（分析化学专业论文）某些量子点在dna序列检测中的应用及对dna损伤的研究.pdf

某些量子点在d n a 序列检测中的应用及对d n a 损伤的研究 摘要 量子点因具有独特且优良的光、电、磁和力学性能而受到人们的广泛研究。 量子点在生物化学、细胞生物学、免疫生物学等学科的研究中显示了巨大的发展 潜力，特别是量子点作为标记物用于生物分析，很有应用前途。然而，近年来量 子点的毒性越来越引起人们的兴趣，这限制了量子点在药学和生物学中的应用。 不同的量子点有其不同的物理化学性质这决定了量子点潜在的毒性和无毒性。 d n a 作为生物体系中重要的生物分子容易受各种物理化学因素的影响而产生损 伤。其中，活性氧基团( r o s ) 是引起d n a 损伤的主要因素【1 , 2 1 。量子点在紫外 光照下能够产生r o s 而引起d n a 的损伤。 本文主要包括以下两方面内容：一是用水热法合成表面修饰聚乙烯吡咯烷酮 的硫化铋纳米粒子，借助氢键将其标记于寡聚核苷酸片段上，进而将其与固定于 纳米金碳糊电极上的目标d 删行杂交。用硝酸氧化溶解d n a 杂交产物，以极 谱络合吸附波测定溶解得到的b i “，成功实现了对目标d n a 特定序列的检测。此 方法对一个碱基错配、互补和非互补序列具有很好的识别能力。二是通过在不同 电极表面修饰聚二甲基二烯丙基氯化铵( p d d a ) 作为固定d s d n a 的平台，得 到了d n a 电化学生物传感器，再将其置入p b s c 量子点和c d s c 量子点分散液中进 行紫外光照，以钴邻菲哕啉( c o ( p h c n ) 3 3 + ) 作为指示剂利用循环伏安法研究量子 点在紫外光照下对d s d n a 的损伤及其机理，并初步探讨了两种量子点共存时对 d s d n a 的损伤协同效应，同时对d s d n a 的损伤进行了简单的修复。本实验方法对 d n a 损伤的检测简单可行，此方法可应用于检测其它量子点和纳米材料的毒性。 关键词：量子点，d n a 检测，d n a 损伤，紫外光照，电化学 s o m eq ua n t u md o t sa p p l i c a t i o nf o rd n a d e t e c n o na n d 唧i rd a m a g et o 以娘dd n a q u a n t u md o t s ( q d s ) h a v eb e e ne x t e n s i v e l ys t u d i e db e c a u s eo ft h e i ru n i q u e s i z e - d e p e n d e n te l e c t r o n i c ，m a g n e t i c ，o p t i c a la n de l e c t r o c h e m i c a lp r o p e r t i e s q u a n t u m d o t sh a v em a n yp o t e n t i a lu s a g e si nm a n yf i e l d ss u c ha sb i o c h e m i s t r y ，c e l lb i o l o g y ， i n l m u n o - b i o l o g ye t c e s p e c i a l l y ，q u a n t u md o t sc a nb eu s e da sl a b e l sf o rb i o l o g i c a l s y s t e m s h o w e v e r ，a ne x i s t i n gm a j o ra r g u m e n tt h a tm a yl i m i tt h e i ru s ei nm e d i c i n e a n db i o l o g yi st h et o x i c i t yo fq d s ，w h i c hh a sa t t r a c t e dg r e a ta a e n f i o ni nt h ep a s t d e c a d e e a c hi n d i v i d u a lt y p eo fq d sp o s s e s s e si t so w nu n i q u ep h y s i c o c h e m i c a l p r o p e r t i e s ，w h i c hi nt u md e t e r m i n ei t sp o t e n t i a lt o x i c i t yo rn o n t o x i c i 哆d n aa sa n i m p o r t a n tb i o m o l e c u l eo fl i v i n gs y s t e m sm a yb eo x i d a t i v e l yd a m a g e db yal a r g e n u m b e ro fc h e m i c a la n dp h y s i c a la g e n t s a m o n gt h e m ，r e a c t i v eo x y g e ns p e c i e s ( r o s ) a r er e g a r d e da sm a i nd n ao x i d a t i v ed a m a g er e a g e n t s u n d e ru vi r r a d i a t i o n ，q d s h a v eb e e nr e p o r t e dt op r o d u c er o s ，w h i c hc a nr e s u l ti nd s d n ab r e a k a g e i nt h i s p a p e r t h es t u d ym a i n l yc o n s i s t so ft w oa s p e c t s 1 ：b i s m u t hs u l f i d e n a n o p a r t i c l es u r f a c e - m o d i f i e dw i mp o l y v i n y l p y r r o l i d o n ew a ss y n t h e s i z e du n d e r h y d r o t h e r m a lc o n d i t i o n s ，a n du s e da sam a r k e rt ol a b e lt h ed n ap r o b e t a r g e td n a w a si m m o b i l i z e d c o v a l e n t l y o nc a r b o np a s t ee l e c t r o d em o d i f i e dw i t h g o l d n a n o p a r i c l e s ，a n dt h e nh y b r i d i z e d 而mt h ep r o b ed n a l a b e l e d 而t 1 1b i s m u t hs u l f i d e n a n o p a r t i c l e mh y b r i d i z a t i o ne v e n t sw e r em o n i t o r e db yd e t e c t i o no fb i 3 + v i a p o l a r o g r a p h i cc o m p l e xa d s o r p t i v ew a v e t h ep r o p o s e dm e t h o d s h o w e dag o o d d i s t i n g u i s h a b l ea b i l i t y t oo n eb a s em i s m a t c h e do rt h en o n c o m p l e m e n t a r yd n a s e q u e n c e sw i t ht h ec o m p l e m e n t a r yd n as e q u e n c e s 2 ：a ne l e c t r o c h e m i c a ls e n s o rf o r t h ed e t e c t i o no ft h e n a t u r a ld o u b l e s 仃a n d e dd n a ( d s d n a ) d a m a g ei n d u c e db y d i f f e r e n tq d s ( p b s eq d s ，c d s eq d s ) u n d e ru vi r r a d i a t i o nw a sd e v e l o p e d t h e b i o s e n s i n gm e m b r a n e sw e r ep r e p a r e db ys u c c e s s i v e l ya s s e m b l i n gp o l y c a t i o n i cp o l y ( d i a l l y l d i m e t h y la m m o n i u m ) a n dd s d n a o nt h es u r f a c eo ft h ed i f f e r e n te l e c t r o d e s d a m a g eo fd s d n aw a sf u l f i l l e db yi m m e r s i n gt h es e n s i n gm e m b r a n ee l e c t r o d ei n d i f f e r e n tq d s ( p b s eq d s ，c d s eq d s ) s u s p e n s i o na n di l l u m i n a t i n gi tw i t ha nu v l a m p c y c l i cv o l t a m m e t r yw a su t i l i z e dt od e t e c td s d n ad a m a g ew i t hc o ( p h e n ) 3 3 + a s t h ee l e c t r o a c t i v ep r o b e t h ed s d n ad a m a g ei n d u c e db yp b s eq d su n d e ru v i r r a d i a t i o nw i t hc d s ec o e x i s t i n gh a sb e e np a r t l yi n v e s t i g a t e d m o r e o v e r t h eo x i d i z e d m d s d n ah a sb e e nr e p a i r e ds i m p l y t h i se l e c t r o c h e m i c a ls e n s o rp r o v i d e das i m p l e m e t h o df o rd e t e c t i n gd n ad a m a g e ，a n dm a yb eu s e df o ri n v e s t i g a t i n gt h ed n a d a m a g ei n d u c e db yo t h e rq d s k e y w o r d s ：q d s ，d n ad e t e c t i o n ，d n ad a m a g e ，u vi r r a d i a t i o n ，e l e c t r o c h e m i s t r y i v 目录 第一章文献综述1 1 1 极谱法用于d n a 电化学检测1 1 2 纳米材料在d n a 生物传感器中的应用“1 1 3 量子点用于d n a 分子标记”2 1 4 量子点与d n a 损伤”4 1 4 1d n a 损伤的现象及类型4 1 4 2 量子点的细胞毒性”8 1 4 3d n a 损伤的检测方法9 1 4 4d n a 损伤的修复1 0 1 5 硕士论文的提出和设想1 1 参考文献”1 3 第二章硫化铋纳米粒子标记d n a 及d n a 特定序列的灵敏检测 1 9 2 1 实验部分一2 1 2 1 1 仪器一2 1 2 1 2 试剂一2 1 2 1 3 实验方法2 2 2 1 3 1b i 2 s 3 d n a 纳米结合物的制备2 2 2 1 3 2 纳米金碳糊电极( a u c p e ) 的制备2 2 2 1 3 3d n a 的固定杂交和检测”2 2 2 2 结果与讨论2 3 2 2 1 纳米粒子的结构表征2 3 2 2 2b i 2 s 3 d n a 探针的紫外光谱表征2 4 2 2 3b i 3 + 钛铁试剂极谱络合吸附波2 4 2 2 4d n a 在a u c p e 上固定与杂交的表征2 6 2 2 4 1 微分脉冲伏安法( d p v ) 和交流阻抗法( e i s ) 研究”2 6 2 2 4 2 杂交条件的优化2 8 2 2 5c a m v 3 5 s 基因d n a 特定序列的极谱络合吸附波法检测”2 8 2 2 5 1 对c a m v 3 5 s 基因d n a 特定序列的选择性识别2 8 2 2 5 2 对c a m v 3 5 s 基因d n a 特定序列的检测范围和检测限”2 9 2 3 本章小结3 l 参考文献3 2 第三章硒化铅量子点对d s d n a 的损伤及其机理的研究3 5 3 1 实验部分3 7 3 1 1 仪器”3 7 3 1 2 试剂”3 7 3 1 3 实验方法3 7 3 1 3 1p b s e 量子点的制备3 7 3 1 3 2 金电极( a u ) 的预处理和d s d n a p d d a m p a a u 电极的制备 3 8 3 1 3 3 量子点对d s d n a 的损伤和修复3 8 3 1 3 4 循环伏安法3 8 3 1 3 5 交流阻抗法3 8 3 2 结果与讨论3 9 3 2 1p b s e 量子点的电镜表征3 9 3 2 2d s d n a 与c o ( p h e n ) 3 “溶液作用时间的优化3 9 3 2 3d s d n a 在p d d 枷触电极上固定的电化学表征4 0 3 2 3 1 循环伏安法( c v ) 研究”4 0 3 2 3 2 交流阻抗法( e i s ) 研究4 1 3 2 4p b s e 量子点对d s d n a 损伤的电化学检测4 2 3 2 5p b s e 量子点引起d s d n a 损伤的可能机理4 3 3 2 6 紫外光照时间对d n a 损伤的电化学研究4 4 3 2 7d s d n a 损伤的修复4 5 3 3 本章小结4 6 参考文献4 7 第四章p b s e 与c a s e 量子点对d s d n a 协同损伤的研究5 0 4 1 实验部分5 1 4 1 1 仪器和试剂5 1 4 1 2 实验方法5 1 4 1 2 1c a s e 和p b s e 量子点的制备5 1 4 1 3 2p d d a c p e 电极的制备以及d s d n a 的固定”5 2 4 1 3 3 不同量子点对d s d n a 的损伤和修复5 2 4 1 3 4 循环伏安法5 2 4 1 3 5 微分脉冲伏安法5 2 4 1 3 6 交流阻抗法”5 2 4 2 结果与讨论5 3 4 2 1p b s e 和c a s e 量子点的电镜表征5 3 4 2 2d s d n a p d d a c p e 修饰电极的电化学表征5 3 4 2 2 1 微分脉冲伏安法表征5 3 4 2 2 2 交流阻抗法表征5 4 4 2 3p b s e 和c d s e 量子点对d s d n a 损伤的电化学研究5 5 4 2 4 紫外光照时间对d s d n a 损伤的电化学研究”5 7 4 2 5d s d n a 损伤的修复5 8 4 3 本章小结6 0 参考文献6 1 结论6 3 致谢6 4 攻读学位期间发表的论文目录6 5 独创性声明6 6 关于论文使用授权的说明6 6 二j 某些量子点在d n a 序列检测中的应用及对d n a 损伤的研究 第一章文献综述 1 1 极谱法用于d n a 电化学检测 极谱络合吸附波是某些金属络合物吸附于电极表面后发生电化学反应所产 生的极谱波【1 。2 1 。它可以选择特效的有机试剂提高极谱法的灵敏度及选择性，发 挥极谱吸附波的特点，大大扩大了极谱分析的应用范围。可以对许多金属离子 或其配位体进行测定，具有灵敏度高、精密度好、实验操作简捷方便、仪器价 格低廉、便于推广应用等优点。 络合吸附波极谱法在我国发展较快，是具有中国特色的极谱分析方法。我 国分析化学家在极谱催化波及其电流理论方面进行了深入系统的研究，提出并 验证了近代极谱学方法的多种催化电流公式，建立了众多无机金属离子的极谱 催化波体系，尤其是在铂族元素催化氢波、稀土元素催化波、配合物吸附波等 方面有突破创新，解决了许多分析难题，广泛应用于地球化学、环境试样中痕 量金属的测定【2 3 】。络合吸附波不仅可以测定无机化合物，而且可以测定有机化 合物，应用非常广泛【】。但极谱络合吸附波方法应用于d n a 电化学生物传感器 的研究，迄今很少有报道。 1 2 纳米材料在d n a 生物传感器中的应用 纳米材料在电化学生物传感器的发展中起到了重要作用，以纳米技术为基 础的生物传感器的研究为生命科学及其相关领域的研究提供了许多新的方法， 纳米技术使发展新型的电化学生物传感器成为可能【6 】，它们的有机结合将会加 快人类科学技术的进步。生物传感器是在化学传感器的基础上发展起来的，也是 电化学分析和生物技术研究最为活跃的领域之一。纳米材料的特点与传感器所 要求的多功能、微型化、高速化相互对应【7 。9 1 。纳米材料由于其特殊的物理化学 性质，从而使其在纳米科学、生物和化学等多个领域得到重视，强有力地推动 了化学和生物传感的发展【协1 2 1 。 电化学d n a 生物传感器，根据是否标记电活性物质可分为标记型和非标记 型两类。非标记型电化学d n a 生物传感器是利用d n a 杂交前后d n a 本身碱基的 电化学信号( 如电流、电容、电阻或频率等) 的变化而进行检测的传感器。标记型 青岛科技入学研究生学位论文 电化学d n a 生物传感器是利用具有电化学活性的物质指示d n a 杂交前后电化 学信号的变化而进行检测的传感器。标记型电化学d n a 生物传感器以其高灵敏 度备受人们关注。根据电化学活性物质的不同，标记型电化学d n a 生物传感器 可以分为以下三类：其一，电化学活性物质作为标记物标记在寡核苷酸或s s d n a 上；其二、酶作为标记物标记在寡核苷酸或s s d n a 上；其三、电化学活性物质 作为杂交指示剂。 1 3 量子点用于d n a 分子标记 d n a 分子标记技术的开发是近年来分子生物学领域研究的热点。分子标记 是继形态标记、细胞标记和生化标记之后发展起来的一种较为理想的遗传标记 形式，它以蛋白质、核酸分子的突变为基础，检测生物遗传结构与其变异。分子标 记技术从本质上讲，都是以检测生物个体在基因或基因型上所产生的变异来反映 生物个体之间的差异。 匿痢 、1 k 。_ s 罗 蝴p 哆厶删幽 妥黼爹 之乏曼羔摩面磊丽蕊嬲 图1 - 1 标记型d n a 生物传感器的主要类型：( a ) 直接标记法即d n a 探针直接与目标 d n a 相杂交：( b ) 夹心式三元复合物法即目标d n a 一部分与固定的d n a 探针杂交另一部 传统的标记方法是利用元素的放射性，尽管这是最灵敏的方法之一，但是 2 某些量子点在d n a 序列检测中的应用及对d n a 损伤的研究 诸如砣p ，1 2 5 i 等同位素的使用有非常大的缺陷。光学和电化学技术在各种标记方 法的基础上已经发展起来。例如，荧光染料、量子点被广泛的应用于光化学检 测f l3 1 。在d n a 杂交检测中，电化学方法 6 , 1 4 l 以其成本低、方法简单、尺寸范围 小的优点已引起人们很大的关注。标记物可以是酶、电活性指示剂、金属阳离 子络合物、有机络合物、纳米粒子等。标记方法【1 5 1 一种直接标记法即d n a 探针 直接与目标d n a 相杂交如图1 1 中a ；另一种是夹入式三元复合体法即d n a 探针 一部分与目标d n a 杂交另一部分与信号d n a 探针杂交如图1 1 中b 。 纳米粒子由于其奇特的尺寸效应、良好的化学物理性质和功能【1 6 i 成为生物 分析中用以提高灵敏度而做标记材料的首选【1 7 1 。传统的生物分析的标记物是酶 1 8 - 2 0 】和具有电活性1 2 1 - 2 6 】的物质，这些物质已经广泛地应用于生物分析标记中。 随着纳米科技的发展，纳米粒子、纳米管和纳米线被引入电化学生物分析中以 增大生物电化学分析如d n a 和蛋白质的灵敏度1 2 7 l 。其中比较有代表性的一个 标记物是胶体金【2 8 。3 0 1 。自从2 0 0 0 年l i m o g e s 等人川将金纳米离子标记应用到电 化学免疫测定中，电化学纳米材料作为分子标记就开始广泛用于电化学生物传 感器中。 、 图1 2 量子点的应用。 ： f i g 1 - 2 t h e a p p l i c a t i o n o f q d s ： ， ， 量子点主要是由i i 族族元素组成的，尺寸大小范围在1 1 0 0 r i m 的半导体 纳米晶体。相对于传统的染料量子点具有较宽的吸收光谱、较窄的发射光谱、 3 青岛科技大学研究生学位论文 较强的荧光强度和高的耐光性1 3 2 - 3 4 】。量子点因其易于制备、表面积大、吸附量 高、稳定性好且有较好的生物相容性，能大幅度提高检测过程中信号物质的灵 敏度，量子点标记法逐渐成为一种新兴的标记法。近年来，他们在细胞标记、 生物分子检测、免疫分析和药物筛选方面的的应用日益显著。量子点在光学、 电化学、光电化学方面有广泛应用【3 5 】如图l - 2 所示，近年来也逐渐应用到分析化 学中3 6 - 3 8 1 。_ 一 ，： ， _， 1 4 量子点与d n a 损伤 j - 1， ， 1| 二 1 4 1d n a 损伤的现象及类型 ， 在多种多样的生物体中，基因组保持完整具有极为重要的意义，它是细胞 发挥功能和维持生存的必要条件。d n a 是重要的遗传物质，在机体的生长过程中， 它不可避免地受到各种因素的作用而产生损伤，如许多内源或外源因素电离辐 射( 瓜) 、_ 基因毒性剂、复制叉停止、核酸酶、减数分裂、免疫细胞v ( d ) j 基因重排等，均可引起d n a 损伤，破坏基因组的稳定性，从而直接影响d n a 的 复制、转录和蛋白质的合成，进而影响细胞生长、发育、遗传、代谢和繁殖等 生命基本过程，还会造成细胞突变、癌变、老化甚至死亡。 d n a 损伤的研究引起人们极大的兴趣，目前文献报道的关于d n a 损伤的情 况主要是以下两种：一种是d n a 碱基的氧化，其中鸟瞟呤最容易被氧化主要产 物是8 - o x o - d g ，活性氧基团( r o s ) 是主要的d n a 氧化损伤试剂；第二种是对 d n a 双螺旋结构的破坏。 j ” ，_ 近年来报道的引起d n a 损伤的类型主要有：， ( 1 ) f e n t o n 反应( 3 射，f e 2 + 与过氧化氢作用分解产生羟基自由基，它能够 引起d n a 中的鸟嘌呤的氧化损伤，其他一些重金属离子也可以发生类似的反应。 f e 2 + 与过氧化氢反应为： 一，。 f 毒2 + + h 2 0 2 一f e 3 + + o h + o h 一 删 ，十7 ( 2 ) 氧化苯乙烯( s o ) 研，：它能与d n a 碱基中的鸟嘌呤和腺嘌呤形成 共价加合物，可以阻碍亚甲基蓝在双链d n a 中的嵌插作用。 z h a n g 等人1 4 5 】利用独特的亚甲基蓝( m b ) 的吸附释放重吸附 ( 1 0 a d i n g r e l e a s e r e l o a d i n g ) 模式研究了氧化苯乙烯( s o ) 对层层组装的聚苯乙 烯磺酸钠( p s s ) 聚二甲基二烯丙基氯化铵( p d d a ) d n a 3 多层膜上的损伤 4 某些量子点在d n a 序列检测中的应用及对d n a 损伤的研究 如图1 3 所示，将层层组装修饰的电极先经过与m b 的吸附释放( 1 0 a d i n g r e l e a s e ) 后，分别经过有s o 损伤和无损伤的条件，再在利用m b 的重吸附后，可以从循 环伏安图( c v ) 中可以看出没有经过s o 损伤的电化学信号能很好的恢复，而经 过s o 损失后的电化学信号明显减小即m b 不能重新附着于电极上。 k , n d i n g r 、i b 代k 4 0 r 、l b 图1 3m b 在p s s p d d a d n a 3 层层组装膜上的吸附释放重吸附过程的原理图和c v 响应图： ( a ) p s s p d d a d n a 3 自组装膜； ( b ) m b 的吸附；( c ) 在缓冲液中的c v 扫 描；( d ) m b 在空白液中的释放；( e ) 经过s o 液处理；( f ) 经过没有s o 控制液处理；( g ) 和( h ) m b 的重吸附；( i ) 和( j ) 在缓冲液中的c v 扫描。 f i g 1 - 3s c h e m a t i cd i a g r a mo ft h ep r o c e d u r eo fl o a d i n g r e l e a s e r e l o a d i n go fm b i nt h e p s s p d d a d n a 3l a y e r - b y l a y e rf d m sa n dt h ec o r r e s p o n d i n gc vd e t e c t i o n s ：( a ) a s s e m b l yo f p s s p d d a d n a 3f i l m s ； l o a d i n g o fm b ；( c ) c vs c a n si nb u f f e r s ；( d ) r e l e a s eo fm bi n b l a n kb u f f e r s ；( c ) i n c u b a t i o ni ns os o l u t i o n ； i n c u b a t i o ni nc o n t r o ls o l u t i o nw i t h o u ts o ；( 曲 a n d0 ) r e l o a d i n go fm b ；( i ) a n d ( j ) c vs c a n si nb u f f e m ( 3 ) 毒性离子，如c 一，s n 2 + 和a s 3 + 引起d s d n a 链的断裂 4 6 4 7 1 ，p b 2 + 引起双 链d n a 的氧化损伤如图1 4 所示，g 碱基的氧化产物和a 碱基的氧化产物的峰电 流值在经过p b 2 + 损伤后明显增大，c a 2 + 、n i 2 + 引起d n a 双螺旋结构的构象转换等 4 8 1 0 5 青岛科技人学研究生学位论文 1 3 3v 0 。40 。60 8 1 01 2l 。4 髋| v v s a g a g c i 图1 _ 4 在0 1m o l l 的醋酸缓冲液( p h = 4 5 ) 中d n a 电化学传感器扣除背景的d p v 图。 f i g 1 - 4b a c k g r o u n d - s u b t r a c t e dd pv o l t a m m o g r a m si np h 4 5 0 1m o f la c e t a t eb u f f e rw i t h a m u l t i l a y e rd s d n a - e l e c t r o e h e m i c a lb i o s e n s o r ：p ) b e f o r ea n d a f t e ri n c u b a t i o nd u r i n g1h w i t hp b 2 + u t i l i z i n gp r o c e d u r e1 ，a n d ( - - _ ) a f t e ri n c u b a t i o nd u r i n g4 8hw i t hp b “f o l l o w i n g p r o c e d u r e2 ( 4 ) c u ( i i ) 络合物【4 9 - 5 0 1 ，铜离子在硫醇类、抗坏血酸盐、苯酚化合物等还 原剂存在下被还原，进而与过氧化氢反应产生羟基自由基，它能影响双链d n a 使其断裂，可能的原理如下： c u ( 哪+ e _ c u ( d 2 c u ( i ) + h 2 0 2 一o h * + o h + 2 c u ( i i ) ( 5 ) 纳米二氧化钛【5 1 。5 2 1 ，它在紫外光照的条件下产生r o s ，引起d n a 氧化 损伤。可能的机理如下： 砷d 2 + h v h + + e 一 0 2 + e - _ 0 2 - 2 0 2 * - + 2 h 2 0 _ 0 2 + 2 0 i - i * + 2 0 h - o h + d n a _ d n a o , ( 6 ) 量子点t 5 3 - 5 4 1 ，在紫外光照条件下量子点能够产生自由基和活性氧基团， 能够引起d n a 链的断裂和碱基的损伤。 6 某些量子点在d n a 序列检测中的应用及对d n a 损伤的研究 3 c 2 c l e o 5 6 06 0 06 4 06 8 9 w a v e l e n g t h ( n m ) 图1 5 在f 砒c d s eq d s 处理前后以及紫外光照前后的r u ( b i p y ) 2 ( d p p x ) 2 + d n a 光谱图： ( a ) 1 0 g m lc t d n a + 3 0 x1 0 m o l lr u ( b i p y ) 2 ( d p p x ) 2 + ；( b ) 1 0p g m lc t d n a + 3 6 x 1 0 。7 m o l lc a s eo d s + 3 0 x 1 0 - 6r u ( b i p y ) z ( d p p x ) “；( c ) 1 0i _ t g m lc t d n a 经过紫外光照9 0m i n + 3 0 1 0 _ 6m o l lr u ( b i p y ) 2 ( d p p x ) “； ( d ) 1 0p e d m lc t d n a + 3 6 x 1 0 - 7m o l lc d s eq d s 经过紫 外光照9 0m i n + 3 0 x 1 0 - 6r u ( b i p y h ( d p p x ) 2 + 。 f i g 1 - 5t h ee m i s s i o ns p e c t r ao fr u ( b i p y ) 2 ( d p p x ) 2 + - d n ab e f o r ea n da f t e rt r e a t m e n tw i t h c d s eq d sa n d o ru vi r r a d i a t i o n ( a ) 1 o t t g m lc t d n a + 3 0 x1 旷m o ! lr u ( b i p y ) 2 ( d p p x ) 抖； 1 0 1 x g m lc t d n a + 3 6 x 1 0 7 m o l lc d s eq d s + 3 0 x 1 0 巧r u ( b i p y ) 2 ( d p p x ) “；( c ) 1 0 1 a g m l e t d n ao ft r e a t m e n tw i t h9 0m i nu vi r r a d i a t i o n + 3 0 x 1 0 - 6m o l lr u ( b i p y ) 2 ( d p p x ) 抖；( d ) 1 o l x g m lc t d n a + 3 6 x1 0 1m o l lc a s eq d st r e a t m e n tw i t h9 0m i nu v i r r a d i a t i o n + 3 0 x 1 0 1 r u ( b i p y ) 2 ( d p p x ) z + l i a n 9 1 5 3 j 等人利用r u ( b i p y ) 2 ( d p p x ) 2 + 作光指示剂研究了由c d s e 量子点 ( q d s ) 引起的d n a 损伤，r u ( b i p y ) 2 ( d p p x ) 2 + 在室温水溶液中无荧光信号，但 是在有d 蝴链存在时会有明显的荧光信号。如图1 5 所示，在紫外光照的条件 下c d s e 量子点对d n a 的损伤非常明显，同时对紫外光照时间也进行了考察。他 们还合成一系列指示剂，用于双链d n a 的检测，单碱基错配分析等。 a r i a s 5 4 1 等人从光学角度利用原子显微镜研究了c a s e z n s 双核量子点对 d n a 的光敏损伤。 7 【o。爵一篇们llo#_一，一 青岛科技火学研究生学位论文 ( 7 ) 纳米金1 5 5 】，可在细胞内与蛋白质非特异形结合形成非正常的蛋白质产 物，或者产生r o s yi 起d n a 的损伤。 ( 8 ) 辐射，辐射可引起d n a 的各种损伤，如碱基变化、糖基损伤、单链 断裂( s i n g l e s t r a n db r e a k ，简称s s b ) 和双链断裂( d o u b l e s t r a n db r e a k ，简称d s b ) 以 及d n a 和蛋白质的交联等。紫外辐射可带来活性氧自由基增加，细胞膜损伤及 d n a 损伤，皮肤老化和皮肤癌的发生率增加等一系列危害。紫外线照射可导致 环丁烷嘧啶二聚体( c y c l o b u t a n ep y r i m i d i n ed i m e r s ，c p d ) 和6 4 光产物的形成 【5 6 j ，损害d n a ，甚至有研究显示光产物形成后能在机体表皮细胞中累积3 周以 上【5 7 1 。紫外辐射引起d n a 损伤的根本原因在于其能诱发d n a 同条链内相邻的 嘧啶碱基产生嘧啶二聚体【5 8 】，使d n a 空间结构发生变化，从而阻碍了d n a 复 制、转录进而影响蛋白质的生物功能。 1 4 2 量子点的细胞毒性 量子点作为一个人工合成的纳米材料，有的已被证明对细胞有毒性，如对 一些细胞和d n a 有毒性的镉、硒的量子点等。所以量子点的生物安全问题日益 引起人们的关注1 5 9 l 。量子点细胞毒性的假设也不同，包括自由镉离子从量子点 核壳结构中的释放i 鲫，量子点中自由基的存在和量子点配体的分解【6 1 1 。这些重 要的结论为理解量子点安全问题提供了依据，但是由于生物体系的多样性和复 杂性，量子点细胞毒性的根源仍有待继续研究。量子点潜在的毒性现在已经成 为一个讨论的重要话题1 6 2 1 。 d u b e r t r e t 等人【6 3 】研究了c d s 吖乙i l s 核壳结构的量子点在细胞早期x e n o p u s 胚 晶发展中的作用，他们发现c d s e z n s 核壳结构的量子点在实验相对较低的浓度 时对细胞的生存力、生态学、功能或发育几乎没有影响，但在相对较高的浓度 时c d s e z n s 核壳结构的量子点对胚晶的发育有显著的影响。他们认为这些异常 可能是由于注入c d s e z n s 核壳结构的量子点后细胞渗透平衡的变化引起的。 b h a t i a t j x 组【删研究了c d s e 量子点对肝细胞的细胞毒性，他们发现c d s e 量子 点的细胞毒性是由于c d s e 晶格衰退导致自由c d 2 + 的释放而引起的。 y a m a m o t o 等1 6 4 1 小组研究了若干个表面以羧酸类、多元醇类、胺类修饰的量 子点，以用来表征哺乳动物细胞的细胞毒性，他们认为量子点的细胞毒性是由 于量子点表面覆盖的分子引起的而不是纳米粒子本身。 p a r a k d , 组【6 1 】研究了不同的无机核在细胞毒性的作用，他们发现c d s e 量子点 的聚集和毒性c d 2 + 的从纳米粒子的释放在细胞毒性中起到了很大的作用。 8 、 某些量子点在d n a 序列检测中的应用及对d n a 损伤的研究 1 4 3d n a 损伤的检测方法 检测d n a 损伤的方法主要有高效液相色谱法、酶联免疫法( e u s a ) 、气 相色谱一质谱法、毛细管电泳法以及电化学方法等瞄- 6 6 1 。利用色谱法( 包括 h p l c 、g q 和毛细管电泳法检测d n a 损伤后的具体产物需对实际样品进行复杂 的预处理( 如一般需对样品进行衍生化后才能测量) ，费时很长，而且所需的检测 仪器( 如质谱) 昂贵，而e l i s a 法由于交叉反应的存在，导致检测结果往往不准确， 从而限制了这些方法的实际使用。 d n a 损伤的电化学检测是p a l a c e k 等m 最先提出的一种基于d n a 中鸟嘌 呤和腺嘌呤电化学氧化的检测方法，它具有快速、方便以及所需仪器价廉等优 点，p a l a c e k 等发现吸附在h g 电极上有损伤的d n a 能产生比没有损伤d n a 更大的 伏安峰电流，从而可用于区别出d n a 是否有损伤。其不足之处是所用h g 电极有 毒，而且所需的检测电位较高( 一般在0 1