（外科学专业论文）mmp2、mmp9在食管癌中表达的研究.pdf

f | i l f i f i f | l i f f l 川川i f i i j i 帅l j i i f f 1 0 y 18 0 6 2 0 3 m m p 2 、m m p 一9 在食管癌中表达的研究 研究生：武志 专业：外科学 导师：高松 教授 中文摘要 背景 食管癌是临床上最常见的消化系统恶性肿瘤之一，发病率高，预后差， 食管癌的浸润和转移是临床治疗中的两大难题之一，癌细胞的浸润和转移是 造成临床治疗失败和病人死亡的主要原因。因此，深入了解食管癌的发生、 发展、浸润和转移的细胞机制和分子机理尤为重要。随着对其发病机制的深 入研究，越来越多的因子如：基质金属蛋白酶2 ( m a t r i xm e t a l l op r o t e i n a s e 2 ， m m p 一2 ) 及基质金属蛋白酶一9 ( m a t r i xm e t a l l op r o t e i n a s e 一9 ，m m p 一9 ) 等被 证实与食管癌的发生、发展、浸润和转移密切相关，深入研究这些基因的作 用机制以及他们与临床诊断、预后的关系，可为临床诊断和治疗提供重要依 据。 目的 本文旨在通过检测基质金属蛋白酶2 ( m a t r i x m e t a l l o p r o t e i n a s e 2 ， m m p 一2 ) 和基质金属蛋白酶- 9 ( m a t r i x - m e t a i l o p r o t e i n a s e 一9 ，m m p 一9 ) 在食管癌患 者血清中的含量，探讨它们与食管癌的发生、发展、浸润和转移的相关性。 方法 取食管癌患者血清6 0 例，全部患者取血前未经任何治疗，并取正常1 0 例作为对照( 非肿瘤患者) 。每例应用酶联免疫吸附法( e n z y m el i n k e d i m m u n o s o r b e n ta s s a y ，e l i s a ) 检测血清中m m p 2 、m m p 9 的含量。肿瘤术后按 病理结果进行t n m 分期，采用s p s s l2 0 软件包进行统计学处理，比较各组 差异有无统计学意义。 结果 1 食管癌患者血清中基质金属蛋白酶一2 的含量( 121 6 6n g m 1 ) 显著高 于正常者血清中基质金属蛋白酶- 2 的含量( 6 1 3 1n g m 1 ) p o 0 5 ) ， 而与有无淋巴结转移及t n m 分期有关( p o 0 5 ) 。 t 2 食管癌中基质金属蛋白酶- 9 的表达( 16 9 7 3n g m 1 ) 显著高于正常者 血清中基质金属蛋白酶一9 的含量( 8 7 6 7n g m 1 ) p 0 0 5 ) ，而与有无 淋巴结转移及t n m 分期有关( 尸 o 0 5 ) 。 3 采用s p s s l2 0 软件包进行统计学处理，m m p 一2 和m m p 9 在食管癌 患者血清中的含量与肿瘤的浸润和转移存在相关性( 尸 o 0 5 ) ，两者成显著正 相关。 结论 1 食管癌患者血清中m m p 2 、m m p 9 的含量显著高于正常者血清中 m m p 2 、m m p 一9 的含量，因此，m m p 一2 、m m p 9 参与了食管癌的发生发展 过程： 2 i + i i 期患者血清中m m p 2 m m p 9 含量较i i i + 期患者血清m m p 2 ，m m p 9 含量均低，两组比较差异有显著意义，因此，m m p 一2 ，m m p 9 的 含量与食管癌有无淋巴结转移及t n m 分期密切相关； 3 食管癌患者血清中m m p 2 、m m p 9 的含量在不同的年龄、性别、组 织学类型组中无显著性差异，因此，m m p 2 ，m m p 9 的含量与食管癌患者 的年龄、性别，组织学类型无关 关键词m m p 2m m p 一9食管癌e l i s a as t u d yo ft h ee x p r e ss 1 0 n0 fm m p 一2a n dm m p 9 i ne so p h a g e a lc a n c e r p os t g r a d u a t e ：w uz h i t u t o r ：p r o f g a os o n g s p e c i a l t y ：s u r g e r y a b s t r a c t b a c k g r o u n d e s o p h a g e a lc a n c e ri s ac o m m o nc a n c e ro ft h ed i g e s t i v es y s t e m ，w i t hh i g h i n c i d e n c ea n dp o o rp r o g n o s i s ，i n v a s i o na n dm e t a s t a s i so fe s o p h a g e a lc a n c e ra r e t w om a jo r p r o b l e m si n c l i n i c a lt r e a t m e n t ，a n d t h em a i nc a u s eo fd e a t ho f p a t i e n t s t h e r e f o r e ，i t i s v e r yi m p o r t a n tt oi n d e p t hu n d e r s t a n d i n go ft h e i n c i d e n c e 、d e v e l o p m e n t a n dm e t a s t a s i so ft h ec e l l u l a rm e c h a n i s m s a n d m o l e c u l a rm e c h a n i s mo fe s o p h a g e a lc a n c e r w i t hi n d e p t hs t u d yo fi t sp a t h o g e n e s i s ，m o r ea n dm o r ef a c t o r sh a sb e e na s s o c i a t e dw i t hd e v e l o p m e n ta n d m e t a s t a s i so fe s o p h a g e a lc a n c e r ，s u c ha sm a t r i xm e t a l l op r o t e i n a s e 一2 ( m m p 2 ) ， m a t r i xm e t a l l op r o t e i n a s e - 9 ( m m p - 9 ) ，a n ds oo n f u r t h e rs t u d ym e c h a n i s m so f t h e s ef a c t o r s ，t h er e l a t i o n s h i po fc l i n i c a ld i a g n o s i sa n dp r o g n o s i sw i t ht h e s e f a c t o r s ，m a yp r o v i d ea ni m p o r t a n tb a s i sf o rc l i n i c a lt r e a t m e n t m e t h o d s 6 0c a s e so fe s o p h a g e a lc a n c e rp a t i e n t si n c l u d e d ，a l lp a t i e n t sw i t h o u ta n y t r e a t m e n tb e f o r eb l o o do b t a i n e d ，a n d10c a s e so fn o n t u m o rp a t i e n t sa sc o n t r 0 1 e l l s au s e df o re a c hc a s et od e t e c tl e v e l so fs e r u mm m p 2 m m p 9 t n m s t a g i n gb yp a t h o l o g yr e s u l t sa f t e rt u m o rs u r g e r y ，u s i n gs p s s 12 0p a c k a g ef o r s t a t i s t i c a l a n a l y s i s t o c o m p a r e w h e t h e r s t a t i s t i c a l l ys i g n i f i c a n td i f f e r e n c e s b e t w e e ne a c hg r o u p r e s u l t s 1 。i ne s o p h a g e a lc a n c e rg r o u p ，t h el e v e lo fm m p - 2 ( 121 6 6 n g m 1 ) i s s i g n i f i c a n t l yh i g h e rt h a nc o n t r o l ( 6 1 31n g m 1 ) p 0 0 5 ) ；t h el e v e lo fm m p 2 r e l a t e dw i t hw h e t h e r l y m p h n o d em e t a s t a s i sa n dt n m s t a g i n g ( p 0 0 5 ) 2 i ne s o p h a g e a lc a n c e rg r o u p ，t h el e v e lo fm m p 一9 ( 16 9 7 3 n g m 1 ) i s s i g n i f i c a n t l yh i g h e rt h a nc o n t r o l ( 8 7 6 7n g m lp o 0 5 ) ；t h el e v e lo fm m p 一9 1 r e l a t e dw i t hw h e t h e r l y m p hn o d em e t a s t a s i sa n dt n ms t a g i n g ( p 0 0 5 ) 3 s p s s12 0p a c k a g eu s e df o rs t a t i s t i c a l t h el e v e l so fm m p 2a n dm m p 9 i ne s o p h a g e a lc a n c e rp a t i e n t sc o r r e l a t i o nw i t ht u m o ri n v a s i o na n dm e t a s t a s i sf p o 0 5 ) 。 1 1 3 标本的采集和制备 手术前取被研究者的外周血标本5 m l ，经3 0 0 0 转m i n 离心、10 m i n 后取 上清液储于一8 0 冰箱内保存。 1 2 主要试剂 m m p 2 9e l i s a 试剂盒购自美国r & d 公司； m m p 2 9 酶标板，鼠抗m m p 2 9 单克隆抗体； 辣根过氧化酶标记的抗m m p 一2 9 多克隆抗体； m m p 2 9 标准品； 样品分析液r d1 3 4 ； 颜色试剂a ； 颜色试剂b ： 校正稀释液r d 5 1 0 ； 浓缩洗涤液； 反应终止液； 去离子水或蒸馏水； 平版盖； 1 3 主要仪器： 伯乐5 5 0 酶标仪( m i o r a d ) 微量移液器( 美国e p p e n d o r f 公司) ； 水平离心机( 科大创新股份有限公司中佳分公司) ； 微量振荡器( 中科院武汉科学仪器厂) ； 低温冰箱( 日本三洋公司m d f 一3 8 2 1 型) ； 普通冰箱( 青岛海尔电器有限公司) 2 实验方法：酶联免疫吸附试验( e l i s a ) 检测血清中m m p 2 、m m p 9 含量 2 1 实验原理 本实验采用e l i s a 法，把抗人m m p 2 或m m p 一9 单抗包被于酶标板上， 将标准品和样品中的m m p 一2 或m m p 9 与单抗结合，加入生物素化的抗人 m m p 一2 或m m p 一9 ，形成免疫复合物连接在板上，辣根过氧化物酶标记的抗 m m p 一2 9 多克隆抗体与生物素结合，加入酶底物t m b ，出现黄色，加终止 液，颜色变深，颜色的深浅与样品中的检测物的浓度成正相关。在相应的波 长处测o d 值( m m p 2 、m m p 9 均为4 5 0 n m 处) ，m m p 2 或m m p 一9 的浓度与 o d 值成正比，可通过绘制标准曲线求出标本中所测样品的浓度。 2 2 实验准备： 2 2 1 血清稀释：10 u l 样品+ 9 9 0 u l 校正稀释液r d 5 10 将血清稀释10 0 倍； 2 2 2 浓缩洗涤液的稀释：有的浓缩洗涤液中存在结晶，可于室温下轻 轻搅拌直到结晶溶解完全，用蒸馏水或去离子水将2 0 m l 浓缩洗涤液稀释至 5 0 0 m l 。 2 2 3 加底物显色液：把颜色试剂a 与颜色试剂b 在避光条件下等容量 混合混匀1 5 分钟，在每个酶标孔加入混合剂2 0 0 u l 。 2 2 4 准备m m p 2 9 标准品：用l m l 蒸馏水或去离子水重新组合m m p 2 9 标准品。随即产生了2 0 n g m l 的贮存液，标准品在稀释之前须竖立搅拌l5 分钟。 2 2 5 把5 0 0 u l 校f 稀释液r d 5 1 0 加入到各个试管，用m m p 2 9 贮存 液配制一个稀释系列，稀释液的浓度依次为2 0 n g m l 、10 n g m l 、5 0 n g m 、 9 2 5 n g m l 、1 2 5 n g m l 、o 6 2 5 n g m l 、 充分混匀各试管内液体。2 0 n g m l 液r d 5 - 1 0 为零标准品( 0 n g m 1 ) 。 2 3 试验步骤： 0 3 1 2 n g m l 、0 n g m l 。在下一次加液前须 的贮存液为最高浓度的标准品，校正稀释 2 3 1 血清中m m p 2 检测 2 3 1 1 将所有试剂、工作标准品和选择的样品复温至室温，所有的样品 和标准品重复测定。 2 3 1 2 从玻片架上移除多余的m m p 2 酶标孔，把它们重新放回箔片中 进行干燥、包裹、密封。 2 3 1 3 加l0 0 u l 的样品分析液r d1 3 4 到各加样孔。 2 3 1 4 每个孔加入10 0 u l 的样品或标准品，封条覆盖，以5 0 0 士5 0 r p m 速度在水平轨道微量震荡仪震荡，室温孵育2 h 。 2 3 1 5 抽吸各样孔并洗涤，重复3 次，洗涤4 次。将4 0 0 u l 洗液稀释液 加入各孔洗涤，每步均应完全清除液体，最后一次洗涤后，除去所有残留的 洗液稀释液。 2 3 1 6 加入2 0 0 u l 辣根过氧化酶标记的抗m m p 2 多克隆抗体至每个加 样孔，并使用新的粘合条覆盖，在水平轨道微量震荡仪上室温孵育1 h 。 2 3 1 7 重复抽吸、洗涤同以上步骤 2 3 1 8 加入2 0 0 u l 底物显色液至每个加样孔，置于桌上，室温下避光孵 育3 0 分钟。 2 3 1 9 加入5 0 u l 反应终止液，如颜色变化不一致，须轻拍玻片以确保 充分混匀。 2 3 1 1o 3 0 分钟以内测定每孔的光密度，用酶标仪在波长为4 5 0 n m 处测 定各孔吸光度( a ) 值，然后根据测出的标本孔及平行孔的a 值，求出平均值。 在5 4 0 n m 波长处进行波长校正。如样品在测定的动态范围之外，则应用校正 稀释液进一步稀释样品并重复测定。 2 3 2 血清中m m p 9 检测 2 3 2 1 将所有试剂、工作标准品和选择的样品复温至室温，所有的样品 和标准品重复测定。 2 3 2 2 从玻片架上移除多余的m m p 9 酶标孑l ，将它们重新放回箔片中 i o 进行干燥、包裹、密封。 2 3 2 3 加1 0 0 u l 的样品分析液r d l 3 4 至各加样孔。 2 3 2 4 每孔加入10 0 u l 的标准品或样品，用封条覆盖，以5 0 0 + 5 0 r p m 速 度在水平轨道微量震荡仪震荡，室温下孵育2 h 。 2 3 2 5 抽吸各个样孔并洗涤，重复3 次，洗涤4 次。把4 0 0 u l 洗液稀释 液加入每孔洗涤，每步须清除所有洗液，最后一次洗涤后，除去所有残留的 洗液稀释液。 2 3 2 6 加入2 0 0 u l 辣根过氧化酶标记的抗m m p 一2 多克隆抗体至每个加 样孔，使用新的粘合条覆盖，在水平轨道微量震荡仪上室温孵育l h 。 2 3 2 7 重复抽吸、洗涤同以上步骤 2 3 2 8 加入2 0 0 u l 底物显色液至每个加样孔，置于桌上，室温下避光孵 育3 0 分钟。 2 3 2 9 加入5 0 u l 反应终止液，如颜色变化不一致，须轻拍玻片以确保 充分混匀。 2 3 2 10 3 0 分钟以内测定每孔的光密度，用酶标仪在波长为4 5 0 n m 处测 定各孔吸光度( a ) 值，然后根据测出的标本孔及平行孔的a 值，求出平均值。 在5 4 0 n m 波长处进行波长校正。如样品在测定的动态范围之外，须用校正稀 释液来进一步稀释样品并重复测定。 2 4 注意事项： 2 4 1 严格按照规定的时间和温度进行温育以保证准确结果。所有试剂都 必须在使用前达到室温2 0 2 5 。使用后立即冷藏保存试剂。 2 4 2 洗板不正确可以导致不准确的结果。在加入浓缩酶联物或底物前确 保尽量吸干孔内液体。温育过程中不要让微孔干燥掉。 2 4 3 消除板底残留的液体和手指印，否则影响o d 值。 2 4 4 底物显色液应呈无色或很浅的颜色，已经变蓝的底物液不能使用。 2 4 5 避免试剂和标本的交叉污染以免造成错误结果。 2 4 6 在储存和温育时避免强光直接照射。 2 4 7 平衡至室温后再打开密封袋以防水滴凝聚在冷板条上。 2 4 8 任何反应试剂不能接触漂白溶剂或漂白溶剂所散发的强烈气体。任 何漂白成分都会破坏试剂盒中反应试剂的生物活性。 2 4 9 不能使用过期产品。 2 4 10 如果可能传播疾病，所有的样品都应管理好，按照规定的程序处 理样品和检测装置。 2 5 结果判定标准 2 5 1 每个标准品和标本的o d 值应减去零孔的o d 值。 2 5 2 绘制标准曲线，以标准品浓度作横坐标，o d 值作纵坐标，以平滑 线连接各标准品的坐标点。显色以后在4 5 0 n m 波长应用酶标仪比色读数，求 取o d 值，并在5 4 0 n m 波长校正读数，通过标本的o d 值可在标准曲线上查 出其浓度。 2 5 3 若标本o d 值高于标准曲线上限，应适当稀释后重测，计算浓度时 应乘以稀释倍数 2 6 统计分析 应用s p s s12 0 统计软件，对相关数据进行t 检验，重复测量的卡方检验， 以p 0 0 5 为有统计学意义。 毒士田 ：日木 1 血清中m m p 2 水平检测 1 1 食管癌组及对照组血清中m m p 2 水平 食管癌6 0 例，血清中m m p 一2 浓度均值为1 2 1 6 6 n g m l ，对照组1 0 例， 血清m m p 2 浓度均值为6 1 3 1 n g m l ，表达水平高于对照组，差异有显著薏 义( p o 0 5 ) 。 表2m m p 一2 的表达与食管癌患者性别、年龄的关系 1 3m m p 2 的表达与食管癌患者组织学类型的关系 鳞癌4 2 例，血清中m m p 一2 浓度均值为1 18 3 2 n g m l ，腺癌病例18 例， 血清m m p - 2 浓度均值为1 2 9 4 5 n g m l ，两组比较差异无显著意义( p o 0 5 ) 。 表3m m p 2 的表达与食管癌患者组织学类型的关系 1 4m m p 2 的表达与食管癌患者区域淋巴结转移的关系 3 6 例有淋巴结转移患者血清中m m p 一2 浓度为13 5 9 2 n g m l ，2 4 例无淋 巴结转移患者血清m m p - 2 浓度均值为1 0 0 2 7 n g m l ，两组比较差异有显著意 义( 尸 o 0 5 ) 。 表4m m p 2 的表达与食管癌患者区域淋巴结转移的关系 1 5m m p 一2 的表达与食管癌患者t n m 分期的关系 3 6 例i + i i 期患者血清中m m p - 2 浓度为10 6 3 7 n g m l ，2 4 例i i i + 期患 者血清m m p 一2 浓度均值为1 4 4 5 9 n g m l ，两组比较差异有显著意义( p o 0 5 ) 。 表5m m p 2 的表达与食管癌患者t n m 分期的关系 2 、血清中m m p 9 水平检测 2 1 食管癌组及对照组血清中m m p 9 水平 食管癌6 0 例，血清中m m p 一9 浓度为16 9 7 3 n g m l ，对照组10 例，血清 m m p 一9 浓度为8 7 6 7 n g m l ，表达水平高于对照组，差异有显著意义( 尸 o 0 5 ) 。 表7m m p 9 的表达与食管癌患者性别、年龄的关系 2 3m m p 9 的表达与食管癌患者组织学类型的关系 鳞癌4 2 例，血清中m m p 一9 浓度均值为1 7 3 1 9 n g m l ，腺癌病例1 8 例， 血清m m p - 2 浓度均值为1 6 1 6 6 n g m l ，两组比较差异无显著意义( p 0 0 5 ) 。 表8m m p 9 的表达与食管癌患者组织学类型的关系 2 4m m p - 9 的表达与食管癌患者区域淋巴结转移的关系 3 6 例有淋巴结转移患者血清中m m p 9 浓度为19 0 1ln g m l ，2 4 例无 巴结转移患者血清m m p - 9 浓度均值为1 3 9 1 6 n g m l ，两组比较差异有显著j l 义( p o 0 5 ) 。 表9 m m p 9 的表达与食管癌患者区域淋巴结转移的关系 组别例数 m m p - 9 浓度 尸值 ( n g m 1 ) 淋巴结转移3 619 0 1 1 无淋巴结转移2 4 1 3 9 1 6 2 5m m p 一9 的表达与食管癌患者t n m 分期的关系 3 6 例i + i i 期患者血清中m m p 一9 浓度为14 2 17 n g m l ，2 4 例i i i + i v 期患 者血清m m p 一9 浓度均值为2 1 1 0 7 n g m l ，两组比较差异有显著意义沪 0 0 5 ) 。 表10 m m p 9 的表达与食管癌患者t n m 分期的关系 1 6 讨1 2 食管癌的诊疗现状：食管癌是人类常见的消化道恶性肿瘤之一，在不同 国家、地区、民族之间，食管癌的发病情况相差悬殊，在发展中国家，食管 癌的发病率居恶性肿瘤的第4 位，在发达国家居第15 位，全球每年约有4 6 万新病例报告，约占全部肿瘤的4 2 。我国的食管癌发病率和死亡率居世界 之首，食管癌发病和死亡人数分别占全球发病和死亡总人数的5 3 8 6 和 4 9 2 6 ，食管癌死亡率在我国十大恶性肿瘤中居第四位，是严重威胁我国 人民生命健康的恶性肿瘤之一。虽然随着外科技术水平的发展及放疗、化疗 方案的日趋成熟，使食管癌的综合治疗达到了一个新的水平，但令人遗憾的 是其术后5 年生存率仅2 5 4 0 【4 】，仍然没有显著的提高。本研究采用酶联 免疫吸附法( e l i s a ) 测定食管癌病人血清中m m p 一2 及m m p 9 的水平，同 时比较其表达水平与食管癌有关侵袭生长的临床病理特点( 性别、年龄、肿瘤 组织类型、淋巴结转移) 、比较不同临床分期血清中m m p 2 及m m p 9 的水 平，以从细胞免疫水平初步探讨其与组织类型、临床分期、转移等生物学的 关系，同时寻找一种与食管癌预后相关的指标，从而对食管癌患者诊断、病 情进展和预后更好地评估，以指导临床治疗。 临床上食管癌患者早期发现比较困难，就诊时以中晚期居多，很多在就 诊时就已存在转移。大多数患者在诊断为食管癌后生存期较短，其预后不良 主要与患者发生的广泛浸润转移有关，食管癌的转移( m e t a s t a s i s ) 是引起其 死亡的主要原因之一【9j 。转移是指进入正常组织中的癌细胞迁移到特定组织 器官并发展成为继发癌灶的过程，它是高度恶性肿瘤的一个重要特征，肿瘤 细胞与其生存的宿主组织基质的外环境的平衡性是肿瘤转移的关键因素。食 管癌转移过程中首先为癌细胞脱离原发病灶，通过浸润进入周围间质中生 长，并与局部毛细血管和淋巴管内皮细胞密切接触并穿透其管壁，或突入其 管腔并转运到靶组织，再穿透毛细血管或淋巴管，在基质中增殖，形成新的 继发瘤【l0 1 。这种新转移肿瘤会获得了更高的转移性，食管癌的转移是造成其 治疗失败的主要原因之一。食管癌在浸润转移过程中涉及到肿瘤细胞与f 常 组织基质细胞之间的相互作用、肿瘤细胞与细胞外基质( e x t r a c e l l u l a r m a t r i x ， e c m ) 成分之间的细胞与基质相互作用【l1 1 。在此相互作用中会激活、释放诸 多细胞因子和生长因子l 协3 1 ，这些因子可以直接或间接地刺激肿瘤的生长， 也可以直接产生促进肿瘤细胞不断的增殖。蛋白质水解酶( p r o t e a s e s ) 在参 与食管癌的侵袭转移调控过程中起到了重要的作用，尤其是细胞外的蛋白质 水解酶，因为它们直接参与了肿瘤细胞与周围基质细胞和基质成份之间的酶 解作用，帮助肿瘤细胞穿过基底膜，改变了它们之间固有的平衡，从而导致 了肿瘤细胞的恶化。大量的研究结果表明m m p s 在肿瘤的这些过程中都起到 了重要的作用。在实体瘤中关于基质金属蛋白酶作用的研究已经基本明确， m m p s 同肿瘤生长、转移及临床治疗成正相关。 目前已知的人m m p s 家族成员有2 4 个，按照新的分类方法，根据其结 构可分为8 类，其中5 类为分泌型，3 类为膜型( m e m b r a n e 。t y p em m p s ， m t m m p s ) 。通过氨基酸序列的比较，所有m m p s 都有以下相似的结构： 信号肽区，由17 2 9 个氨基酸组成。人类m m p s 中除m m p 14 外均有一个信 号肽序列；前肽区，由7 7 8 7 个氨基酸组成，含有一个高度保守的 p r c g v n p d 氨基酸序列，它的裂解对m m p s 的激活非常重要；催化区， 有2 个z n 2 + 结合区和至少1 个c a ”结合区，其中保守的h e x g h xxh s x m 中有z n 2 + 的催化结合位点，对z n 2 十的催化活性必不可少；除m m p 7 外都具有一个羟基端区域，它可能介导m m p s 与细胞外基质成分或与m m p 抑制剂结合；与细胞外基质具有同源序列区域；跨膜区：此区域存在于 膜型金属蛋白酶中，具有将膜型金属蛋白酶固定于细胞膜上的作用1 1 4 】。 根据其底物的特异性，可将已经发现的m m p s 粗略地分为四型： i 型：胶原酶包括m m p 一1 、m m p 8 和m m p 17 三种。此三种都可分解i 、 i i 、i i i 型胶原( f i b r i l l a rc o l l a g e n s ) 。 i i 型：包括为两种7 2 k d a ( 明胶酶a ) 、9 2 k d a ( 明胶酶b ) 的明胶酶 ( g e l a t i n a s e s ) 和金属弹性蛋白酶( m e t a l l o e l a s t a s e ) ，两种明胶酶可分解i v 、 v 型基底层( b a s a l l a m i n a ) 非纤维状胶原质，也可分解型的胶原质、纤维 结合蛋白( f i b r o n e c t i n ) ，x 型的短链胶原质、弹性蛋白和金属蛋白酶。 i i i 型：包括为基质溶素1 ( s t r o m e l y s i n 1 ) 、基质溶素2 、m a t r i l y s i n ，它 们可分解i v 型的胶原质和x 型胶原质中的蛋白多糖( p r o t e o g l y c a n ) 、纤维结 合蛋白、l a m i n i n 。 i v 型：m t - m m p 可结合于胞膜上，m t - m m p 是以特殊的活性明胶酶原 a ( a c t i v a t ep r o g e l a t i n a s ea ) 出现。从最初的发现至今，已有数个m t - m m p 的基因被确定，这些酶都暂时归于m m p 的i v 型。 传统观点认为，m m p s 的底物主要是e c m 的结构成分，m m p s 可以降 解至少一种细胞外基质成分，大部分m m p s 的底物具有特异性。而且，大部 分m m p s 还可裂解或激活某些非细胞外基质生物活性分子，从而与几种 m m p s 基因启动子上的a p 1 结合而产生不同的生物学效应。现代研究发现， m m p s 的作用己大大超出这一范围。第一，每个细胞膜上都存在能与e c m 结构成分结合的受体，m m p s 水解e c m 蛋白必然会影响其与受体的相互作 用进而引发信号转导【l 引。第二，m m p s 对e c m 成分的降解必定会引起底物 分子释放一些具有功能的蛋白水解片段，例如层粘连蛋白和i v 型胶原的部 分水解产物就具有启动细胞迁移的作用 1 6 - 17 】，胰岛素样生长因子结合蛋白与 基底膜聚糖的部分水解可以释放出i g f 和成纤维细胞生长因子( f g f ) 。 有研究表明m m p s 还参与了以前体形式结合于细胞膜上的多种细胞因 子及生长因子的释放，如基质金属蛋白酶2 和基质金属蛋白酶9 可使t g f b 从无活性的e c m 复合物中水解释放，从而调节t g f p 的生物利用度 18 1 。另 外，生长因子受体也是m m p s 的底物之一i l 引，m m p s 可催化生长因子受体的 胞外区断裂而阻断信号转导。 另外，基质金属蛋白酶亦可作用于细胞粘附因子。基质金属蛋白酶将 c d 4 4 和e 钙粘素的肽链水解所释放出的胞外区片段能显著提高肿瘤细胞的 侵袭能力 2 0 l 。基质金属蛋白酶前体和一些蛋白酶抑制剂如丝氨酸蛋白酶抑制 剂也是基质金属蛋白酶的作用底物。因此，任何存在于细胞膜上或e c m 中 的蛋白分子都有可能作为基质金属蛋白酶底物而被水解，所生成的生物活性 物质将会影响细胞信号转导和细胞功能。 m m p s 在正常组织水平很低，当机体需要时，其相关信息才转导至细胞， 通过细胞内转录调控，合成并分泌m m p s ，反之m m p s 则停止合成分泌，其 活性消失。m m p s 在体内的调控十分复杂而有序，具体可分为基因水平调节、 酶原活化调节及基质金属蛋白酶组织抑制剂( t i m p ) 的调节。正是这种精细 准确的调控才保证了机体正常的细胞迁移和细胞外基质重构，然而，如果调 节失控就会导至肿瘤细胞的浸润和转移等病理过程的发生。 m m p s 的表达与多种细胞因子、生长因子、类固醇激素、佛波醇醋密切 相关。多种细胞外基质成分、细胞因子、致癌物、癌基因等均可影响基质金 1 9 子( p d g f ) 及糖皮质激素可以稳定m m p l3 的m r n a ，而肿瘤生长因子t g f b 有相反的作用 2 2 - 2 3 】。r o t h h u t 等2 4 】发现表皮生长因子( e g f ) 能诱导基质金属 蛋白酶9 在滤泡性甲状腺癌中的转录和分泌。根据不同的肿瘤细胞类型基质 金属蛋白酶可被不同的基因转录诱导或抑制。细胞外的刺激通过信号转导途 径影响基质金属蛋白酶的表达，如i l 1 、t n f a 、e g f 可导致激活蛋白( a p 1 ) 转录因子被激活。佛波醇酯和m m p l 基因启动子的a p 一1 位点结合并与其临 近的e t s 位点结合可协同诱导基质金属蛋白酶一1 的表达；但在基质金属蛋白 酶13 基因启动子上两位点间隔较远，佛波醇酯不能诱导其表达 2 5 1 。 b a c h m e i e r 等【2 在不同的乳腺癌细胞株研究中发现了细胞密度激活a p 1 途 径，从而调节基质金属蛋白酶表达。a p 一1 转录因子表达由m a p k 途径中的 细胞外信号调节激酶( e r k 1 ，2 ) 和应激活化蛋白酶j u n 氨基末端蛋白酶 ( s a p k j n k ) 以及p 3 8 诱导【2 。人类成纤维细胞p 5 3 蛋白可以抑制基质金属 蛋白酶1 的基础和诱导性表达【2 引，在人胎盘滋养层细胞中，s v 4 0t 抗原下 调p 5 3 的表达可抑制m m p 2 ，3 ，9 的表达【2 9 1 。t h o m a s 等研究亦发现p 5 3 蛋白 对m m p 3 有调节作用1 3 0 。r h e e 等发现核因子k b ( n f k b ) 能调节m m p 9 的 基因表达【31 1 。多种核转录因子，作用于各种基因调控元件，通过各种不同的 信号转导通路，形成了复杂的网状调控系统来调节基质金属蛋白酶基因的转 录。 基质金属蛋白酶的表达、分泌都是以前酶原形式进行，大部分酶原基质 会属蛋白酶分泌至细胞外后，由丝氨酸蛋白酶，如纤溶酶( p l a s m i n ) 、肿瘤 相关胰蛋白酶2 ( t u m o r a s s o c i a t e dt r y p s i n o g e n s 一2 ，w 小2 ) 及其它已经激活 的基质会属蛋白酶激活，只有激活原蛋白酶原后，它们彳。可以对细胞外基质 产生作用。基质金属蛋白酶可被蛋白水解酶激活，也可在体外被构象改变剂 激活，如巯基化合物、有机汞、重金属( h g 和a u ) 和除污剂以及氧化剂，低 p h 和热处理也可激活基质金属蛋白酶。其激活步骤包括：保守半胱氨酸氨基 端的活性前区断裂；锌半胱氨酸结合区打开，进而通过进一步的蛋白分解作 用而使活性前区剩余部分失活。大多数基质金属蛋白酶，包括基质金属蛋白 酶1 ，一3 , - 7 ，9 都可被纤维蛋白溶酶及尿激酶型纤维蛋白溶酶原等丝氨酸蛋白 激酶激活【3 2 】，活化的基质金属蛋白酶参与其他基质金属蛋白酶的活化过程和 调节机制。m m p 1 激活m m p 一1 、m m p 一2 ，m m p 3 可分别激活m m p 9 、 m m p 1 3 ；m m p 2 可分别激活m m p 一1 、m m p 2 、m m p 一9 、m m p 1 3 ，m m p 一9 可分别激活m m p 一2 、m m p 9 、m m p 1 3 ；6 种膜型m m p s 中，除m t 4 m m p ( m m p 一1 7 ) 外，其余均可激活m m p 2 ，而m t l m m p ( m m p 1 4 ) 还可激活 m m p 1 3 ：m m p 3 可激活m m p 1 、m m p 一3 、m m p 7 、m m p 8 、m m p 9 、m m p 1 3 ， m m p 8 可激活m m p 1 、m m p 一8 、m m p 1 0 。而m m p 一1 1 、m m p 2 3 、m m p 2 7 以及6 种m t - m m p s 在胞内被丝氨酸蛋白酶裂解失去前肽而激活 3 3 1 。其中， m m p 2 的激活机制较为特别，m t l 一m m p 与t i m p 一2 的n 术端结合，t i m p 2 的c 末端则与p r o m m p 2 的血红素蛋白域相结合，然后临近的未抑制的 m t l m m p 激活被固定的p r o m m p 2 。由此可见，酶原活化调节过程中很难明 确哪一个是激活级联的启动子，第一个酶原是如何被激活的。 在细胞外基质中，基质金属蛋白酶的活性可被内源性抑制剂金属蛋白酶 组织抑制因子( t i s s u ei n h i b i t o r so fm e t a l l p r o t e i n a s et i m p s ) 家族所调节。金属 蛋白酶组织抑制因子对基质金属蛋白酶的抑制作用主要表现在两个方面，一 是阻止基质金属蛋白酶酶原活化，二是抑制已活化的基质金属蛋白酶的活 性。在正常生理状态下，m m p s 与t i m p 协同产生，维持动态平衡，但是当这 种平衡被打破时，e c m 的代谢发生异常，可导致各种疾病并促进疾病恶化。 目前已发现4 种亚型，依其被发现的先后顺序命名为t i m p 一1 到t i m p 4 。 t 1 m p 分子包括2 个蛋白质结构域，n 端结构域拥有m m p 抑制活性，c 端结 构域可能与明胶酶原的蛋白定位或复合物的形成有关。保守性最强的区域是 n 端的前2 2 个氨基酸残基( 在信号肽断裂位点附近) ，已表明这个区域包含着 活化位点，在这位点中的第7 个组氨酸和第9 个甘氨酸与z n 2 + 的相互作用尤 显重要 3 4 1 。不同金属蛋白酶组织抑制因子抑制基质金属蛋白酶的能力是有差 别的 3 5 1 。其中t i m p 2 、t i m p 3 、t i m p 4 对m m p 2 活性的抑制最为明显，而 t i m p1 、t i m p 3 对m m p 9 活性的抑制最为明显；t i m p 2 、t i m p 3 、t i m p 4 能 抑制m t - m m p s 的活性，而t i m p l 却不能抑制m t - m m p s ( 1 ，2 ，3 ，5 ) 的活性。 4 种t i m p s 都可以促进肿瘤细胞的生长，而且t i m p l 、t i m p 4 可促进肿瘤转 移1 36 。有研究表明恶性黑色素瘤进程中诱导了m m p 1 、3 及t i m p 1 、3 的 高表达，而t i m p 的高表达则反映了宿主控制m m p 的活性，保护e c m 完整 性从而对抗肿瘤的侵袭【3 7 7 。另外，因癌组织中m m p s 在一定程度上比t i m p s 表达更高，因此t i m p s 的增高不足以抑制m m p s 的活性。t i m p 通过抑制 m m p s 而发挥抑制基底膜降解、拮抗新生血管形成及抑制内皮细胞形成的作 用，进而影响了肿瘤的侵袭、转移过程【3 8 】。 另外，某些与t i m p s 具有相似结构的片段也能抑制m m p s 活性，这类 抑制因子包括w 型胶原n c i 结构域、前胶原蛋白c 末端片段以及近年发现 f 的惟一一种膜结合基质金属蛋白酶抑制剂r e c k ( r e v e r s i o n i n d u c i n gc y s t e i n e - r i c hp r o t e i nw i t hk a z a lm o t i f s ) 。 基质金属蛋白酶可降解0 【2 一巨球蛋白而引起巨球蛋白的四聚体的构相变 化，这种四聚体可不可逆的结合基质金属蛋白酶形成复合物，随后引发细胞 内吞作用而降解清除基质金属蛋白酶”】。此外，凝血酶敏感素2 ( t h r o m b o s p o n d i n2 ，t s 2 ) 很可能参与了m m p 2 的清除 4 0 - 4 1 1 ；而m m p l 3 与m m p l 3 特 异性高亲和力1 7 0 k d 受体结合后则可被清除【4 2 1 。 m m p 2 和m m p 9 是到目前为止唯一能够降解i v 型胶原的一种基质蛋 白水解酶，它们可以破坏基质的降解平衡而促进癌细胞穿透基底膜与细胞外 基质构成的屏障，从而侵袭周围组织并转移到远处组织，因此明胶酶在肿瘤 的侵袭和转移过程中具有十分重要的作用 4 3 1 ，近年来研究较多。t a n i o k ay 等【4 4 】采用免疫组化法检测5 5 例表浅食管癌中m m p 9 的表达发现m m p 9 的 阳性表达率为4 7 3 ，且m m p 9 的表达与肿瘤浸润深度、淋巴结转移呈显