（分析化学专业论文）纳米金复合体系荧光探针的设计、研制及应用.pdf

独创声明 本人声明所臌交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的 研究戏果。据我掰细，除了文巾特剐加以撂渡窝致澎的地方外，论文中不包含其 他入融经发表或撰譬过的研究成巢，也不爸禽为获得 ( 注；如 没有其他需要特别声明的，本檄可空) 或其他教育机构的学位或证书使用过的材 辩。墨我一圈王谨鹣阉恚对零疆突爨徽豹经夥燹藏薅已在谂交孛终了甓确豹说明 并袭承谢意。 学位论文露者签名， 次笋 鞣擀气别，之 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解堂撞有关僳磐、使用学饿论文的规定，有权保 留并向国家有关部门或机构遴交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅。 本久授投兰夔霹滋猿学霞论文瓣全部或部分内容缡入蠢关数据痒遴弦检索，虿 以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。( 保密的学位论文在 解密詹适用本授权书) 学位论文锈者签名：哟 签字目期：2 。7 年易月目 导箨熬字： 签字目期j2 0 0 7 、才气 刨钾 ，、t。；、， 年 一 由客帮范大学硕士学位论文 摘要 荧光共振能量转移( f r e t ) 侔为重要的光物理技术殴广泛应用于嫩物大分子 之间躐离的定性、定量检钡4 ，在鬣自质、核酸、细胞器结构功能研究，免疫分析，高 努予帮麓分子辩学，鸯由基、金耩离子及藉炎测定等镖域舔骞巧妙瑟有效夔应矮。 f r e t 也称为非辐射能量转移，即处于激发态的物种以偶极- 偶极相互作用形式将 激发能转移给处于熬态的物种，传递距离在2 0 - 8 0a 之阈。其中，能量给予者为供 俸( d o n o r ) , 能量接受者为受体( a c c e p t o r ) ，受髂胃发射垂己豹特征荧光( 荧先增强) ， 也可不发荧光( 荧光猝灭) 。荧光綮量子产率粥，是最常用的供体分子。镧系元素铕 作为荧光标记的能爨供体，量子产率高、荧光港命长、发射峰窄，其准确性和信噪 魄大大提高。不产黧荧光静受体麓优势在于髓够减少霹麓幽受体本隽壹接产生静荧 光背景的干扰。纳米金良好的稳定性、小尺寸效应、表丽效应、光学效威、特殊的 生物采帮效应，以及对荧光试剩精的猝灭效率，提高了f r e t 过程的灵敏发和特异 往，傻箕成失一个研究和应用的热点。 本论文基于f r e t 原理，设计、研制纳米盒复合体系的荧光探针应用于生物活 牲物矮靛检测，嚣鼹了三方葱豹纂毋究： ( 一) 基于f r e t 原理，建纛纳米- 2 金- d n a 荧光素复合体系专一性识剐活细胞内 羟自由基的新方法。纳米金具有离消光系数，在纳米金荧光素组成的f r e t 供受 薅对巾发挥突出的荧光狻灭捧髑。羟叁峦綦警 莛d n a 链羧裂导致f r e t 现象消 失，缡米金猝灭荧光素的荧光随之得到恢复，据此实现羟爨由基的测定。方法的线 性范围为8 0n m 1 0 “m ，检测限为2 4n m 。小鼠腹腔巨噬细胞及h e p g 2 人肝癌 缨瑰巍羟鑫峦基豹荧光残豫实验袭鞠：搽赞其蠢膜穿透性，劳选择经撼获缨戆蠹豹 羟自由基，对细胞内微摩尔级焱自由基含量的变化产生响成，表现了良好的生物适 用性。 ( ：) 基予f r e t 霖理，施建荧麦纯学传戆器绫寒金一一强颧精( c d s ) 一荧光素 超分子主体化合物识别客体分予胆固醇。纳米金经 3 - c d s 修饰，通过1 3 - c d s 的包 结作用使荧光素靠近纳米金，f r e t 现象发缴，荧光素的荧光猝灭：竞争性的客体 垂东费范大学磺学使论交 分子胆固醇存在时，挤占 3 - c d s 的空腔与其形成甄加稳定的包含物，荧光素远离 续米金，f r e t 难默发生，楚蹩素懿荧必涟之褥至後复。疆固醇派发嶷3 0r i m - 1 5 蚺 范围内与荧光信号强度成线性关系，传感器的检测下限为9 0n m 。方法应用予斑清 样中胆固醇禽量的测定，结果令人满意。 三) 慕手f r e t 爨壤，建立缎米众簌铸螯会貔复合钵系将器经检测燮黢琢 酶活性的新方法。纳米念疑有高消光系数，在纳米众铕螯舍物构成的f r e t 供受 体对中发挥突出的荧光猝灭作用。型胶原酶水解肷链断裂导致f r e t 现象消失， 续米金猝灭镌螯会物静荧光夔之褥至恢复，据魏实瑗掰型胶原酶的溅定。方法豹线 性范围为o 1 - - - 5 0p g m l ，检测限为5 7 6n g m l 。黢于恶性表型和侵袭转移袭型的 细胞均表达型胶原酶高水平，预计举方法可用于评价癌变细胞躲性程度。 关键词：荧光共振能量转移纳米金复合体系荧光探针羟自由基胆固 醇型胶原酶 2 山东师范大学硕士学位论文 a b s t r a c t f l u o r e s c e n c er e s o n a n c ee n e r g yt r a n s f e r ( f r e t ) i so n eo ft h em o s tp o w e r f u la n d w i d e l yu s e df l u o r e s c e n c et e c h n i q u e sa v a i l a b l ef o rp r o b i n gs t r u c t u r ea n dd y n a m i c si n m e d i a a p p l i c a t i o n s 擞m u l t i f a r i o u sa n ds p a nn u m e r o u sd i s c i p l i n e s a l ll i n k e db yt h e n e e dt oi n t e r p r e tf r e td a t ai nt e r m so fi m p r o v e df u n d a m e n t a lu n d e r s t a n d i n go ft h et a s k a th a n d ，f o re x a m p l e ，f r e th a sb e e nu s e d 黼a na r u l e ri np r o t e i n s , t op r o b ed y n a m i c si n s y n t h e t i cp o l y a n e r s ，t om o n i t o rm e m b r a n ef l u i d i t y ，t od e s c r i b et h em o r p h o l o g yo fs i l i c a a n di ns e n s o r sf o rm e t a li o n sa sw e l l 瓣g l u c o s ed e t e c t i o n f r e ti s8p o w e r f u l s p e c t r o s c o p i ct e c h n i q u et h a ta l l o w sb i o l o g i c a l l yr e l e v a n td i s t a n c e sb e t w e e n2 0a n d8 0a 协b eq u a n t i f i e du n d e rp h y s i o l o g i c a lc o n d i t i o n s 砸墩n e a r - a n g s t r o mr e s o l u t i o nd u el ot h e s t r o n gd i s t a n c ed e p e n d e n c eo f t h et r a n s f e rp r o c e s s 。t h ee f f i c i e n c yo ff r e ti sd e p e n d e n t u p o nd o n o r - a e e e p t o rp r o x i m i t ya n ds p e c t r a lo v e r l a p , w h e t h e rt h ea e c e p t o rp a i t n e ri s f l u o r e s c e n to rn o t t h em o s tu s e dd o n o ri sf l u o r e s c e i nd u et oi t sh i g hq u a n t u my i e l d t h e 蹴o fq u e n c h i n ga c c e p t o r si sb e c o m i n gi n c r e a s i n g l yp o p u l a ri nf r e ts y s t e m s 。t h e p r i n c i p a la d v a n t a g et h a tt h e s em o l e c u l e so f f e ro v e rt h e i rf l u o r e s c e n tc o u n t e r p a r t si st h e e l i m i n a t i o no fb a c k g r o u n df l u o r e s c e n c eo r i g i n a t i n gf r o md i r e c ta c c o p t o re x c i t a t i o no r r e - e m i s s i o n a sap h o t o l u m i n e s c e n t q u e n c h e r , g o l dn a n o p a r t i c l e s ( a un p s ) c 鑫鑫 u l n a - e f f i c i e n t l yq u e n c h t h em o l e c u l a r - e x c i t a t i o ne n e r g yi nc h r o m o p h o r e - a un p c o m p o s i t e s a un p sh a v eb e e no fg r e a ti n t e r e s tb e c a u s eo ft h e i rh i 馥e x t i n c t i o n c o e f f i c i e n ta n dab r o a da b s o r p t i o ns p e c t r u mi nav i s i b l el i g h tt h a ti so v e r l a p p e d 旗氇t h e e m i s s i o nw a v e l e n g t ho fu s u a le n e r g yd o n o r s i nc o m p a r i s o nw i t ht h eo r g a n i cq u a n c h e b a un p sh a v eu n i q u es t r u c t u r a la n do p t i c a lp r o p e r t i e sf o rn e wa p p l i c a t i o n si nb i o s e n s i n g a n dm o l e c u l a re n g i n e e r i n g b a s e do nt h ef r e tp r i n c i p l ei nd e s i g n i n gn e w - t y p e df l u o r e s c e n tp r o b e sf o rt r a p p i n g b i o l o g i c a la c t i v es p e c i e s ，w eh a v ec a r r i e do u tt h r e ea s p e c t so f i n v e s t i g a t i o n ： f i r s ti st h ed e s i g no fa un p sa saq u e n c h e rm o d u l eo ff l u o r e s c e n tp r o b e sf o rd n a d a m a g e sc a u s e db yi n t r a e e l l u l a rh y d r o x y lr a d i c a l s ( 0 h ) a un p sp o s s e s s i n gh i 垂 e x t i n c t i o nt o e 伍c i e mf u n c t i o n 髂e x c e l l e n tf l u o r e s c e n tq u e n c h e r si nf l u o r e s e e i n - a un p c o m p o s i t e s f r e t s w i t c h e so f f b yaf a c t o r o f o h - i n d u c e ds t r a n db r e a k si n s i n g l e s t r a n d e dd n a s ，w h i c hr e s t o r e st h ef l u o r e s c e n c eo ft h eq u e n c h e df l u o r e s e e i m n 3 山东师范大学硕士学位论文 v i t r oa s s a y s 、衍也a l lo hr a d i c a lg e n e r a t i n gf e n t o nr e a g e n td e m o n s t r a t ea l li n c r e a s ei n f l u o r e s c e n c ei n t e n s i t yw i t hal i n e a rr a n g ef r o m8 0n mt o1 0u ma n dt h ed e t e c t i o nl i m i t a sl o wa s2 4n m c o n f o c a lm i c r o s c o p i ci m a g i n go f m a c r o p h a g e sa n dh e p g 2r e v e a l st h a t t h ep r o b ei sc e l l - p e r m e a b l ea n di n t r a c e l l u l a r o h - r e s p o n s i v e s e c o n d ，a un p s - d - c d s f l u o r e s c e i nh a sb e e nd e s i g n e d 私as e l e c t i v ef l u o r e s c e n t c h e m o s e n s o rf o rd e t e c t i n gc h o l e s t e r o lc o n t e n tu t i l i z i n gf r e t i n c l u s i o no ff l u o r e s c e i n i n t o1 3 - c d sm a k e sf r e to c c u rt h r o u g hd o n o ra n dq u e n c h e rn e a r b y f r e ts w i t c h e so f f b yt h ea d d i t i o no f t h ec o m p e t i t i v ec db i n d e rc h o l e s t e r o l ，w h i c hr e s t o r e st h ef l u o r e s c e n c e o f t h eq u e n c h e df l u o r e s c e i n t h i sp h e n o m e n o ni se x p l a i n e db yt h eg u e s t - i n d u c e dl o c a t i o n c h a n g eo ft h ef l u o r e s c e i nf r o mi n s i d et oo u t s i d eo ft h ec a v i t y ，s u g g e s t i n gt h a tt h ea u n p s - b - c d s - f l u o r e s c e i ni se f f e c t i v ea saf l u o r e s c e n tc h e m o s e n s o rf o rc h o l e s t e r o l r e c o g n i t i o n t h ef l u o r e s c e n c ei n c r e a s ei sp r o p o r t i o n a lt ot h ec o n c e n t r a t i o no fc h o l e s t e r o l i nt h er a n g eo f3 0r i m - 1 5u m ac o n c e n t r a t i o no fc h o l e s t e r o la sl o wa s9n mw o u l db e r e a d i l yd e t e c t e d t h er e c o v e r ya n dp r e c i s i o no ft h em e t h o da p p l i e dt o d e t e r m i n e c h o l e s t e r o li ns e r u me x t r a c t sw e r es a t i s f a c t o r y t h i r d 遗t h ed e s i g no f a un p s 够aq u e n c h e rm o d u l eo f f l u o r e s c e n tp r o b ef o rh y d r o l y s i s o fa m i d eb o n d si np e p t i d e sc a u s e db yt y p ei ve o l l a g e n a s e i nt h ep r e s e n ts t u d y ，h i 曲 s e n s i t i v i t yw a so b t a i n e du s i n gt h ef l u o r e s c e n te u r o p i u mc h e l a t ea sl a b e l ，i n t e m a u y q u e n c h e db ys u i t a b l eq u e n c h e ra un p sa n dr e l e a s e du p o ne n z y m a t i cr e a c t i o n i nv i t r o a s s a y sw i 也t y p ei ve o l l a g e n a s ed e m o n s t r a t ea ni n c r e a s ei nf l u o r e s c e n c ei n t e n s i t yw i t l la l i n e a rr a n g ef r o mo 1t 05 0r t e d m la n dt h ed e t e c t i o nl i m i ta sl o wa s5 7 6n g m l 豇l i s a p p r o a c hw o u l da l l o ws e n s i t i v em o n i t o r i n go fl o wt y p ei vc o l l a g e n a s ea c t i v i t i e si n n o r m a la n dc a n c e r o u sc e l lc u l t u r e su s i n gf r e t p a i r - l a b e l e dp e p t i d es u b s t r a t e k e y w o r d s ：f r e t g o l dn a n o p a r t i c l e s c o m p l e xs y s t e m f l u o r e s c e n tp r o b e 。h y d r o x y l r a d i c a l s c h o l e s t e r o l t y p ei vc o l l a g e n a s e 4 山东师范大学硕士学位论文 第一章荧光共振能量转移研究概述 生物体内存在菪许多对生愈现象具鸯重要影响的微量或痕量的活性物质，具有 特豫的生理功缝，当与飒俸作用嚣能弓l 起各秘生物效应。由乎生物成分的多样性、 复杂性，对微量釜穆分子豹研究就螫须采用选择性强、炙敏发寒豹分柝方法。 光谱技术是研究生物活性街蕨最常用的方法之一。荧光筵摄能量转移( f r e t ) ， 是目前极受到重视的- - i - 高新光谱技术，由于其兵有院光度法灵敏度高，与常裁荧 光法和共振光散射相比受瑞利散射光干扰小，重现骰好的特点，该方法巴被广泛应 用予化学分析、生物结构研究等领域，在生命科学研究中成为一项有效的研究工具 u - s l 。f r e t 是指能量从种受激发的荧光基团( d o n o r 供体) ，以非辎射的方式转移 剃另秽荧光基盟( a c p t o r 受体) 豹物理现象，只有当d 靼a 搭配适当时， f r e t 才胃戮用洙勰决实际瓣蘧。实际可以裂用黪d 瞌对，必缀网异寸满足以下几个 条秤：( 1 ) 给俸的发射光谱稀受体的激发先谱要尽可熊重蹙；( 2 ) d 豹s t o r k s 位移要 足够大，或者说d 和a 的激发光谱要舔可髓分开；( 3 ) d 和a 的发射光谱也蘩远 离。特殊情况下，a 可以是只吸收不发射的荧光猝灭剂。近年来，f r e t 技术醴发 展用于生物火分子之间距离的定性、定邀检测，在爨白质、核酸、细胞器结构功能 捡测，免疫分橱，高分予和超分子科学，自妇基、金属离子及糖类测定等领域都有 巧妙嚣鸯效瓣应用。本绻论对荧光共振能量转移方法的发展及其应用进行了较垒面 豹综述。 1 f r e t 探针 能羹供受体对组成f r e t 探针，很多生物大分- 7 = 自身含有荧光活性基团，如蛋 白质中的色氨酸( t 嘲、核酸中的袋些荧光活性碱基等，利用这些内源性荧光基团 藏组分，人 f 3 均建了诲多有效的d 姨对睁 。由予生物体的自身荧光往往太微弱或 缺乏特菇性，礤究串鬻麓豹能量供受俸对多是会成的荧光物质，通过化学方法标记 捌研究对象上，罗丹碉与荧光素就怒最常用戆一对。将荧煮物臻遴幸亍穆馋，还褥以 使它针对特定的基醋如巯基、羧基等迸行标记l 载。 山东师范大学硕士学位论文 1 9 9 2 年，p r a s h e r 等 9 从维多利亚水母中分离并克隆出了一种生物荧光物质绿 色荧光蛋白( g f p ) 。由于g f p 稳定性好、量子产率高、无生物毒性，很快在基因 表达、蛋白质定位、细胞间物质交换等研究中获得了广泛应用。1 9 9 4 年以来，人们 利用定点突变的方式得到了多种具有不同荧光光谱或具有更高荧光量子产率的荧光 蛋白，以其为基础组成了多个新的f r e t 供受体对，适用于观察活体内生物反应的 动态变化，特异性远远高于化学标记法。 镧系元素与传统的有机染料联用分别作为能量供体和受体，拓展了f r e t 技术 【1 0 1 。镧系染料有很多优势：它们能测量大至1 0 0h 的距离；与传统f r e t 染料相比，其准确性和信噪比大大提高：它们对不完全标记的供体和受体样品不 敏感。发光量子点( q d ) 是近年发展起来的一种新的能量供体1 2 1 ，相对于传统有 机荧光染料，量子点的发射光谱很窄而且不拖尾，减少了供体与受体发射光谱的重 叠，避免了相互间的干扰；由于量子点具有较宽的光谱激发范围，当它作为能量供 体时，可以更自由地选择激发波长，可以最大限度地避免对能量受体的直接激发； 通过改变量子点的组成或尺寸，可以使其发射可见光区任一波长的光，也就是说它 可以为吸收光谱在可见区的任一生色团作能量供体，并且保证了供体发射波长与受 体吸收波长的良好重叠，增加了共振能量转移效率。 瓣 2 f r e t 技术的应用 2 1 蛋白质结构、功能分析 f r e t 作为生物系统中的“光谱尺”，其最为经典和广泛的应用就是测量蛋白 结构中两个位点的位置和在液体中它们的聚集及其拓扑结构。蛋白质包含有内源性 荧光团( 如色氨酸和酪氨酸) ，并且它们可以与外来的荧光团发生共价性结合( 常具 有专一性) 【1 3 】。在蛋白质活性部位微环境的研究中，f r e t 技术可以轻松地分析生物 大分子三维结构及特定位点间的距离1 4 】。f r e t 也常用于确定蛋白质分子内部特定 位点之间的距离，或是直接用来测量分子的大小“5 1 。采用稀土荧光探针后由于它的 长激发寿命易于与生物的背景荧光区分开来，以稀土螯合物标记蛋白质成为研究蛋 白质构象的一种新途径【1 6 l 。 引入绿色荧光蛋白及其变异型后，f r e t 的应用又向前迈进了一大步进入活体 6 山东师范火学硕士学位论文 水平。在蛋白酶底物的研究中，分子内f r e t 可以用来检测细胞内酶的作用，比较 窭色载镶子燕，c f p 箨y f p 之淘的接头主毙隆一个c a s p a s e - 3 甥患，转染进入 h e l a 细胞，巍细胞受到紫外照射时，诱导c a s p a s e 3 的表达，诱发凋亡，同时接 头被翻开，这释就霹班菇察鬟荧光发辩强度5 倍静交像，帮f r e t 瑰象唆显凝弱， 这个研究不但证明了c a s p a s e 3 在凋它中的作用，而鼠建立的这个结构可以用来筛 选凋亡诱导剂h 7 1 。 2 2 核羧捡测 核酸杂交技术与f r e t 桐结合，可用于突变检测、同源饿分析和核酸定墩分析 等寿n t l s - 2 0 j 。凌这些捡浏孛，据记在核羧上黪戆量拱受髂之阕豹距离会嚣探镑结合 状态的不同而改变，可通过荧光的变化检测出来。能爨供受体可以分别标记柱探针 衽靶土，当探针与靶结合螽发生f r e t ；氇哥戳标记穰探铮静苓同罄经，当搽锋专 靶结合后解链戏改变构象而使原有的f r e t 消失；还可以标记在不同的探针上，当 靶序列存在时间时结合两个探钎而发嫩f r e t 。 分子灯标作为一种新型的基因检测技术就在这一慕础上诞生，它是一种能形成 茎环结构的寡核苷酸，两端分别标有f r e t 的能量供体和受体，茎部怒段长和1 2 轴要蛰兹发炎结稳，鞭孛阉矮数缝梅嫒包含熬寡接替羧裁是搽铮约基因识别、配对 部分。当探针朱与靶序列结合时，它是正常的蓬环结构，可以检测到f r e t ；而探 锌一燕毒轻彦翻结合，茎环结梅务器，f r e t 就瀵失了。壶予置脊酝怼特舅魏懿差 别将导致探针和靶序列的杂食体的解键温度的不同，邋过改变温度，检测f r e t 的 发生与否可l ；i 确定靶序列与探钎之间的同源後盼大小1 2 l l 。戳常窥静荧光检灏仪就可 以测定f r e t 的变化，它已舆有和放射性搽针同样的灵敏度，在核酸杂交中可以测 定1 0 0 此体积中1 0 0 8t o o l 数量级的反应，却避免了操作的繁琐和危险性，应用 嚣景十分广耀。 f r e t 还被运用到d n a 结构研究、核酸调控、核酸降解、寡核苷酸从核糖体 上释敞豹磅究簿诸多方蘧 2 2 - 2 3 1 ，逶过在孩酸鲍不同部缝标记裁量安受锩对，麓量转 移的效率会因核酸结构的改变i 面改变，从而获得与分子构象相关的信息。 2 3 糖类研究 糖类豹分析检测中也有f r e t 的运用。m a u r o 等1 2 4 1 设计了糖传感嚣，将c y 3 或 7 山东师范大学硕士学位论文 c y 3 5 连接在麦芽糖结合蛋白( m b p ) 上作为d 分子，以1 3 - c d 修饰的c y 5 作 为a 分子。未加麦芽糖之前，由于m b p 与i b - c d 结合，使c y 3 5 和c y 5 相互 靠近，体系发生f r e t 。当存在麦芽糖时，麦芽糖竞争1 3 - c d ，占据了m b p 的结合 位点，使i b - c d 与m b p 分离，此时d - a 间距离加大，f r e t 减弱，d 荧光增强。 m c s h a n e 等1 2 5 1 设计了基于荧光素和罗丹明间f r e t 作用的葡萄糖测定方法。葡萄 糖竞争结合罗丹明标记的脱辅基葡萄糖氧化酶( a p o ，g o x ) ，使荧光素标记葡聚糖脱 离a p o g o x ，从而降低荧光素到罗丹明的f r e t 效率。根据f r e t 效率降低的程 度可以计算出葡萄糖的浓度。 2 4 免疫分析 免疫分析是目前疾病检测的一项重要手段，免疫分子之间的相互作用和各种免 疫现象可结合f r e t 加以研究，如利用抗原与抗体、补体与抗体、c d 分子之间的 特异结合可发挥f r e t 的优势。以f r e t 为基础的免疫分析法可分为夹心法和竞 争法。夹心法就是能量转移的供体和受体分别标记同一个抗原相结合的两种抗体， 形成d - a b l ：a g ：a b 2 a 形式的抗原抗体复合物，使供体和受体之间的距离减小，发 生f r e t ，从而可以判断免疫反应的发生。竞争法就是能量转移的供体和受体分别 标记抗原和抗体中的一种。由于抗原、抗体之间的特异性结合，使供体和受体之间 发生能量转移，当加入未标记的抗原或抗体时，由于与标记的抗原或抗体发生竞争， 产生无f r e t 现象的抗原抗体复合物，从而可以检测抗原或抗体。w a n g 掣2 6 1 将两 种分别发出绿色荧光( g - n p s ) 和红色荧光( r - n p s ) 的c d t e 纳米粒子用于免疫分 析法。他们用r - n p s 标记牛血清白蛋白( b s a ) ，用g - n p s 标记抗b s a 的i g g 。 当形成b s a - i g g 抗原抗体复合物时，g - n p s 和r - n p s 之间就发生了f r e t ， g - n p s 的发光被猝灭，而r - n p s 的发光增强。他们还使用了竞争免疫分析法，在 ( r - n p s - b s a ) ( g - n p s i g g ) 抗原抗体复合物中加入未标记的b s a ，由于b s a 逐渐 取代标记的b s a ，使得g - n p s 的发光逐渐增强，而r - n p s 的发光逐渐减弱，从 而可以检测出b s a 的浓度。利用这种基于竞争免疫分析的f r e t 可以制成蛋白质 传感器和杂交光电装置。 2 5 金属离子检测 t a k e n a k a 等跚以6 羧基荧光素( 6 - f a m ) 和6 羧基四甲基罗丹明 8 山东师范大学硕士学位论文 ( 6 - t a m r a ) 作为供体和受体，戳对k + 特髯结合的寡聚核瞀酸为连接藉，得弼了 种可用于活细胞内k + 测定的k + 传感器( p s o ) 。当无1 0 存在时，p s o 以随机 螺旋状存在，d a 棚对远离，f r e t 难以发生。当k + 存在时，p s o 折叠成高级 结构，使6 - f a m 和6 - t a m l l a 靠近，f r e t 发生，从瓶实现对k + 的检测。 m i y a w a k i 等2 3 1 摄b f p g f p 成功用于c a 2 + 豹检测，将b f p ( c f p ) 连接到钙 调蛋自懿n 端，将g f p ( y f p ) 连接到m 1 3 瓣c 爆0 a 1 3 是骨黪飘球蛋自轻链 激酶静锈谲簧自结合获) ，共蠲构成“c a m e l e o n s ”。警有c a ：t * 存在辩，c a 2 + 与锈调 蛋白结合导致钙调蛋白与m 1 3 缠绕，从而使胁哦之间距离减小，提高了f r e t 效率。m i y a w a k i 通过位点突变调整了钙调蛋白与钙离予的亲和力，使c a j 冲浓度与 f r e t 效率照线性关系，从而使得该探针可以对c a p 进行定量测定。与c a 2 + 试剂 楣比，该探针使用方便，适用面宽，几乎可以用于所有细胞组织中c a 2 + 的测定。 2 6 自出基测定 在生鑫活动豹代落过稷中不錾产囊各释氧叁出基，铡翔超氧弱离子垂由基 ( 0 2 - - ) 、羟毒由萋( - o h ) 、脂舀由基( r o o ，) 、过筑讫缀 磁a 嘧等。蠢由基能够奔导 生命活动的许多重要反废过程，参等细胞免疫功能，但也能够对组织细胞的纯学结 构发生破坏性修饰，损伤正常组织细胞的形态和膜功能。因此，发腥高灵敏、特异 性的细胞内自由基检钡4 方法湿得尤为重要。f r e t 探针基于非氧化性反应机理，摒 赛了基予氧化机理的探针选择性不理想的弊端，结仓荧光共聚焦成像技术，从丽实 现缨腿疼实辩i 原傻、专一毂识别德测囊由慕。i m a t o 等1 2 明以6 - f a mo e x = 4 9 6 n m , j k e m = 5 1 8 r i m ) 彝5 - t a m r a ( z e x = 5 5 8 n m ，g e m = 5 7 6 n m ) 分别作必供体积受体，修饰 予胸腺嘴啶= 聚体5 端和3 端，构建了一种遥用子潘细稳内o h 测定的荧光探 针。o h 以其极高的化学反应活性学致碱蒸损伤、d n a 断链、核背酸糖基损伤。 当无o h 存在时，连接臂将供受体控制在合适的距离内( 1 1 0r i m ) ，使6 - f a m 和 6 - t a m r a 靠近，f r e t 发生；当o h 存在时，诱发核酸链断裂，d a 相对远离， f r e t 难以发生，从丽实现o h 的特异性检测。 2 一荧光共振憝量转移照礅镜方法 f r e tf - 泛应用予研究分予海的距离及其相互作用，与荧光显微镜结合，霹定 鲎获取有关生物活谇内鬣自质、镕旨樊、d n a 和r n a 静时空信怠。m u p a r n 等人就 叠 山东师范大学硕士学位论文 通过荧光显微镜、电感偶合相机( c h a r g e dc o u p l e dd e v i c e ，c c d ) 和光谱仪来进行完 整细胞中f r e t 发生的定位，将细胞内的理化反应研究提高到细胞器的水平3 0 1 。 数码免疫荧光显微镜和f r e t 相结合将荧光显微镜的分辨率提高到了分子水平，可 进行单细胞膜的定量测量【3 “。 3 荧光共振能量转移的发展前景 作为一种重要的光物理技术，f r e t 具有灵敏度高、适用范围广、受环境因素 干扰少等特点，特别适合于生物体系、超分子体系等复杂系统中相互作用的研究。 荧光蛋白、镧系元素配合物和量子点的开发使用进一步扩展了f r e t 技术的应用范 围，时间分辨荧光检测、荧光显微镜等都已开始与f r e t 结合应用，新材料、新技 术的作用都是不可估量的，未来f r e t 除了用于研究生物大分子的结构功能之外， 还可能用于细胞器功能研究、细胞信号传导以至对在自然环境中的生活细胞进行分 析。而在蛋白质结构功能分析及核酸的识别检测、免疫测定、生物大分子相互作用 的研究方面也会有更多的实际应用价值，联系目前迅速发展的聚合酶链反应一微孔 板核酸杂交技术( p c r e l i s a ) 、生物芯片等技术，f r e t 将对生物检测的发展起到 巨大的推动作用。值得注意的是，新的d - a 对的设计合成，新的f r e t 体系的开 拓，以及将f r e t 技术与时间分辨荧光检测、激光共聚焦荧光显微、荧光漂白、荧 光各向异性等光物理技术结合使用将成为未来f r e t 技术发展的主要方向。 参考文献： 1 】b n u n b a u g h ，j ；s c h l c i f c n b a u m ，a ；g a s c h , a ；s a t t l e r , m ；s c h u l t z ，c za m c h e m 8 0 e 2 0 0 6 ，1 2 2 4 2 5 【2 】w i c h m a n n , 0 ；w i t t b r o d t ，j ；s c h u l t z , c a n g e w c h e m i n t e d i t 2 0 0 6 ，4 5 , 5 0 8 5 1 2 【3 h o n g ，s w ；a 1 1 n ，c - h ；h u h ，j ；j o ，w h m a c r o m o l e c u l e s , 2 0 0 6 ，3 9 ，7 6 9 4 - 7 7 0 0 【4 】s h i ，l ；r o s e n z w e i g ，n ；r o s e n z w e i g ，z a n a l c h e m 2 0 0 7 ，7 9 , 2 0 8 2 1 4 【5 】a l b e r s ，a e ；o k r e g l a k ，vs ；c h a n g ，c j j ：a m c h e m s o c2 0 0 6 ，1 2 8 ，9 6 4 0 9 6 4 1 【6 s a h o o ，h ；r o c e a t a n o ，d ；z a e b a r i a s ，m ；n a u , w m j = a m c h e m s o c 2 0 0 6 ，船， 1 0 山东师范大学硕士学位论文 8 1 1 8 - 8 11 9 f 7 】t u c k e f ，m 。j 。；o y o l a , ；g a i ，f tzp h y s c h e n 它丑2 0 0 5 ，1 0 9 , 4 7 8 8 - 4 7 9 5 【8 】s o kn ；m a k i h a r a , k ；s a k o d a , e ；i m a t o ，量c h e m c o m m u n 2 0 0 4 ，只4 9 6 - 4 9 7 。 【9 】p r a s h e r , d c ；e e k e n r o d e ，vk ；w a r d ，w ：w ：；p r e n d e r g a s t , fg ；c o r m i c r , m j g e n e1 9 9 2 ，1 1 1 ，2 2 9 - 2 3 7 【i o l a i t a l a , v - ；h e m m i l a , 1 a n a l c h e m 2 0 0 5 ，7 7 , 1 4 8 3 一l 媳7 。 d1 】z h a n g , c - y ；j o h n s o n ，l w a n a l c 玩j ，2 0 0 6 , z 配5 5 3 2 - 5 5 3 7 【1 2 1s i f t ，l ；d ep a o l i ，v - ；r o s e n z w e i g ，n 。；r o s e n z w e i g , z za m c h e m s o c 2 0 0 6 , j 2 最 1 8 3 7 8 1 e 3 7 9 。 【1 3 le i s a n h a w e r , m ；c a t t a r i n u s s i ，s ；k u h n , 丸；v o g e l ，壬| b i o c h e m i s t r y2 0 0 1 ，4 0 , 1 2 3 2 1 1 2 3 2 8 【1 4 】r a m i r e z - c a r r o z z i ，v 。；k e r p p o l a , t 。；m e t h o d s , 2 0 0 1 ，2 5 ，3 1 - 4 3 。 【1 5 w i l l a r d , d m ；c a r i l l o ，l l ；j u n g , j ；v a no r d e r a n a n ol e t t 2 0 0 1 ，? ，4 6 9 - 4 7 4 。 【1 6 h i r a t a , j 二d ej o n g ，c e ；v a i ld o n g e n , m m ；b u i j s ，j + ；a r i e s e , e ；h 氓h ；o o o i j e r , c + a n a lc h e r t2 9 0 4 7 6 , 4 2 9 2 - 4 2 9 8 。 【1 7 】l u o , k q ；魄vc ；p i l ，ym ；c h a n g ，d c b i o c h e mb i o p h y sr e sc o m m u n2 0 0 1 ， 2 8 3 。1 0 5 4 - 1 0 6 0 f 1 8 】p e n g , h ，；z h a n g , l 。；鞫a l l m a n , t h 。m 。；s o e h e r , c ；t r a v a s - s e j d i k , j ja m c h e m s o c2 0 盯，1 2 9 ，3 0 4 8 - 3 0 4 9 【1 9 】f r u t o s ，a q ；p a l ，s ；q u e s a d a , m ；l a h i r i ，j za m c h e m s o c 2 0 0 2 ，1 2 4 , 2 3 9 6 - 2 3 9 7 。 2 0 】s a n d o ，s ；s a s a k i ，t ；k a n a t