（分析化学专业论文）新型重组双功能水蛭素结构与功能关系的研究.pdf

摘要复旦大学硕士学位论文 摘要 本文所研究的新型重组双功能水蛭素，由6 6 个氨基酸残基组成，相对分子 量约为7 k d 。样品是通过重组d n a 技术将精氨酸一甘氨酸一天冬氨酸( r g d ) 序 列融合在野生水蛭素的合理部位，经过表达和纯化后得到的高纯度重组水蛭素蛋 白质。经活性实验证明它具有抗凝血酶和抗血小板集聚的双重功能。 测定了重组双功能水蛭素溶液的傅里叶红外光谱，拉曼光谱和圆二色谱，分 析并确定了该蛋白质二级结构组成，通过使用l o r e n t z i a n 曲线对红外光谱的酰胺 i 带进行分峰拟合，以及使用c o n t i n 程序应用峰回归算法分析圆二色谱，得到 蛋白质中各二级结构的相对含量：无规卷曲结构大约为5 3 ，伸展链结构约占 2 6 ，转角结构约占2 1 ，未发现螺旋结构。 在b r u k e rd m x 5 0 0 核磁共振仪上，用t p p i 方法纯吸收模式，测得了重组 双功能水蛭素的2 d1 hc o s y ，t o c s y 和n o e s y 等一系列二维核磁共振谱图。我们 采用顺序识别方法完成了蛋白质质子共振全归属。并且通过对重组水蛭素主链 a h 化学位移，n o e 约束，j 耦合常数的分析，详细解析了重组双功能水蛭素的 二级结构特征，发现重组双功能水蛭素的n 端由两个反平行b 折叠( 残基1 4 1 6 和残基2 1 - - 2 3 ，残基2 6 。3 l 和残基3 6 4 1 ) ，一个半转角( 残基5 8 ) ，一个i i 型转角( 残基8 1 1 ) ，两个紧绷的转角( 残基1 7 2 0 和残基2 3 2 6 ) ，以及一个 连接b 折叠股片i i ；和i i 的1 1 型转角( 残基3 2 - 2 5 ) ，通过三个二硫键( c y s 6 - c y s l 4 、 c y s l 6 c y s 2 8 和c y s 2 2 c y s 3 9 ) 紧密地结合成一个结构域，可以与凝血酶催化位 点紧密结合；c 端形成了无规卷曲结构，能够与凝血酶的纤维蛋白原识别位点相 互作用；而r g d 序列( 残基3 2 3 4 ) 位于反平行d 折叠( 残基2 6 3 1 和残基3 6 4 1 ) 形成的长臂末端，并与第3 5 位残基构成了一个b 转角。重组水蛭素的这种结构 特征使得它既能强而专一地与凝血酶相互作用，又能与血小板膜表面糖蛋白 i i b i i i a 相结合，从而起到抗凝血酶和抗血小板集聚的双重功能。 本论文从蛋白质分子结构层次上解析了新型水蛭素所具有的双功能特性的 根本原因，研究了其结构与功能之间的相互关系，为进一步进行分子设计，改良 新药提供了理论依据。 关键词：重组双功能水蛭素：结构与功能；傅里叶红外光谱；拉曼光谱：圆二色 谱：2 d1 hn m r 。 第l i i 页 复旦大学硕士学位论文 a b s t r a c t t h en e wt y p er e c o m b i n a n tr g d h i r u d i ns t u d i e di nt h i s p a l ) e rc o n s i s t so f6 6 a m i d ea c i dr e s i d u e sw i t h 一7 k d am o l e c u l a rw e i g h t e m p l o y i n gr e c o m b i n a n td n a t e c h n i q u e ，i t sc o n s t r u c t e db yi n t r o d u c i n gt h ea r g g l y - a s p ( r g d ) s e q u e n c et ot h e p r o p e rs i t eo fw i l d t y p eh i r u d i n t h e nh i g hp u r i f i e dr e c o m b i n a n tr g d h i r u d i nw a s o b t a i n e db ye x p r e s s i o na n dp u r i f i c a t i o n 1 th a sb e e np r o v e dt h a tt h er e c o m b i n a n t r g d h i r u d i nh a sd u a lf u n c t i o n so fa n t i - t h r o m b i na n da n t i - p l a t e l e ta g g r e g a t i o nb y a c t i v ea s s a y s t h es e c o n d a r ys t r u c t u r eo fr e c o m b i n a n tr g d h i r u d i nh a sb e e ns t u d i e db yt h e f o u r i e rt r a n s f o r m e di n f r a r e ds p e c t r a ( f t - i r ) r a m a ns p e c t r aa n dc i r c u l a rd i c h r o i s m s p e c t r af c d l t h ed i s t r i b u t i o no fv a r i o u sk i n d so fs e c o n d a r ys t r u c t u r eh a sb e e n d e t e r m i n e db yu s i n gl o r e n t z i a nc u r v e f i t t i n gp r o c e d u r e si nt h ea m i d eib a n do fi t si r s p e c t r u ma n du s i n gt h er i d g er e g r e s s i o np r o c e d u r ep r o g r a mc o n t i nf o ra n a l y z i n gc d d a t a t h er e s u l t ss h o wt h a tr e c o m b i n a n tr g d h i r u d i nc o n t a i n sa b o u t2 6 e x t e n d e d c h a i n 2l 1 3 - t u ma n d5 3 u n o r d e r e ds t r u c t u r e 1 c a v i n gn oc 【h e l i x t h e s p e c t r a o fr e c o m b i n a n tr g d - h i r u d i nh a v eb e e nr e c o r d e do nb r u k e r d m x 5 0 0s p e c t r o m e t r yi nt h ep u r ep h a s ea b s o r p t i o nm o d ew i t ht p p ib v2 dn m r m e t h o d ss u c ha sc o s y ，t o c s ya n dn o e s y t h ep r o t o nr e s o n a n c e sw e r ea s s i g n e d t o s p e c i f i ca m i n o a c i d si nt h es e q u e n c e u s i n gs t a n d a r ds e q u e n t i a la s s i g n m e n t p r o c e d u r e s t h es e c o n d a r ys t r u c t u r eo fr e c o m b i n a n tr g d h i r u d i nh a sb e e nd e d u c e d f r o mc h e m i c a ls h i f ti n d i c e s ，s e q u e n t i a ln o e sa n d j h n qc o u p l i n gc o n s t a n t s w ef o u n d t h a tt h en t e r m i n u sc o n s i s t so ft w oa n t i - p a r a l l e l1 3s t r a n d s ( r e s i d u e s2 6 31a n d3 6 41 r e s i d u e s2 6 - 3la n d3 6 - 4 1 ) ，o n et y p i c a lh a l ft u m ( r e s i d u e s5 - 8 ) ，o n et y p ei it u r n ( r e s i d u e s8 - 1 1 ) ，t w ot i g h tt u r n s ( r e s i d u e s1 7 2 0a n dr e s i d u e s2 3 2 6 ) ，a n dat y p ei t u r n ( r e s i d u e s3 2 3 5 ) w h i c hc o n n e c t s 3 - s h e e ts t r a n d si ia n di i t h r e ed i s u l n d e b r i d g e s ( c y s 6 一c y s l 4 ，c y s l 6 一c y s 2 8a n dc y s 2 2 一c y s 3 9 ) i nr e c o m b i n a n tr g d h i r u d i n m a k ei tat i g h tg l o b u l a rd o m a i nw h i c hc a nb i n dt i g h t l yt ot h ea c t i v es i t eo ft h r o m b i n ； c t e r m i n u sf o r m sar a n d o mc o i ls t r u c t u r ew h i c hm a k e si n t e r a c t i o n sw i t ht h e f i b r i n o g e nr e c o g n i t i o ne x o s i t e ( f r e ) o f t h r o m b i n ；a n dt h er g db i n d i n gm o t i f o f t h i s p r o t e i ni s1 0 c a t e da tt h ee n do f al o n ga r mw h i c hc o n s i s t so f t w oa n t i p a r a l l e lbs t r a n d s ( r e s i d u e s2 6 3la n d3 6 4 1 ) ，r g ds e q u e n c ea n dt h er e s i d u e3 5f o r r aabt u r n s u c ha c h a r a c t e r i z e ds t r u c t u r eo fr e c o m b i n a n tr g d h i r u d i nm a k e si tn o to n l yb i n ds t r o n g l y a n ds p e c i f i c a l l yt ot h r o m b i nb u ta l s om a k e si n t e r a c t i o n sw i mt h eg l y c o p r o t e i nl i b i l i a o np l a t e l e t s t h u st h er e c o m b i n a n tr g d h i r u d i nh a sd u a lf u n c t i o n so fa n t i t h r o m b i n a n d a n t i - p l a t e l e ta g g r e g a t i o n i nm i sp a 口e r lt h er e l a t i o n s h i pb e t w e e ns t r u c t u r ea n df u n c t i o no ft h en e wt y p e r e c o m b i n a n tr g d h i r u d i nh a sb e e ns t u d i e da tt h el e v e lo f p r o t e i nm o l e c u l a rs t r u c t u r e t or e v e a lt h em e c h a n i s mo fi t sa n t i t h r o m b i na n da n t i p l a t e l e ta g g r e g a t i o nd u n l f u n c t i o n s i tc a np r o v i d et h e o r e t i c a li n f o r m a t i o nf o rf l l r t h e rm o l e c u l a rd e s i g nt o d e v e l o pn e wd r u g s k e y w o r d s ：r e c o m b i n a n tr g d h i r u d i n ；s t r u c t u r ea n df u n c t i o n ；f t - i r ：r a m a n ；c d ： 2 d1 hn m r 第1 v 页 第一章绪论 复旦大学硕士学位论文 第一章绪论 1 9 5 3 年4 月2 5 日，英国的n a t u r e 杂志上刊登了美国的w a t s o n 和英国的 c r i c k 合作研究的结果d n a 分子的双螺旋结构模型 1 ，这两位科学家也因此 获得了诺贝尔奖。从此，对生物大分子结构与功能的研究，成为分子生物学研究 领域的一个热f 课题，它有助于在分子水平上了解复杂的生命现象。2 0 0 1 年2 月1 2 日，中、美、日、德、法、英等六国科学家和美国塞莱拉公司联合公布了 人类基因组图谱及初步分析结果，这也宣告了“后基因组时代”的到来。“后 基因组时代”，最重要的工作就是弄清基因的全部蛋白质产物的结构与功能。一 种生物体的基因组规定了所有构成该生物体的蛋白质，基因规定了组成蛋白质的 氨基酸序列。虽然蛋白质由氨基酸的线性序列组成，但是，它们只有折叠成特定 的空间结构才能具有相应的活性和生物学功能。确定蛋白质的结构对于生物学研 究是非常重要的。研究蛋白质结构，有助于了解蛋白质的作用，了解蛋白质如何 行使其生物功能，认识蛋白质与蛋白质或蛋白质与其它分子之间的相互作用，这 无论是对于生物学还是对于医学和药学，都是非常重要的。多维核磁共振方法研 究蛋白质的溶液结构的工作开始于上世纪八十年代初。2 0 多年来，它发展迅速， 提供了几千个蛋白质或蛋白质复合体的三维结构信息，特别是对那些难以结晶的 生物大分子，在溶液结构的研究上获得了许多重大的突破，成为近年来研究蛋白 质结构与功能关系的强有力的手段之一。 1 1 水蛭素简介 野生型水蛭素( h i r u d i n ) 是一种由6 5 个氨基酸残基组成的抗凝血酶蛋白质。 它最初是由药用水蛭的分泌腺中分离得到的。水蛭素蛋白质能够直接与凝血酶活 性位点相互作用，充当c 【凝血酶的专一抑制剂，其阻聚常数( k 。) 可达1 0 4 1 1 0 “4 m o l - l 。1 2 。它是迄今为止所发现的最强的凝血酶天然特异抑制剂。强而专 一的与q 凝血酶亲和，低抗原性和从血液中快速的清除性，使得水蛭素在医疗应 用中非常具有吸引力，并且成为最早应用到临床的一种直接凝血酶抑制剂 ( d t i ) 。早期常用的肝素( h e p a r i n ) 和低分子肝素( l m w h ) 等抑制剂药物，属于 间接凝血酶抑制剂，它们是通过激活或加速血液内的抗凝血机制而产生作用的。 动物试验与临床研究表明，水蛭素无毒性，又无明显抗原性，在合理剂量内，没 嚣i 更 第一章绪论复旦犬学硕士学位论文 有引起出血的危险，可用于抗凝抗栓，治疗不稳定性心绞痛，急性心肌梗塞，血 管成形术后血栓形成，血液透析，体外循环，弥散性血管内凝血等等疾病，它的 效果明显优于肝素等抗凝血剂，而又无肝素诱导的血小板减小症和血栓复形成、 肾衰等后遗症 3 】。如表1 1 所示，水蛭素比肝素，低分子肝素更具有医药价值。 因此，近十年来，国内外普遍应用d n a 重组技术来研究和发展水蛭素类抗凝血 酶新药，其具有很大的社会效益和经济效益。 d n a 重组技术是指将不同的d n a 片段( 如基因等) 按人们的设计方案定向连 接起来，并在特定的受体细胞中，与载体一起得到复制与表达，从而使受体细胞 获得新的遗传特性。应用d n a 重组技术，不仅可以获得新型的水蛭素，而且可以 使水蛭素的产量得到非常大的提高。通常，从每个水蛭的头部大约只能分离出 2 0u g 水蛭素，而将水蛭素的d n a 片段在大肠杆菌、酵母菌等载体中表达后，每 升培养液就可以获得0 2 1 5 9 的重组水蛭素蛋白质。因此，自从1 9 8 6 年重组 水蛭素 4 问世以来，国内外一些机构竞相研究开发新型重组水蛭素。例如1 9 9 7 年德国h o e c h s tm a r i o nr s s l 公司开发的重组水蛭素r e f l u d a n ( l e p i r u d i n ) 在 欧洲获准上市，1 9 9 8 年5 月获得美国食品及药物管理局( f d a ) 批准，它主要用 于肝素诱导的血小板减少性疾病病人的抗凝治疗，以预防进一步发生的血小板减 少性并发症：1 9 9 7 年，瑞士a v e n t i sp h a r m s 公司开发的重组水蛭素i p r e v a s k 回 ( d e s i r u d i n ) 在欧洲上市，用于手术时预防深部静脉血栓的形成；美国t h e m e d i c i n e s 公司的一种类水蛭素多肽a n g i o m a x ( b i v a l i r u d i n ) 也于2 0 0 0 年1 2 月 获得美国f d a 许可用于接受冠脉血管修补术的不稳定性心绞痛病人。国内，早在 t 9 9 1 年，申同健等人用人工合成的水蛭素h v 2 基因，在酵母c 因子表达系统中成 功地表达，纯化后得到了h p l c 纯的水蛭素，其n 一端氨基酸序列与野生型水蛭素 完全相同，并具有强烈的抗凝活性 5 。而后罗春贞和顾银良等人，以及咎云红 等人，分别在大肠杆菌 6 ，哺乳类细胞中 7 和酵母菌 8 中，成功地表达了重 组水蛭素。最近，中国药科大学的吴梧桐等人采用新的p c r 定点诱变技术合成水 蛭素h v 3 基因，对水蛭素分子指状结构的尖端进行了r g d s 序列移植替换，他们 应用大肠杆菌表达系统获得重组水蛭素蛋白质后，对其抗凝、抗血栓作用，及构 效关系进行了一系列研究 9 。 第2 页 第一章绪沦 复旦大学硕士学位论文 表1 1 抗凝血酶药物肝素，低分子肝素和水蛭素基本特性比较。 抗凝血酶药物肝素低分子肝素重组水蛭素 机理与抗凝血酶i i i 结合抑制x a 因子的活性与凝血酶直接结合 能否使结合凝不能，只能灭活流动不能，只能灭活流动结合凝血酶及流动 血酶失活相凝血酶相凝血酶相凝血酶均能灭活 能否抑制纤维 不能不能能 蛋白降解产物 是否会引起血 小板减少 会有可能不会 实验室监测要求高要求高要求低 是否与血浆蛋 # 结合，不结合， 白结合 抗凝效果难预测抗凝效果难预测抗凝效果可预测 对于水蛭的药效研究，很早就开始了。水蛭是我国传统中药，一千八百年前 神农本草经中就有记载，后在本草纲目和中国动物药等专著中均有 收载。中医认为它有破血、逐瘀、通经的疗效，主要用于治疗瘤症、痞块、血 瘀、闭经和跌打损伤。1 8 8 4 年，h a y c r a f i 发现水蛭提取物有抗凝血作用。事实上， 从水蛭及其唾液腺中可以提取出多种活性成分，水蛭素蛋白质是其中活性最显著 并且研究得最多的一种成分。真正对于水蛭素蛋白质的研究是1 9 5 5 年m a r k w a r d 从水蛭头部唾液腺中分离出水蛭素纯品后 1 0 才开始的。此后，鉴于它潜在的药 用价值，国内外开始对其组成结构和理化性质进行了一系列的研究。2 0 世纪6 0 年代，进一步发展了野生型水蛭素的分离和纯化技术，分析得知野生型水蛭素是 由6 5 个氨基酸残基组成，分子量约为7 k d a 。1 9 7 6 年，b a g d y 等人确定了水蛭素变 体i ( h v - i ) 的肽链组成和一级结构【1 1 】，但是它的完整的初级结构是由d o d t 等人 于1 9 8 4 年证实的【2 。由于水蛭素的单品难以得到，因而对其三级结构的研究是 在多维核磁共振用于生物大分子结构测定的技术发展起来以后才开始的。在1 9 8 7 年c l o r e 等人测定了水蛭素的2 d1 hn m r 谱图，并对谱图进行了归属，研究了其 二级结构组成 1 2 】。1 9 8 9 年，c o r e 等人发表了用核磁共振测定的野生型水蛭素和 l y s 4 7 - - g l u 突变体重组水蛭素的溶液三级结构 1 3 ，并因此在蛋白质数据库 ( p d b ) 中，水蛭素成为了用核磁共振测定完整结构的第四个蛋白质。1 9 8 9 年， w f i t h r i c h 等人也用核磁共振方法对脱硫重组水蛭素的溶液结构进行了测定，分析 第3 页 第一章绪论复旦大学硕士学位论文 了该重组水蛭素活性比野生型水蛭素差的原因 1 4 】。1 9 9 0 年g r u t t e r 等人用x 射线 单晶衍射研究了水蛭素一凝血酶共晶的晶体结构，阐明了两者间的相互作用关系 1 5 。1 9 9 7 年，t a t 6 等人用n m r 测定了水蛭素变体h m 2 的溶液结构，并用分子动 态模拟的方法研究了蛋白质的分子动态结构 1 6 1 。这些研究表明水蛭素的n 端有3 个二硫键，使n 端肽链绕迭成密集形核心环肽结构，减少任何一个二硫键都会造 成其与凝血酶亲和力的急剧下降：水蛭素的c 端富含酸性氨基酸残基，游离在分 子表面：肽链中部还有一个由脯氨酸一赖氨酸4 7 一脯氨酸( p r o l y s 4 7 p r o ) 组 成的特殊序列，不被般蛋白酶所降解。水蛭素是一种非常强的凝血酶特异性抑 制剂，带负电的c 端结合在凝血酶的带正电的纤维蛋白原识别位点，最小保持抗 凝活性的片段为酸性c 端的l o 个肽段。n 端密集形核心环肽链段则同凝血酶催化 位点结合，抑制凝血酶的催化作用。改变第5 6 、5 7 、5 9 、6 0 年1 1 6 4 中的任一位置 的氨基酸能够改变分子的结合能力，其中苯丙氨酸5 6 是抗凝血酶活性的关键所 在。野生型水蛭素与凝血酶分子结合比例为1 ：1 ，解离常数k = 2 3 1 0 “4 m o l l ， 故复合物非常稳定，不仅使凝血酶难以分解纤维蛋白原，同时不诱导血小板发生 反应，也使凝血酶的刺激成纤维细胞增生和平滑肌细胞收缩等作用受抑制，从而 达到良好的抗凝效果 3 。 1 2 用于蛋白质结构分析的技术介绍 对于蛋白质结构的研究是探讨结构与功能关系的前提。目前低分辨率分析蛋 白质结构的主要方法有：紫p b 可见吸收光谱、荧光光谱、圆二色谱( c d ) 、傅 里叶红外光谱( f t _ i r ) 、拉曼光谱( r a r a a n ) 、小角x 射线散射、原子力显微镜 和顺磁共振等；高分辨率的分析方法主要是x 一射线单晶衍射、中子衍射和核磁 共振。 紫# b 可见吸收光谱和荧光光谱对于蛋白质分子中芳香环侧链的极性环境较 为敏感，因此可以用来研究酪氨酸( t y r ) 和色氨酸( t r p ) 在不同蛋白质中不同 的结构。通过分析荧光能量转移情况，即测量荧光寿命，还可以测定荧光基团之 间的距离。圆二色谱是利用蛋白质分子对于左右圆偏振光吸光率的不同，测定圆 二色性曲线来判断蛋白质主链的结构。傅里叶红外光谱和拉曼光谱属于振动光谱 范畴，主要通过分析谱图中体现羰基伸缩振动的酰胺i 区( 1 6 0 0 1 7 0 0c i n 。) ，体 第4 页 第一章绪论复且大学硕十学位论文 现肽键振动模式的酰胺i i i 区( 1 2 0 0 1 4 0 0c m 1 ) 和对应于肽键伸缩振动的酰胺i i 区( 1 5 0 0 1 6 0 0c m 4 ) 来解析蛋白质的结构。小角x 射线散射能够测定蛋白质晶 体分子的大小和形状。原子力显微镜可以捕获蛋白质分子的图像，目前该方法的 有效分辨率一般为2 0 a 。如果将蛋白质分子用稳定的氮氧自由基进行自旋标记， 那么可以用顺磁共振技术获得分子的活动性和两个自旋标记基团之间的距离。从 以上这些方法的特点中可以看到，傅里叶红外光谱、拉曼光谱和圆二色谱比较适 用于对蛋白质分子二级结构的整体的研究。 当今，能够在原子水平上全面描述大分子结构的主要技术是x 一射线单晶衍 射技术、中予衍射( 晶体样品) 和核磁共振波谱技术( 溶液样品) 。x 一射线单晶 衍射技术利用波长非常短的x 一射线照射晶体样品，通过分析衍射图案来得到蛋 白质晶体结构。中子衍射与x 一射线衍射相类似，所不同的是照射源是中子，因 此中子衍射法要求样品具有较大的晶体。在2 0 世纪6 0 年代初，剑桥大学的 p e r u t z 和k e n d r e w 成功地第一次用x 一射线单晶衍射技术测定了肌红蛋白和血 红蛋白的结构 1 7 ，1 8 。x 一射线单晶衍射和中子衍射技术首要限制因素在于其 所研究的对象必须是晶体。而与结晶学不同，n m r 的测定允许样品处于溶液状态 中，因而可以测定蛋白质在接近生理条件下的结构。用多维核磁共振方法研究蛋 白质的溶液结构的工作开始于2 0 世纪8 0 年代初。在1 9 8 2 年，w u t h r i c h 等人在 j o u r n a lo fm o l e c u l a rb i o l o g y1 5 5 卷上连续发表了四篇文章，确立了同核2 dn m r 研究蛋白质的溶液结构的标准方法。k u r tw t l t h r i c h 由于在这方面做出的杰出贡 献而获得了2 0 0 2 年诺贝尔化学奖。这种标准方法是选择生物大分子中的质子( 氢 原子核) 作为测量对象，连续测定所有相邻的两个质子之间的距离和方位，这些 数据经计算机处理后就可形成生物大分子的三维结构图。这种原理也可以用测绘 房屋的结构来比喻：即首先选定一座房屋的所有拐角作为测量对象，然后测量所 有相邻拐角间的距离和方位，根据这些数据就可以推知房屋的结构。 1 9 8 5 年， 出现了第一个用w u t h r i c h 方法测定的蛋白质三维结构 1 9 。目前，在所有已知 的成千上万的蛋白质结构中的1 5 2 0 是用n m r 测定的。用n m r 方法确定蛋白 质空间结构具有其独特的优点 2 0 ：( 1 ) 可以不破坏蛋白质的结构( 包括空间结 构) ，在接近生理状态下对样品进行探测；( 2 ) 能够用来研究蛋白质在溶液中的 空间结构与功能的关系；( 3 ) 能够用来研究生物样品中的动态行为；( 4 ) 和其他 第5 页 第一章绪论复旦大学硕士学位论文 光谱方法相比，核磁共振具有可观察个别基团行为的特点。目前常规的二维、三 维核磁共振方法一般可以测定分子量在2 5k d a 以下的蛋白质。随着核磁共振仪 器磁场强度的不断提高，8 0 0 m h z 和9 0 0 m h z 等高场核磁共振仪的相继出现，以 及遗传工程技术和计算机技术的迅速发展，n 叭r 测定蛋白质样品的分子量范围越 来越大，到目前为止，用n m r 测定的最大分子量的蛋白质是9 0 0 k 1 ) a 的分子伴侣 ( g r o e l ) 一辅助分子伴侣( g r o e s ) 复合物 21 。 1 3 论文的理论意义与实际意义 重组双功能水蛭素以其出色的抗凝血酶和抗血小板聚集的活性，被用来作为 治疗血栓性疾病如心绞痛、心肌梗塞等的新药。血栓性疾病是危及心脑血管的大 病，全球每年脑血栓、脑梗塞、心肌梗塞、冠心病、动脉硬化等心脑血管疾病夺 走1 2 0 0 万人的生命，接近世界总死亡人数的1 4 ，成为人类健康的头号大敌。我 国每年死于心脑血管疾病的人数达到2 6 0 万人以上。因此水蛭素作为优秀的抗凝 血酶药物，其临床应用前景非常可观。 本论文所研究的对象是通过d n a 重组技术在野生型水蛭素的基础上将第3 2 - - 3 4 位残基改变为精氨酸一甘氨酸一天冬氨酸( r g d ) 序列的新型重组双功能水 蛭素( r r g d h i r u d n ) 。同时它在c 端残基上也有改进，使其与凝血酶的作用得 到进一步加强 2 2 。从而重组水蛭素蛋白质不仅具有抗血小板聚集的新功能，而 且其抗凝血酶的活性也有所提高，治疗效果比野生型水蛭素提高了2 3 倍，具 有非常良好的临床药用应用价值 2 3 。 我们通过光谱学方法和多维核磁共振方法对于由d n a 重组技术得到的新型 重组双功能水蛭素溶液结构进行测定和分析，用以研究它的结构与功能之间的相 互关系，从而得到该蛋白质能够起到抗凝血酶和抗血小板聚集双重功效的结构信 息。通过分析蛋白质的结构，我们可以确认功能单位或者结构域，为遗传操作提 供目标，为设计新的蛋白质或改造已有蛋白质提供可靠的依据，同时为新的药物 分子设计提供合理的靶分子结构，进一步设计出分子量更小，适于口服，皮下注 射等特殊制剂的更好的重组水蛭素。 本论文用n m r 方法研究新型重组双功能水蛭素的结构意义在于：探索用n m r 研究溶液中重组双功能水蛭素结构的最佳实验条件：研究新型重组水蛭素在溶液 第6 页 第一章绪论复旦大学硕士学位论文 中的结构；比较新型重组双功能水蛭素与野生型水蛭素的不同，并且从结构角度 探讨重组水蛭素能够起到抗凝血酶和抗血小板聚集双重功效的机理：提供进一步 改进水蛭素药效的理论依据。 参考文献 1 w a t s o n ，j d ，c r i c k ，fh c ，as t r u c t u r ef o rd e o x y r i b o s cn u c l e i ca c i d n a t u r e ，1 9 5 3 1 7 1 ： 7 3 7 2 d o d t ，j ，m u l l e r , he ，s e e m u l l e r , u a n dc h a n g ，jy ，t h ec o m p l e t ea m i n oa c i ds e q u e n c eo f h i r u d i n ，at h r o m b i n s p e c i f i ci n h i b i t o r f e b s l e t t ，1 9 8 4 1 6 5 ：1 8 0 - 1 8 4 3 s o h n ，j h ，k a n g ，h a ，r a o ，kj ，k i m ，c h ，c h o i ，e s ，c h u n g ，bh a n dr h e e ，s k ， c u r r e n ts t a t u so ft h ea n t i c o a g u l a n th r u d i n ：i t sb i o t e c h n o l o g i e a lp r o d u c t i o na n dc l m i c a l p r a c t i c e a p p l m i c r o b i o lb i o t e c h n o l ，2 0 0 i 5 7 ：6 0 6 6 1 3 4 b e r g m a n n ，c ，d o d t ，j ，k o h l e r , s ，f i n k ，e a n dg a s s e n ，hg ，c h e m i c a ls y n t h e s i sa n d e x p r e s s i o no f ag e n ec o d i n gf o rh i r u d i n ，t h et h r o m b i n - s p e c i f i ci n h i b i t o rf r o mt h el e e c hh i r u d o m e d i c i n a l i s b i o lc h e m 1 9 8 63 6 7 ：7 3 1 7 4 0 5申同健，葛庆远，韩玉珉，人工合成的水蛭素基因在酵母中的表达驴厚群学日辑1 9 9 8 ：8 1 8 8 2 3 6罗春贞，顾银良，宋后燕，水蛭素新生物基因的克隆及其在大肠杆菌中的表达上晦俘 私尤学笋掘1 9 9 62 3 ( 3 ) ：18 1 - 1 8 4 7 顾银良，罗春贞李凌，张艳玲，宋后燕，水蛭索衍生物基因的克隆及其在哺乳类细胞 中的表达上游厦群力学蝴：1 9 9 62 3 ( 3 ) ：1 8 5 1 8 8 咎云红，孙茂盛，郭仁，代长柏，水蛭素变异体基因的合成及其在酵母中表达的初步研 究手厚医学群学院钧髭1 9 9 82 0 ( 5 ) ：3 6 1 3 6 6 9李香玉、谭树华、吴梧桐、袁冬萍，水蛭素i i i 突变体h v 3 ( r g d ) i 拘构建及其抗血小板聚 1 0 1 1 集活性初步研究手厚芫辅药魏2 0 0 3l ( 3 ) ：1 6 9 1 7 2 m a r k w a r d t ，f ，u n t e r s u c h u n g e nu b e rh i r u d i n n a t u r w i s s e n s c h 妒g n ，1 9 5 5 4 2 ：5 3 7 5 3 8 b a g d y , d ，b a r a b a s ，e ，g r a f , l ，p e t e r s e n ，t e ，a n dm a g n u s s o n ，s ，h i r u d i n m e t h o d s e n z y m o l , 1 9 7 64 5 ：6 6 9 - 6 7 8 2 s u k u m a r a n ，d k ，c l o r e ，gm ，p r e u s s ，a ，z a r b o c k ，j a n dg r o n e n b o m ，a m ，p r o t o n n u c l e a rm a g n e t i cr e s o n a n c es t u d yo fh k u d m ：r e s o n a n c ea s s i g n m e n ta n ds e c o n d a r y 第7 页 第一章绪论复旦大学硕士学位论文 s t r u c t u r eb i o c h e m i s t r y , 1 9 8 72 6 ( 2 ) ：3 3 3 - 3 3 8 1 3 f o l k e r s ，p j ，c l o r e ，g m ，d r i s c o l l ，p c ，d o d t ，j ，s t e f a n i ek o h l e r , s ，a n dg r o n e n b o r n ，a m ， s o l u t i o ns t r u c t u r eo f r e c o m b i n a n t h i m d i na n d t h e l y s 一4 7 - g l u m u t a n t ：a n u c l e a r m a g n e t i c r e s o n a n c ea n d h y b r i dd i s t a n c eg e o m e t r y d y n a m i c a l s i m u l a t e d a n n e a l i n gs t u d y b i o c h e m i s t r y , 1 9 8 9 2 8 ：2 6 0 1 - 2 6 1 7 1 4 h a r u y a m a ，h ，w i l t h r i c h ，k ，c o n f o r m a t i o no fr e c o m b i n a n td e s u l f a t o h k u d i n i n a q u e o u s s o l u t i o nd e t e r m i n e db yn u c l e a rm a g n e t i cr e s o n a n c e b i o c h e m i s t r y , 1 9 8 9 2 8 ( 1 0 ) ：4 3 0 1 - 4 3 1 2 1 5 g r u t t e r , m g ，p r i e s f l e ，jr ，r a h u e l ，j ，g r o s s e n b a c h e r , h ，b o d e ，w ，h o f s t e e n g e ，j a n ds t o n e ， s r c r y s t a l s t r u c t u r eo ft h et h r o m b i n h i m d i nc o m p l e x ：an o v e lm o d eo fs e r i n ep r o t e a s e i n h i b i t i o n t h ee m b o j o u r n a l 1 9 9 09 ：2 3 6 1 2 3 6 5 n i c a s t r o ，g ，b a n m e r , l ，b o l l s ，ga n dt a r o ，m ，n m rs o l u t i o ns t r u c t u r eo fan o v e lh i r u d i n v a r i a n th m 2 ，n t e r m i n a l1 - 4 7a n dn 6 4v + gm u t a n t b i o p o l y m e r s ，1 9 9 74 1 ( 7 ) ：7 31 - 4 9 7 b o l t o n ，w ，p e r u t z ，m f ，t h r e ed i m e n s i o n a lf o u r i e rs y n t h e s i so fh o r s ed e o x y h a e m o g l o b i na t 2 8a n g s t r o mu n i t sr e s o l u t i o n n a t u r e ，1 9 7 02 2 8 ：5 5 1 - 5 5 2 18 w a t s o n ，h c ，t h es t e r e o c h e m i s t r yo ft h ep r o t e i nm y o g l o b i np r o g s t e r e o c h e m , 1 9 6 9 4 2 9 9 3 3 3 w i l l i a m s o n ，m p ，h a v e l ，t f a n dw f i t h r i c h ，k ，s o l u t i o nc o n f o r m a t i o no f p r o t e i n a s e i n h i b i t o r i i af r o mb u l is e m i n a lp l a s m ab y1hn u c l e a rm a g n e t i cr e s o n a n c ea n dd i s t a n c e g e o m e t r y m 0 1 b i o l ，1 9 8 5 1 8 2 ：2 9 5 31 5 2 0 夏佑林，吴季辉，刘琴，施蕴渝，生物大分子多维核磁共振1 9 9 9 ，合肥：中国科学技术 大学出版社 f i a u x ，j ，b e r t e l s e n ，eb ，h o r w i c h ，al a n dw u t h r i c h ，k ，n m ra n a l y s i so fa9 0 0 k g r o e l g r o e sc o m p l e x n a t u r e , 2 0 0 2 4 1 8 ：2 0 7 - 21 1 2 2 莫炜张艳玲，王龙生，杨新英宋后燕，重组双功能水蛭素的发酵、纯化和鉴定生 物i 程学报，2 0 0 4 2 0 ：1 2 6 1 2 9 2 3卢伟锋符伟国，莫炜，郭大乔，王玉琦宋后燕，重组双功能水蛭素的抗凝防栓作用 中华实验舒科杂志，2 0 0 4 2 1 0 ) ：8 0 9 - 8 1 1 第8 页 第二章应用振动光潜和圆二色谱研究新型重组双功能水蛭素的溶液结构 复旦大学硕士学位论文 第二章应用振动光谱和圆二色谱研究新型重组双功能水蛭素的溶液结构 2 1 引言 目前应用于蛋白质结构研究的光谱学方法主要有：紫外可见吸收光谱，荧 光光谱，傅罩叶红外光谱( f t - l r ) ，拉曼光谱( r a m a n ) 和圆二色谱( c d ) 。如 绪论所述，其中紫p h i 可见吸收光谱和荧光光谱仅能研究部分基团的结构情况。 目前傅里叶红外光谱，拉曼光谱和圆二色谱已广泛应用于蛋白质二级结构