（分析化学专业论文）生物染色素与生物大分子受体体外作用的光散射表征及其分析应用.pdf

地燮与生塑数于受体体外作用的塑 表征及其分析应用 学科专业：分析化学 指导教师：李明教授 论文摘要 研究方向：分子光谱分析 研究生：李原芳 生物染色素广泛存在于自然界和生物体内，参与诸如光合作用和生命物质 的运输等生物物理过程，因此研究生物染色素与生物大分子物质的作用过程具 有十分重要的意义。本文选择了具有抗菌特点的生物染色素作为分子识别的主 体，应用共振光散射( r l s ) 技术、光电子吸收光谱对有关反应机理进行探讨，并 建立简单、快速、灵敏地测定核酸和蛋白质的光散射分析方法。 ， 1 | 、【天青a 、天青b 、健那绿b 等都是醌亚胺类生物染色素，在适当的酸度和离子 l 强度下，它们与微量核酸作用产生明显的共振光散射增强信号。利用增强的共 振光散射强度在一定范围内与核酸的浓度成良好的线性关系，建立了检测限均 在1 0 o n g m l下的核酸分析法，并对有关作用机理作了初步探讨。 在中性条件下，阿利新蓝8 g x ( a b g x ) 与d n a 作用产生以3 9 8 8 n m ， 4 5 1 1 n m ，4 6 9 0 r i m 为特征峰的共振光散射( r l s ) 增强光谱。根据r l s 的测定和吸 收测定建立了a b g x 与d n a 之问作用的静电吸引机理，并根据最佳条件下， 3 9 8 8 m 处的共振光散射增强与c t d n a 和f s d n a 的浓度在o 一2 o p g ，f 柚范围内成 线性关系建立了检测限在纳克级的d n a 分析方法。 酸性品红和固绿f c f 是阴离子三苯甲烷类生物染色索。在酸性条件下，它 们的i l l s 信号能被蛋白质增强，最大散射峰位于2 7 7 0 和2 7 9 0 r i m ，且增强r l s 强度在一定范围内与蛋白质浓度有线性关系，其中固绿f c f 是目前r l s 法测定 蛋白质最灵敏的方法，检测限为o 6 n 咖1 方法用于人尿中蛋白质的测定，结果 满意。 在中性溶液中，阿利新蓝8 g x 与蛋白质作用产生增强的r l s 信号，根据 3 9 8 0 n m 受i ：增强的r l s 强度。使用不同浓度的阿利新蓝能测定肛3 5i _ t g m l 范围内 的蛋白质，检测限低于3 0 0r i g n i l 合成样的测定结果重现性好，此方法用于人血 清样品测定，结果与使用c b b g 2 5 。b r a d f o r d 方法一蠡0 l i g h ts c a t t e r i n g c h a r a c t e r i s t i c so nt h e i n t e r a c t i o n so f b i o l o g i c a ld y e s w i t hb i o m a c r o m o l e c u l e s nv i t r oa n d t h e i r a n a l y t i c a la p p l i c a t i o n s m a j o r ：a n a l y t i c a lc h e m i s t r y s u p e r v i s o r ：p r o f e s s o rm i n g l i r e s e a r c h ：m o l e c u l a rs p e c t r o s c o p y a u t h o r ：y u a n f a n g l i b i o l o g i c a ld y e sw i d e l ye x i s ti nn a t u r ea n do r g a n i s m s ，a n dp a r t i c i p a t ei n m a n y i m p o r t a n tb i o p h y s i c a lp r o c e s s e ss u c ha sp h o t o s y n t h e s i sa n dt r a n s p o r t a t i o no f z o e t i c s u b s t a n c e s ，s o i ti so fi m p o r t a n ts i g n i f i c a n c e t o i n v e s t i g a t e t h ei n t e r a c t i o n so f b i o l o g i c a ld y e sw i t hb i o m a c r o m o l e e n i e s nv i t r o i nt h i st h e s i s ，b i o l o g i c a ld y e sw i t h t h ea b i l i t yo fr e s i s t a n tt ob a c t e r i aa r es e l e c t e da sh o s t so fm o l e c u l a rr e c o g n i t i o n ，a n d t h em e c h a n i s m so f t h ei n t e r a c t i o n so f t h e m 晰t l lb i o m a c r o m e c u l e sa r ei n v e s t i g a t e db y r e s o n a n c et i g h ts c a t t e r i n g ( r l s ) t e c h n i q u ea n dp h o t o e l e c t r o na b s o r p t i o ns p e c t r a , b a s e do nt h ee n h a n c e dr l s s i g n a l so f t h ei n t e r a c t i o n s ，r a p i da n ds e n s i t i v ea s s a y so f n u c l e i ca c i d sa n d p r o t e i n s a r ee s t a b l i s h e d a z u ra ( a a ) ，a z u rb ( a b ) a n dj a n u sg r e e nb b e l o n g t oq u a t e m a n r ya m m o n i u m s a l tb i o l o g i c a ld y e s i np r o p e ra c i d i t ya n di o n i cs t r e n g t h ，s i g n i f i c a n t l ye n h a n c e dr l s s i g n a l sa r eo b t a i n e dw h e nt h e yi n t e r a c tw i t hat r a c ea m o u n t o fn u c l e i ca c i d sa n dt h e e n h a n c e dr l si n t e n s i t yi si ng o o dp r o p o r t i o nt ot h ec o n c e n t r a t i o no fn u c l e i ca c i d s b a s e do nt h i s d e t e r m i n a t i o n so fn u c l e i ca c i d sw i n ll i m i to fd e t e c t i o n ( l o d ) b e l o w 1 0 0n g m la r ep r o p o s e da n d c o r r e s p o n d i n gm e c h a n i s m s a r ca l s od i s c u s s e d p r i f m d l y i nn e u t r a la q u e o u ss o l u t i o n , t h ei n t e r a c t i o no fa b g xw i t hd n ar e s u l t si n s t r o n ge n h a n c e dr l ss i g n a l sc h a g a g t c t i g c db y t h r e ep e a k sa t3 9 8 8n n l ，4 5 1 1n n la n d 4 6 9 0n n l e l e c t r o s t a t i ca t t r a c t i o nm e c h a n i s mo fa b g xw i t hd n aw a se s t a b l i s h e d b a s e do nt h em e a s u r e m e n t so fr l sa n d a b s o r p t i o n d a t a u n d e rt h e o p t i m u m c o n d i t i o n s a s s a yo fd n a a tn a n o g x a ml e v e l sa i a l s oe s t a b l i s h e db yd e t e c t i n gt h e e n h a n c e dr l s s i g n a l sa t 3 9 8 8n mi nt h er a n go f0 - 2 0i _ t g m lf o rb o t hc t d n a a n d f s d n a f u e h s i n ea c i d sa n df a s tg r e e nf c fa r ea n i o n i ct r i a r y l m e t h a n eb i o l o g i c a l d y e s i na c i d i cm e d i u m , t h e i rr l si n t e n s i t i e sa r eg r e a t l ye n h a n c e db yp r o t e i n sw i t h t h er l sc h a r a c t e r i z e dp e a k sa t2 7 7 0n n la n d2 7 9 0a m ，r e s p e c t i v e l y i tw a sf o u n d t h a tt h ee n h a n c e dr l s i n t e n s i t i e sw e r ei np r o p o r t i o nt ot h ec o n c e n t r a t i o n so f p r o t e i n s i nac e r t a i nr a n g e f a s t 霉- c c nf c fu s e da st h ep r o b eo f p r o t e i n si st h em o s ts e n s i t i v e m e t h o do f p r o t e i n si nr l st e c h n i q u ea n di t s l i m i to fd e t e c t i o n ( l o d ) i s0 6 n g m 1 t h er e s u l t so fd e t e r m i n a t i o no f p r o t e i n si nh u m a nu r i n es a m p l e sw i t hf u c h s i n ea c i d a n df a s t 9 1 - 地nb y u s eo f r l s t e c h n i q u e a f es a t i s f a c t o r y i nn e u t r a ls o l u t i o n , t h ei n t e r a c t i o no fa l c i a nb l u e8 g x ( a b g x ) a n d p r o t e i n sc a r l g i v er i s et os i g n i f i c a n t l ye n h a n c e dr l ss i g n a l s a c c o r d i n gt ot h ee n h a n c e di n t e n s i t i e s l i t3 9 8 0 蛐p r o t e i n so f t h ec o n c e n t r a t i o nr a n g eo f 0 3 5p g m lc a nb ed e t e c t e dw h e n e m p l o y i n gd i f f e r e n tc o n c e n t r a t i o n so fa b g xa n di t sl i m i to fd e t e c t i o n ( l o d ) i sl e s s t h a n3 0 0n g m 1 t h ea r t i f i c i a l s a m p l e sc a nb ed e t e r m i n e dw i t hg o o dr e p r o d u c i b i l i t y t h er e s u r so fd e t e r m i n a t i o nf o rp r o t e i n si nh u m a nb l o o ds e n n 雠i d e n t i c a lw i t h t h o s eo b t a i n e d a c c o r , l i n g t oc b bg - 2 5 0b r a d f o r dm e t h o d 缩写符号对照表 英文名称 c a l f m y m u sd n a f i s hs p e r md n a a z u r a a z u r b j a n u s g r e e n b l a u t h i sv i o l e t a l c i a nb u l e8 g x c e t y l l a i r n e t h y l a m m o n i u mb r o m i d e f u e h s i n ea c i d f a s tg r e e nf c f b o v i n es e r u ma l b u m i n h u m a ns e r u ma l b u m i n p e p s i n a - c h y m o t r y p s i n l y s o z y m e c e l l u l a s e y - g l o b u l i n r e s o n a n c e l i g h ts e a t t e d n g 中文名称 小牛胸腺d n a 鱼精子d n a 天青a 天青b 健那绿b 劳氏紫 阿利新蓝8 g x 溴代十六烷基三甲基铵 酸性品红 固绿f c f 牛血清白蛋白 人血清白蛋白 胃蛋白酶 甜糜蛋白酶 溶菌酶 纤维素酶 p 球蛋白 共振光散射 缩写符号 c t d n a f s d n a a a a b j g b l v a b g x c t m a b f s a f c f b s a h s a p e p c h y l y s c e l y - i g g i 己l s 第一章绪 论 1 1 光散射简介 光散射是指一束光通过介质时，在入射光方向以外的各个方向上都能观察 到光传播的现象，是电磁辐射与物质问相互作用的一种表现形式，是光波的电磁 场与介质分子相互作用的过程。如果介质分子是可极化的，就会被诱导产生以电 磁场频率振荡的电偶极子。根据电磁理论，振动着的电偶极子是一个二次波源， 它将产生振动的自身电磁场。这个电磁场将以与入射光相同的频率向各个方向发 出辐射。 光散射现象广泛存在于光和粒子的作用中，产生散射光的条件是介质必须具 有不均匀结构。当一束光通过光学均匀的( 即折射率到处都一样的) 介质时，介 质中偶极予发出的次波具有与入射光相同的频率，并且偶极子之间有一定的位相 关系，它们是相干光，在与折射光不同的一切方向上，相干光相互抵消，因此均 匀介质不能散射光，光只能沿着折射光线方向传播。但当均匀介质中掺入进行布 朗运动的微粒后，或者体系由于热运动而产生局部的密度涨落或浓度涨落时，就 会破坏次波的相干性，而在其他方向上出现散射光。除真空以外，所有的介质都 是不均匀的，因此光散射现象非常普遍。根据介质中散射粒子的大小( 由，散射 光分为反射和折射( 移 丑o ) 、丁达尔散射( 出砌和瑞利教射( 亦 0 0 5 五o ) 。根据入射 光与散射光之间的波长( 能量) 关系，光散射可以分为弹性散射、非弹性散射和准 弹性散射i 甜。弹性散射( 又称为经典散射或静态散射) 是没有能量改变的散射，如 瑞利散射( r a y l e i g hs c a t e r r i n g 其光子的能量没有改变) ；非弹性散射是有能量改变 的散射，如拉曼散射( r a m a ns m t e r i n g ，由分子或晶格振动所引起的的散射) 和 稚罩渊散射( b r i l l o u i n ，由声波引起介质密度涨落导致能量改变) ；准弹性光散射 是由于散射质点不停的傲布朗运动而引起的多普勒效应导致了教射光频率以入 射光频率为中心展开，所以又称动态光散射。根据产生光散射的粒子相对于入射 辐射波长的大小以及粒子相对于用围介质的折射率，一般地又将又将弹性散射分 成几种类型，如表1 所示。其中最重要的悬瑞利散射。 t a b l e1 t y p e so fe l a s t i cl i g h ts c a t t e r i n g c l a s s i f i c a t i o no f e l a s t i cl i g h t c o n d i t i o n s s c a t t e r i n g s i z eo f t h es c a t t e r e r r e l a t i v er e f r a c t i v ei n d e x r a y l e i g l l ，d e b y e 窿o 0 5 名p 0 1 2 p 一3一。量-9。i圭lj爵厶o1一酲寸一g寸兰iq腰kolu士一磊a。z 目i|_厶。昌卜q鼻一so-b芝卜u笔lso蕾葛kb譬口暑。最i置 皿o。一u|对q。li匣-pqulp。j。暑。工厶oii山五。厶23q - c 喜 曲芒州善曙2盈-p窖复一2茹ls。lc宝_霉置od歹w甚窖 乏) i 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当纳米粒子的粒径在1 0 9 5 n m 范围 内时，r l s 强度与纳米粒子粒径的立方成正比1 1 4 5 “7 1 。 1 4 新共振光散射技术 1 4 1 三维共振光散射技术 除t r l s ，使用具有三维功能的荧光分光光度计还可获得其他光散射信号。 这些散射信号包括二级散射( s l s ，厶n _ 2 如) 、反二级散射( a s l s ，a 。= o 5 a 。) 和 拉曼散射4 3 1 。对于没有三维功能的荧光分光光度计可以手动选择九。= 2 如和 a , m = 0 5 九。获得二级散射和反二级散射光谱 6 5 , 6 9 , 7 1 1 。三苯甲烷类染料有微弱的 s l s 和a s l s 信号，当它们与碘负离子和金属离子作用后形成离子缔合物，s l s 和a s l s 增强且产生新的s l s 和a s l s 蜂，据此可以测定纳克级的h g ( i i ) 和s e ( i v ) ， 但对同样的散射粒子，s l s 和a s l s 比r l s 弱，灵敏度比r l s 法低1 4 3 1 。 1 4 2 液一液界面的共振光散射技术 液液界面吸收和反应在金属离子的溶剂萃取、液膜分离、离子选择电极、 光纤传感器和反向色谱等基础研究中十分活跃。通过组合普通荧光分光光度计 的样品室，基于分析物在水四氯化碳界面上的吸附，将分析物萃取到液- 液界面 上，建立了全内反射麸振光散射f r m - r l s ) 技术。该法用于体液中金霉紊的测定， 比同样体系用荧光光度法测定灵敏高，且选择性更好( 1 4 8 1 。 r l s 法的抗干扰能力不是很强，大粒子外来物质干扰测定，而t i r r l s 法由 于分析物被萃取到了液- 液界面，减少了外来物质的干扰。此外，由于作用发生 在厚度低于2 0 0 n m 的液液界面上l l 伽1 蚓，t i r - r l s 法适用于研究不能在同一相中 溶解的作用体系。通常r l s 法只能在低离子强度下才能观察到较强的信号，而 t i r - r l s 法，在离子强度高于0 2 m o l l 也有很强的信号f m l 。 1 6 1 5 研究内容的确定 正如上述所述，生物染色素在生命过程中十分重要，因此，系统的研究生物 染色紊与生物大分子受体的作用具有十分重要的意义由于药物分子在体夕b ( i n v i t r 0 ) 和体内( i nv i v o ) 作用有一定的一致性，因此我们根据本实验室的条件，选择 具有抗菌特性的醌亚胺等生物染色索作为光谱探针，以生物受体核酸和蛋白质 作为研究对象，以设备简单( 仅在普通荧光分光光度上即可进行) 的共振光散射技 术作为主要研究手段，研究具有不同结构的生物染色素与核酸和蛋白质的作用， 初步探讨不同结构的生物染色素与生物受体作用的机理，建立简单、快速和灵 敏的测定核酸、蛋白质的方法。 参考文献 1 张寒琦，王芬蒂等译，光学分笏纪影长春，吉林大学出版社，1 9 9 6 ，5 3 0 5 5 9 。 2 庄榘，旅光馈嘱嚆灏兵在简分子群的厦序甄郑州，河南科学技术出版 社1 9 9 4 ，4 0 3 a n g l i s t e r , j ，a n ds t e i n b e r g ，i ，z ，c h e m p h y s ，19 8 1 ，7 4 ，7 8 6 4 黄承志，李原芳，胡小利分析纪雾1 9 9 8 ，2 6 ，1 5 0 8 5 p a s t e m a c k , r f ，b u s t a m a n e ，c ，c o l l i n g s ，p j ，g i a n n e t t e o ，a ，a n dg i b b s ，e j j ： a mc h e m s o c ，1 9 9 3 ，l15 ，5 3 9 3 6 m i l l e r ，g a 1 9 7 8 ，j p h y s c h e m ，1 9 9 3 ，8 2 ，6 1 6 7 h u a n g ，c z ，l i ，y f ，m a o ，j g ，a n dt a n ，d g a n a l y s t1 9 9 8 ，1 2 3 ，1 4 0 1 8 黄承志，李原芳，奉平分笏纪 鬈2 0 0 1 ，2 9 ，8 3 2 9 l i ，z p ，l i ，k a ，a n dt o n g ，s y t a l a n t a ，2 0 0 0 ，1 5 l ，6 3 1 0 魏永巨嚣直劈分子吸我与膨影兕谔援铲的谚完北京大学博士论文1 9 9 7 北京 1 1 a n g l i s t e r , j ，a n ds t e i n b e r g ，i ，z c h e m p h y s l e a 1 9 7 9 ，6 5 ，5 0 12 k e r k e r ，m ，t h e s c a t t e r i n go f l i g h t a n do t h e r e l e c t r o m a g n e t i cr a d i a t i o n ，1 9 6 9 ， a c a d e m i c p r e s s ，n e wy o r k 1 3 n e l s o n ，w h ，h o w a r d ，w f ，a n dp e e o r a a , r ，i n o r g c h e m 1 9 8 2 ，2 1 ，1 4 8 3 1 7 ：笙二空堑笙 1 4 a n g l i s t e r ，j ，a n ds t e i n b e r g ，i ，z ，c h e m p h y s ，1 9 8 3 ，7 8 ，5 3 5 8 15 r o nc h i a r e l l o ，a n dl o ur e i n i s c h ，c h e m j p 缈，1 9 8 8 ，8 8 ，2 5 3 1 6 s t a n t o n 。s g ，p e e o r a , r ，a n dh u d s o n ，b s j = c h e m e h y s ，1 9 8 8 ，8 8 ，3 3 6 5 1 7 b o h r e n , c f ，a n d h u f f m a n ，d r a b s o r p t i o n a n d s c a t t e r i n g o f l i g h t 砂s m a l l p a r t i c l e s j o h nw i l e y a n ds o n s ，1 9 9 8 ，n e wy o r k 18 p e c o r a , r d y n a m i cl i g h ts e a t t e f i n g p l e n u mp r e s s ，1 9 8 5 ，n e wy o r k 1 9 c o m i ，s ，c a p p e l l i ，c ，c a m m i ，r ，a n dt o m a s i ，j = p h y s c h e m a ，2 0 0 1 ，1 0 5 ， 8 3 1 0 2 0 p u r r e l l o ，r ，b e l l a c c h i o ，e ，g u r r i e r i ，s e ta 1 j p h y s c h e m 最，l 鲫8 ，2 7 6 ：2 4 2 2 1 p a s t e m a e k ，r f ，a n dc o l l i n g s ，p j s c i e n c e ，1 9 9 5 ，2 6 9 ，9 3 5 2 2 p a s t e m a c k , r f ，s c h a e f e r ，k s ，h a m b r i g h t ，p i n o r g c h e m ，1 9 9 4 ，3 3 ，2 0 6 2 2 3 k a n o ，k ，f u k u d a , k ，w a k a m i ，h ，n i s h i y a b u ，r ，p a s t e m a c k ，r f j ：a m c h e m s o c ，2 伽时，1 2 2 ，7 4 9 4 2 4 b o r i s s e v i t c h ，i ，e ，t o m i n a g a ，t t ，i m a s a t o ，h ，a n dt a b a k ，m a n a lc h i m a c t a , 1 9 9 7 ，3 4 3 ，2 8 1 2 5 d ep a u l a , j c ，r o b b l e e ，j h ，a n dp a s t e m a c k ，r f b i o p h y s z ，1 9 9 5 ，6 8 ，3 3 5 2 6 p a r k a s h ，j p ，r o b b l e e ，j h ，a g n e w ，j ，g i b b s ，e ，c o t l i n g s pp a s t e m a c k ，r f a n d d e p a u l a , 3 c b i o p h y s j ，1 9 9 8 ，7 4 2 0 8 9 2 7 a r e n a , g ，s c o l a r o ，l m ，p a s t e m a c k ，r f ，a n dr o m e or 1 n o r g c h e m ，1 9 9 5 ， 3 4 2 9 9 4 2 8 d i x o n ，d w ，a n ds t e u l l e t ，v 一l n o r g b i o c h e m ，1 9 9 8 ，6 9 。2 5 2 9 h u a n g ，c ，z ，l i ，y f ，l i ，n ，l i ，k a ，a n dt o n g ，s y ，b u l l , c h e m , s o cd p n ， 1 9 9 8 ，7 1 ，1 7 9 1 3 0 h u a n g ，c z ，z h u ，j x ，“，k a ，a n dt o n g ，s y ，a n a l s c i ，1 9 9 7 ，1 3 ，2 6 3 3 1 黄承志，李原芳，黄新华，刘绍璞物理纪学学掘1 9 9 8 ，1 4 ，7 3 1 3 2 g u r r i c r i ，s ，a l i f f i ，a ，b e l l a c c h i o ，e ，l a u c e r i ，r ，a n dp u r r e l l o ，r ，i n o r g c h i m a c t a 1 盼9 。2 8 6 ，1 2 1 3 3 “，y f ，h u a n g ，c z ，l i u ，x d ，a n dh e ，y q ，s o u t h w e s tn o r m u n i v ( n a t s c i e d ) 1 9 9 7 ，2 2 ，5 4 3 1 毫 墨二兰丝堡 3 4 l i u ，s p ，a n dl i u ，z f s p e c t r o c h i m a c t a ，1 9 9 5 ，5 1 ，t 4 9 7 3 5 c o l l i n g s ，p j ，g i b b s ，e j ，s t a r r ，t e ，v a f e k ，0 ，y e e ，c ，p o m c r a n e e ，l a ，a n d p a s t e r n a e k ，r f ，j = e h y s c h e m b ，1 9 9 9 ，1 0 3 ，8 4 7 4 3 6 p a s t e m a c k ，r f ，f l e m i n g ，c ，h e r r i n g ，s ，c o l l i n g s ，p j ，d e p a u l a , j ，d e c a s t r a , g ，a n dg i b b s ，e j ，b i o p h y s 2 0 0 0 ，7 9 ，5 5 0 3 7 黄承志，李克安，童沈阳廊等学兹纪学学规1 9 9 7 ，1 8 ，5 2 5 3 8 h u a n g ，c z ，l i ，k a ，a n dt o n g ，s y b u l l c h e m s o c 咖，1 9 9 7 ，7 0 ，1 8 4 3 3 9 h u a n g ，c z ，l i ，y f a n d h u a n g ，x h a n a l l e t t ，1 9 9 8 ，3 1 ，1 1 4 9 4 0 h u a n g ，c z ，l i ，y f a n d l i u ，x d ，a n a l c h i ma c t a ，1 9 9 8 ，3 7 5 ，8 9 4 1 黄承志，李原芳，刘希东，纪笋r 台北) ，1 9 9 8 ，5 6 ，2 5 4 2 达毛拉杰里力，黄承志分析纪寻肇1 9 9 9 ，2 7 ，l2 0 4 4 3 h u a n g ，c z ，l i ，y fh u , x l ，a n dl i ，n b a n a l c h i m a c t a ，1 9 9 9 ，3 9 5 ，1 8 7 4 4 r t u a n g ，c z ，l i ，y f ，p u ，q h ，a n dl a i ，l j a n a ll e t t ，1 9 9 9 ，3 2 ，2 3 9 5 4 5 黄承志，李原芳，李念兵，罗红群，黄新华分历化学1 9 9 9 ，2 7 ，1 2 4 1 4 6 h u a n g ，c z ，l i ，y fd e n g ，s y ，a n dl i u ，s r b u l l c h e m s o c 咖门，1 9 辨，7 2 ， 1 5 0 1 4 7 魏永巨，李克安，童沈