（生药学专业论文）海洋细菌cellulophaga+spqy201的λ卡拉胶酶研究.pdf

海洋细菌c e l l u l o p h a g as p q y 2 01 的n 卡拉胶酶研究 摘要 卡拉胶是由1 ，3 b d 吡喃半乳糖和l ，4 - 0 【d 吡喃半乳糖交替连接而成的线性 硫酸多糖。根据是否含有3 ，6 一内醚半乳糖结构以及硫酸基的含量的不同，目前工 业上生产和使用的卡拉胶主要为1 c 型、l - 型和九型三种，其二糖单元分别含有1 个、 2 个和3 个硫酸基。卡拉胶寡糖具有抗病毒、抗肿瘤、免疫调节等多种药理活性， 尤其是n 卡拉胶寡糖，它含有多个硫酸基，可能具有更好的生理活性，有望成为 新一代的海洋药物。 卡拉胶酶( c a r r a g e e n a s e ) 是一种糖水解酶，它降解卡拉胶的d - 1 ，4 糖苷键产生 卡拉胶低聚糖。卡拉胶酶不但能作为工具酶用于卡拉胶寡糖的制备，还能用于藻 类原生质体的制备和卡拉胶结构的研究，在医药、食品、农业等多个领域具有广 泛的应用价值。目前国内外对k - 和卜卡拉胶酶研究较多，而对卜卡拉胶酶的报道 很少。因此，寻找高活力的新型九一卡拉胶酶具有重要的理论意义和明确的应用前 景。 本实验室从舌状蜈蚣藻表面分离到一株产胞外b 、卜和卜卡拉胶酶的菌株 c e l l u l o p h a g as p q y 2 0 l ，本文对该菌株液体发酵条件进行了优化，确定其产卜 卡拉胶酶的最优培养基为( w v ) ：3 n a c l ，0 3 m g s 0 4 7 i - 1 2 0 ，0 0 2 c a c l 2 ， 0 0 1 k c l ，0 0 0 2 f e s 0 4 ，0 3 c a s e i n ，0 15 n a 2 h p 0 4 ，o 1 n a h 2 p 0 4 ，0 2 5 n 卡拉胶，起始p h 为7 o ；最适培养条件是：5 0 0 m l 摇瓶装液量为1 5 0 m l ，培养温 度为2 8 ，培养时间为3 6h 。在最适产酶培养条件下，发酵液中九卡拉胶酶活力 可达到3 6u m l ，为优化前的3 5 倍。 利用硫酸铵沉淀、d e a e 离子交换层析、s u p e r d e x7 5h r 凝胶过滤层析技术， 从c e l l u l o p h a g as p q y 2 0 1 发酵液上清中分离纯化到一种n 卡拉胶酶，比活力为8 u m g ，纯化倍数为4 0 倍，回收率为3 。s d s p a g e 显示为单一条带，酶的分子 量为3 8 0k d ，溶液状态下为单体结构。 c e r u l o p h a g as p q y 2 0 1n 卡拉胶酶的酶学性质研究结果表明，其最适反应温 度为3 0 ，在0 3 0 之间酶活力较稳定：最适反应p h 为7 5 ，在p h6 0 8 5 之间 较稳定：n a + 、k + 、c u 2 + 、m g + 对酶活性有促进作用，f e 2 + 、b a 2 + 、m n “、( n h 4 h s 0 4 、 n i 2 + 以及e d l a 对酶活性有抑制作用。该酶对n 卡拉胶的k m 值为4 9 2 6 x1 0 击 m o l l 。酶的底物特异性分析结果表明，该酶主要降解九卡拉胶，对卜卡拉胶、b 卡拉胶和琼胶具有很微弱的降解作用。该k 卡拉胶酶为内切酶；m a l d i t o f m s 分析表明，它专一性水解n 卡拉胶的a 2 ，6 一硫酸d 半乳糖和d 2 硫酸d 半乳糖之 间的1 3 1 ，4 糖苷键，最终产物为硫酸新n 卡拉四糖和硫酸新n 卡拉二糖。利用p 6 凝胶过滤柱对它们进行了有效的分离，得到了二糖和四糖的纯品。 综上所述，本文利用硫酸铵沉淀、离子交换层析及凝胶过滤层析技术从 c e l l u l o p h a g as p q y 2 0 1 的发酵上清液中分离到一种k 卡拉胶酶。酶的分子量和 降解产物分析表明该酶是一种结构和功能全新的糖水解酶。它的发现丰富了n 卡拉胶酶的多样性，将推动糖生物学研究的发展，同时也将为海洋寡糖类创新药 物的研究与开发创造条件。 关键词：卜卡拉胶酶；噬纤维菌属；分离纯化；酶学性质；卡拉胶寡糖 s t u d yo nk c a r r a g e e n a s eo fm a r i n eb a c t e r i u m a b s t r a c t q y 2 0 1 c a l r a g e e n a n sc o n s i s to f l i n e a rc h a i n so fg a l a c t o p y r a n o s er e s i d u e si nt h e d - c o n f i g u r a t i o nl i n k e db ya l t e r n a t i n ga ( 1 3 ) a n dp ( 1 - 4 ) l i n k a g e s ，v v i t h s u l f a t e - e s t e rg r o u p sc o m m o n l yp r e s e n t o nt h eb a s i so ft h el e v e la n dp o s i t i o no f s u l f a t es u b s t i t u t i o n , 廿1 e ya l ec o m m e r c i a l l yc l a s s i f i e di n t ot h r e em a j o rt y p e sa s1 1 ( - ，t - a n dx - c a l r a g e e n a n ( w i t h1 ，2a n d3s u l f a t eg r o u p s ，r e s p e c t i v e l y ) r e c e n t l y , s o m e c a l r a b i o s eo l i g o s a c c h a r i d e sa l ef o u n dt ob eo fv a l u a b l ep h a r m a c o l o g i c a la c t i v i t i e s ， s u c ha sa n t i t u m o r , a n t i v i r a l ，a n t i c o a g u l a n ta n di m m u n o m o d u l a t ea c t i v i t i e s ，i nt h e d e v e l o p m e n t o fd r u g s e s p e c i a l l y , x - c a r r a b i o s e o l i g o s a c c h a l i d e s t h a tc o n t a i n 1 , 4 一l i n k e dd - g a l a c t o s e2 , 6 - d i s u l p h a t eu n i t sa n dh i g h l ys u l f a t e dg r o u p s ，a l ec o n s i d e r e d t oh a v eb e t t e rb i o l o g i c a la c t i v i t i e sa n dm a yb ee x p l o i t e da sn e wd r u g s c a r r a g e e n a s e s ，w h i c ha l eg l y c o s i d eh y d r o l a s e st h a tc l e a v et h ei n t e r n a l ( 1 - - - 4 ) l i n k a g e so fc a r r a g e e n a n sy i e l d i n gp r o d u c t so ft h en e o - c a r r a b i o s es e r i e s ，d i s p l a ya s t r i c ts u b s t r a t es p e c i f i c i t yn a m e l yi ( - ，卜，a n dx - c a l r a g e e n a s e s u pt on o w , k - a n d t - c a l r a g e e n a s e s h a v e b e e n w i d e l ys t u d i e d ，h o w e v e r , t h e r e w a so n l yo n e x - c a r r a g e e n a s er e p o r t e d t h e r e f o r e ，t h ed i s c o v e r yo fn o v e ll - e a r r a g e e n a s e sw i ml l i 曲 a c t i v i t yh a sb e c o m et h ef o c u so fr e s e a r c ha n dd e v e l o p m e n to fn e wd r u g s i nt h ep r e v i o u ss t u d y , am a r i n eb a c t e r i u mc e l l u l o p h a g as p q y 2 01w a si s o l a t e d f r o mg r a t e l o u p i al i v i d aa n di tc o u l dp r o d u c ek ，l - a n dx - c a r r a g e e n a s e s t h eo p t i m a l m e d i u mf o ra , - c a l r a g e e n a s ep r o d u c t i o nw a sa sf o l l o w s ( ，w v ) ：3 n a c i ，o 3 m g s 0 4 7 h 2 0 ，0 0 2 c a c l 2 ，0 01 k c i ，0 0 0 2 f e s 0 4 ，0 3 c a s e i n , 0 1 5 n a h 2 p 0 4 ，0 1 n a h 2 p 0 4 ，0 2 5 九- c a r r a g e e n a na n dt h ei n i t i a lp h7 0 t h eo p t i m a l c u l t i v a t i o nc o n d i t i o n sf o rk - c a r r a g e e n a s ep r o d u c t i o nw e r e5 0 0 m lf l a s k sc o n t a i n i n g 15 0 m lm e d i u m ，s h a k i n gc u l t i v a t i o na t12 0 r p ma n d2 8 f o r3 6h o u r s t h e ) 。- c a r r a g e e n a s e a c t i v i t yc o u l dr e a c h3 6 u m lw h e nc e l l u l o p h a g as p q y 2 0 1w a s i n c u b a t e du n d e rt h eo p t i m a lc u l t i v a t i o nc o n d i t i o n s ，w h i c hw a s2 5t i m e sh i g h e rt h a n t h a tu n d e rt h eo r i g i n a lc o n d i t i o n s t h ex - c a r r a g e e n a s eo fc e l l u l o p h a g as p q y 2 01w a se x t r a c t e db y ( n h 4 ) 2 8 0 4 p r e c i p i t a t i o na n dp u r i f i e db yi o n - e x c h a n g ec h r o m a t o g r a p h ya n ds u p e r d e x7 5g e l f i l t r a t i o nc h r o m a t o g r a p h y t h i sp r o c e d u r er e s u l t e di n4 0 一f o l dp u r i f i c a t i o no ft h e x - c a r r a g e e n a s ef r o mt h ec r u d ec u l t u r es u p e m a t a n tw i t ha3 r e c o v e r y t h ep u r i f i e d e n z y m eg a v eas p e c i f i ca c t i v i t yo f8u r a ga n das i n g l eb a n do ns d s p a g ew i t h am o l e c u l a rm a s so f3 8 0k d s i z ee x c l u s i o nc h r o m a t o g r a p h yi n d i c a t e dt h a t t h i s e n z y m ee x i s t e da sam o n o m e ri ns o l u t i o n t h eo p t i m a lt e m p e r a t u r ea n d p hf o rh y d r o l y s i so f 九- c a r r a g e e n a nb yt h e 久, - c a r r a g e e n a s ew e r e3 0 0a n d7 5 ，r e s p e c t i v e l y ；t h ee n z y m ew a ss t a b l eb e l o w3 0 。c a n do v e rar a n g eo fp h6 0 - 8 5 n a + ，k + ，c u 2 + a n dm 矿e n h a n c e dt h ee n z y m e a c t i v i t ys i g n i f i c a n t l y , w h e r e a sb a 2 + ，m n 2 + ，( n h 4 ) 2 s 0 4 ，n i 2 + a n de d t ad e c r e a s e dt h e e n z y m ea c t i v i t y t h ev a l u eo fk mw a s4 9 2 6 x10 西m o l lf o rx - c a r r a g e e n a n a n a l y s i s o ft h es u b s t r a t e s p e c i f i c i t ys h o w e dt h a tx - c a r r a g e e n a s eh a dh i g ha c t i v i t yo n k - c a r r a g e e n a na n dl i t t l ea c t i v i t yo nz - c a r r a g e e n a n ，卜e a r r a g e e n a na n da g a r t h ep a r e m o fx - c a r r a g e e n a nh y d r o l y s i ss h o w e dt h a tt h ee n z y m ew a sa ne n d o t y p ea , - c a r r a g e e n a s e ， a n dt h em a i nf m a l p r o d u c t sh a v eb e e np u r i f i e da n dc h a r a c t e r i z e dt ob e n e o - l - c a r r a t e t r a o s e ( d p 4 ) a n dn e o a , - c a r r a d i a o s e ( d p 2 ) u s i n gm a l d i - t o f m s i nc o n c l u s i o n , a 九- c a r r a g e e n a s ew a sp u r i f i e df r o mc e l l u l o p h a g as p q y 2 01a n d t h em o l e c u l a rw e i g h ta n dd e g r a d a t i o np r o d u c t so ft h i se n z y m ei n d i c a t e dt h a ti tw a sa n o v e lg l y c o s i d eh y d r o l a s e i tw i l ln o to n l ye n r i c ht h ed i v e r s i t yo fx - c a r r a g e e n a s e s ，b u t a l s op r o v i d ea no p p o r t u n i t yf o ri n v e s t i g a t i n gt h es t r u c t u r e - f u n c t i o nr e l a t i o n s h i po f c a r r a g e e n a s e s f u r t h e r m o r e ，i t sh i g ha c t i v i t ya n dp r o d u c ts p e c i f i c i t yw i l le n a b l et h i s e n z y m et ob ea p p l i e di nm a n yd i f f e r e n tf i e l d s ，e g ，m e d i c i n e ，a g r i c u l t u r ea n df o o d t e c h n o l o g y k e yw o r d ：) p - c a r r a g e e n a s e , c e l l u l o p h a g a ，p u r i f i c a t i o n ，e n z y m a t i cp r o p e r t i e s ， c a r r a b i o s eo l i g o s a c c h a r i d e s 独创声明 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成 果。据我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发 表或撰写过的研究成果，也不包含未获得l 逵；垫塑查墓丝 重要挂别岂盟的：奎拦亘窒2 或其他教育机构的学位或证书使用过的材料。与我一同 工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示谢意。 学位论文作者签名：佐溆签字日期：磁石月e l 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定，有权保留并向国 家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅。本 授权学校 可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或 扫描等复制手段保存、汇编学位论文。同时授权中国科学技术信息研究所将本学位论 文收录到中国学位论文全文数据库，并通过网络向社会公众提供信息服务。( 保密 的学位论文在解密后适用本授权书) 学位做作者签名：琅破 签字日期：b 。9 年6 月6 日 乃 吒 乒 钿年 j 喈 ， 滂 字 期 签 日 师 字 导 签 海洋细菌c e l l u l o e 7 h a g as p q y 2 0 1 的b 卡拉胶酶研究 _ - - 一 刖蟊 海洋蕴涵着生物种类的8 0 以上，是生物多样性的巨大储存库。随着海洋药 物和海洋保健生物制品的蓬勃发展，海藻多糖的利用潜能引起了广大科技工作者 的关注。近年的研究发现，多糖衍生物尤其是硫酸酯化多糖往往具有独特的生物 活性，中国海洋大学医药学院就已经利用褐藻胶研制出p s s 、甘糖酯等治疗心脑 血管疾病的药物。卡拉胶作为一种结构独特的硫酸多糖，也被证明在抗病毒、抗 溃疡、抗凝血等方面具有较理想的药理活性。但是，未降解的卡拉胶由于粘度大、 扩散困难，很难吸收；且其毒性大，未达到有效量就能致死实验动物，因此限制 了它的应用。而降解的卡拉胶是一种有效的体内致炎剂，已经有几种酸降解的卡 拉胶制剂被应用于临床上。降解的卡拉胶像肝素一样具有抗凝血活性，且与血纤 维蛋白原形成的可溶络合物毒性比未降解的卡拉胶小的多。近年来，研究发现卡 拉胶寡糖具有抗病毒、抗肿瘤、免疫调节、抗凝血以及诱导植物胚胎发育过程中 小孢子形成等作用；尤其是痢k 卡拉胶寡糖，它们均含有多个硫酸基，可能具有 更好的生理活性，已经成为医药、农业、食品等领域研究与开发的高科技竞争热 点。卡拉胶寡糖的生物活性虽然引起了人们的极大兴趣，但目前从获得手段上总 是显得比较乏力，缺乏有效的降解方法。传统的物理和化学降解反应条件不易控 制，产物分布不均匀，目的产物不易分离，根本无法进行大规模卡拉胶低聚糖的 制备。酶法降解条件温和、底物专一，可以从根本上解决这些问顾，从而受到人 们的广泛关注，同时，酶法降解卡拉胶也使得这种多糖有了更为广泛的应用潜力。 另外，卡拉胶酶还用于藻类原生质体的制备，对细菌卡拉胶代谢的研究具有重要 作用。因此，卡拉胶酶的研究具有重要的理论意义和应用价值。目前国内外对k 和卜卡拉胶酶研究较多，而对n 卡拉胶酶的研究报道很少，至今为止只有一个n 卡拉胶酶的基因报道。本文意在分离高活力的新型n 卡拉胶酶，从而填补国内研 究领域的空白；并研究其酶学性质和基因序列，为深入了解硫酸多糖降解酶的构 效关系提供新思路；同时，运用酶解的方法分离制备n 卡拉胶寡糖，为研究其生 理药理活性奠定基础。 海洋细菌c e l l u l o p h a g as p q y 2 0 1 的b 卡拉胶酶研究 l 卡拉胶 1 1 卡拉胶的结构与分类 卡拉胶是从某些红藻的细胞壁中提取的一种由1 ，3 p d 吡喃半乳糖和 1 ，4 吨d 吡喃半乳糖作为基本骨架，交替连接而成的线性硫酸多糖。含有卡拉胶 的海藻，主要是红藻纲中的角叉属、杉藻属、麒麟菜属、银杏藻属、卡帕藻属等， 其中角叉菜和星芒杉藻为提取卡拉胶的主要原料。 表l 不同类型卡拉胶的结构组成 t a b l elt h er e p e a t i n gd i s a c c h a r i d er e s i d u e si nd i f f e r e n te a r r a g e e n a n sf r o mv a r i o u s e a r r a g e e n o p h y t e s b 族r 拉胶 1 , 3 连接的1 4 连接的 类型 d i ) - 半乳糖a i ) - 毕乳塘单位 弘半乳糖d 硫酸基口半乳糖 _ 族譬拉胶4 硫酸萋d 半乳镑 x 族鼻拉胶2 硫酸茎队牛乳塘 i 每拉胶 u 譬拉胶 2 j 硫酸基4 6 旬吒1 羧弧 乙萋) 阻牛乳糖 6 - 硫酸基良牛乳糖 3 6 内醚o - - # 乳糖 2 6 二二硫酸基队半乳糖 6 硫酸基口牛乳搪 3 6 内醚d 牛乳糖 2 6 二硫酸基阻半乳箝 2 硫酸基3 6 内醛口半乳糖 刎酸基阻半乳糖 2 6 二硫酸茎队- 1 t 乳塘 2 硫酸基3 ，6 内醚- m ? 仁乳糖 细毫酸基阻牛乳塘 v y 、参 6 u v i x o i 3 ，6 - 内醚口半乳糖 u 根据是否含有3 , 6 内醚半乳糖结构以及硫酸基的含量和在分子中连接的位 置的不同，卡拉胶可分为十几种类型，k 卡拉胶，k 卡拉胶，u 卡拉胶，卜卡拉 胶，、1 ，卡拉胶，毛卡拉胶，卡拉胶，1 3 一卡拉胶，y 卡拉胶，6 卡拉胶，q 卡拉胶和卡拉胶。根据已经确定的各种类型的理想的卡拉胶重复二糖的结构 特征，以及l ，3 连接的d 半乳糖上的硫酸基位置，可将各类型卡拉胶分类为b 一 族卡拉胶、k - 族卡拉胶和n 族卡拉胶。p 族卡拉胶( 包括t ，b ，6 和q 卡拉胶) 2 海洋细菌c e l l u l o p h a g as p q y 2 0 1 的k 卡拉胶酶研究 在l ，3 连接的d 半乳糖单位上不含有硫酸基；b 族卡拉胶( 包括p ，k ，1 ) 一和 卜卡拉胶) 在l ，3 连接的d 半乳糖单位c 4 上带有1 个硫酸基；九族卡拉胶( 包 括 ，0 ，n 和兀卡拉胶) 则在其c 2 上有一个硫酸基。0 卡拉胶在藻体内是不 存在的，是k 卡拉胶经碱处理后形成的。此外，还有不属于这三族类型的f , o 卡 拉胶【1 】( 表1 ) 。 红藻中不存在理想的重复二糖连接的卡拉胶，是多种卡拉胶的混合体。目前 工业生产和使用的主要有k 型、卜型和k 型三种，其二糖单元分别含有1 个、2 个和3 个硫酸基( 图1 ) 。 一o 洛s o ：- 公丁 l 硼di d g 一 纠阻翻砷d 锄i i 凶o - g a l n o h l ，- - 蚤- r m r a g e e r m i - c a r m g a e r ) 1 - c b , 3 r g e e l 图1 卡拉胶的重复二糖理想结构式 f i g 1s t r u c t l l r e so fr e da l g a l s u l f a t e dg a l a c t a n s 1 2 卡拉胶的理化性质 卡拉胶为无臭、无味的白色至浅褐黄色粉末，是一种天然高分子化合物，无 一定的分子量。商业( 食品级) 卡拉胶的重均分子量通常为4 0 0 6 0 0 k d a ( v a n d e v e l d e ，2 0 0 2 ) 。所有类型的卡拉胶在热水中都能溶解。在冷水中，k 卡拉胶不论成 何种盐都能溶解。钠盐的静卡拉胶和卜卡拉胶也能溶解，而钾盐和钙盐的k 卡拉 胶只膨胀不溶解【2 1 。 1 c 和卜卡拉胶的水溶液加热近沸时就融化成溶胶，放冷后则形成凝胶，即有 海洋细菌c e l l u l o p h a g as p q y 2 0 1 的知卡拉胶酶研究 凝胶一溶胶的可逆反应；而n 卡拉胶基本上不形成凝胶。这种凝胶的性质主要取 决于多糖中存在的硫酸基及其结合位置，还因与其他类型卡拉胶的杂交程度、分 子量大小以及生产工艺等因素有直接关系。s t a r d e y ( 1 9 7 0 ) 曾提出以多糖中的 2 s 0 4 己糖与3 , 6 内酚己糖的含量比值将卡拉胶区分为无凝固能力类型和有凝 固能力类型【3 】。前者如n 卡拉胶和芒卡拉胶，它们在碱处理前或处理后都不凝固， 因为在l ，3 连接和1 ，4 连接的d 半乳糖c 2 上有硫酸基团。后者如卜卡拉胶和k - 卡拉胶，当加入k + 或经碱处理后可以凝固，它们在1 ，3 连接单位c 4 上都有硫酸 基团。 1 3 卡拉胶的应用 1 3 1 卡拉胶在食品、工业方面的应用 卡拉胶具有形成亲水胶体和凝胶、增稠、乳化、成膜、稳定分散等特性，可 以用作胶凝剂、增稠剂或悬浮剂，可用于稳定乳液、控制脱液收缩、赋形、胶结 和分散。广泛应用于乳制品、饮料、牛乳布丁、咖啡、果冻、罐头等食品工业上。 据估计，约有8 0 的卡拉胶被用于食品和食品相关的产业，其余的用在化妆品与 医药生产上。卡拉胶在工业上主要用做牙膏、洗发香波、洗涤剂、感光材料、陶 瓷制品等【4 ，5 1 。 1 3 2 卡拉胶在医药方面的应用 近年的研究发现多糖衍生物尤其是硫酸酯化多糖往往具有独特的生物活性， 它们经修饰、改造后，可被制成各种药物来造福人类。卡拉胶是从海洋三大藻类 之一红藻提取的一种结构独特的硫酸酯化多糖，已经被证明在抗病毒、抗溃疡、 抗凝血等方面具有较理想的药理活性，显示出其在医药领域广阔的发展前景【6 1 。 卡拉胶具有较强的抗病毒活性。研究表明卡拉胶尤其是九卡拉胶能通过阻断 疱疹病毒对宿主细胞的吸附过程，从而抑制疱疹病毒( h s v 1 ，h s v 2 ) 的侵染， 其活性与含硫量有关。卡拉胶还对多种病毒的逆转录酶有抑制作用，尤其是它能 抑制人免疫缺陷病毒( h ) 逆转录酶的活性，进而抑制h i v 的复制，保护宿主 细胞免受侵害阴。h i d e k in a k a s h i m a 等从红藻s c h i z y m e n i a p a c i f i c a 中提取了一种 硫酸多糖s a e ( 分子量2 0 0 0 k d ，经鉴定属于九卡拉胶族) 能在体外选择性抑制h i v 逆转录酶活性和h i v 复制。当用大于1 0 4 抑制单位毫升的s a e 作用于被h i v 浸 4 海洋细菌c e l l u l o p h a g as p q y 2 0 1 的知卡拉胶酶研究 染的m t 4 细胞时，就能明显观察到对病毒抗原合成的抑制。当用s a e 作用的 m t - 4 细胞还有9 0 存活时，对照组细胞已几乎全部死亡。由于卡拉胶的h i v 逆 转录酶抑制活性及毒性小等特点，已有将其用于防治艾滋病( 越d s ) 的报道【s j 。 卡拉胶另外一个重要的活性就是对消化性溃疡的保护和治疗。藻类多糖对胃 粘膜显示其保护作用，可与粘膜层上的粘蛋白结合，形成具抵抗力的膜性结构， 减少了胃液通过粘蛋白向粘膜的扩散【6 1 。此外，有报道认为，降解后的卡拉胶可 以再通过一定方式的化学修饰，如磺化或乙酰化，提高硫酸根含量或改变其空间 构型，以增强其抗病毒活性【9 ，o l 。卡拉胶经化学修饰改性后获得的c - 4 酯化的硒 化卡拉胶具有更好的生物可利用性和生理增益效应。经动物实验证明硒化卡拉胶 比以前的最佳硒化物亚硫酸钠毒性低数百倍，且活性更高、更易被吸收。因此， 卡拉胶可作为硒元素的良好载体，用于癌症等疾病的治疗【1 1 1 。 不过，由于未降解的卡拉胶粘度大、扩散困难、很难吸收；且其毒性大，未 达到有效量就能致死实验动物，从而限制了它的应用。因此，利用可以大量获得 的卡拉胶多糖作为基础原料，采用降解、接枝修饰和结构衍变等手段，增强其生 物活性并降低毒性，开发海洋新药，已经成为我国海洋糖类化合物研究的重要方 向。 2 卡拉胶寡糖 2 1 卡拉胶寡糖的生物活性 与很多硫酸多糖、硫酸低聚糖及其衍生物类似，卡拉胶寡糖具有抗病毒、抗 肿瘤、免疫调节、抗凝血以及诱导植物胚胎发育过程中小孢子形成等作用。尤其 是i 和n 卡拉胶寡糖，它们均含有多个硫酸基，可能具有更好的生理活性，从而 引起了人们的极大关注，已经成为医药、农业、食品等领域研究与开发的高科技 竞争热点。 牟海津等( 2 0 0 3 ) 通过酶解方法获得不同聚合度的1 c 新卡拉低聚糖，采用磺 化的方法进行化学修饰后，获得带有不同硫酸基含量的低聚糖衍生物，发现佟 新卡拉低聚糖具有明显的抗肿瘤活性，并认为其生物学活性同低聚糖的分子量、 空间结构以及硫的含量和存在位置有密切关系【1 2 j 。o e f e iz h o u 等人( 2 0 0 3 ) 通过 微波处理来源于c h o n d r u so c e l l a t u s 的n 卡拉胶，检测到降解的卡拉胶片段具有 5 海洋细菌c e l l u l o p h a g as p q v 2 0 1 的知卡拉胶酶研究 抗肿瘤和免疫病理学活性【1 3 1 。2 0 0 6 年，该小组又对降解的不同大小k 卡拉胶片段 的生理活性进行比较，发现分子量大的片段溶解度比较低，生物活性较小。动物 实验表明，降解的k 卡拉胶片段可以提高抗肿瘤活性和免疫病理学活性【l 训。李翊 等( 2 0 0 5 ) 探讨了卡拉胶寡糖对放射损伤的保护作用，得出卡拉寡糖对实验小鼠 有明显的辐射防护作用【1 5 】。为了开发新型畜禽饲料添加剂，充分利用海洋资源， 王秀武以酸解法制备的卡拉胶寡糖作为饲料添加剂，证明了卡拉胶寡糖可抑制肉 仔鸡肠道菌的增殖，促进小肠微绒毛生长发育，提高免疫反应和生产性能【l 们。 为了阐明寡糖及其衍生物的结构与活性之间的关系，袁华茂等2 0 0 5 年首先对卡拉 胶进行降解，利用凝胶色谱分离得到聚合度为6 1 2 的卡拉胶寡糖，利用红外、高 效凝胶色谱、质谱和核磁共振分析，确定了其结构和分子量范围。同时对其体外 体内的抗肿瘤抗氧化活性进行了研究，发现寡糖的抗肿瘤活性相对的要好于多 糖，降低卡拉胶分子量的大小可以增加其抗肿瘤活性；而卡拉胶寡糖及其衍生物 均能显著保护胸腺淋巴细胞免受长波紫外线以及过氧化氢的损伤，具有良好的抗 氧化作用；还能显著提高荷瘤小鼠的脾脏特别是胸腺指数，具有免疫调节活性 【l 刀。2 0 0 7 年，陈海敏等采用鸡胚尿囊膜模型( c a m ) x 观察n 卡拉胶寡糖对c a m 血 管发育的抑制，通过m t t 法测定n 卡拉胶寡糖对人脐静脉内皮细胞( h u v e c ) 增殖 的影响，说明了k 卡拉胶寡糖通过抑制内皮细胞的增殖、细胞侵袭和迁移达到血 管生成抑制的作用【1 8 】。 2 2 卡拉胶寡糖的测定方法 鉴定卡拉胶寡糖产物结构意义重大，其结构活性之间的联系( s a r ) 在药 物设计中显得越来越重要。目前，高压液相色谱( h p l c ) 、毛细管电泳( c e ) 、 高效凝胶渗透色谱( h p g p c ) 、高效离子色谱配合使用脉冲安培检测器 ( ，e c p a d ) 、电喷雾电离质谱( e s i m s ) 、核磁共振技术( 1 h ，1 3 c 蝴) 、红 外光谱( 瓜) 、单晶x 射线衍射等方法都是进行产物组成分析、纯度鉴定和结构 归属的较好方法。 s v e i n 等( 2 0 0 0 ) 报道了一种快速分子筛层析方法( s e c ) 对卜和b 卡拉胶 酶的降解产物进行分离和分析，以s u p e r d e x ( p h a r m a e i a ) 填料代替s e p h a d e x 和 b i o g e l ，大大提高了分离速度，2 0 分钟可以得到传统的数小时完成的分离图谱。 6 海洋细菌c e l l u 卸h a g as p q y 2 0 1 的b 卡拉胶酶研究 结合核磁共振和红外光谱分析，可以得到最小为卡拉二糖和最大为卡拉十二糖的 组分【1 9 1 。同年，e k e b e r g 等运用e s i m s 方法对佟卡拉胶寡糖系列进行了结构上 的确证【2 0 l 。于广利等( 2 0 0 2 ) 以静卡拉胶为原料，经盐酸水解，强阴离子交换 高效液相色谱分离纯化，得到了一种卡拉胶五糖。该五糖的结构经各种核磁共振 波谱技术( 1 h - n m r ，2 c - n m r ，1 h 1 h c o s y ，1 h 1 3 c h m q c ) 以及电喷雾离子化 质谱( e s i m s ) 得到了确证，其结构为：p d - 4 o 硫酸半乳糖( 1 4 ) - 0 【d 3 ，6 内醚 半乳糖p d - 4 o 硫酸半乳糖( 1 4 ) q d 3 ，6 内醚半乳糖一p d 4 0 硫酸半乳糖【2 l j 。 2 0 0 4 年，于广利等又从卡拉胶中获得了2 5 个寡糖，通过对k - 卡拉胶寡糖结构与 序列分析，首次提出了稀酸法水解静卡拉胶时水解反应只发生于a - ( 1 3 ) 糖苷键 之间，并得到还原端为4 硫酸半乳糖，非还原端为半乳糖或者4 硫酸半乳糖的 系列奇数寡糖。通过e s i m s 以及f a c e 分析，有力证明了佟卡拉胶分子中不存 在分枝点，是一个线性硫酸半乳聚糖。这些结构确定、序列明确的硫酸寡糖，为 进一步从分子水平上探讨其结构与活性关系提供了基础数据田】。2 0 0 6 年，g u i b e t 等人利用n 卡拉胶酶来完全降解g i g a r t i n as k o t t s b e r g i i 来源的k 卡拉胶，结合核 磁共振技术对寡糖产物进行结构研究，从而发现九卡拉胶二糖单元中并不像人们 先前所认为的只含有三个硫酸基，部分单元可能存在四个硫酸基四】。牟海津等 从m z 4 4 分离得到k - 胞外卡拉胶酶，降解卡拉胶。降解产物通过d c n m r 、瓜 和m a l d i t o f m s ( 基质辅助激光解析电离一飞行时间质谱) 分析可以明确地 得出卡拉胶酶解终产物的组成和结构，为进一步探讨卡拉胶寡糖的抗凝血和抗病 毒活性提供了基础数据【2 4 1 。同年，孙海红等首次利用高效毛细管区带电泳模式 紫外检测( c z e u v ) ，进行了佟卡拉胶寡糖的高效毛细管电泳分离分析方法的研 究。这对酸性寡糖毛细管分离分析的研究有着重要的意义【2 5 1 。 实际上，多种有力工具的联合运用将更有利于有关寡糖构象理论及极微量寡 糖的结构功能关系研究的发展。当然，寡糖构象及其功能关系的研究还不完善， 许多工作还有待进一步深入进行。 3 卡拉胶酶 卡拉胶寡糖的生物活性虽然引起了人们的极大兴趣，但目前从获得手段上总 是显得比较乏力，缺乏有效的降解方法。而传统的化学和物理降解方法反应条件 7 海洋细菌c e l l u l o p h a g as p q y 2 0 1 的b 卡拉胶酶研究 不易控制、产物分布不均匀，根本无法进行大量高纯度寡糖的制备。酶法降解条 件温和、底物专一，可以从根本上解决这些问顾，从而受到人们的广泛关注，同 时，酶法降解卡拉胶也使得这种多糖有了更为广泛的应用潜力。卡拉胶酶是一种 多糖水解酶，它可以降解卡拉胶的p 1 ，4 糖苷键，生成系列偶数卡拉胶寡糖，主 要有佟卡拉胶酶、1 卡拉胶酶和k 卡拉胶酶。目前有关卡拉胶酶的报道并不多见。 早在1 9 4 3 年，m o r i 就从海洋软体动物中提取到能够水解角叉菜卡拉胶的酶【2 6 1 。 海洋假单胞菌p s e u d o m o n a sc a r r a g e e n o v o r a 是最早研究的能够产生卡拉胶酶的微 生物。1 9 6 6 年，w e i g l 等人从只c a r r a g e e n o v o r a 分离到k - 卡拉胶降解酶，该酶在 对静卡拉胶降解的过程中，使其粘度迅速下降，还原糖含量增加，降解产物以 4 硫酸新卡拉二糖为主【2 7 1 。现在己经在假单胞菌、噬纤维菌c y t o p h a g a 、别单胞 菌属a l t e r o m o n a sa t l a n t i c a ，a c a r r a g e e n o v o r a 及某些未鉴定菌种中发现到卡拉胶 降解酶。本实验室也一直在从事这方面的工作，并成功筛选到一株产静，卜和n 卡拉胶酶的菌株c e l l u l o p h a g as p q y 2 0 1 ，拜晶晶等对该菌株发酵所产的卜卡拉胶 酶进行了研究，分离纯化得到了分子量为5 0 k d 的卡拉胶酶，其水解的最终产物 为1 新卡拉二糖和i 新卡拉四糖。另外，该酶最显著的性质是其酶活的最适p h 值为1 0 ，这在国际上属首次报道【2 8 1 。 3 1 卡拉胶酶的来源 卡拉胶酶来源广泛，主要包括微生物和海洋动物。能够产生卡拉胶酶的微生 物大部分是海洋细菌，已经在假单胞菌属2 9 ，3 0 3 1 1 、别单胞菌属【3 2 1 、噬纤维菌属【3 3 1 、 弧菌属p 4 】等中检测到卡拉胶酶。在以海藻为食的海洋动物体内也发现了卡拉胶 酶，软体动物是其中最为重要的一种，早在1 9 4 3 年，m o r i 就从中提取到能够水 解角叉菜卡拉胶的酶【2 6 1 ；s k e a 等( 2 0 0 7 ) 在新西兰食草鱼内脏中也发现了可以 降解卡拉胶的酶【3 5 】。 3 2 卡拉胶酶的分类 卡拉胶酶作为一种糖苷水解酶，根据酶解底物的专一性，主要分为k - 卡拉胶 酶、卜卡拉胶酶和n 卡拉胶酶等。目前的研究已经确定k 卡拉胶酶属于1 6 糖苷 水解酶家族，专一水解a 一3 ，6 内醚一d 一半乳糖和p - 4 - 硫酸- d 半乳糖之间的d 1 ，4 - 糖苷键，生成以1 ( 硫酸新卡拉寡糖为主的终产物；而卜卡拉胶酶则属于另外一种 8 海洋细菌c e l l u l o p h a g as p q y 2 0 l 的b 卡拉胶酶研究 新的糖苷水解酶8 2 家族，作用于a - 2 硫酸3 ，6 一内醚d 半乳糖和p 一4 一硫酸d 一半乳 糖之间的p 一1 ，4 糖苷键，生成以卜硫酸新卡拉寡糖为主的终产物：k 卡拉胶酶特 异性降解a 一2 ，6 硫酸d - 半乳糖和p 2 硫酸d 半乳糖之间的p - l ，4 糖苷键，生成以 n 硫酸新卡拉寡糖为主的终产物，不属于任何已知的糖苷水解酶家族。目前所发 现的卡拉胶酶大多数是k - 卡拉胶酶，只有2 种卜卡拉胶酶和1 种n 卡拉胶酶。 + l 啦 图2k 卡拉胶的两个糖单元立体结构图 f i g 2s c h e m a t i cd i a g r a ms h o w i n gt w od i s a c c h a r i d e - r e p e a t i n gu n i t so f c - c a r r a g e e n a n k 卡拉胶中两种不同的糖苷键被标记出来，分别用r 和r ”表示还原端和非还原端。 图中表示出k - 卡拉胶酶水解瞰1 ，4 ) 糖苷键的位点。 t h et w od i f f e r e n tg l y c o s i d i cb o