o d w a sl i n e a ri nt h er a n g eo f0 2 0 o 8 5 m g m l e x t r a c t i o na n da n a l y r s i so fv o l a t i l eo i l sf r o mh e d e r an e p a l e n s i sv a r s i n e n s i s t h eo p t i m a lc o n d i t i o n so fe x t r a c t i o nw e r ea b t a i n e d t h ev o l a t i l e o i l sw e r ea n a l y z e db yg c m s ，a n d2 1c o m p o u n d sw e r ei d e n t i f i e d t h e m a i nc o n s t i t u e n t sw e r et e r p e n e sa n d e p o x yc o m p o u n d s k e yw o r d s ：h e d e r an e p a l e n s i s v a t s i n e n s i s ，t o t a ls a p o n i n s ， h e d e r a c o s i d ec ，h p l c ，v o l a t i l eo i l i i 原创性声明 本人声明，所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究 工作及取得的研究成果。尽我所知，除了论文中特别加以标注和致谢 的地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不 包含为获得中南大学或其他单位的学位或证书而使用过的材料。与我 共同工作的同志对本研究所作的贡献均已在在论文中作了明确的说 明。 作者签名； 关于学位论文使用授权说明 本人了解中南大学有关保留、使用学位论文的规定，即：学校 有权保留学位论文，允许学位论文被查阅和借阅；学校可以公布学位 论文的全部或部分内容，可以采用复印、缩印或其它手段保存学位论 文；学校可根据国家或湖南省有关部门规定送交学位论文。 作者签名： 导师签名e t 期：年一月一 硕士学位论文第一章绪论 1 1 概述 第一章绪论 中华常春藤( h e d e r an e p a l e n s i sv a r s i n e n s i s ) ，又名土鼓藤、钻天风、三角风、 爬墙虎、散骨风、枫荷梨藤，系五加科植物。中华常春藤是一种蔓性植物，常绿 攀援藤本，原产欧洲、亚洲和北非，能有效抵制尼古丁中的致癌物质，可以去除 甲醛。通过叶片上的微小气孔，中华常春藤能吸收有害物质，并将之转化为无害 的糖份与氨基酸。祛风，利湿，平肝，解毒。用于风湿性关节炎、肝炎、头晕、 口眼蜗斜、衄血、目翳、痈疽肿毒i l 】。我国对中华常春藤的认识和利用至少有2 0 0 0 年的历史。 我国有丰富的常春藤资源，种植范围已从传统的原秦岭以南等地区扩大到现 在的各地均有分布。 我国的中华常春藤研究主要集中在培育繁殖、化学成分分析、资源调查、药 理及保健功能研究上。目前国内对中华常春藤资源的利用率不高，化学成分分析 的研究报道很少，科技含量不高；然而，国外在1 9 9 1 年就开始有关于常春藤属植 物化学成分的报道。这无疑是对我国常春藤研究实现产业化、工业化道路的一种 鞭策与激励，这条路可谓任重而道远。 1 1 1 常春藤资源分类学特征 常春藤，常绿攀援藤本，见图1 1 。茎枝有 气生根，幼枝被鳞片状柔毛。叶互生，2 裂，革 质，具长柄；营养枝上的叶三角状卵形或近戟 形，长5 l o c m ，宽3 8 c m ，先端渐尖，基部 楔形，全缘或3 浅裂；花枝上的叶椭圆状卵形或 椭圆状披针表，长5 1 2 c m ，宽1 8 c m ，先端 长尖，基部楔形，全缘。伞形花序单生或2 7 个顶生：花小，黄白色或绿白色，花5 数；子房 下位，花柱合生成柱状。果圆球形，浆果状， 黄色或红色。花期5 8 月，果期9 1 1 月。 图1 1 常春藤 据调查，全球约有5 1 3 种，自然分布于亚 洲、欧洲及北非洲。目前在我国应用比较多的品种分别属于3 个种或变种，一种 硕士学位论文第一章绪论 ( h e d e r an e p o l e n s i sv a r s i n e n s i s ) ，分布于华中、华南、西南及甘、 陕等省，耐荫。有一定的耐寒性，在华北宜选小气候良好的稍荫环境栽培【2 】；一 种为洋常春藤，又名西洋常春藤、长春藤、英国常春藤( n k d _ f xl ) ，原产欧洲及 高加索地带，目前国内外栽培非常普遍，而且品种繁多；另一种为菱叶常春藤 ( h r h o m b e nb e a n ) 原产日本，我国山东有引种栽培f 3 l 。 1 1 2 常春藤生态学特征 1 1 2 1 对光的适应性 常春藤属的多数种、变种或品种都具有耐荫的特性，但品种之间有差异，英 国和丹麦培育的无性系中，从喜光品种( m i n i k i n ”、 n i g r aa u r e a 、“k o l i b r i ”等) 到耐荫品种( “l i t l ed i a m o n d ”、 m e o l l 、“m e l i o i lb e a n t y 等) 都有。丰富的耐荫品 种是建筑物背阴面绿化的优良植物材料。 1 1 2 2 土壤条件 常春藤属植物对土壤要求并不是很严格，但在土壤湿润，有机质含量高的地 方生长最好。具有一定的耐盐能力，对p h 值的要求，文章报导之间有一定差别， 有的认为不耐碱性土壤，有的认为要求不严格，在酸性、碱性土壤均能生长。 1 1 2 t 3 对空气温湿度的要求 总体来讲，常春藤属植物适宜在温度0 2 5 c ，空气湿润的环境条件下生长， 温度低于0 1 2 时停止生长，高于2 5 时生长不良，多数品种在2 0 条件下枝叶 翠绿，有些品种能耐3 0 * ( 2 低温，有些品种能耐3 8 4 0 高温。由以上几点可以 看出，常春藤在部分遮荫、土壤水肥条件好、气候温凉湿润的条件下生长好。在 冬季寒冷干燥、夏季炎热、土壤瘠薄的恶劣条件下，相对不是很好 4 1 。 1 1 3 中华常春藤的栽培方法 中华常春藤对土壤要求不严最宜在中性或微酸、疏松、肥沃，排水良好的 沙壤土中生长，故可用园土、腐殖土混合配制，也可单独用水苔栽培。中华常春 藤在生长过程中要保持盆土湿润，忌完全干燥。夏季高温需喷水降温，并要遮荫 和通风良好。高温对它生长不利，需常喷叶面水，如供水不足则植株茎部叶片易 脱落：但灌水过多，在积水时会烂根，特别是冬季要控水。常春藤耐瘠也喜肥， 生长期每半个月施肥一次，施肥时氮、磷、钾比例为各l 3 氮肥不可过多，否则 花叶会变成绿叶。中华常春藤在高温干燥、通风不良时，易发生红蜘蛛、介壳虫 等病虫害，应及时防治。每年换盆一次，并剪除过长的根、腐根。换盆时盆底加 足基肥。繁殖以扦插、分株、压条为主。扦插是选取长2 0 厘米左右枝条，茎部2 3 节插入土中，保持盆土湿润，二周左右可生根也可将枝条的两三个芽眼的茎段 2 硕七学位论文第一章绪论 浸泡在清水中，在1 5 c 2 0 c 时，l o 天左右可生根 5 1 。 1 2 常春藤属植物化学成分研究进展 皂苷类化合物是常春藤属植物中被研究最多，而且发现种类较多的一类成 分，我们发现，该类化合物具有保肝 6 1 、抗肿瘤 7 1 、止痉。1 ，止痛 9 1 、抗真菌【l o l 、 杀虫【1o 】等多种药理活性。 由台湾常春藤( h e d e r ar h o m b e ab e a nv c w f o r m o s a n al ) 中分离到1 4 种皂苷 i v ，其中i 为齐墩果烷型皂苷，v 为达玛烷型皂苷i i j 】，其结构式如 下图1 2 ，各取代基如表1 - i 所示。 图1 2 台湾常春藤所含皂苷结构式 表1 - 1 取代基结构 由尼泊尔常春藤( h e d e r an e p a l e n s i sk k o c h ) 中分离到1 1 种齐墩果烷型皂 苷，命名为h n - s a p o n i n sb ，d i j ) 2 ，e ，f ，h ，i ，k m ，n 和p 。其中h n b ，e ，m ，n 和p 即为k i z u t as a p o n i n sk 3 ，k 6 ，k i o ，k l l 和k 1 2 t 1 2 1 。其结构式如下图1 3 ，各取 代基如表l - 2 所示。 一 时够 图l - 3 尼泊尔常春藤所舍皂苷结构式 表l _ 2 取代基结构 r l r 2r 3 由常春藤( h e d e r ar h o m b e ab e a n ) 中分离到多种齐墩果烷型皂苷：l d z u t a s a p o n i n sk 3 ，k 6 ，k 8 ，k 1 0 ，k i i ，k 1 2 t ”1 ，其结构式如下图1 - 4 ，各取代基如表1 3 所示。 图l - 4 多种齐墩果烷型皂苷结构式 表1 - 3 取代基结构 由台湾常春藤( h e d e r ar h o m b e a b e a nv a r f o r m o s a n a l i ) 中分离到7 种齐墩果 烷型皂苷：i - ，其中ik i z u t as a p o n i si ( 2 ，i i ( k 5 ) ，i i 为3 o p 葡萄糖醛酸常春 藤皂苷元：i v ( k 1 0 ) ，v ( k 1 2 ) ，v i ( k 1 4 ) 为一新化合物，无色针状结 晶，1 1 1 p 2 9 7 2 9 8 ( d e c ) ，【a 】+ 2 6 2 。( m e o h ) ，苷元中具有内酯和环氧结构。 其结构如图1 5 所示1 1 4 1 。 4 硕士学位论文 第一章绪论 a 陷一o 图1 - 5 皂苷v 结构式 五加科植物菱形常春藤( h e d e r ar h o m b e a b e a n ) 中分离到1 0 种皂苷：k i z u t a s a p o n i nk 4 ，k 4 ，k 7 ，k 7 a ，k 7 b ，k 7 c ，k 8 ，k 9 ，k 1 l ，k 1 2 ，k 1 3 15 1 。其结构式如下图1 石， 各取代基如表1 - 4 所示。 h 困l _ 6 菱形常春藤所舍皂苷 结构式 表l - 4 取代基结构 一种产于英国的常春藤( h e d e r a h e l i x l ) ，其中含有a - h e d e r i n h e d e r a s a p o n i n c 在体内试验显示有抗炎活性，它的机理是通过阻断舒缓激肽或其他发炎介体， 如影响前列腺分泌通路等等。主要是c 3 和c 2 8 位置的r h a 7 g l e l - 6 g l c 产生抗炎 效果【1 6 1 。其结构式如下图1 7 ，各取代基如表1 5 所示。 r 0 图1 7 英国常春藤所含皂苷结构式 硕+ 学位论文第一章绪论 表1 - 5 取代基结构 各基团缩写详解见表i - 6 ： 表l - 6 基团缩写详解 1 3 皂苷类化合物简介 1 3 1 皂苷结构类型p t - l s l 皂苷( s a p o n i n s ) 是广泛存在于植物界的一类特殊的苷类，它的水溶液振摇 后可生产持久的肥皂样的泡沫，因而得名。 根据水解后生成皂苷元的结构，皂苷可分为三萜皂苷与甾体皂苷两大类。组 成皂昔的糖常见的有葡萄糖、半乳糖、鼠李糖、阿拉伯糖、木糖及葡萄糖醛酸、 半乳糖醛酸等，常与皂苷元c 3 位的。o h 连接成苷【1 9 1 。 三萜皂苷的皂苷元为3 0 个碳原予组成的三萜类衍生物。大多数苷元在c u 或c 2 s 位有c o o h 基，故又称酸性皂苷；少数苷元只含醇羟基而呈中性，如人参 皂苷、柴胡皂苷等。三萜皂苷元的结构可分为五环三萜( p e n t a e y c l i ct r i t e r p e n o i d s ) 及四环三萜( t e t r a e y c l i ct r i t e r p e n o i d s ) 。甾体皂苷是由甾体皂苷元和糖组成。皂 苷元是由27 个碳原子组成，是环戊烷多氢菲的衍生物，其基本骨架称为螺旋甾 烷及其异构体异螺旋甾烷。 1 3 2 皂苷的理化性质 皂苷大多为白色或乳白色的无定形粉末，味苦而辛辣，具吸湿性，能刺激粘 膜而引起喷嚏，无明显的熔点。可溶于水，易溶于热水、热甲醇、热乙醇，不溶 于乙醚、苯等极性小的有机溶剂。皂苷易溶于水饱和的丁醇或戊醇，因此常从水 溶液中用丁醇或戊醇提取，借以与糖、蛋白质等亲水性成分分开。皂苷经酶或酸 水解生成的皂苷元为结晶状物质，可溶于丙酮、乙醚、三氯甲烷等有机溶剂。 皂苷水溶液大多能破坏红细胞而有溶血作用，因此含有皂苷的药物不能静脉 注射，但口服毒性较小，可能在胃肠道被水解所致。皂苷的溶血作用与血细胞的 种类和皂苷的结构有关，如对冷血动物的毒性较大，三萜皂苷的溶血作用比甾体 6 硕士学位论文第一章绪论 皂苷大。皂苷的最低溶血浓度称为溶血指数( h a e m o l y t i ci n d e x ) 。在同一条件下， 不同的皂苷具不同的溶血指数。 皂苷的水溶液可以和一些金属盐类如铅盐、钡盐、铜盐等产生沉淀。酸性皂 苷的水溶液加入硫酸铵、醋酸铅或其它中性盐类即产生沉淀。中性皂苷的水溶液 则需加入碱式醋酸铅等碱性盐或氢氧化钡等才能产生沉淀。由此可用于皂苷的提 取和分离。 甾体皂苷在乙醇溶液中能与胆甾醇生成分子复合物而沉淀，当沉淀用乙醚回 流时，胆甾醇可溶于乙醚，而皂苷不溶，从而达到分离的目的。 1 4 皂苷的提取、分离与纯化 1 4 1 提取方法 皂苷的分子量很大，极性强且结构相似，这就给它的分离纯化造成很大的困 难，因此皂苷的分离纯化一直是一项富有挑战性的工作。 三萜皂苷和甾体皂苷的提取分离方法基本相似。经典的而且目前仍然通行的 提取方法是用甲醇、乙醇或水回流、温浸或渗漉提取，把减压浓缩提取液得到的 浸膏悬浮于水，依次用石油醚或正已烷、氯仿或乙酸乙酯、水饱和的正丁醇等不 同极性的溶剂萃取，或者将浸膏上硅胶柱，用上述溶剂洗脱。皂苷大多集中在正 丁醇相，在石油醚和正己烷等中可能有皂苷元，将正丁醇提取液减压浓缩即得粗 总皂苷1 2 0 - 2 2 1 。 也可以直接用水提取，将减压浓缩提取液得到的浸膏依前法处理得到粗总皂 苷【2 3 1 。由于皂苷不溶于乙醚和丙酮，因此有人将用上述方法得到的浸膏溶于适量 甲醇，然后加足量乙醚或丙酮或乙醚丙酮( 1 ：1 ) 沉淀，滤取沉淀为粗总皂苷1 2 4 - 2 6 。 近年来采用大孔树脂【2 7 - 2 9 或大孔网络树脂柱层析法得到的粗总皂苷，先用水洗 去糖、氨基酸等强极性组分，然后用甲醇、乙醇或它们的水溶液洗脱得总皂苷。 近年来，超临界c 0 2 萃取法以其绿色环保，提取时间短，提取成分纯度较 高等优点被广泛使用来萃取天然有机化合物，所以有可能在不久的将来被应用于 皂苷的提取【3 i 】。 1 4 2 分离与纯化 在以前，从皂苷糯提物中分离出足够量和纯度的皂苷以供分析几乎是不可能 的，分离出皂苷中各种单一物质更是不可想象的。现在，随着技术的进步，提纯 和分离皂苷已经实现，但是要大规模制备高纯度的皂苷仍是一个难题。 皂苷的分离常用硅胶柱层析，用c h c l 3 m e o h h 2 0 系统溶剂洗脱，辅以制 7 硕士学位论文第一章绪论 备薄层纯化。也有采用a 1 2 0 3 柱层析的【3 2 1 。随着科学技术的发展，大孔树脂 d a - 2 0 1 、d i a i o n h p - 2 0 ，烷化硅胶r p - 8 r p - 1 8 等在t l c 和c c 中普遍应用， 提高了皂苷的分离效能1 3 3 - 3 6 】。交联葡聚糖凝胶( 如s e p h a d e xl h 2 0 ) 柱色谱 3 7 - 3 9 、 液滴逆流层析( d r o p l e te o u n t e r c u r r e n t c h r o m a t o g r a p h y , d c c c ) 、旋转多段式逆流层 析( r o t a t i o nl o e u l a r c o u n t e r - c u r r e n tc h r o m a t o g r a p h y , r l c c l 和高效液相层析 ( h p l c ) l 帅】，尤其是h p l c 中甲硅烷基化十八烷( o c t a d e c y l s i l y l a t e d ，o d s ) 柱、羟 基磷酸盐( h y d r o x y a p a t i t e ) 柱和硼酯化( b o r a t e ) 离子交换柱的使用，更是使一些难 以分离的皂苷得到很好的纯化。此外，反相柱层析( r e v e r s e dp h a s ec o l u m n c h r o m a t o g r a p h y ) 1 4 1 - 4 5 1 和闪式层析( n a s hc h r o m a t o 鲫h y ) f 4 6 1 在皂苷分离中也得以 应用，并取得了很好的效果。 以下是皂苷分离和纯化常用的一些方法。 ( 1 ) 正相色谱 目前使用最多的仍然是使用正相硅胶柱，为了提高分离效果，可采用细粒度 ( 1 0 4 0 p a n ) 硅胶和低压柱层析。 ( 2 ) 反相柱层析 近年来反相键合柱得到普遍应用。使用较多的预填充反相硅胶柱主要有 l i c h r o p r e p 砩- 8 ( m e r c k 6 0 8 0 甲醇洗脱) 和l o b a rk 一8 ( m e r c l 【，6 0 8 0 甲醇洗 脱) ，常使用的反相多孔聚合物有d i a i o nh p 2 0 ，k o g c lb g - 4 6 0 0 ( 以不同比例的 甲醇和水洗脱) 。 ( 3 ) 离子交换树脂 在分离含葡萄糖醛酸时，常使用阳离子交换树脂除去离子，常用的有 a m b e r l i t em b 3 和d o w e x5 0 w x l 。x 8 等。在分离纯化绞股蓝和丝瓜的皂苷时， 使用a m b e r l i t e ，x a d - 2 树脂，以水、2 0 甲醇依次洗脱，可以分离得到丝瓜皂 苷。 ( 4 ) 高效液相层析 现在国外已普遍应用h p l c 分离结构相似的皂苷。虽比较费时摸索最佳分离 条件，但效果较好。近年分离皂苷使用的层析柱主要有o d ss i l i c a g e l ，1 1 b o n d a p a k c 1 3 ，s - 1 0 o d s ，o d s 1 2 0 a ，n u c l e o s i lc 1 3 ，羟基磷灰石等。使用制备型反相h p l c ， 在o d s 硅胶柱上，用甲醇：水( 1 ：9 ) 作为流动相，可以成功地分离三七皂苷。 ( 5 ) 葡葡糖凝胶l h 2 0 和液滴逆流层析法 葡萄糖凝胶l h - 2 0 是在葡萄糖分子中引入一些亲脂性基团，从而使它不仅 具有亲水性能吸水性而膨胀，也有一定程度的亲脂性溶剂而膨胀，这就扩大了它 的应用范围。葡萄糖凝胶l h 2 0 对甾体皂苷分离效果较好。典型一例是k o n i h i 等用硅胶柱和葡萄糖凝胶l h 2 0 相结合，有效地分离了天门冬中呋甾醇的低聚 8 硕士学位论文第一章绪论 糖皂苷。液滴逆流分配层析( d c c c ) 技术是较常用的液液分离技术。原理是利用 物质在互不混溶的两相液体中分配系数不同而达到分离目的。其最主要的优点是 没有固定吸附剂，不存在着被分离物质的不可逆吸附问题。尤其是极性大的皂苷 化合物特别有意义。 ( 6 ) 大孔吸附树脂 大孔吸附树脂在对总皂苷的粗分离和除去水溶性色素、多糖和无机盐等杂质 显示出其独特的效果。使用时先用水作为洗脱剂，除去一些水溶性杂质，然后再 用不同浓度乙醇进行洗脱，得到不同的极性部位。使用起来很方便，并且大孔吸 附树脂可再生使用，十分经济。 上述各分离方法各具优点，在实际工作大多配合使用。一般以大孔树脂或凝 胶柱对粗提液做预处理，然后以硅胶柱或逆流层析进行分离。 1 5 皂苷类化合物的生物活性研究进展 近年来随着分离纯化和结构鉴定技术的进步，使皂苷的药理研究取得了很大 进展。皂苷具有显著的多种生物活性，如对代谢、免疫，心血管、神经和酶系统 的影响以及抗炎、抗菌、抗病毒、抗肿瘤、抗生育等作用，并不断发现一些新皂 苷的重要生物活性，内容极为丰富。 1 5 1 溶血作用 皂苷的水溶液大多数具有溶血作用。其机理是由于皂苷与红血球细胞壁上的 胆固醇结合，生成水不溶性分子复合物而沉淀，使血球内渗透压增加而发生破裂， 导致溶血现象。皂苷溶血作用的有无和作用的强弱与化学结构密切相关。但并不 是所有皂苷都有溶血作用，例如人参总皂苷就没有溶血作用，其中参三醇及齐墩 果酸为苷元的人参皂替，具有显著的溶血作用，而以人参二醇为苷元的人参皂苷， 则有抗溶血作用。皂苷的溶血作用与糖部份有关，认为单糖链皂苷作用显著1 4 7 4 9 1 。 1 5 2 抗菌、抗病毒作用 皂苷有抗细菌和霉菌的活性。作用机理之一是由于皂苷与细菌细胞膜中胆固 醇形成复合物。一般认为抗菌活性与溶血相关。螺甾醇皂苷结合有4 _ 5 个糖分子 时活性强。糖数目减少，活性减弱。双糖链甾苷活性弱，双糖链三萜皂苷几乎没 有活性，若酶解后生成单糖链的次级苷，活性加强1 5 0 , 5 ”。例如常春藤 ( h c d c r a s a p o n i n ) a 和b 没有抗菌活性，酶解后生成的a 常春藤皂苷( a - h e d e r i n ) 和8 常春藤皂苷h e d e r i l l ) 具有强烈抗菌活性【5 2 5 3 1 。 9 硕士学位论文第一章绪论 1 5 3 抗肿瘤作用 从o m i t h o g a l u n ls a u n d e r s i a e 中分离的皂苷o s w - i 对正常细胞没有毒性，而 对恶性肿瘤细胞具有强烈毒性，其抗癌活性比目前临床用的抗癌药物m i t o m y c i n e ， a d f i a m y c i n ，紫杉醇、顺铂高1 0 0 倍，有望成为新一代抗癌药物【翊。由竹节香附中 得到的竹节香附素a 对腹水肝癌有明显的抑制作用1 5 5 1 ，存在于多被金银花( a n e - m o n cr a d d e a n a ) q ，= 萜皂苷有显著的消肿作用并能抑制腹水性肝癌的生长。从人 参皂苷、绞股蓝皂苷、辽东橡木中皂苷类化合物、玄参科全草中的总皂苷、白头 翁皂苷、毛莨科植物中的皂苷都是经过多次试验证明了的抗癌药物1 5 6 1 。 1 5 4 杀精及抗生育作用 十蕊商陆中的商陆皂苷i ，i i ，m 经水解得到的次生皂菅l e m m a t o x i n 、具有 杀死人体精子的作用；尼泊尔常春藤( h e d c r an e p a l e n i s i s ) 中的皂苷常春藤素的 单糖苷、双糖苷，具有1 0 0 凝固人体精子的作用，其土贝母中的皂苷具有快速 和强力的杀精作用，p o l y g a l ac h a m a e b u x u sl 中的双糖链皂苷可杀死精子；欧樱 草和仙客来中的皂苷可固化人体精子；五叶参中的三萜皂苷也具有杀精作用：从 朱砂根中分离到一种新的三萜皂苷a r d i e r e n i n ，具有明显的抗生育作用【5 7 侧。 1 5 5 免疫调节作用 皂苷与其他化学成分相比，已显示为一种有效的免疫兴奋剂。如人参皂苷、 绞股蓝皂营和黄芪皂苷可增强机体的免疫功能，明显提高巨噬细胞的吞噬功能， 增加1 细胞的数量，提高血清补体水平，同时均具有免疫双向调节作用。皂树皂 苷可显著增强接种灭活狂犬病疫苗的小鼠的体疫免疫反应。坡柳( d o d o n a e a v i s c o s e ) 皂苷，商陆皂苷均能增加自细胞的吞噬功能，具有免疫刺激荆的作用 6 t , 6 2 1 。 1 5 6 对心血管系统的作用 人参皂苷r g l 在治疗动脉粥样硬化和血栓形成方面具有显著的疗效，绞股 蓝皂苷对氧自由基所致脑血管痉挛有保护作用蚓，对地塞米松所致小鼠肾上腺皮 质改变有拮抗作用，g y p 对血小板聚集有抑制作用，可作为血小板功能抑制剂【鲫。 辽东襁木中所含的皂苷类化合物对异丙肾上腺素诱发的心肌缺血和结扎冠豚所 致鼠心肌梗塞均有良好的保护作用和降血脂、降血糖和降血压作用瞄l 。甘草皂苷 通过对代谢影响促进胆固醇的排泄，而使血清胆固醇总水平下降，卵磷脂明显降 1 0 硕士学位论文第一章绪论 低，中性脂肪、b 一脂蛋白和游离脂肪酸有下降趋势l 硐。 1 5 7 滋补强壮，提高免疫力作用 甘草皂苷能破坏血管内的爱滋病细胞，对人的免疫缺陷病毒( h i v ) 具有抑制 增殖的效果【6 7 l 。酸枣仁皂苷具安神补脑的作用碡】，大豆皂苷具有减肥作用例， 还能抑制艾滋病病毒的感染【7 0 】。 1 5 8 对酶活性的影响 人参皂苷r b i 、r b 2 、r c 、r e 和r g 可激活醛脱氢酶；人参皂苷的存在可引起 猪姨脂体脂肪酶构象的变化；人参二醇和人参三醇皂苷对兔大脑微粒体中 n a + k 十a t p 酶具有类似氯丙嗪的抑制作用。从远志中提取的远志皂苷能抑制磷 酸二酯酶的活性；常春藤总皂苷及常春藤素( a - h e d e r i n ) 、常春藤苷( h e d c r a c o s i d e ) b 和c 有显著的抗玻尿酸酶活性，局部应用常春藤苷治疗蜂窝组织炎有良效，9 0 病人在用药3 0 天后症状得到改善；实验证明与春藤素抗酶活性有关系 t l 7 2 。 1 5 9 杀虫作用 皂苷对用鳃呼吸动物和软体动物、鱼类显示很强毒性。从s m a l a x m a d a g a s l a l i c n s i s 中分离得到的四种寡糖皂苷和一种双糖皂苷具有杀软体动物的 活性、能防治血吸虫病【7 3 l ，从b a l a n i t e sr o x b u r g h i 中分离得一甾体皂苷对 d i a m s i a o b l i q l y a 具有较强杀虫活性【7 4 l 。 1 5 1 0 其它方面活性 除上述活性外，皂苷还表现多方面活性如土贝母皂苷具有治疗疣症作用【7 5 1 ， 重楼排草皂苷的子宫兴奋作用，合允总皂苷的抗子宫外孕作用7 6 】，桔梗皂苷对中 枢神经系统有抑制作明，并具镇咳、镇痛和解热作用，对消化性溃疡有预防和促 进治疗作用【7 7 l 等。 1 6 本课题的提出，研究目的和意义 中华常春藤在我国具有丰富的自然资源，目前只是作为观赏植物广为栽培和 研究。近年来随着研究的深入，发现了常春藤许多新的种类及其生理作用，特别 是其中皂苷类活性成分抗菌及抗癌防癌的作用，使常春藤在医药、食品领域具有 潜在的广阔应用前景。因此加速和加强对中华常春藤的深入研究和开发，提高中 硕士学位论文第一章绪论 华常春藤的综合开发利用价值具有十分重要的经济和社会意义。 本文研究旨在采用现代分离分析技术，建立中华常春藤皂苷活性成分的提 取、分离纯化工艺，同时分离鉴定中华常春藤中挥发油成分，以发挥我国的中华 常春藤资源优势，促进我国中华常春藤的中药现代化研究及应用。基于以上目的， 本论文主要开展了以下几方面工作：研究中华常春藤总皂苷的提取和纯化工艺， 建立中华常春藤中总皂苷提取的最佳工艺条件。利用大孔吸附树脂和制备色谱纯 化分离中华常春藤中皂苷类化合物。建立快速，准确的定量分析方法，以便对中 华常春藤中皂苷类化学成分进行跟踪检测，优化提取与纯化工艺；采用g c m s 对 中华常春藤中挥发性成分进行定性分析，筛选出有效的挥发性化学成分。 硕士学位论文第二章中华常春藤中总皂苷的提取工艺研究 第二章中华常春藤中总皂苷的提取工艺研究 植物有效成分提取的方法很多，如加热凹流法，索氏抽提法，超声波法，超 临界法，生物酶法，微波萃取法等，这些技术都有其优缺点，本文根据中华常春 藤中总皂苷成分的特点，分别对常规溶剂提取法，微波法7 8 1 和生物酶法1 7 9 】提取 工艺条件进行了系统研究，以中华常春藤中总皂苷的得率为指标，对这三种方法 的提取效果进行了比较，确定了提取中华常春藤中总皂苷的最佳方案和工艺参 数，为今后大规模提取中华常春藤中的有效成分奠定了基础。 总皂苷得率( 户型罨冀器l 。( 2 一1 ) 提取物蝻妒号磊篙筹引o o 协z ， 总皂苷纯度( 妒端翥藉挚。 协， 2 1 常规溶剂回流提取法 2 1 1 实验部分 2 1 1 1 仪器与试剂 s e n c ow 2 0 1 旋转蒸发器r 系列，上海申生科技有限公司；s h b i i i 循环 水式多用真空泵，郑州长城仪器厂；a y l 2 0 电子天平，s h i m a d z u 公司：f z l 0 2 微型植物试样粉碎机，天津泰斯特仪器有限公司；甲醇、乙醇( 9 5 呦为分析纯， 湖南师大试剂厂；实验用水为蒸馏水；中华常春藤全株由安徽毫州药材中心提供， 用烘箱于5 5 烘干、粉碎、过2 0 目筛，备用。 2 1 1 2 实验方法 1 提取溶剂筛选实验：根据皂苷易溶于水、热甲醇和乙醇的特性，可选择用水、 甲醇和乙醇作为溶剂来提取中华常春藤中总皂苷。 2 提取条件的单因素实验：选取浸泡时间、提取温度、提取时间、料液比、 提取次数5 个影响提取效果的因素做单因素实验，以确定相关因素及各因素的合 适范围，得到中华常春藤中总皂苷的最佳提取条件。 硕士学位论文第二章中华常春藤中总皂苷的提取： 艺研究 2 1 2 结果与讨论 2 1 2 1 提取溶剂的选择 提取溶剂的选择是常规提取中关键的一步。溶剂选择适当，就可以比较顺利 地将需要的成分提取出来。需要注意的有三点：1 溶剂对有效成分溶解度大，对 杂质溶解度小；2 溶剂不能与中药的成分起化学变化；3 溶剂要经济、绿色环保 等。皂菅类活性成分一般是极性较强的水溶性成分，根据“相似相溶”原理，本文 选择水，甲醇和乙醇进行研究。 准确称取l o g 中华常春藤粗粉若干份，分别加入蒸馏水、不同浓度的甲醇水 溶液和乙醇水溶液l o o m l ，在4 0 ( 2 下提取l h ，提取1 次。减压蒸馏后定容。按 4 2 2 5 建立的显色法测定中华常春藤中总皂苷的含量，结果见图2 1 。 活 性 成 分 得 塞 肋 0 5 5 0 5 o r 3 5 0 3 口乙醇 口甲醇 。埚厂 2 0 4 0 6 0 舳i o o 提取溶剂浓度， 图2 - i 提取溶剂对活性成分得率的影响 由图2 1 可见，甲醇( 乙醇) 浓度低于6 0 ，总皂苷得率均随浓度升高而增 加，甲醇( 乙醇) 浓度高于7 0 时，乙醇总皂苷得率高于甲醇；以水为提取溶剂， 总皂苷的得率仅为o 4 2 ，并有大量糖类物质溶出，增加了溶液粘度，给后处理， 如过滤操作，带来困难。因此从溶剂的安全性，生产成本及操作简便等因素综合 考虑，选用9 5 乙醇水溶液为提取溶剂。 2 1 2 2 提取条件的单因素实验 2 1 2 2 1 浸泡时间的选择 准确称取l o g 中华常春藤粗粉，加入1 0 0 m l 9 5 的乙醇水溶液，在5 0 * ( 2 下 提取1 次，每次1 5 h ，为考察浸泡时间对总皂苷提取效果的影响，选择3 h 、6 h 、 1 4 硕士学位论文 第二章中华常春藤中总皂营的提取工艺研究 9 h 、1 2 h 、1 5 h 、五个浸泡时间进行实验。结果如图2 - 2 所示。 述 将 鬟 扭 脾 珀 3691 21 5 浸泡时问血 图2 - 2 浸泡时间时活性成分得率的影响 由图2 2 可以看出，随着浸泡时间的增加，总皂苷的得率显著增加：超过1 2 小时后，总皂苷的得率随着浸泡时间的升高增加缓慢。浸泡1 2 小时和浸泡1 5 小 时总皂苷得率差距很小，从经济性和高效性的角度出发，浸泡时间定为1 2 h 。 2 1 2 2 2 提取温度的选择 述 需 囊 扭 硼】 躅 4 0 7 0 提媪度1 2 图2 - 3 提取温度对活性成分得率的影响 准确称取l o g 中华常春藤粗粉，加入1 0 0 m l 9 5 的乙醇水溶液，浸泡6 小时， 硕士学位论文第二章中华常春藤中总皂苷的提取下艺研究 提取1 次，每次1 5 h ，考察浸泡时间对总皂苷提取效果的影响，选择4 0 、5 0 、 6 0 、7 0 1 2 、8 0 五个温度进行实验。结果如图2 3 所示。 由图2 3 可以看出，随着温度的升高，总皂苷的得率显著增加；超过6 0 ， 总皂苷的得率随着温度的升高增加缓慢。原因可能是：1 ) 皂苷均含有苷键，易 脱去苷键生成糖基，低温提取可避免变化。2 ) 杂质的溶出量会随着温度的升高而 增加，吸附包裹了有效成分。但提取是溶质在溶液中的传质平衡过程，温度过低 提取效率明显不高。故提取温度选择为6 0 。 2 1 2 2 3 提取时间的选择 准确称取l o g 中华常春藤粗粉，再加入1 0 0 m l l 9 5 的乙醇水溶液，浸泡6 小时，温度为5 0 ，提取1 次的条件下，考察提取时间对皂苷活性成分得率的 影响，选择1 0 、1 5 、2 0 、2 5 、3 0 、3 5 五个时间点进行实验，结果如图2 _ 4 所 示。 述 哥 甾 取 扭 坤 确 1 o1 52 02 53 03 , 5 提取时间m 图2 4 提取时间对活性成分得率的影响 在2 5 h 以前，总皂苷得率随着时间的增加而显著增加；在3 h 时达到最大， 此后缓慢下降。究其原因可能是由于受热时间过长，活性成分发生分解所造成的。 故提取时问应选择在为3h ，次左右为佳。 2 1 2 2 4 料液比例的选择 准确称取l o g 中华常春藤粗粉，加入不同料液比9 5 乙醇水溶液，浸泡6 小时，温度为5 0 ，提取1 次，每次1 5 小时，考察料液比对皂苷活性成分得率 的影响，选择1 ：1 0 、1 ：1 5 、1 ：2 0 、1 ：2 5 、1 ：3 0 ( g ：m l ) 五个料液比进行实验，结果如 1 6 硕士学位论文第二章中华常春藤中总皂苻的提取工艺研究 图2 5 所示。 芒 哥 备 冀f 抽 神 确 1 ：1 01 ：1 51 ：2 01 ：2 51 ：3 0 料液比( g ：m l ) 图2 - 5 料液比对得率的影响 由图2 5 可知，随着溶剂量的增加，提取效果也随之提高，但提高的幅度逐 渐减小。因此从提取效果、减小溶剂用量和降低浓缩负荷三方面综合考虑，料液 比应选择1 ：2 0 。 2 1 2 2 5 提取次数的选择 准确称取l o g 中华常春藤粗粉，加入1 0 0 m l 9 5 乙醇水溶液，浸泡6 小时， 温度为5 0 ，提取不同次数，每次1 5 小时，考察提取次数对皂苷活性成分得率 的影响，结果如图2 - 6 所示。 芝 褥 重 扭 硼p 确 123456 提取次数欣 图2 - 6 提取次数对活性成分得率的影响 1 7 硕士学位论文 第二章中华常春藤中总皂营的提取_ t 艺研究 由2 - 6 图可知，当提取次数达到2 次时，总皂苷几乎被提取完全，提取次数 继续增大时，目标成分得率变化不大，