（分析化学专业论文）蛋白质的生物质谱分析.pdf

摘要蛋白质的生物质谱分析 蛋白质的生物质谱分析 摘要 f f 自从9 0 年代初，电喷雾、基质辅助激光解析等新型的离子化技术出现后， 用质谱分析鉴定大分子蛋白质成为常规分析手段。相比传统的蛋白质分析技术， 质谱以其快速、灵敏、提供信息丰富等特点，成为生物学和化学工作者的有力工 具。质谱能够精确地测定蛋白质等大分子的分子量，因此可以快速、有效地鉴定 基因表达的蛋白质，与h p l c 、c e 、分离芯片等联用后，可以推测蛋白质的级 结构，并发现基因在表达过程中的修饰和变异。随着人类基因组测序的基本完 成，蛋白质组学成为新的研究热点。生物质谱技术以其独有的优势又成为蛋白质 组学研究中的核心技术。目前，用二维凝胶电泳和质谱开展功能蛋白质组的研究， 对发现致病基因、新药开发具有指导性作用；从发展前景上看，质谱可以大规模、 高效率、高准确性地鉴定一个组织或细胞中的全部蛋白质，对于在细胞和生命有 机体的整体水平上认识生命现象的本质和活动规律具有深远的意义。 目前，用生物质谱分析鉴定蛋白质的方法学仍在不断发展，发展有效的联用 技术，样品的前处理，谱图中大量有用信息的提取和解析，数据库搜索方法的优 化和改进，对最后快速、有效地鉴定蛋白质部具有重要的作用。对新兴的蛋白质 组学来说，研究体系更为复杂，极微量蛋白的有效分离、提取和鉴定方法都还没 有很成熟的规律，都是难点i j 趣和关键技术。对上述问题进行探索性研究，具有 深刻的学术与应用意义。矿 本论文主要发展了前人创立的用电喷雾质谱分析鉴定蛋白质的标准方法；在 蛋白质组学研究中，创建了鉴定胶上染色斑点的标准方法，并应用于二维凝胶电 泳分离后胶上实际斑点的鉴定。 在此过程中，研究和讨论了样品前处理技术，证明样品脱盐和去除表面活性 剂的必要性，并在以后的分析实践中使用最有效的h p l c - - m s 联用技术进行在 线的前处理、分离和检测。i 在微柱h p l c 一质谱联用技术方面，优化了各种仪器 条件，进一步提高了质谱的检测灵敏度，减少了柱后扩散效应，并得到断裂更完 全、可推测序列更长的c i d 谱图。在蛋白质组学的蛋白鉴定方面，建立了套 胶上酶解、肽段提取、微柱h p l c m s 联用分析、数据库搜索的有效方法。在 胶上极微量蛋白点的检测方面，有效地应用自填毛细管柱和质谱联用，初步分析 了胶上极微量的结核杆菌分泌蛋白点。1 在复杂的c i d 谱图解析方面，综合应用并讨论了d er l o v o 测序方法和本实验 室发展的序列模式相关的测序方法，有效地应用于谱图解析和数据库搜索。在数 据库搜索方面，成功地应用并讨论了多种数据库搜索方法，如肽质量指纹搜索， 用解谱后的序列搜索，序列标签搜索，并发展了一种更为有效的数据库搜索方法， 即使用m a s c o t 搜索平台，不用解谱，直接将多组c i d 谱图碎片数据输入数据 库，进行批处理搜索。通过大量的比较研究证实，综合运用多种数据库搜索方法， 摘要蛋白质的生物质谱分析 、 都能获得确定的结果。其中，最简便、确定性最高的是m a s c o t 批处理搜索。， 最后，本论文研究和讨论了热变性对蛋白的结构影响及对酶解效率的影响。 比较研究了牛血清白蛋白、溶菌酶、肌红蛋白三种蛋白质，在经过和不经过热变 性酶解的质谱分析结果，比较了它们各自的酶解效率和在数据库中的匹配情况。 阐明了热变性形成蛋白集结物的机理，并总体上增强蛋白与酶的作用，提高酶解 效率。证实了酶解前对蛋白进行热变性的必要性。该项研究是质谱在蛋白质结构 分析中的一个有价值的应用。 关键词：电喷雾质谱，h p l c ，c i d ，蛋白质缝举争 乙7 l l “ 垒! 坐坚! 丝型坚垫g ! ! ! ! ! i 墅堕里! ! 坐竺! ! 里! ! 塑里! 堕 a n a l y z i n g p r o t e i n sb yb i o m a s s s p e c t r o m e t r y a b s t r a c t i nt h ee a r l yo f9 0 s ，t h en e wi o n i z a t i o nt e c h n i q u es u c ha se l e c t r o s p r a ya n d m a t r i x a s s i s t e dl a s e r d e s o r p t i o n h a sb e e n e m e r g e d ，t h e n t h ei d e n t i f i c a t i o no f m a c r o m o l e c u l a r p r o t e i n sb y m a s s s p e c t r o m e t r y b e c o m et h er o u t i n e a n a l y t i c a l t e c h n i q u e p r i o rt ot h et r a d i t i o n a la n a l y t i c a lm e t h o d sf o rp r o t e i n s ，m a s ss p e c t r o m e t r y t e c h n i q u e h a sb e e np a i dm o r ea t t e n t i o nb yb i o l o g i c a la n dc h e m i c a lr e s e a r c h e r sd u et o i t sh i g hs p e e d ，h i g hs e n s i t i v i t ya n de x c e l l e n tc a p a b i l i t yt op r o v i d ea b u n d a n ts t r u c t u r e i n f o r m a t i o n t h em o l e c u l a rw e i g h to fm a c r o m o l e c u l e ss u c ha sp r o t e i n sc a nb ed e t e r m i n e d a c c u r a t e l yb ym a s ss p e c t r o m e t r y , s om s c a nb eu s e dt oi d e n t i f yg e n ep r o d u c tq u i c k l y a n de f f i c i e n t l y h p l c m s ，c e m s ，s e p a r a t i o n c h i pm sc a nb eu s e dt op r e d i c tt h e p r i m a r ys t r u c t u r e so fp r o t e i n s ，a n dd e t e c tt h em o d i f i c a t i o na n dm u t a t i o nw i t h i nt h e g e n e e x p r e s s e dp r o c e s s e s w i t h t h e c o m p l e t i o n o f s e q u e n c i n g h u m a n g e n o m e ， p r o t e o m i c sb e c o m e t h en e w r e s e a r c h i n gh o t s p o t b i o m sb e c o m e t h ek e yr e s e a r c h i n g t e c h n i q u eo fp r o t e o m ed u et o i t s p a r t i c u l a rp r e d o m i n a n c e a tp r e s e n t ，r e s e a r c ho n f u n c t i o n a lp r o t e o m eu s i n g2 d p a g ea n dm a s ss p e c t r o m e t r yg u i d e st h ed i s c o v e r yo f g e n ec a u s e dd i s e a s ea n de x p l o i t a t i o no fd r u g s o nt h ev i e w o f i t sf u t u r ea p p l i c a t i o n s ， m a s ss p e c t r o m e t r yc a nb ec o m p e t e n tf o ri d e n t i l y i n gt h ew h o l ep r o t e i n si no n et i s s u e o rc e l l c o s m i c a l l y , a c c u r a t e l ya n dh i g he f f i c i e n t l y t h e s ep o s s i b l ea p p l i c a t i o n sh a s f a r - r e a c h i n gs i g n i f i c a n c e so nr e s e a r c h i n gt h en a t u r eo fv i t a lp h e n o m e n o na n dt h e a c t i v e d i s c i p l i n a r i a no n t h ew h o l el e v e l so f c e l l sa n dv i t a lo r g a n i s m s a t p r e s e n t ，t h em e t h o d o l o g yo fi d e n t i l y i n gp r o t e i n sb y m a s ss p e c t r o m e t r yk e e p s b e i n gd e v e l o p e d h o w t om a k et h eh y p h e n a t i n g t e c h n i q u ew o r k m o r ee f f i c i e n t l y , h o w t op r o c e s st h es a m p l ep r e t r e a t m e n t ，h o wt oe x t r a c ta b u n d a n to fu s e f u li n f o r m a t i o n f r o mt h es p e c t r a , a n dh o wt oo p t i m i z ea n di m p r o v et h em e t h o do fd a t a b a s es e a r c h i n g ， a r ea l ls i g n i f i c a n t l yc o n t r i b u t et ot h ei d e n t i f y i n gp r o t e i n sq u i c k l ya n de f f i c i e n t l y t o t h en e w l ye m e r g e d p r o t e o m i c s ，t h ew h o l es y s t e mo fb e i n gs t u d i e di sm o r ec o m p l e x h o wt o s e p a r a t e ，e x t r a c ta n di d e n t i f yp r o t e i n s o nt h e v e r ym i c r oq u a n t i t i e s a r e d i f f i c u l tp r o b l e m sb u tk e yt e c h n i q u e s p r o b i n gi n t ot h ea b o v et e c h n i q u e sa n dm e t h o d s h a sp r o f o u n ds i g n i f i c a n c eo nt h er e s e a r c ha n dt h ea p p l i c a t i o n i nt h i sd i s s e r t a t i o n ，t h es t a n d a r dm e t h o do fi d e n t i f y i n gp r o t e i n sb ye s i m si s f u _ r t h e rd e v e l o p e d o nt h es t u d yo fp r o t e o m e ，t h es t a n d a r dm e t h o do fi d e n t i f y i n g s t a i n e ds p o t so nt h eg e li se s t a b l i s h e da n dh a sb e e na p p l i e dt ot h ei d e n t i f i c a t i o no f s t a i n e ds p o t sa f t e r2 d p a g e 1 i i 垒! 堕型墅! ! 坚i 竖! 翌! ! ! 呈! 堕曼! ! ! ! 塑! 旦! 竺望墨! 塑 i nd e t a i l t h et e c h n i q u eo f s a m p l ep r e t r e a t m e n ti sd i s c u s s e d n es t u d ys h o w s t h e d e s a l t i n ga n dr e m o v i n g t h ed e t e r g e n t p r i o rt ot h em sa n a l y s i si sv e r yi m p o r t a n t i nt h e l a t e ra n a l y s i s ，t h eo n - l i n eh p l c m si su s e dt od e s a l t i n gs a m p l e st h o r o u g h l ya sw e l l a s s e p a r a t i n g a n dd e t e c t i o n o nt h eh a n do ft e c h n i q u eo fo n l i n em i c r o - c o l u m n h p l c - m s ，a l lk i n d so fo p e r a t i n gc o n d i t i o n sa r eo p t i m i z e d ，w h i c hc o n t r i b u t e st ot h e i m p r o v e m e n to fd e t e c t i n gs e n s i t i v i t y , m i n i m i z i n gt h ee f f e c to fp o s t c o l u m nd i f f u s i o n ， a n da c q u i r i n gt h ec i d s p e c t r aw i t l lm o r ef r a g m e n t a li n f o r m a t i o n o nt h eh a n do fi d e n t i f y i n gp r o t e i n so np r o t e o m e ，t h es t a n d a r dm e t h o do f i n g e l d i g e s t i o n ，p e p t i d e se x t r a c t i o nf r o m t h eg e l ，a n da n a l y s i sb yt h eo n l i n em i c r o c o l u m n h p l c - m si se s t a b l i s h e da n dh a sb e e np r o v e dt ow o r ke f f i c i e n t l y f u r t h e r m o r e ，t h e m i c r oq u a n t i t i e so fp r o t e i ne x t r a c t e df r o mt h es e c r e t e dp r o t e o m eb yt h et u b e r c l e b a c i l l u si si d e n t i f i e d p r e l i m i n a r i l yb ys e l f - c o m p a c t i n gc a p i l l a r y c o l u m nh p l c m s o nt h eh a n do f e l u c i d a t i n gt h ec o m p l i c a t e dc i ds p e c t r a ，t h ed e n o v os e q u e n c i n g m e t h o da n dt h es e q u e n c i n gm e t h o db a s e do nt h ep r i n c i p l eo fp a r e m c o r r e l a t i o ni s d i s c u s s e da n dc o m p a r e d b o t ho ft h e ma r ea p p l i e dt ot h es e q u e n c i n ga n dd a t a b a s e s e a r c h i n ge f f i c i e n t l y o nt h ed a t a b a s es e a r c h i n g ，m a n yk i n d so fm e t h o d ss u c ha s s e a r c h i n gb yp e p f i d em a s s ，b ys e q u e n c e ，b ys e q u e n c et a g sa r ea p p l i e da n dd i s c u s s e d a l lo ft h e mh a v eb e e np r o v e dt ow o r ke f f i c i e n t l y f u r t h e r m o r e ，t h en e wm e t h o do f u s i n gm a s c o ts e a r c h i n gp l a t f o r mi sd e v e l o p e d ，e a s i e ra n dm o r ec o n f i d e n t l y f i n a l l y , i n t h i s d i s s e r t a t i o n ，t h e i n f l u e n c e so ft h e r m a ld e n a t u r a t i o no nt h e s t r u c t u r e so f p r o t e i n s a n d d i g e s t i o ne f f i c i e n c y a r ed i s c u s s e d n o r m a t u r e da n d t h e r m a l l y d e n a t u r e d p r o t e i n s s u c ha sb o v i n es e r u m a l b u m i n ，l y s o z y m e ，a n d m y o g l o b i na r ei n s o l u t i o nd i g e s t e da n da n a l y z e dc o m p a r a t i v e l yb ym i c r o c o l u m n h p l c m s t h ep e p t i d e sn u m b e r s ，a n dt h en u m b e r so ft h em a t c h e dp e p t i d e sa r e r p e r f o r m i n gm s m si o ns e a r c h i n ga g a i n s tt h ed a t a b a s ea r ec o m p a r e d t h er e s u l t s s h o wt h a tp r o t e i na g g r e g a t e sa r ef o r m e dd u r i n gt h e r m a ld e n a t u r a t i o n , a n di t a p p e a r s m o r ep r o t e a s e l a b i l e o nt h ew h o l e ，t h eh i g h e ry i e l d so f p e p t i d ef r a g m e n t so b t a i n e d b yu s i n gt h e r m a ld e n a t u r a t i o ni m p r o v ed i g e s t i o ne f f i c i e n c y , t h e r e b ye n h a n c i n gp r o t e i n i d e n t i f i c a t i o nb ym s t h e r m a ld e n a t u r a t i o np r i o rt op r o t e i nd i g e s t i o ni sp r o v e dt ob e v e r yn e c e s s a r y s t u d yo nt h et h e r m a ld e n a t u r a t i o no fp r o t e i n si s o n ea p p l i c a t i o no f s t u d yo n t h es t r u c t u r e so f p r o t e i n sb ym s k e y w o r d s ：e s i m s ，h p l c ，c i d ，p r o t e o m i c s 第一章蛋白质的质谱分析研究背景 第一章蛋白质的质谱分析研究背景 1 概述 本世纪6 0 年代，科学家们曾注意到质谱技术在蛋白质和肽的结构分析中存 在的潜力，但由于离子化技术的限制，近3 0 年来，质谱技术只在有机化合物小 分子的结构测定中得到应用，而对大分子( 分子量超过1 , 0 0 0d a ) 、极性分子和 难气化的分子，则显得无能为力，但科学家们一直在努力改进和发明新的离子化 技术。7 0 年代，出现了等离子体解吸( p l a s m a d e s o r p t i o n ，p d ) 的离子化技术； 8 0 年代初，出现了快原子轰击( f a s ta t o mb o m b a r d m e m ，f a b ) 电离技术；8 0 年 代末，最引人瞩目的是另两种新型离子化技术的出现，即电喷雾电离( e l e c t r o s p r a y i o n i z a t i o n ，e s i ) 和基质辅助激光解吸电离( m a t r i xa s s i s t e dl a s e rd e s o r p t i o n i o n i z a t i o n ) 技术，这两种技术解决了极性大、热不稳定的蛋白质、多肽分子的离 子化和大分子的测定问题。应用这两种技术的质谱无论在灵敏度、准确性和在分 析混合物的复杂性方面都比以前的技术有了显著的改善，大大拓宽了质谱技术在 蛋白质领域中的应用，可以说是质谱技术在生物大分子中应用的一场革命( 1 ) 。随 后的9 0 年代，所有的新型质谱仪的研制基本围绕着这两种离子化技术展开。 质谱在蛋白质分析领域中的研究主要可分为几个分支方向：一个分支致力于 研究蛋白质的结构：一个分支致力于高效地鉴定蛋白或肽：另外还有一个分支致 力于改进质谱本身的技术，以更好地为前两个分支的研究服务。对研究工作者来 说，这种研究又常常是交叉的，在应用型研究中由于仪器本身的一些限制，研究 者们会尝试探索改进仪器，几乎所有质谱公司关于仪器技术的发展和改进，都来 源于众多实验室工作者的探索和积累。 在第一个分支研究方面，质谱在测定蛋白质结构中以其快速、准确、灵敏、 耗样少等优点倍受青睐。质谱可以准确测定一个未知蛋白质或不纯蛋白质各组分 的分子量，同时又可以定出较复杂的蛋白质裂解的肽片断混合物中每个肽片断的 分子量及氨基酸序列，所以它成为蛋白质一级结构测定中的重要手段。同时，由 于e s i 、m a l d i 等软电离技术在一定的电离条件下，并没有破坏生物大分子的 非共价作用，因而在对生物大分子中的非共价结构研究中也取得很大进展。传统 的测定结构的方法，有的要求拿到样品的纯品，而质谱( 尤其是联用了分离技术 第一章蛋白质的质谱分析研究背景 的质谱) 可以测出混合物各组分的结构；有的不能测定n 端封闭的肽或环肽， 质谱却不受限制；就灵敏度而言，质谱已成为仅次于荧光分析的通用型检测器， 而荧光分析给出的结构信息又太少。 第二分支的研究方向是在蛋白质组提出后应运而生的。质谱快速、灵敏的特 点使它成为蛋白质组研究领域中不可替代的技术。这一分支的研究主要着力于提 高检测灵敏度、发展新的接口技术、更高效地鉴定蛋白。目前的标准技术是，经 双向凝胶电泳分离后的蛋白酶解后，用质谱作肽谱分析，或用串级质谱作序列分 析。 质谱用于蛋白质研究的发展，很大程度上得力于仪器技术的进步，另一方面， 离不开相关数据库的发展。获得肽质量指纹谱后，搜索蛋白数据库，如果匹配得 好可帮助鉴定蛋白质，如果匹配不上可以发现未知蛋白质。当然，在确定是已知 蛋白还是未知蛋白时必须慎重，可以通过其它方法佐证。 下文简要介绍了质谱的原理及新技术在生物大分子分析中的应用。 2 生物质谱的原理 生物质谱仪器一般可分为离子源、质量分析器和检测器几个部分。本文只介 绍新型的离子源、质量分析器和接口技术的发展。 2 1 离子化技术 本文主要介绍两种离子源e s i 和m a l d i ，以及与它们相关的离子化技术。 2 1 1电喷雾及与其相关的离子化技术 电喷雾离子化过程首先由d o l e 等2 提出，但用在质谱上是1 9 8 4 年 孙。其电 离过程首先是溶液雾化成具有高电荷液滴的气溶胶，然后使带电液滴去溶和离子 化。当样品溶液以低的流速( 1 - - 2 0 ul m i n ) 流出毛细管的瞬间，在加热温度， 雾化气( n 2 ) 和强电场( 3 5 k v ) 的作用下，溶剂雾化并产生带电液滴。液滴 在向带相反电荷的电极方向运动过程中，逐渐脱溶剂使得液滴变小，表面电荷密 度增大，当达到一定极限时，液滴爆裂，产生小的液滴，再循环下去。当液滴很 小时，由于液滴表面电荷密度很大，足以从液滴中解析出分子离子而进入质谱分 析器中( 图1 ) 。e s i 的特点是： ( 1 ) 它是最软的电离技术，是连续流动方式的，易于同h p l c 或c e 联用。 ( 2 ) 多电荷离子的形成可以分析大分子量化合物，如蛋白质和寡核苷酸。 第一章蛋白质的质谱分析研究背景 电嘎零 厶甚以 离子蒸发、 分析物 朔毒f 履 c e 2 2 1 d ；+ 翟啼翁扣? + 譬 喷嘴。，：、：垒：二。弋 矗残基 帝电雾流之函f 离享亿 耳毡羁。鍪 第章蛋白质的质谱分析研究背景 这种技术。 2 1 2m a l d i m a l d i 是1 9 8 8 年由m i c h a c lk a r a s 及f r a n zh i l l e n k a r n p 首次提出1 0 ) 。在 m a l d i 中，激光束照射分散于基质中的样品，由于基质能够强烈吸收激光，从 而保护了样品分子。当基质吸收定能量后产生爆射进入气相，同时基质分子与 样品分子进行能量交换，产生分子离子进入质谱仪。m a l d i 是一种脉冲电离技 术，因此常和t o f m s 联用1 1 ) 。m a l d i 的基质种类较多，主要特性如下： ( 1 ) 基质对激光有较强的吸收力 ( 2 ) 基质与样品能溶于同一种使用的溶剂中 ( 3 ) 具有真空稳定性 ( 4 ) 对普遍存在于生物溶液中的无机盐及缓冲液等污染物具有一定包容性 ( 5 ) 促进样品易于离子化 目前常用的基质有芥子酸( s a ) 、2 ，5 一二羟基苯甲酸、咖啡酸、吡臻酸、 安息香酸、尼古丁酸。其中常用的为前四种。基质在改善灵敏度、精确度及重现 性等方面都有着重要作用，因此目前对液态基质( 1 2 ) 、固液复合基质都有一定的 研究1 孙。赵善楷在基质的选用中还研究了底物的影响1 卦。 样品和基质混合物被放到不锈钢样品棒的尖端，用热空气挥发干燥或真空干 燥，在干燥过程中，基质和被分析物在溶液中共沉积共结晶。 相比其它离子化方法，m a l d i 有以下几个优点：1 ) 制样简便，对纯化的要 求低，比如e s i 常需对样品反复除盐，而m a l d i 可忍受一定程度的盐；2 ) n 与 时间飞行质谱( t o f - - m s ) 联用；3 ) 宽的质量范围( 4 0 0 k d a ) ；4 ) 灵敏；5 ) 快速； 6 1 采用延迟采样d e 技术后，更大大提高了分辨率和质量精度，使蛋白和d n a 的识别更容易；7 ) m a l d i 源产生的离子多为单电荷离子，谱图易于解析。但遗 憾的是由于m a l d i 的脉冲性决定了它在l c - - m s 应用中受到一定的限制。 2 2 质量分析器 本文主要介绍三种质量分析器：四极杆、离子阱和飞行时间质谱。 2 2 1 四极杆质谱仪( q m s ) 4 第一章蛋白质的质谱分析研究背景 四极杆质谱仪具有体积小，重量轻，性能好等方面的优点。它由两组平行对 称的双曲线形电极构成( 注：由于双曲线形电极加工的困难，只有f i n n i g a n 公司 还坚持采用双曲线形电极，其余公司都以圆柱形极杆替代。因此，实际电位和理 想双曲场电位稍有偏差 l ) ，其基本原理如下： 在四个电极杆的x 和y 方向分别施加u + v c o s ( c o t ) 和( u + v c o s ( c o t ) ) 的 高频电压，在四个电极之间任意位置( x ，y ，z ) 上的电压将是： m ( w ，f ) ：( u + v c o s c o t ) 半 当质量为m ，电荷为e 的离子从z 方向进入四极电场中，其运动方程是： 窘+ ( a + 2 q c o s 2 t 肛。 箬m + 2 q c o s 2 t 肛o t = c o t 2 a = 8 e u m r 0 2 c o 2 q = 4 e v m r o z c 0 2 四撮滤质量穗定性图 图2 数学分析表明，在a 和q 取图2 中稳定区内的数值时，离子将围绕z 轴作有 限振幅的运动而沿着z 方向前进。a 和q 取图2 中不稳定区内的数值时，运动振 幅将不断增大，质量大于稳定运动离子m 的其他离子，将因振幅增大而碰到y 方向电极，质量小于m 的其他离子，将因振幅增大而碰到x 方向电极。选择适 当的“q ( u v ) 值，使扫描线通过稳定区，就可以使两个交点之间对应的质量 范围的离子以有限振幅沿着z 方向运动到达接受器，而其他质量的离子则因振幅 增大，撞击x ，y 电极而被“吸收”或“过滤”掉，因此实现了质量的分离。在r 0 和e 一定的条件下，质量与u ，v 以及卢有关。因此，保持u v 和厂值不变而 改变v 值，或保持u 、v 和u v 值不变而改变厂值，都可以实现质谱扫描，使 不同质量的离子依次到达接受器。 如果将多个四极杆质谱串联起来，可做成三级四极杆质谱( t r i p l e q u a n d r u p o l em s ) ，如图3 所示，第一个四级杆质谱议作为一个质量分析器，可 第一章蛋白质的质谱分析研究背景 选择单一的母离子通过第一级质谱而进入第二级质谱仪。第二级质谱仪作为一个 碰撞反应池，其内充有一定的惰性或中性气体如a r ，n 2 ，当单个的母离子飞入第 二级质谱时，将和气体产生碰撞的离子反应。碎片离子再经过第三级质谱仪得以 检测。串级质谱提供了更多的分子结构信息，对于鉴定和研究生物大分子极有意 义。 巍般泓粥：p f o d u c ti 例雌s c 窝n f 勰嘲。州嘲潮h 鲥褂嘲m o d e ) 8 羽自c l p i r i s rc d 董l c 曩n p r o d u t a t s q 1激q 3 1 p ki i 。稿h 嗽i 憎l 缸蝴_ i 曩玉舯_ h 伽啦t 轴黼删i 麓矗di 嗡搿辨蚺抽畦 如i t 枷蠡黼瞎铂纠哗蝴黼n 蝴 。u 轼嘲糟，埘n _ 蛐糟li 棚b 糟棚蚺h 精辅衲瞳i 撼鸯i 黧糠盥幽 图3 三级四极杆质谱仪 2 2 2 离子阱质谱仪( i t m s ) 图4 离子阱由一对上下的端电极和一环电极 组成( 图4 ) ，上下端电极( e n d c a p e l e c t r o d e s ) 面为双曲线的旋转对称面， 环形电极( r i n ge l e c t r o d e ) 内表面也为双 曲线的旋转对称面。 由于脉冲式透镜和加在环电极上的r f 电 压作用，电喷雾产生的离子被传输到离 子阱中，四极杆仪器中，离子流是连续 流入质量分析器的；而离子阱中，在离 子化阶段结束后，离子流脉冲式传输入 阱中。离子阱中一般充有l m t o r r 的氦气，用来降低离子的动能，因此离子可以 第一章蛋白质的质谱分析研究背景 迅速地聚焦在离子阱的中心。 进入阱中的离子用振荡电压( f u d a m e n t a lr f ) 进一步聚焦于离子阱的中心。 离子阱能够稳定捕获的离子取决于离子的荷质比、离子阱半径r 、振荡电压的频 率r f ( w ) ，和环电极电压v 。在离子阱中的离子行为可用一个多维参数q z 描述： 口，= 和v m w 2 当环电极电压是直流电压d c 时，可用近似的参数a z 代替。 为了提供一个四极场，应满足，：2 2 2 ，z 为离子阱中心自上下端电极的距离。科 二一_ i 如 图5 离子的稳定工作区 学家们多年的研究表明， 增加对电极间的距离，或 改变电极间的非对称角 度，可获得性能更高的多 极场，从而提高分辨率， 使离子更有效地激发 ( e x c i t a t i o n ) 和甩出 ( e j e c t i o n ) 。 图5 显示了离子在阱 中的稳定工作区。在某 特定的环电压下，一定荷 质比的离子将具有一定 的o z 、q z 值，当此口z 、q z 值落在稳定工作区内时，离子被捕获：当它们落在稳 定工作区以外时，离子将撞在电极上不被捕获。商业的离子阱仪器一般沿a z = o 工作。 不同荷质比的离子可能同时有相同的轨道。由于在特定的q e j e c r 下( 见图5 ) ， 离子轨道会变得不稳定，所以在一个给定的r f 振幅下，可以精确地设置一个低 质量检测限( c u t o f f ) 。在此检测限以下的离子不会被捕获，而凡高于此检测限的 离子都可被捕获，只不过m z 值增加，捕获效率会下降。通过调节加在端电极上 的辅助电压( a u x i l i a r yp o t e n t i a l ) 可设置高质量检测限。目前，离子阱可测量的 i i l z 上限已可达4 ，0 0 0 6 ，0 0 0 。这个质量上限高于四极杆质谱，低于飞行时间质 谱。 离子阱检测的方式有两种： 第一章蛋白质的质谱分析研究背景 1 a z lq z 和振荡电压( f u d a m e n t a lr f ) 值决定了离子在阱中的振荡频率。通过扫 描r f 电压值( 即从低到高加r f ) ，可以使阱中离子的轨道依次变得不稳定，因此 可从低m z 到高m z 依次将离子甩出阱外，一般在离子阱下端电极中央开几个小 孔，被甩出的离子便可通过d , t l 用电子倍增器( 或其它检出器) 检测。 2 仃z 值决定了离子在阱中的振荡频率，如果加在端电极上的交流电频率与离子振 荡频率一致，将会产生共振，离子振荡的振幅随时间线性增加，当振幅足够大时， 离子将甩出阱外。这样，对于q z q e j e 。离子仍可由于共振而甩出。由于靠反 比于m ，较大的分子将会在共振条件下被甩出检测。 如果加在端电极上的交流电振幅很小，离子不会被甩出，但会和氦气碰撞产 生碎片，它们大部分是沿肽骨架断裂的碎片，这样就可以实现串级质谱功能。不 仅如此，研究证实离子阱可实现多级质谱功能( m s “) ，大大丰富了可获得的分 子结构信息( 1 4 。”。 2 2 3 飞行时间质谱仪( t o f m s ) 飞行时间质谱仪工作原理很简单：样品在个短的离子源区s ( 一般为几个 厘米) 中离子化，离子经过一个长的无场区d ( 一般在o 5 4 m ) 到达离子检澳0 器。 在离子源区，常施加一电场( e = v s ) ，离子获得一致的动能，然后飞入无场区， 质量差别导致飞行速度不同，因此到达检测器的时间不同，从而实现质量分离。 假设离子的初始速度为零，则在离子源区将获得如下动能：mr2 ，2 = e v ，因此， l d 矿j 2 离子将以v = i 竺二l的速度飞入无场区，到达检测器的飞行时间为： lmj ，= 差d 。从该式中，可知ro c 沏儿少2 a 因此，可以通过测定离子到达检测 器的时间来测定离子的荷质比r n e 。 从上面的to c ( m ，p ) i 胆可得质谱的分辨率为盖= 去。因此，将无场区的长 度增加将有助于提高仪器的分辨率。近年来，人们常采用反射式的t o f m s 来增 强分辨率。另外，采用延迟激发( d e ) 技术，可减少离子的空间分散，也大大 提高了t o f m s 的分辨率。 飞行时间质谱仪要求记录谱图要非常“快”，因此电学系统要求较高。此外， 第一章蛋白质的质谱分析研究背景 它必须工作在脉冲状态，否则就无法确定离子的起始和到达时间，无法区分到达 接收器的不同质量，因此，适于和脉冲式的m a l d i 离子源相连。近年来，也出现 了e s i t o f ，它在电喷雾室后加一个离子聚集区和脉冲源，离子可以脉冲的方式 进入t o f m s 。 由于t o f m s 的分辨率高，理论上可测质量范围无上限( 只要飞行管足够长) ， 所以近年来，各仪器公司都致力于发展和t o f m s 组合的仪器，如最新的仪器有 0 - t o f ( 四极杆一飞行时间质谱) ，e s i t o f ，t o f t o f 。 2 3 联用技术 这里所说的主要是以电喷雾源为基础的质谱与其它分离手段接合的联用技 术。 2 3 1h p l c - - m s 联用1 6 ) 有人说，“色谱是分离的巨人，鉴定的矮子”，所以色谱常和各种分析鉴定仪 器联用，比如和鉴定能力强、提供信息丰富的质谱联用。以前，研究者们尝试各 种方法，使h p l c 和质谱联用。但从电喷雾离子源出现以后，这种联用方法才成 为常规的、较成熟的技术。 从e s i 、i s 、a p c i 、m i c r o 一n a n o e s i 的原理中可知，这几种电离技术都是连 续流动电离方式，都是大气压下离子化，离子源部分不要求真空状态，这些特点 决定了它们易于和l c 接合。而l c 使用的溶剂( 如乙睛、甲醇、0 i t f a 、o 1 甲酸) 也可直接流入质谱。在联用中主要考虑的是h p l c 流速和质谱进样流速的 匹配。如果h p l c 流速太大，要在进质谱前进行分流。对色谱部分来说，现在发 展毛细管柱h p l c ( 流速可低至几十个纳升分钟) 成为和质谱联用的趋势( 1 7 - 1 9 ) 。 对质谱部分来说，可在喷针结构中设计使用辅助流，以提高液体流量及扩大溶液 组成范围。 h p l c m s 联用，综合了h p l c 的高效分离性能和m s 测定灵敏、准确、快速 的优点，使其在生物分析领域得到日益广泛的应用，比如在生物混合物样品的分 离及性质研究、蛋白质肽质量指纹谱、蛋白质组学研究中倍受青睐。 2 3 2 毛细管电泳与质谱联用 c e 具有超群的分离效能，c e 在分离分析复杂的生物样品和当样品量极少 第一章蛋白质的质谱分析研究背景 时，具有独特的优越性。但c e 有限的进样量对检测器的灵敏度提出了较高的要 求。c e m s 的联用为c e 向实用化方向发展提供了有效手段。m s 的高灵敏度以 及为分析物提供结构信息的能力正好补偿了c e 进样量有限以及定性能力差的不 足。而纳喷雾离子源的出现和日益成熟更为c e m s 提供了广阔的舞台。 c e 与m s 联用的关键是连接毛细管与质谱仪的接口。c e 的分离常用较高浓 度的缓冲液，并常使用非挥发性的的添加剂，如环糊精、十二烷基磺酸钠等，然 而，当这些物质进入质谱时，将极大地降低质谱的灵敏度和信噪比。如何降低及 克服c e 中的盐及表面活性剂是c e e s i m s 联用的关键问题。作为c e e s i m s 联 用的接口应满足以下要求：( 1 ) 由于c e 的分离在高压电场中进行，c e e s i m s 接口应当具有良好的导电性。( 2 ) 降低或去除c e 分离中盐份对e s i 的影响。( 3 ) 减少柱后扩散。 在过去的几年中，几种新的接口技术