（动物学专业论文）壬基酚和β萘黄酮对河川沙塘鳢（odontobulis+potamophila）幼鱼雌激素抗雌激素效应的研究.pdf

摘要 中文摘要 近年来，环境内分泌干扰物质( e d c s ) 对人类和野生生物的危害越来越受到人 们的关注。这些物质通过模拟或拮抗下扰生物体内源激素的形成或功能，由此影响 生物体生长、发育、繁衍等生命活动。目前，关于单一环境内分泌干物对鱼的影响 的研究已相当深入，但多数是对成鱼阶段的研究，对幼鱼阶段的研究相对较少。野 外自然环境是个复杂的，多元化的，往往存在多种e d c s 共同作用，其原理和结果有 时与单一物质作用时人不相同。本文以壬基酚( 4 n o n y l p h e n o l ，n p ) 和p 一萘黄酮 ( i b - n a p h t h o f l a v o n e ，p n f ) 为内分泌- t 扰物质，研究其对河川沙塘鳢幼龟阶段的雌激素 和抗雌激素效应的影响，主要包括以下两部分，探索n p 长期暴露对河川沙塘鳢性腺 分化和精巢发育的影响，以及对肝脏卵黄蛋f 1 原( v i t e l l o g e n i n ，v t g ) 的诱导；以 河川沙塘鳢幼鱼肝脏卵黄蛋白原( v i t e l l o g e n i n ，v t g ) 的转录和表达为指标，研究 壬基酚和p 萘黄酮联合作用下的雌激素抗雌激素效应，以及对7 乙氧基3 异吩嗯唑 酮脱乙基酶( e r o d ) 和谷胱甘肽转移酶( g s t ) 等牛物转化系统酶的影响。为进 一步了解环境内分泌t 扰物对幼龟生态毒理影响研究提供基础资料。 l 壬基酚对河川沙塘鳢( o d o n t o b u l i s p o t a m o p h i l a ) 幼鱼卵黄蛋白原的诱导 v t g 已被公认为检测鱼类和其他卵生脊椎动物受环境雌激素影响的生物标志 物。本章运用酶联免疫吸附反应( e l i s a ) 和半定量r t p c r 米研究n p 对河川沙塘鳢 幼鱼卵黄蛋白原诱导的情况。把孵化出的河川沙塘鳢仔鱼暴露于3 个浓度( 1 0 0 p g l 、 3 0 0 p g l 和5 0 0 i - t e d t , ) 的壬基酚中。暴露时间为1 5 0 d 。研究结果显示，n p 可以诱导河 川沙塘鳢幼鱼肝脏v t g 基凶的表达，并合成v t g 蛋白；血液中v t g 蛋白的含量以及 肝脏v t g m r n a 的表达量随着n p 浓度的增加而递增，具有明显的浓度效应；当n p 达 到5 0 0 0 9 l 时，所诱导的v t g 量与对照相比差异极显著( 尸 o 0 0 1 ) 。囚此v t g 的含量 及基凶表达水平可以作为环境雌激素监测的有效终点指标。 2 壬基酚长期暴露对河川沙塘鳢( o d o n t o b u l i s p o t a m o p h i l ) 性腺分化和发育的影响 本章利用组织学方法研究了环境雌激素化合物壬基酚对河川沙塘鳢性腺分化和 发育的影响。把人工孵化的河川沙塘鳢仔鱼暴露于3 个浓度( 1 0 0 、3 0 0 和5 0 0 耀l ) 的工基酚中，同时设空白对照和溶剂对照，暴露时间为1 5 0 d ，显微观察性腺组织。 试验结果显示，河川沙塘鳢性腺分化的过程足由中性的性腺直接分化出卵巢或精巢。 暴露于5 0 0 u g l n p 以下的各处理组中的河川沙塘鳢性别比例约为l ：l ，与对照组没有 差异；但是精巢未发育的个体数量随n p 浓度提高而增加，在n p 3 0 0 p g l 和n p 5 0 0 鸺l 摘要 暴露组中分别占样本总数的2 0 和2 2 ：此外，n p 对精巢组织结构产生一定的毒害， 精巢中出现了坏夕e 细胞和纤维化现象。 3 壬基酚和肛萘黄酮联合暴露对河川沙塘鳢( o d o n t o b u l i s p o t a m o p h j , 1 ) 幼鱼卵黄蛋 臼原诱导的影响 利用e l i s a 和r e a l t i m er t - p c r 来研究n p 和类多环芳烃化合物一b n f 联合暴露 对河川沙塘鳢幼鱼v t g 的诱导情况。把河川沙塘鳢幼鱼分别暴露在( n p l 0 0 1 a g l ， 2 0 0 腭几，3 0 0 i _ t g l ：n p 2 0 0 腭几+ 卧f3 0 p g l ，n p 2 0 0 1 t g l + 1 3 n f6 0 f t g l ，n p 2 0 0 p g l + l b n f l 2 0 1 a g l ) 6 个浓度组，暴露2 8 d 后取样进行检测。结果显示：n p 所诱导的雌 激素效应可被斛f 抑制， 3 n f 3 0 g l + n p 2 0 0 i - t g l ，刚f 6 0 p g l + n p 2 0 0 0 9 l 和j b n f 1 2 0 “g 几+ n p 2 0 0 p g l 各组样品的血清v t g 蛋白含量分别为阳性对照( n p 2 0 0 p g l 组) 的3 6 、4 0 和3 5 ，差异极显著( p 0 0 0 1 ) ；这种抑制效应也体现在转录水平 上，刚f 也抑制v t g m r n a 的表达量，表现为较强的抗雌激素效应。 4 壬基酚和p 萘黄酮对河川沙塘鳢( o d o n t o b u l i sp o t a m o p h i l ) 幼鱼生物转化酶系统 的影响 本章主要以e r o d 酶j f i i g s t 酶为标志物来探i f n p 幂i i 刚f 单独和联合暴露对幼鱼 生物转化系统的影响。把河川沙塘鳢幼鱼分别暴露在( n p l 0 0 p g l ，2 0 0 p g l ， 3 0 0 n g l ；i b n f 3 0 f t g l ，6 0 p g l ，1 2 0 l a g l ：n p 2 0 0 g l + p n f 3 0 “g l ，n p 2 0 0 肚g l + p n f 6 0 p g l 、n p 2 0 0 p g l + p n f l 2 0 p g l ) 9 个浓度组，并且设一个空白对照，暴露 2 8 d 后取样进行检测。试验结果显示：首先，n p 单独暴露时可以抑$ i e r o d 酶的活 性；当j 3 n f 单独暴露时，i b n f3 0l ag l 和j b n f6 0ug l 暴露组的活性升高，f 且是与对 照没有明显的差异，郦n f l 2 0 p g l 的活性却下降，有可能由于浓度太高导致酶的 活性诱导机制欠活。当p n f 与n p 联合暴露，活性恢复到对照的水平，但是与 n p 2 0 0 g l 相比，其活性迅速升高。最后，n p 和刚f 单独暴露时可以降低g s t 酶的 活性，而刚f 与n p 联合暴露后，酶的活性恢复到对照的水平，与对照相比没有显 著的差异。无论是单独暴露还是联合暴露g s t 的酶活性均没有升高，这说明了在第 1 i 相代谢过程中除了g s t 参与此阶段的反应，还有其他的酶参与此反应，如尿苷二 磷酸葡萄糖酸转移酶( u d p g t ) 。 关键词壬基酚；p 一萘黄酮：河川沙塘鳢；性别分化；性腺发育；卵黄蛋白原；7 - 乙氧基3 异吩嗯唑酮脱乙基酶( e r o d ) ；谷胱甘肽硫转移酶( g s t ) 。 2 a b s u a c t a b s t r a c t r e c e n t l ge n d o c r i n ed i s r u p t i n gc h e m i c a l s ( e d c s ) a r ec a u s i n ga ni n c r e a s i n g l ys e r i o u s p o l l u t i o np r o b l e mt ot h eh u m a na n dw i l d l i f ea l lo v e rt h ew o r l d t h e s ec h e m i c a l sh a v et h e a b i l i t yt om i m i co rr e s i s tt h ea c t i o no fe n d o g e n o u sh o r m o n e s ，a n da f f e c tg r o w t h ， d e v e l o p m e n ta n dr e p r o d u c t i o na n d s oo n a tp r e s e n t ，s o m er e s e a r c hw o r ka b o u tt h es i n g l e c h e m i c a l se f f e c t so nf i s hw e r ef o c o u s e do nm a t u r ef i s h ，a n dl e s sa t t e n t i o nh a sb e e ng i v e n t ot h ee f f e c ti nj u v e n i l ef i s h f u r t h e r m o r e t h ew i l de n v i r o n m e n ti sc o m p l e x , d i v e r s i f i c a t i o na n dt h ee d c s a l w a y si n t e r a c t w i t h e a c ho t h e rtt h e i rf u c t i o na n d m e c h a n i s m sa r ev e r yd i f f e r e n tf r o mt h es i n g l ec h e m i c a l s i nt h i sp a p e r , w eu s e d 4 - n o n y l p h e n o l 州p ) a n d1 3 - n a p h t h o f l a v o n e ( 1 3 n f ) a st w oa n t a g o n i s me d c st os t u d yt h e e s t r o g e n i ca n da n t i e s t r o g e n i ce f f e c t so nj u v e n i l eg o b b i df i s h t h i sp a p e ri n c l u d e dt w o p a r t s ，f i r s t ，t h el o n g - t e r mn pe x p o s e de f f e c t s o nt h es e xd i f f e r e n t i a t i o n ，t e s t i s d e v e l o p m e n t a n dv t gi n d u c t i o nw e r e s t u d i e s ； s e c o n d ， w es e l e c t v t g ， e t h o x y r e s o r u f i n - o - d e e t h y l a s e ( e r o d ) ，a n dg l u t a t h i o n es - t r a n s f e r a s e ( g s t ) a sb i o m a r k e r s t os t u d yt h ee f f e c t so fn pa n dp n fo nj u v e n i l eg o b b i df i s h t h eu l t i m a t ea i mw a st o p r o v i d eb a s i cd a t e st o f u r t h e ru n d e r s t a n d i n gt h ee f f e c t so fe d c so nj u v e n i l ef i s h e x t o x i c o l o g y ie f f e c to f n po nv t gi n d u c t i o ni n j u v e n i l eg o b b i df i s h ( o d o n t o b u t i s p o t a m o p h i l a ) v t gh a sb e e nu s e da sa ni m p o r t a n tb i o m a r k e rf o ra s s e s s i n gt h ee s t r o g e n i cp o t e n c y i nf i s ha n do t h e ro v i p a r o u sv e r t e b r a t e t h i sp a p e rr e p o r t e dt h ee f f e c to fn po nv t gi n g o b b i df i s hb ye l i s aa n ds e m i - q u a n t i t a t i v er e v e r s et r a n s c r i p t i o n - p o l y m e r a s ec h a i n r e a c t i o n ( r t - p c r ) t h el a r v a ew e r ee x p o s e dt o 10 0 腭几，3 0 0 p g l ，5 0 0 肛g l ( n o m i n a l c o n c e n t r a t i o n s ) n p t h ep e r i o dl a s t e d15 0d a y s p l a s m av t gc o n c e n t r a t i o n sa n di t s m r n al e v e io fg o b b i df i s hw e r em e a s u r e d t h er e s u l t s s h o w e d ：p l a s m av t g c o n c e n t r a t i o na n di t sm r n al e v e li n c r e a s e dw i t ht h en pc o n c e n t r a t i o n t h i se f f e c tw a s d o s ed e p e n d e n t ，i tw a sg r e a t l ys i g n i f i c a n td i f f e r e n c ei nt h en p 5 0 0 斗g le x p o s u r e g r o u p ( p 0 0 01 ) w i t ht h ec o n t r o lg r o u p s ot h ec o n c e n t r a t i o no fv t g a n di t sm r n al e v e l c o u l db et h ea p p r o p r i a t ee n d p o i n t sf o rs c r e e n i n ge n v i r o n m e n t a le s t r o g e n s 2e f f e c to fl o n g - t e r mn pe x p o s e do nt h eg o n a d a ld i f f e r e n t i a t i o na n dd e v e l o p m e n ti n g o b b i df i s h ( o d o n t o b u t i sp o t a m o p h i l a ) t h ee f f e c to fe n v i r o n m e n t a le s t r o g e nc o m p o u n d ，4 - n o n y l p h e n o i ( n p ) o ng o a n d a l a b s t r a c t d i f f e r e n t i a t i o na n dd e v e l o p m e n ti ng o b b i df i s hw a ss t u d i e db yu s i n gh i s t o l o g i c a l t e c h n i q u e s t h el a r v a e w e r ee x p o s e dt olo o p g l ，3 0 0 嵋几，5 0 0 p g l ( n o m i n a l c o n c e n t r a t i o n s ) n p , b l a n kc o n t r o lg r o u pa n dv e h i c l ec o n t r o lg r o u p t h ep e r i o dl a s t e d15 0 d a y s ，a n dt h e nt h eg o n a d sw e r ee x a m i n e dw i t hh i s t o l o g i c a lm e t h o d s t h er e s u l t ss h o w e d t h a tt h ep r o c e s so fg o n a d a ld i f f e r e n t i a t i o nd e v e l o p e dn e u t r o n s t a t e sa tf i r s t ，a n dt h e n d i r e c t l yf o r m e do v a r ya n dt e s t i s c o m p a r e dw i t hc o n t r o lg r o u p ，t h e r ew e r en os t a t i s t i c a l l y s i g n i f i c a n td e p a r t u r e sf r o ms e xr a t i oo f1 ：l a ta n yc o n c e n t r a t i o ng r o u p so fn p , b u tt h e n u m b e ro fu n d e v e l o p e dt e s t e sw a si n c r e a s e d t h ep e r c e n t a g eo fu n d e v e l o p e dt e s t i sw e r e 2 0 a t3 0 0 烬几n pa n d2 2 a t5 0 0 g ln pr e s p e c t i v e l y , f u r t h e r m o r e ，n o to n l y t e s t i c u l a rd e v e l o p m e n tw a ss u p p r e s s e di nt h ee x p o s e dg r o u p ，b u ta l s oh i s t o p a t h o i o g i c a l c h a n g e sw e r ea l s oo b s e r v e dw i t h i nt h et e s t e s i n c r e a s e dt e s t i c u l a rf i b r o s i sa n dn e c r o t i c t e s t i c u l a rc e l l sa tt h eh i g hc o n c e n t r a t i o no f np 3t h ee f f e c t so fn pa n d1 3 n fc o m b i n e do nv t gi nj u v e n i l eg o b b i df i s h ( o d o n t o b u t i s p o t a m o p h i l a ) t h i ss t u d yi n v e s t i g a t e dt h ee f f e c t so fc o m b i n e dw i t hn pa n dp o l y c y c l i ca r o m a t i c h y d r o c a r b o n s ( p a h s ) l i k ec o m p o u n d 一州fo nv i t e l l o g e n i n ( v t g ) i n d u c t i o ni nj u v e n i l e g o b b i df i s hb yu s i n ge l i s aa n dr e a l - t i m er t - p c r t h ej u v e n i l ef i s hw a se x p o s e dt o n p l 0 0 “g l ，n p 2 0 0 p g l ，n p 3 0 0 肛g l ；n p 2 0 0 p g l + p n f 3 0 肛g l ，n p 2 0 0 “g l + p n f 6 0 1 a g l ，n p 2 0 0 p g l + p n f i2 0 p g l ( n o m i n a l c o n c e n t r a t i o n s ) e a c he x p e r i m e n t a l e x p o s u r ew a sf o r2 8d a y s ，p l a s m av t g a n dl i v e rv t gm r n aw e r em e a s u r e di no r d e rt o e v a l u a t et h ee f f e c to fc h e m i c a l so nf i s h t h er e s u l t ss h o w e d ：t h ee s t r o g e n i ce f f e c to fn p w a si n h i b i t e db yp n f t h ep l a s m av t g p r o t e i no fp n f 3 0 1 a g l + n p 2 0 0 1 a g l ，j 3 n f 6 0 i a g l + n p 2 0 0 p g la n d1 3 n f 12 0 i t g l + n p 2 0 0 1 a g lw e r e3 6 ，4 0 ，3 5 r e s p e c t i v e l yo v e rt h e n p 2 0 0 p g lg r o u p ，a n dh a v eg r e a t l ys i g n i f i c a n td i f f e r e n c e ( p 0 0 01 ) ，a n dt h eg e n e e x p r e s s i o nw a si n h i b i t e d t h ev t g m r n aw a sa l s or e s t r a i n e di nt h ew ea n dn p c o m b i n e dg r o u p s ( 尸 0 0 5 ) s ot h e r ew a sa n t i e s t r o g e n i ca f f e c t i o ni nt h ec o m b i n e dg r o u p s 4t h ee f f e c t so fn pa n dm eo nb i o t r a n s f o r m a t i o ne n z y m es y s t e mi nj u v e n i l eg o b b i d f i s h ( o d o n t o b u t i sp o t a m o p h i l a ) t h i sp a p e ri n v e s t i g a t e dt h ee f f e c t so fn pa n dp n fo nb i o t r a n s f o r m a t i o ne n z y m e s y s t e mi nj u v e n i l eg o b b i df i s h t h ef i s hw a se x p o s e dt on p 10 0 腭几，2 0 0 p g l ，3 0 0 增几； 1 3 n f 3 0 虮，6 0 g l ， 1 2 0 l a g l ；n p 2 0 0 p g l + p n f 3 0 嵋几，n p 2 0 0 1 x g l + 1 3 n f 6 0 p g l ， n p 2 0 0 腭几+ i b n f i2 0 i g l ( n o m i n a l c o n c e n t r a t i o n s ) a n d b l a n kc o n t r o l g r o u p e a c h 4 a b s t r a c t e x p e r i m e n t a le x p o s u r ew a sf o r2 8d a y s ，a n dt h e ne r o da n dg s ta c t i v i t i e sw e r e m e a s u r e di no r d e rt oe v a l u a t et h ee f f e c to fe n v i r o n m e n t a ic h e m i c a l so nf i s h t h er e s u l t s s h o w e d ：f i r s t , n pc a ni n h i b i tt h ee r o da c t i v i t i e s ，t h e r ew a sad i f f e r e n c ea tt h e n p 2 0 0 增几a n d3 0 0 鹏几g r o u p 俨 o 0 5 ) w i t hc o n t r o lg m u p 。1 8 n f 3 0 9 9 la n di b n f 6 0 g l c a ni m p r o v et h ee r o da c t i v i t y ，b u ti tw a sn od i f f e r e n c ew i t hc o n t r o lg r o u p ，t h ea c t i v i t y d e c l i n e da tt h ej 3 n fi2 0 嵋lg r o u p ，t h ei n d u c e dm e c h a n i s m so f e n z y m em a yb ed e s t r o y e d b yp n fa tt h eh i g hc o n c e n t r a t i o n w h e nm i x e dn pa n d 刚f t h ee r o da c t i v i t i e sg e t b a c kt ot h el e v e lo fc o n t r o lg r o u p s e c o n d ，t h eg s t a c t i v i t yo f t h en pg r o u pa n dt h e 刚f g r o u pw a sd e c l i n e d ，w h e nt h e yc o m b i n e d ，t h eg s ta c t i v i t yl e v e lr e s t o r e dt h ec o n t r o l g r o u p w h e t h e rn pa n d 州fs i n g l eo rc o m b i n e d ，t h eg s ta c t i v i t yd i d n ti n c r e a s e ，t h i s m a y b es o m eo t h e re n z y m e sa c t i v ei nt h i sp a s e ，s u c ha su d p g l u c u r o n i d et r a n s f e r a s e ( u d p g t ) k e y w o r d s4 - n o n y l p h e n o ；1 3 - n a p h t h o f l a v o n e ；o d o n t o b u t i sp o t a m o p h i l a ： s e xd i f f e r e n t i a t i o n ；g o n a d d e v e l o p m e n t ；v i t e l l o g e n i n ；e t h o x y r e s o r u f i n o - d e e t h y l a s e ( e r o d ) ；g l u t a t h i o n es - t r a n s f e r a s e ( g s t ) 5 学位论文独创性声明 本人所呈交的学位论文是我在导师的指导下进行的研究工作及取 得的研究成果据我所知，除文中已经注明引用的内容外，本论文不包 含其他个人已经发表或撰写过的研究成果。对本文的研究做出重要贡献 的个人和集体，均已在文中作了明确说明并表示谢意 作者签名：痞习社日期： 学位论文授权使用声明 本人完全了解华东师范大学有关保留、使用学位论文的规定，学校 有权保留学位论文并向国家主管部门或其指定机构送交论文的电子版 和纸质版。有权将学位论文用于非赢利目的的少量复制并允许论文进入 学校图书馆被查阅。有权将学位论文的内容编入有关数据库进行检索 有权将学位论文的标题和摘要汇编出版。保密的学位论文在解密后适用 本规定。 学位论文作者签名：鸯祥翠 日期：迎畔 厂、 撇名：词娠 导师签名：俐影l 入 日期： 绪论 绪论 内分泌干扰物( e n d o c r i n ed i s r u p t i n gc h e m i c a l s ，e d c s ) 是指能改变极体内分泌功 能，并影响牛物体或其后代的发育、繁殖和行为的外源性物质。内分泌干扰物按其 生物活性可分为类雌激素及抗雌激素、类雄激素及抗雄激素、类甲状腺素及抗甲状 腺素等。目前研究最多的是类雌激素和抗雌激素，主要包括有机氯农药、洗涤剂、 除莠剂、二恶英以及某些重金属如铅、镉等。内分泌t 扰物已在全球范围内对野牛 生物种群造成明显影响，导致鸟类( k r i s t e rh a l l d i n ，2 0 0 5 ；江燕琼，2 0 0 7 ) 、鱼类( 沈 万赞，2 0 0 7 ；r i n u sb o g e r s ，e ta 1 。2 0 0 6 ) 和哺乳类动物( 孙茕，2 0 0 7 ；m c l a c h l a nj a ， 2 0 0 6 ) 的繁殖能力下降、出牛缺陷增加、代谢行为异常以及动物的性畸变现象等。 更为重要的是，许多研究认为内分泌干扰物质能引起人类精子数目减少，精子活力 下降，不孕，不育，性器官发育畸形以及乳腺癌、睾丸癌发病率升高( w i s el a 2 0 0 5 ； t s u t s u m io ，2 0 0 5 ；c h o is m ，2 0 0 4 ) 等。随着环境污染的加剧，大量的内分泌t 扰物 质从相应的生产过程中不断的释放，通过饮食、接触等途径进入生物体内，对生物的 生存及人类的健康都产牛了巨大的影响。因此。研究环境内分泌干扰物质在生物体 内的作用机制、监测控制以及对其进行识别已成为当前环境科学界的当务之急。 环境雌激素是一种常见的内分泌干扰物，随着工业的发展，环境雌激素对环境 的巨大危害越来越为人们所认识与重视，特别是对牛物的危害。环境雌激素在环境 中广泛存在，能在十壤和水体中长期残存，且能通过迁移、转化过程和自然循环散 布到包括南极和北极的世界各地；污染物能沿食物链传播，在动物脂肪组织聚集， 使动物产牛过敏反应、免疫系统和牛殖系统受损等病症。由于这些污染物的难降解 性，从环境中去除极为困难，因而进行生物的生态毒理相火研究非常必要。当有机 污染物使牛物体发生可观察的毒性反应时，需要较长的作用时间。因此，建立环境 雌激素污染物的甲期监测模型，通过研究明确污染物对生物体的毒性伤害和甲期表 现出的对细胞水平生物标记物的诱导状况之问的火系，以毒性伤害为污染的评判标 准，应用早期细胞水平毒理反应的良好预警作用，对水环境进行生物监测，可减少 对仪器的依赖性高、需耗费大量的人力物力的化学分析工作。 在众多的环境雌激素物中，壬基酚( 4 n o n y l p h e n o l ，n p ) 是非离子表而活性剂 壬基酚聚氧乙烯醚( n p e o s ) 的合成材料和分解产物，广泛存在于各种环境介质中， 是一种具有雌激素活性的物质( p u r d o m ，ce ，e ta 1 ，1 9 9 4 ；m e t c a l f e ，cd ，e ta 1 ，2 0 0 1 ) 。 对鱼类的影响包括发育的畸形，性比的失调，雌雄同体的机率增高，导致生物的不 育、抑制性腺的发育和生殖功能，减少排卵的数量和质量，受精卵的成活率也下降 以及卵黄蛋白原( v i t e l l o g e n i n ，v t g ) 的诱- 导( h i l l ，e ta 1 ，2 0 0 3 ；v a z q u e zd u h a l t , e ta 1 ， 绪论 2 0 0 6 ) 等。同时对7 乙氧基3 异吩嗯唑酮脱乙基酶( e r o d ) 和谷胱甘肽转移酶( g s t ) 等牛物转化酶系统有一定的影响( e m i l i av a c c a r o ，2 0 0 5 ) 。 在环境中还有些物质表现出一定的抗雌激效应，如t c d d 可以拈抗或抑制靶器 官的雌激素效应( o h t a k e ，f ，2 0 0 3 ) ，多氯联苯类化合物( p c b s ) 可以结合到芳香烃 受体上( a h r ) ，诱导c y p i a 的活性，抑制v t g 的合成( k i r b y e ta 1 ，2 0 0 4 a , b ) ，对性 腺的发育有一定的影响。多环芳香烃化合物( p a h s ) 是一种有毒的有机化学物质， 分子巾含有两个或两个以上苯环结构的化合物，是最早被认识的化学致癌物，主要 在石油的生产、加：i ：以及石油燃料的使用过程中产牛。表面水中p a h s 的来源丰要包 括城市生活污水、工业废弃物、大气沉降、表面径流，以及土壤浸析等。有报道指 出p a h s 可抑制鱼体内卵黄蛋白原的分泌，并且有许多是a h r 的活化剂( n i c o l a s ， 1 9 9 9 ；梁勇等，2 0 0 4 ) ，抑制龟体性腺的发育，这对角类的生长和繁殖造成危害。 p 萘黄酮( 1 3 - n a p h t h o f l a v o n e ，d n f ) 是多环芳香烃化合物的类似物，但是一种非致 癌的类黄酮物质，是一种抗雌激素物质( p a c h e c oa n ds a n t o s ，2 0 0 2 ) ，p n f 是a h r 的激 活剂，主要影响鱼类的e r o d 酶活性、c y p i a 、尿苷二磷酸葡萄糖苷酸转移酶 ( u d p g t ) 、g s t 和遗传毒性( w i l s o ne ta 1 1 9 9 8 ；t e l e s ，m ，2 0 0 3 ；t e l e s ，m ，e ta 1 ， 2 0 0 4 ) 。但是有关p 萘黄酮对鱼类卵黄蛋白原诱导的研究较少。 内分泌t 扰物对生物和人类的侵害主要是通过三种直接的途径进行的，即空气 侵入、水源侵入和食物侵入等。其巾地面水是环境污染物最人的贮存库，随着工农 业牛产的发展，越来越多的外源环境污染物直接排放、转移、迁移进入水牛态环境， 对水体造成了一定的污染，生活在其中的鱼类往往先受其害，以鱼为研究对象，考 察环境内分泌干扰物对鱼体的影响，可以为生态风险评价及环境执法提供可靠的依 据，为可持续水牛牛态系统的管理提供重要的牛物指标。 在水生生态系统中，鱼类处于食物链顶端，可在其组织脏器和脂肪中富集无机 和有机污染物，当浓度达到个阈值水平时会影响其产卵、发育，生长、成熟、繁 殖甚至导致死亡。因此龟类彳i 仅可以指示污染物的累积效应，而且能够指示不同层 次上污染的毒性效应。在外源激素的生态和健康风险研究中，确定污染物对脊椎动 物的繁殖和发育影响，尤其是长期低水平暴露后的动物毒性效应至关重要。 鱼类具有与哺乳动物类似的生理系统，在鱼类中许多由污染物导致的功能紊乱 可能与人类相似，特别是生殖内分泌系统与其它脊椎动物具有很大相似点。凶此在 鱼类中发现的污染效应可以应用到其它脊椎动物中，甚至可以预测对人类产牛的类 似后果。 利用鱼类进行污染物的长期效应研究具有很大的优点。与哺乳动物不同，鱼在 繁殖季节可以将大量的卵子释放到环境中，通过其所产卵子和精子的数量与活力， 受精率和后代的存活率来确定环境污染对鱼本身的生殖力以及后代的影响。除此以 2 绪论 外，鱼类适合在野外环境( 原位) 和实验室培养( 静态和流水试验) 中生长，可以 在限定的发育时期或在繁殖时期的不同生命阶段进行暴露染毒，甚至可以将它们暴 露于已受污染的生态系统进行研究和验证。 此外，鱼类生活于水中，毒性试验时操作极为方便，特别是耗时长的慢性环境 毒性试验；管理上也比较经济。利用鱼类动物对环境污染物进行生物监测，与理化 分析手段相比，具有直观、客观、综合和历史可溯源性的特点，能更真实更直接反 映环境污染的客观状况，这种综合性和真实性是任何化学监测无法比拟的。 有毒的化学物质很少在白然环境中孤立存在的。暴露于不同化学物质的混合物 中可能会导致毒物的相互作用。毒物相互作用是指这样一种现象：即暴露于两种或 更多化学物质中所产生的生物学效应，在数量和质量上均与这些化学物质单个所产 牛的效应4 i 同。毒物相j 与：作用包括协同、拈抗、相加等。协同效应是指两种化学物 质的组合效应大于其个体效应的总和，而拮抗作用是指同时施加两种化学物质时， 这两种物质会相互干扰，从而导致他们的效应减少。由于毒物相互作用可能与剂量 有关系，这使得其更加复杂化。由此可知以每种毒物的单独效应为基础，来预测这 些物质混合后的影响是错误的。很明湿，在评估化学物质的联合毒性时，对每种有 毒物在不同浓度时相互作用的认识是很重要的。 河川沙塘鳢( o d o n t o b u l i s p o t a m o p h i l ag 0 n t h e r ) 隶属鲈形h 、沙塘鳢科。是广 泛分斫门= 我国长江巾下游及其支流的底栖小型肉食性鱼类，因其含肉量高，肉质细 嫩，深受人们的欢迎，是种很有开发前景的经济鱼类。为此，对于河川沙塘鳢牛 物学、繁殖生物学( 孙帼英等，1 9 9 6 ；谢仰杰等，1 9 9 6 ：胡先成等，2 0 0 7 ) 、卵黄 蛋白原、卵黄磷蛋白( 吴鹰等，2 0 0 6 a ；顾建华等，2 0 0 7 ) 、以及环境内分泌干物( 如 e 2 、壬基酚和苯并芘) 对河川沙塘鳢成鱼内分泌影响( 吴鹰等，2 0 0 6 b ) 等各方面 进行系统研究。但是有火内分泌干扰物对河川沙塘鳢幼鱼阶段的影响尚没有研究。 南于幼鱼对环境内分泌干扰物反应比较敏感，再加上近年来，太湖流域河川沙塘鳢 的数量日趋减少，除人为捕捞冈素外，环境污染也为种群的增长带来很大压力。河 川沙塘鳢属于肉食性动物，处于食物链的较高层级，对环境中的污染物具有一定的 生物富集效应，并且还具有环境适应力强，因此研究环境内分泌干扰物质对河川沙 塘鳢的影响，具有重要的意义。 有关内分泌干扰物对鱼类内分泌生殖的影响报道有许多，如对斑马鱼 ( d r a s t i c h o v d ，j ，2 0 0 5 ) ，青 鳓( m e t c a l f e ，cd ，2 0 0 0 ) ，虹鳟( m a n u e lg e s t o ，2 0 0 8 ) ，比 目鱼( k i r b y ，mf ，2 0 0 7 ) 精巢、卵巢、肝脏、生殖、v t g 等的影响，但是研究一般 都停留在成鱼上，对于幼鱼的研究较少，并且一般是研究单一因子对鱼的的毒性效 应，而在环境中实际上存在多种不同的具有内分泌干扰作用的化学物质，人类及动 物所受到的影响，无疑应是这些多种不同污染物联合作用的结果。因此，本文以河 3 绪论 川沙塘鳢为模型，研究环境内分泌干扰物对其幼鱼阶段的影响，主要包括以下两部 分：一方面以壬基酚为环境内分泌干扰物，长期暴露对河川沙塘鳢性腺分化和发育 以及对幼鱼卵黄蛋白原诱导的影响作初步研究。另一方面，通过壬基酚和1 3 萘黄酮 的亚急性实验室暴露，以卵黄蛋白原、肝脏巾的e r o d 酶和g s t 酶的活性这几个标 志物的变化情况为指标，研究环境内分泌干扰物对其幼鱼阶段可能产牛的效应。以 期为太湖地区以及其它水体环境污染j i c 测研究提供基础资料和技术。 4 第一章壬基盼对河川沙塘鳢幼鱼卵黄蛋白原的诱导 第一章壬基酚对河川沙塘鳢幼鱼卵黄蛋白原的诱导 壬基酚( 4 n o n y l p h e n o l ，n p ) 是一种常见的环境雌激素，可以诱导成熟雄性的 稀有鲫( g o b i o c y p r i sr a r u $ ) 产生卵黄蛋白原( v i t e l l o g e n i n ，v t g ) ( j i n m i a oz h a , e ta 1 ， 2 0 0 6 ) ，暴露在n p 3 3 0 p g l 中的成熟的比目鱼( p l a t i c h t h y sf l e s u s ) f f l l 浆v t g 含量升高 ( k i r b y me c ta 1 ，2 0 0 7 ) 。但是有关环境雌激素对幼鱼v t g 诱导的研究报道相对较少， 只有对虹鳟( o n c o r h y n c h u sm y k