（微生物与生化药学专业论文）福鸽霉素结构鉴定及其发酵条件优化.pdf

摘要 摘1 要 粘细菌( m y x o b a c t e r i a ) 是类重要药源微生物类群。本论文在实验室前期研究工作的 基础上，对粘细菌产生的次级代谢产物中抑瘤活性物质的分离和筛选、组成结构、培养 条件优化、抑瘤活性物质的体内抑瘤活性等方面进行了较为深入的研究。 以b 1 6 、s g c7 9 0 1 肿瘤细胞系为筛选模型，w x n x j c 菌株发酵产物中有7 个具有 较高抗癌活性和较宽的抗肿瘤谱的物质。经c 1 8 层析柱、1 5r p c 柱、c 1 8 制备柱等多 次分离、纯化，采用l c m s 、m a l d i t o f 、m s m s 、i r 、n m r 等分析技术对7 f 组分 进行结构分析，得到分子量为4 2 4d a 的c 2 2 h 3 2 0 s ，系统名称为f 1 r ，7 r ，8 r ，1 0 s ，1 1 s ， 1 2 s ，1 3 s 一1 ，7 ，1 2 ，1 3 一t e t r a h y d r o x y 一1 4 一m e t h o x y - 8 ，1 0 一d i m e t h y l 一6 一p h e n y l 一5 ，15 - d i o x a - b i c y c l o 9 3 1 p e n t a d e c a n 4 o n e ；1 , 7 ，1 2 ，1 3 四羟基。1 4 甲氧基8 ，1 0 。二甲基6 苯基5 ，1 5 一二氧。双环 9 3 1 】十五烷4 酮) ，起名为福鸽霉素( p h o x a l o n e ) 。查新确证福鸽霉素是粘细菌w x n x j c 产生的一种新的含有1 5 元环的大环内酯化合物。 通过建立移植黑色素瘤b 1 6 小鼠模型，初步考察了福鸽霉素的体内抗肿瘤活性。对 荷瘤小鼠进行实体瘤称重，无论福鸽霉素纯品还是粗提物均有显著的抑瘤效果，其抑瘤 率均在3 0 以上；样品作用组瘤体积生长速率比阴性对照组慢，且瘤体积小；同时能 延长荷瘤小鼠的存活期，能增加荷瘤小鼠脾脏的重量及脾指数，也能一定程度地提高胸 腺指数。h e 染色表明福鸽霉素能使b 1 6 肿瘤细胞呈团索状实性排列或弥漫性分布，并 有肿瘤细胞大片坏死。 通过p l a c k e t t b u r m a n 设计法筛选产福鸽霉素的主要影响因素为马铃薯淀粉、c a c l 2 和脱脂奶粉。采用b o x b e h n k e n 实验设计，通过响应面法对影响纤维堆囊菌s o 钟 m w x a b 1 2 5 产福鸽霉素的主要影响因子进行优化，当马铃薯淀粉、c a c l 2 、脱脂奶粉 浓度分别为8 0 5g l 、2 7 2g l 、1 0 0 0g l 时，福鸽霉素产量最大预测值为1 2 0 4 6m g l ， 在此条件下进行验证实验，实验结果表明，福鸽霉素的产量为1 1 9 9 8m g l ，较优化前 产量( 6 7 0m g l ) 显著提高。 关键词：粘细菌，福鸽霉素，发酵优化，分离纯化，抗肿瘤 a b s t r a c t m y x o b a c t e r i ah a v ea t t r a c t e dm u c hm o r ei n t e r e s ta sd r u gs o u r c e s i nt h i sw o r k ，b a s e do n t h ep r e l i m i n a r ye x p e r i m e n t so fo u rl a b ，w ea t t e m p t e dt oi n v e s t i g a t et h es e p a r a t i o n ， b i o a c t i v i t y d i r e c t e df r a c t i o n a t i o n ，p u r i f i c a t i o na n ds t r u c t u r a la n a l y s i so ft h ea n t i t u m o ra c t i v e f e r m e n t a t i o ne l u t i o n , t oo p t i m i z et h em e d i u mc o m p o s i t i o no fs i g n i f i c a n tf a c t o r st oi n c r e a s e t h ey i e l d so fp h o x a l o n eu s i n gr e s p o n s es u r f a c em e t h o d o l o g y , a n dt oi n v e s t i g a t et h ea n t i t u m o r a c t i v ef e r m e n t a t i o ne l u t i o np h o x a l o n e se f f e c ti nv i v o b a s e do nb i o a c t i v i t ye v a l u a t i o n ，7c o m p o n e n t sw i t hh i g h e ra n db r o a d s p e c t r u ma n t i t u m o r b i o a c t i v i t yw e r ed i r e c t l ys c r e e n e dv i ab 16a n ds g c 7 9 01e e l ll i n e sm o d e l si nt h ew x n x j c f e r m e n t a t i o n e l u t i o n b yu s i n gc 一18c o l u m nc h r o m a t o g r a p h y , 1 5 r p cc o l u m na n dc - 18 p r e p a r a t i o nc o l u m n ，ac o m p o n e n t ( n a m e d7 f ) w i t hm o l e c u l a rw e i g h t4 2 4d aw a so b t a i n e d t h es t r u c t u r eo f7 fc o m p o n e n tw a sa n a l y z e dw i t hl c m s ，m a l d i t o f , m s m s ，i ra n d n m r n l em o l e c u l a rf o r m u l ao f7 fw a sc a l c u l a t e da sc 2 2 h 3 2 0 8 t h et r a d i t i o n a ln a m ea n d s y s t e m a t i cn a m eo fc o m p o u n dc 2 2 h 3 2 0 8w e r ep h o x a l o n ea n d 1 r ，7 r ，8 r ，1 0 s ，l l s ，1 2 s ，1 3 s 一 1 ，7 ，1 2 ，1 3 一t e t r a h y d r o x y 一1 4 一m e t h o x y 一8 ，1 0 一d i m e t h y l - 6 一p h e n y l 一5 ，1 5 一d i o x a b i c y c l o 9 。3 1 p e n t a d e c a n 一4 o n e ，r e s p e c t i v e l y v i ac o n f i r m i n gw i t hi n v e s t i g a t i n gb yl 0 8s t a t i o no fs c i e n c ea n d t e c h n o l o g y , m i n i s t e ro fe d u c a t i o ni tw a sc o n f i r m e da san o v e l15 - n u m b e rr i n gm a c r o l i d e c o n t a i n i n ga no x y g e n b r i d g e t h ea n t i t u m o ra c t i v i t yo fp h o x a l o n ew e r ee x a m i n e da n de v a l u a t e dw i t ht h em i c e t r a n s p l a n t e db 16t u m o ri nv i v o p h o x a l o n eh a ds t r o n ga n t i t u m o ra c t i v i t y , c o u l di n h i b i tt u m o r t u m o r a lg r o w t ha n de x t e n ds u r v i v a ls p a n 。髓eh i s t o p a t h o l o g yo ft l l m o r sf r o mt h ev a r i o u s g r o u p si n d i c a t e dt h a tt h et u m o rc e l l so fu n t r e a t e dm i c eg r e wv i g o r o u s l y , h o w e v e rt h et u m o r c e l l sf r o mt h ed i f f e r e n tp h o x a l o n et r e a t e dg r o u p sh a dc l e a rn u c l e u sp y c n o s i sa n dn e c r o s i s a r e a si nd i f f e r e n td e g r e e b a s e do np l a c k e t t b u r m a nd e s i g n ，t h es i g n i f i c a n tf a c t o r sa f f e c t i n gt h ep h o x a l o n e - p r o d u c i n gf e r m e n t a t i o nw e r ed e t e r m i n e da sf o l l o w s ：p o t a t os t a r c h ，c a c l 2a n ds k i mm i l k b a s e do nb o x b e h n k e nd e s i g n ，ar e s p o n s es u r f a c em e t h o d o l o g y ( r s m ) w a su s e dt oo p t i m i z e t h r e ec r i t i c a li n t e m a lf a c t o r sm e n t i o n e d t h eo p t i m a lc o n c e n t r a t i o no ft h ev a r i a b l e sw a s d e t e r m i n e da s ：p o t a t os t a r c h8 0 5g l ，c a c l 22 7 2g la n ds k i mm i l k10 0 0g l u n d e rt h e s e c o n d i t i o n s ，t h em a x i m u my i e l do fp h o x a l o n ew a s1 2 0 4 6 m g lt h e o r e t i c a l l y t h r o u g h s i m u l a t i o ne x p e r i m e n t ，t h er e s u l to fs t u d yw a sv a l i d a t e d t h ey i e l do fp h o x a l o n ew a s s i g n i f i c a n t l yi n c r e a s e df r o m6 7m g l t o1 19 9 8m g l k e y w o r d s ：m y x o b a c t e r i a ，p h o x a l o n e ，f e r m e n t a t i o no p t i m i z a t i o n ，s e p a r a t i o np u r i f i c a t i o n ， a n t i t u m o ra c t i v i t y i i 独创性声明 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取 得的研究成果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文 中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含本人为获得江南 大学或其它教育机构的学位或证书而使用过的材料。与我一同5 - 作的同志 对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示谢意。 签名： 关于论文使用授权的说明 本学位论文作者完全了解江南大学有关保留、使用学位论文的规定： 江南大学有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允 许论文被查阅和借阅，可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库 进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文， 并且本人电子文档的内容和纸质论文的内容相一致。 保密的学位论文在解密后也遵守此规定。 签名： 导师签名：赶弼历r ! 星：主! 丝 e l 期： 塑：三：蟹 第一章绪论 第一章绪论 1 1 粘细菌 1 1 1 粘细菌的发现 德国植物学家l i n khf 在1 8 0 9 年发现了第一个粘细菌属：p o l y a n g i u mv i t e l l i n u m 。1 8 9 2 年美国植物学家r o l a n dt h a x t e r 第一次把这些菌划分为粘细菌并描述其生活史。直到2 0 世纪初，科学家们才真正开始粘细菌的研究工作。目前已涉及分子生物学、发育生物学、 生物技术及生物活性物质等多个研究领域，粘细菌受到越来越多研究者的青瞅1 。4 1 。 1 1 2 粘细菌的生活环境 粘细菌是一类可滑行运动的单细胞革兰氏阴性杆菌p j ，其营养细胞埋于粘液中，一 般为0 4 x 1 5 “m 2 1 5 l m ，依种属和条件而异。粘细菌在全世界都有分布【6 】，在温暖、 半干或干燥环境中大量存在，它的典型生活环境为中性p h 低盐浓度土壤、腐败有机质包 括草食性动物粪便腐木树皮以及淡水等，此外在腐烂的植物及树干上也很多见。有时从 植物叶片表面也能分离到粘细菌，高盐浓度的淤泥中【_ 7 】和干燥的沙漠土壤中也曾分离到 粘细菌菌株。尽管有文献报道依然认为粘细菌在盐浓度高于1 的培养基中不能生长， 而1 9 9 8 年日本学者l i z u k a 从日本海岸的沙子中分离到两株新的粘细菌，其最适生长n a c l 浓度在2 3 之间，并首次用1 6 sr d n a 同源性分析的方法证明它与小囊菌属 ( n a n n o c y s t 括) m 源，属于粘细菌【8 1 。李越中等在1 9 9 7 年分离获得能够耐受海水环境生长 的粘细菌【9 】，也说明了粘细菌也具有耐一定浓度盐的能力，而且其休眠体对外界有很强 的抗性。有报道从南极土壤分离到耐低温的粘细菌，培养温度高于9 就不能生长，说 明粘细菌能在极端环境下存活。g e r t h 最近分离到了一株耐4 2 c - 4 6 的粘细菌，1 6 s r d n a 鉴定表明，该菌株和普通粘细菌没有多大的差别，但是在此温度下能够正常生长， 而且生长速度是普通粘细菌的2 3 倍，可以代替生长缓慢的粘细菌，从而可能降低粘细 菌代谢产物的成本【1 0 】。 1 1 3 粘细菌的两个显著特性 尽管粘细菌在系统分类上属于细菌，但某些生物学特性却表现出与真核生物更多的 相似性。粘细菌细胞的摄食、运动、多细胞形态发生( 子实体发育和粘孢子形成) 等，具 有很强的社会性，粘细菌对细胞分化、发育和生物进化研究具有重要意义。 1 1 3 1 子实体形成 在粘细胞的群体行为中，子实体发育和粘孢子形成最为引人注目，过程中涉及的信 号传导模式更接近于真核生物。过去的3 0 年里，粘细菌细胞行为的研究要是以黄色粘球 菌( m y x o c o c c u sx a n t h u s ) 作为模式菌株进行的。黄色粘球菌子实体发育需要三个基本条 件：营养物匮乏、高细胞浓度、固体介质表面。此外p h 、阳离子和温度也对予实体形 成有调控作用【1 1 1 。形成过程包括以下几个步骤：( 1 ) 营养物匮乏导致发育信号因子的合 成，粘细菌群落中的营养细胞在子实体发育早期信号因子的作用下向各焦点有序聚集， 1 坚堕奎堂堡主堂垡丝茎 聚集细胞丧失性；( 2 ) 杆状细胞停止营养生长，在聚集群的某一部位聚合，细胞表面形成 的分子促使细胞粘和在一起；( 3 ) 最终，6 5 - 一9 0 的细胞发生程序化自溶，存活细胞进行 有序排列，其中一部分细胞形成不具繁殖能力的结构细胞( 如子实体的柄、孢子囊壁等) ， 还有一部分细胞在子实体形成末期，分化为抗逆的休眠孢子，粘孢子的形成标志着子实 体的真正成熟和发育过程的结束 1 1 - 1 3 】。在适宜的条件下，子实体形成全过程需1 2 1 4 小 时【6 1 。 1 1 3 2 滑行运动 粘细菌的另一特性是能在固体表面或水面滑行 1 1 - 1 4 】，这种运动伴随着细胞的弯曲和 乳液的分泌。与鞭毛运动相比，滑行速度相对缓慢( 1 0 6 0i t m m i n ) ，而且需要固体支持。 滑行运动对粘细菌子实体的形态发生和粘孢子的形成等群体行为具有重要意义。粘细菌 不同菌株1 6 sr n a 分子的比较表明它们不同于其他滑行细菌，是一个独立类型。滑行是 菌体靠蠕动按其长轴方向运动，偶尔停顿或改变为向，没有发现明显的细胞器作为推动 器【l5 | 。近些年的研究认为滑行运动与其细胞壁的复杂结构有关。粘细菌的滑行结构包括 位于外膜下螺旋状环绕在细胞表面的带状物，滑行中带状物在细胞外表面产生微小的收 缩波纹，当波纹沿细胞表面传播时推动细胞运动【1 6 】。 1 1 4 粘细菌的营养条件 粘细菌严格好氧，喜中性p h 环境，大多数为嗜常温菌，最适生长温度3 0 3 5 ， 但它们在9 , - - - 3 8 的范围内都可获得生长，代时为4 1 2 小时【l 。7 1 。 粘细菌属于有机化能自养型，能分解生物大分子。根据它们利用营养物的成分可简 单划分为两个生理类群：群i ( s o r a n g i n e a c ) 以纤维素和葡萄糖为营养基质，但含糖量高会 抑制纤维素酶的形成 1 8 , 1 9 】。群i i 包括大多数粘细菌菌株，它们不能利用纤维素，能在含 有酶降解蛋白胨形成的寡肽或单个氨基酸的培养基中生长。在自然条件下，这些粘细菌 以环境中的其他有机体例如真细菌或酵母菌为食。它们可分泌胞外酶( 蛋白酶、核酸酶、 脂肪酶、葡聚糖酶等) 水解菌体或细胞，形成的裂解物是这类粘细菌的营养基础，因此 它们也被称为依附寄生物 1 7 - 1 9 】。粘细菌的盐耐受性很低，大多数粘细菌仅在盐浓度低于 1 的培养基中生长发育，浓度过高时会抑制粘细菌的生长。碳水化合物对群1 i 型粘细 菌的生长为非必需的，但添加后会起促进作用。 1 2 粘细菌的活性次级代谢产物 近2 0 年来，粘细菌作为一类可产生丰富次级代谢产物的微生物类群日趋受到重视。 粘细菌的基因组在原核生物中是最大的，约为94 5 4 - - 一1 00 1 0k b p 2 0 , 2 1 1 ，大部分基因在细 胞活动后期负责合成复杂的次级代i 身 产物。 粘细菌的生物合成潜力巨大，5 0 , - - 一1 0 0 的粘细菌可合成生物活性物质，目前文献 报道的粘细菌来源的生物活性物质已有4 0 0 多种，约占微生物来源总数的3 5 ，仅排在 放线菌和芽孢杆菌之后，在医疗方面有很大的实际意义【6 1 。如：s o r a g i c i n 是一种广谱、 无毒的抗菌剂，在动物特别在胞内有抗菌活性。s a f r a m y c i n 具有抗肿瘤活性。a m b r u t i c i n 对很难治疗的全身性真菌病有很好的作用。e p o t h i l o n s 已引起医药界的广泛注视，它可 第一章绪论 阻止很多人体癌细胞，如胸部、肠和卵巢癌细胞的生长，因此将有望为癌症的临床治疗 做出贡献吲。图1 。1 为粘细菌产生的具有生理活性的几种次级代谢物的化学结构孵3 1 。 m e s a f r a m y c i nm a d a u r a c h i ne + m y x o v i r e s c i n a m b r u t i c i nv s - 1 o m y x o t h i a z o l 夕一八a 八o 、，夕c 0 0 h c l m a r a c e n 江南大学硕士学位论文 芦、 喵弋人 e p o t h i l o ns o r a p h e n 图1 - 1粘细菌产生的几种生理活性次级代谢物 f i g 1 - 1s o m eb i o a c t i v es e c o n d a r ym e t a b o l i t e sf r o mm y x o b a c t e r i a h 早在1 9 4 7 年就证明了变绿粘细菌( m v i r e s c e n s ) 的培养液中有抑制金黄色葡萄球菌的 物质。在以后的二十几年，德国、瑞典和日本的几个实验室报道了粘细菌的抗生素活性， 但未分离到物质，主要是因为当时认为这些粘细菌不能悬浮培养。1 9 7 3 年获得了能抑制 镰刀菌孢子发芽的异支链脂肪酸。1 9 7 7 年阐明了第一种粘细菌抗生素a m b r u t i c i n 的化 学结构，该抗生素系由能降解纤维素的纤维堆囊菌产生，其抗真菌作用强【2 4 1 。以后以色 列、西班牙和日本的实验室相继报道了粘细菌抗生素。 在研究粘细菌活性代谢物的几十年当中，科研人员们发现从粘细菌中分离到的多数 抗生素具有全新结构，虽然其中的异硫霉素( a l t h i o m y c i n ) 、硝吡咯菌素( p y r r o l n i t r i n ) 和 s a f r a m y c i n s 曾在链霉菌和假单胞菌中发现过。粘细菌还能生物合成其它化合物，虽然 还未证明它们有生物活性，如g e o s m i n 、类固醇和特殊的类胡萝卜素。一株菌株产生2 种或3 种结构完全不同的抗生素相当普遍，例如橙色标桩菌s g a l 5 同时合成s t i g m a t e l l i n 、 m y x a l a m i d 和a u r a c h i n s 【4 1 1 2 】。不同菌株可产生相同抗生素j ，例如橙色粘球菌、珊瑚粘 球菌、碟形囊球菌似n g i o c o c c u s ) 和橙色标桩菌产生m y x o t h i a z o l 。 1 2 1 粘细菌产生的活性物质的特点 ( 1 ) 种类多：目前已知的粘细菌来源的生物活性物质有8 0 种基本结构，6 0 0 多种衍生 结构，包括芳香类、杂环类、醌类、大环类、聚醚类、多烯类、肽类化合物等，从而为 筛选获得全新结构的生物活性化合物提供了广泛的基础。 ( 2 ) 结构新：目前分离到的8 0 多种基本结构，6 0 0 多种化合物中，仅有三种类型是在 其它微生物中报道过的；a l t h i o m y c i n 、s a f r a m y c i n 最初是从链霉菌发酵液中分离到的 2 5 - 3 1 】，n p y r r o l n i t r i n 是从假单胞菌得到的【3 2 ，3 3 1 。 ( 3 ) 一株菌可产生一种基本结构的多种衍生物 1 2 , 3 4 1 ：例如橙色粘球菌( m y x o c o c c u s f u h , u s ) 日- i 产生3 5 种不同的m y x o t h i a z o l e s ：纤维堆囊菌( s o r a n g i u mc e l l u l s o u m ) s oc e 2 6 菌株 可产生5 0 多种s o r a p h e n 族化合物；变绿粘球菌( m y x o c o c c u sv i r e s c e n s ) 的一株菌产生的 m y x o v i r e s c i n 有2 0 种类似物。从而为筛选高效低毒的新药提供了巨大的契机。 ( 4 ) 具有菌株特异性活性物质产生菌的比例高，菌株特异性强【1 2 , 3 5 ：在株粘细菌中 可以同时合成多种不同类型的化合物，各种组分可以达到数百种之多；抑菌活性阳性率 分析表明，溶细菌群( b a c t e r i o l y t i cg r o u p ) 粘细菌中5 5 的菌株可产生抑菌活性，而溶纤维 笙二皇笙丝 素群( c e l l u l o l y t i c gr o u p ) 粘细菌甚至高达9 6 ，高于链霉菌【35 1 。同种的不同菌株产生生物 活性物质的差异很大，如德国国家生物技术研究中心( g b f ) 己分析的7 0 0 多株纤维堆囊荫 中仅有1 2 株能够合成e p o 也i l o n e s 。 ( 5 ) 粘细菌产生的某些活性物质具有特异性：例如，m y x o c o c c u s f u l v u s m xf 1 6 菌株产 生橙粘菌素c 【3 5 】，是已知的分子量最小的细菌素之一。其结构紧密不易被胰凝乳蛋白酶 链霉蛋白酶水解，它在多种生境下保持稳定，并且能耐8 0 0 高温。它在浓度相当高的 条件下才能抑制和杀死细胞。m i u r a e n a m i d e s 能抑制电子传递等。 ( 6 ) 粘细菌产生的活性物质有许多是作用于真核生物的：s o c e l l u l o s m 产生的化合物 d i s o r a z o l a 对真核生物的作用显著，尤其对哺乳动物细胞有很高的毒性，是所记载的自 然产物中毒性最强的化合物之一【3 7 j 。c h r o n d r a m i d e s a d 是1 9 9 6 年在c r c r o c a t u s 的发酵 液中分离得到的，作用谱广泛，尤其可作用于对化疗有抗性的细胞系，具有很大的开发 潜力。 1 2 2 粘细菌生物活性物质的类型及其作用机理 粘细菌产生的生物活性物质种类繁多，作用机制也多种多样，主要类型有： ( 1 ) 呼吸抑制( 电子传递抑制) ：女1 m y x o t h i a z o l 、s t i g m a t e l l i n 、t h i a n g a z o l 和p h e n o x a n ； ( 2 ) 核酸合成抑制：如m y x o p y r o n i n 、c o r a l l o p y r o n i n 、s o r a n g i c i n 和r i p o s t a t i n s 等抑制细 菌r n a 多聚酶活性，s a f r a m y c i n 等作用于d n a 合成，这在微生物来源的生物活性物质中 是非常少见的一种作用机制； ( 3 ) 蛋白质合成抑制：在粘细菌培养物中己发现4 种这类物质，如作用于细菌的 m y x o v a l a r g i n 和a n g i o l a m ，作用于真核生物的g e p h y r o n i ca c i d 等； ( 4 ) 细胞骨架抑制剂：已发现c h o n d r a n i d e s 作用于肌动蛋圭l ( a c t i n ) ，而e p o t h i l o n e s 贝l j 作 用于微管蛋白( t u b u l i n ) t 3 8 】，这些物质的作用机制在抗生素中是十分罕见的； ( 5 ) 蛋白质磷酸化系统抑制剂：如r h i z o p o d i n 等； ( 6 ) 干扰金属离子的运输( 金属离子螯合剂) ：皂发现3 种，如m y x o e h e t i na 等； ( 7 ) 干扰脂类合成：如大环内酯s o r a p h e n 的基本作用位点是细胞膜的生物合成； ( 8 ) 干扰糖类代谢：a m b m b r u r u t i c i n 3 9 】具有抑制糖类利用，从而限制能量产生和传递 作用，这在微生物来源的生物活性物质作用机制中也是很少见的； ( 9 ) 作用细胞壁：女n c h i v o s a z o la 4 0 】，可破坏真菌细胞壁的完整性和稳定性等。 特别值得注意的是，粘细菌中发现的生物活性物质有许多是作用于真核细胞的，抗 肿瘤和抗真菌活性物质的比例较高，这也是粘细菌不同于其他生物活性物质产生菌的独 特之处【3 4 1 。其中，能够溶解纤维素的纤维堆囊菌( s o r a n g i u mc e l l u l o s u m ) 尤为引人注目， 其产生抑菌活性的阳性率高达9 6 ，甚至比著名的链霉菌还高。 将以上几类粘细菌生物活性物质的作用机理进行归纳，见表1 1 。 江南大学硕士学位论文 、 表1 1 粘细菌海 生代谢物的作用机理 t a b l e 1 1m e c h a n i s mo f b i o a c t i v em e t a b o l i t e sf r o mm y x o b a c t e r i a 作用机理作用部位抗菌谱代谢物 呼吸抑制 细胞色素b c l 复合物( 在q o 部位( k d真菌、酵母、和某 - - - - 1 0 - 1l m o l l ) 。辅酶q ：细胞色素c 2 些细菌 氧化还原酶( 细菌光合系统) b - 5 6 6 中心( k d = 1 0 - 1 0m o l l ) 的细胞 色素b c l 复合物。高等植物( 1 5 0 = 5 0 6 0 n m ) 的光合系统i i ( j 丕原面) 和细 胞色素b 6 f 复合物 n a d h ：辅酶q 氧化还原酶 n a d h 氧化( 牛心亚线粒体) 核酸合成抑制 真细菌的k n a 聚合酶( 阻断链的伸 长) 真细菌的r n a 聚合酶( 阻断链的起 始) 真菌、酵母、和某 些g + 细菌 g + 细菌、一些酵m y x a l a m i d s 母 g + 细菌、对某些 真菌有弱的作用 g + 细菌和某些g 一- 细菌 g + 细菌：i ：g - 细菌 蛋白质合成抑制 真细菌的蛋白质合成( 阻断氨酰t r n ag + 细菌和g 一细 与核糖体a 部位的结合)菌 干扰蛋白质磷酸 化系统 干扰金属离子运 输 作用于脂类代谢 干扰糖类利用 作用于细胞壁 作用于细胞膜 细胞的蛋白质磷酸化系统( 导致细胞 形变) 培养基中的金属离子( 干扰金属离子 的利用) 乙酰辅酶a 羧化酶抑制剂( 阻止细胞 膜的生物合成) 抑制糖的利用( 抑制能量的产生和传 递) 干扰酵母细胞壁出芽区域特定位点而 破坏其稳定性 导致细胞膜通透性改变，大量在紫外 有吸收的物质从细胞中漏出 1 2 3 粘细茵活性次级代谢物的生物合成 动物细胞、酵母和 霉菌 g + 细菌、部分酵 母菌和霉菌 真菌 真菌( 包括人类致 病菌) 和g + 细菌 生长态的酵母和 丝状真菌 g + 细菌和动物细 胞 a u r a c h i n s m y x o p y r o n i n c o r a l t o p y r o n i n s o r a n g i c i n r i p o s t a t i n s d i s r a z o l m y x o v a l m g i n a n g i o l a m c h o n d r a n i d e s e p o t h i l o n s r h i z o p o d i n m y x o c h e l i n n a n n o c h e l i n s o r a p h e n a m b r u t i e i n j e r a n g l i d s c h i v o s a z 0 1a s o r a n g i o l i d 文献表明，粘细菌产生的活性次级代谢物都含有氨基酸、乙酸、丙酸和甲硫氨酸的 甲基，提示它们来源于氨基酸和脂肪代谢4 1 1 。即使粘细菌能有效地合成糖、嘌呤和嘧啶 碱，但多数粘细菌它们的氨基酸是所有生物合成活性的起始原料。有些粘细菌抗生素如 s o r a l l g i c i n 是纯粹的聚缩酮，其合成涉及多酶系统，肽类抗生素m y x o v a l a r g i n 情况也与此 6 薰蔷 蔓二至笙笙 相似，虽然目前还不能在体外通过酶的作用合成m y x o v a l a r g i n ，已经证明非核糖体的生 物合成和存在分子量2 8 00 0 0 以上的多酶。此外，a 坤可使氨基酸活化，这涉及一些比通 常的氨酰t r n a 合成酶大得多的蛋白质。抗生素中的d 一氨基酸来自相应的l 一异构体。当 提供d 一氨基酸时却不能掺入抗生素分子中。1 3 一酪氨酸可能是通过2 ，3 一氨基变位酶 ( a m i n o m u t a s e ) 苯丙氨酸和酪氨酸产生的。在肽键形成后在丙氨酸的肽键部位可发生n 一 甲基化。胍基丁胺可掺入c 一端，也可通过细菌由精氨酸合成。n 一端的异戊酸来自亮氨酸。 2 ，3 - - - 羟异戊酸通过脱氢成酮羟酸和转氨基作用可生成1 3 一羟基缬氨酸。此外，脱水后 可生成脱氢缬氨酸。 粘细菌活性次级代谢物的合成需要各种生物酶的催化。其中很多次级代谢产物是由 p o l y k e t i d es y n t h a s e ( p k s ) 和或p e p t i d es y n t h e t a s e so f t h en o n r i b o s o m a lt y p e ( n r p s ) 催 化合成的。图1 - 2 n 出了这些次级代谢物的结构【4 2 1 。 此外，粘细菌产生的一些次级代谢产物的合成途径已经研究清楚。例如，k l a u s 等【4 3 j 阐明y e p o t h i l o n ea ，b ，c ，d 的合成途径其它们之间的相互转化。y a s u h a r u 等【4 4 j 对p h e n o x a n ( 一种由粘细菌产生的h w 1 病毒抑制剂) 的合成途径进行了研究，图1 3 展示了p h e n o x a n 的生物合成步骤。 、弋黯 图1 - 2 可能由p k s 和域n r p s 催化合成的次级代谢物 f i g 1 2e x a m p l e sf o rs e c o n d a r ym e t a b o l i t e sp r o b a b l ys y n t h e s i z e db yp k sa n d o rn r p s a m i n oa c i d m o i e t i e sa r es h a d e di ng r e y 7 江南大学硕士学位论文 图1 - 3p h e n o x a n 的生物合成步骤 f i g 1 - 3s t e p so fp h e n o x a nb i o s y n t h e s i s 1 3 粘细茵产生抗肿瘤药物的国内外研究现状 粘细菌的次级代谢产物在药物开发方面具有很好的潜力【l2 1 ，在抗生素开发和抑制肿 瘤因子研究方面有巨大的开发前景，可能成为开发生物活性物质新的微生物来源。 在国外，自从1 9 9 6 年德国国家生物技术中心( g b f ) 通过粘细菌纤维堆囊菌( s o 睨) 9 0 发酵，第一次从发酵液中分离到埃坡霉素( a 2 2m g l 和b1 1m e j l ) 以后，同一时期d a n i e l 等也从纤维堆囊菌的发酵液中分离至l j t e p o t h i l o n e s ，体外细胞毒实验表明，其活性是紫 杉醇的2 0 0 0 , - - 一3 0 0 0 倍。1 9 9 7 年m a n nj q ! e n a t u r e 上称e p o t h i l o n e s 是粘细菌赠给人类的礼物。 近年来，从粘细菌各个属的代谢产物中均发现了具有生物活性的新物质，粘细菌及其代 谢产生的e p o t h i l o n e s 引起了生物学家和药物学家广泛重视。而后美国k o s a n 、 b m s ( b f i s t o l m y e r - s q u i b b ) ，瑞士的n o v a r t i s ，r o c h e 以及以色列、西班牙、日本等国也有 实验室开始从事这方面的研究工作。其中美国、德国的几个研究室都是采取发酵与合成 并重的策略，取得了较大的进展。 在国内，对粘细菌研究比较成功的是山东大学，自2 0 世纪9 0 年代早期涉足这一领 域，从一株纤维堆囊菌9 0 ( s o c e 9 0 ) 菌株发酵液中得到了埃坡霉素a 和b ，并取得了2 项提取分离专利，另外东南大学( 盐土粘细菌) 、南京理工大学( 胞外多糖) 、天津大学等 院校近年来也开始了对粘细菌的研究工作。而化学合成方面目前世界上产率最高的是中 科院上海有机所刘志煜领导的研究小组，在2 0 世纪9 0 年代末期，中科院上海有机所刘 志煜课题组组采用化学法2 5 步合成得到了埃坡霉素a 和c 及其类似物异埃坡霉素b 等。 但是由于合成步骤多，制约了工业化的推广应用，仍然停留在实验室阶段。 从检索到的公开发表的文章看，从1 9 m 年至今，有关粘细菌的研究文章大约有1 1 0 0 多篇，其中与发酵有关、研究埃坡霉素的论文只有1 0 多篇，采用野生菌株发酵生产 e p o t h i l o n e s 的研究论文只有德国1 45 i 、华南理工大学【4 6 j 二篇报道，与对放线菌、芽孢杆菌 的研究相比，粘细菌的研究在全世界范围内还仍然处于刚刚起步阶段，因此对高产野生 。冀卜y 0 d l 一 r 卜h 一 v如 末。_ 囊 o 0 r 。e 一 翌二望堑丝 -_。-_。-。_。-_-。_-_-_。_。_。_-。-_-。_。-_。_-。-。_-。-。_。_。_。_-_-。_-。-_。1。一一 菌株的筛选以及对其抗癌活性物质的研究仍然有广阔的前景。 目前，对粘细菌生物活性物质的研究较其他类群的产生菌落后，这主要是因为粘细 菌操作困难，分子生物学研究手段的缺乏和基础研究的不足。粘细菌分子生物学研究目 前仅涉及粘球菌属( m y x o c o c c u s ) 和标桩菌属( s t i g m a t e l l a ) 两个属，而生物活性物质产生菌 却分布于粘细菌各个属，尤其是堆囊菌属( s o r a n g i u m ) ，因此，进一步加强粘细菌的分离 纯化和分子生物学等方面的基础研究，对更好地开发该类菌有重要的意义。 1 4 抗肿瘤药物的主要筛选模型 整体水平抗肿瘤实验结果是评价侯选抗肿瘤化合物有效性的最重要的指标。整体水 平模型的建立是进行药效学评价的先决条件。样品经体外活性检测( 初筛) 结果为阳性仅 为进一步筛选提供线索，还需要经过动物体内实验确定有无疗效以决定取舍。不管采用 何种分子靶点和相应的检测进行初筛，都需要经过动物实验疗效评价。动物体内实验反 映了药物的疗效和毒性的综合结果，是体外检测方法与模型不能取代的药物筛选过程的 决定性环节j 。 早在2 0 世纪5 0 年代早期，小鼠肿瘤移植瘤模型就被用作抗肿瘤药物的主要筛选模 型。通过这个筛选模型，已经发现了不少抗肿瘤药物，同时其经验也对制定肿瘤治疗原 则做出了贡献。小鼠肿瘤移植瘤模型具有实验周期短、重复性好、所需空间小、费用相 对较低、可以定量并可根据不同肿瘤采用不同的治疗方案或条件等优点，因此曾经广泛 使用。该模型采用的是动物的肿瘤组织，不是人源的肿瘤组织，难以准确模拟药物的临 床疗效。小鼠肿瘤一般对药物敏感性较高，与临床抗肿瘤药物治疗人肿瘤的实际情况有 较大差别，特别是难以寻找对某种特定的人类肿瘤有较好疗效的药物。因此，自1 9 9 0 年以来国际上便广泛地采用人癌裸小鼠移植瘤模型对抗肿瘤侯选化合物进行评价，并以 此作为抗肿瘤药物临床前药效学的主要评价依据。但是小鼠移植瘤模型对于缩小药物筛 选范围，判定化合物的开发前景有意义【4 7 】。 目前，世界上建株的小鼠移植性瘤有几百种，不同瘤株对宿主有不同的要求。在众 多的移植瘤中，小鼠的l e w i s 肺癌、b 1 6 黑色素瘤和白血病p 3 8 8 、l 1 2 1 0 以及这些移植 瘤的亚型和耐药株在抗肿瘤药物的筛选、药效和药理研究中应用最为广泛。其他在国内 建立的小鼠肿瘤模型还有宫颈癌u 1 4 、肝癌b 1 6 、网织细胞瘤m 5 0 7 6 、结肠癌2 6 、结肠 癌3 8 、乳腺癌c d 8 f 1 、艾氏腹水瘤( e a c ) ，肉瘤( 8 1 8 0 ) 等。采用小鼠肿瘤移植瘤体内评 价被试药物的作用，影响因素复杂，包括药物的体内转化和作用方式，小鼠种系、实验 模型、给药方式、移植瘤部位等。实验模型的选择是关键，每一种小鼠移植瘤模型都有 局限性，也有其特殊价值，研究者根据自己的目的进行选择【47 。 恶性黑色素瘤( m a l i g n a n tm e l a n o m a ，m m ) 是由皮肤和其他器官的黑素细胞系统所发 生的一种恶性程度相当高的肿瘤，容易发生血行转移。黑色素瘤b 1 6 是c 5 7 b l 6 小鼠 耳根部皮肤的自发性