（光学专业论文）金属离子对dna结构影响的喇曼光谱研究.pdf

摘要 摘要 癌症是类严重危害人类健康及生命安全的常见病、多发病，其发爿三是多 种因素引起，其中以化学物质为主，如：砷、镉、镍及苯等。金属汞、银、铅、 镉、砷、铬、镍等对d n a 、r n a 、酶、蛋白质以及细胞膜的损伤非常大，从而引 起它们的致癌、致突变作用，以破坏细胞的正常代谢和分裂；降低机体的免疫 功能、防癌和抗癌能力，1 旦中毒是很难治愈的。锌为人体必需的一种元素， 俗称“生命之光”，但过量的锌也会对d n a 的性质产生影响，导致d n a 结构变 得不稳定。日本的骨痛病、水俣病就是金属离子引起的中毒。因此，研究金属 离子跟d n a 的相互作用，对于了解d n a 的中毒机理，以及预防疾病有着重要的 生物学意义和应用价值。 本文利用喇曼光谱技术研究了不同金属离子在不同的m e “p o ：一( r ) 情 兑下 ( m e ”表示金属离子) 对d n a 结构的影响，发现：在c d ”一d n a 中随着r 从0 逐渐 增加到3 0 时，8 3 5 o c m 。的中心位置相应地移到了8 3 5 0 ，8 3 2 0 ，8 3 2 0 ，8 2 9 0 和8 2 7 o c m - 1 ；1 4 4 6 0 和1 4 6 1 o c m l 处的重叠峰分开，前者移到了1 4 4 1 o c m l 处，后者移到了1 4 5 8 o c m ；除了这两处显著变化之外，其它喇曼峰也都发生了 变化。而在z n ”一d n a 中，8 3 5 o c m l 处的光谱也出现红移，其所对应的中心位置 分别为8 3 5 0 、8 3 5 0 、8 3 2 0 、8 2 7 0 和8 2 3 0c m ；1 0 9 5 o c m 。1 和1 4 9 1 o c m - 。 的谱线宽度增大，1 1 4 6 o c m - 。强度和频率明显改变等等。通过对这些变化进行详 细讨论和分析，我们得到了如下的结论： z n ”和c r 都可以跟d n a 的磷酸基团螯合，形成- p o 。m e ”n 7 ( g ) 螯合物， 但是前者的螫合跟离子浓度有很大的关系，在摩尔浓度比小于2 0 时，螯合物 的生成量跟r 成正比关系，而后者的螯合跟离子的关系不是很明显，只有当r 处于i 0 至i j 之间时，螯合作用才能进行，并且螯合物的生成量跟r 之问没 有很明显的关系存在。此外，z n 2 + 还能跟d n a 中c 上的n 3 - 0 2 螯合，而c 矿不能， 这种螫合打断了g c 碱基对之间的氢键，破坏了d n a 的稳定性。 z n ”和c 矿都可以跟g 碱基上的n 7 进行结合，同时这两种金属离子还能在其 摘要 它位置跟g c 碱基结合。另外，z n ”和c 矿还能同d n a 中的a t 碱基对结合。但是 不同的金属跟g c 、a t 碱摹对之问的结合情况不同，就算是同一种金属离子在不 同浓度时跟g c 、a t 碱基对的结合情况也不同。在低浓度情况下，z n ”较多的跟 a t 结合，但是在较高浓度时，z n ”跟g c 的结合就要强很多。而c 矿则主要跟a t 碱基结合，这种结合打断了a t 碱基对之问的氢键，破坏了d n a 的稳定性，造成 g c 百分含量增加。 总而言之，低浓度的z n ”能够稳定d n a 的结构，但是高浓度的z n “却能打断 g c 碱基对之问的氨键，对d n a 的稳定性起到破坏作用。而cd 2 + 跟d n a 的相互作用 只有在较高浓度下，即r 大于1 0 时，才能发生作用，并且主要跟a 作用这种作 用也对d n a 结构的稳定性起到了破坏作用。在这两种金属离子的作刷下，d n a 的 构象都发生了变化，不再是一个典型的b - d n a ，而是一个修饰过的b 一d n a 。 另外，本论文还对喇曼光谱技术的发展及应用作了相应的展望，随着激光光 源的不断进步，以及相应措施的改进，喇曼光谱技术在生物医学上的作用越来越 大，并且这种技术还将扩展到其他的一些领域中去。 关键词：喇曼光谱；稳定性；构象：c 矿： z n 2 + v a b s t r a c t c a n c e r sa n di t sc o m p l i c a t i o n sh a v eb e c o m et h ea d v e r s ep r o b l e m st h a ts e r i o u s l y t h r e a t e nh u m a nh e a l t hw o r l dw i d e l y h o w e v e r , t h e r ei ss o m ed i f f i c u l t yi nt r e a t m e n t t h ec a n c e re f f i c i e n t l y t h eb e s te x i s t i n gw a y o f c u r i n gc a n c e r s i st od e t e c tt h es t a t e so f p a t i e n t sf r e q u e n t l ya n d t h e na d j u s tt h eq u a n t i t yo fn e c e s s a r ym e d i c a ld o s e ；t h e r e b yt h e c a n c e r so f p a t i e n t sc a nb ec o n t r o l l e da n d t h ec o m p l i c a t i o n so fi tc a nb ep r e v e n t e do r r e l i e v e d c a n c e ri sc a u s e db ym a n yf a c t o r si nw h i c ht h ec h e m i c a lm a s t e r i e ss u c ha sa s ， c d ，n ia n db e n z e n e ，e t c ，h o l dt h ef i r s tp l a c e m e t a lm a s t e r i e s ，f o re x a m p l eh g ，a g ，p b ， c d ，a s ，c r ，n i ，a r eh a r m f u lt od n a ，r n a ，e n z y m e ，p r o t e i na n dc e l lm e m b r a n ea n d w i l lc a u s et h e t a k i n gp l a c e o fc a n c e r sa n dm u t a t i o n so ft h e m s ot h en o r m a l m e t a b o l i z ea n ds p l i ta r ed a m a g e d ，t h ei m m u n i t yf u n c t i o n ，t h ea n t i c a n c e rf u n c t i o n w i l lb ew e a k e n e d i ti sv e r yd i f f i c u l tt ob ec u r e do n c eh eo rs h ei st o x i c z ni sa n e c e s s a r ye l e m e n tf o rm a n a n di sn a m e da s t h el i g h to fl i f e ”b u ts u p e r f l u o u sz na l s o a f f e c t st h ep r o p e r t i e so fd n aa n dl e a d si t s c o n f i g u r a t i o nu n s t a b l e t h ei t a i - - i t a i d i s e a s ea n dt h e s h u iy u ”d i s e a s ew e r ec a u s e db ym e t a li o n s s ot o s t u d yt h e i n t e r a c t i o no fm e t a li o n sw i t hd n ai sv e r yi m p o r t a n ti nb i o l o g ya n da p p l i c a t i o n sf o r u st ou n d e r s t a n dt ot o x i cm e c h a n i s ma n d g u a r da g a i n s t d i s e a s e s i nt h i sp a p e r , w eu s e dr a m a n s p e c t r o s c o p i ct e c h n i q u et os t u d yd i f f e r e n tm e t a l i o n sw i t hd i f f e r e n tc o n c e n t r a t i o n sa n df o u n dt h a ti nc d - d n as o l u t i o n ，w h e nr i n c r e a s e sf r o m0t oo 5 ，1 0 ，1 5 ，3 0 ，t h ec o r r e s p o n d i n gr a m a n s p e c t r ao f8 3 5 0 c m “ a r e8 3 50 c m 一，8 3 2 0 c m 1 ，8 3 2 0 c m 。，8 2 9 0 c m ，8 2 7 0 c m - 1 , r e s p e c t i v e l y t h es p e c t r u m o ft h ed o u b l eh e l i xb - d n am a c r o m o l e c u l ea t8 3 5 0 c m s h i f t e sa b o u t8 c m t h e o v e r l a p p i n gs p e c t r ao f1 4 4 6 0 e m l a n d1 4 6 1 0 c m ls e p a r a t e sw i t hi n c r e a s i n go fc d 2 + w h i c hi sd i f f e r e n tf r o ma n c i e n t e x p e r i m e n t sa n de a c hm o v e st o 1 4 4 10 c m - 1a n d 1 4 5 8 0 c m 1 ，r e s p e c t i v e l y b u ti nz n d n as o l u t i o n ，t h ec o r r e s p o n d i n gc e n t e rp o s t i o n s o f8 3 5 0 c m 1w i t hi n c r e a s i n go fra r e8 3 5 0 ，8 3 5 0 ，8 3 2 0 ，8 2 7 0a n d8 2 3 0 c m ， r e s p e c t i v e l y t h eb a n d w i d t ho f1 0 9 5 0a n d1 4 9 1 ，0 c m 1a r eb r o a d e n e da c u t l y b o t ht h e v i 一 塑蔓 f r e q u e n c ya n di n t e n s i t y o f11 4 6 0 c m lc h a n g el a r g e l y ，e t c d i s c u s s e da n dc o m p a r e d t h em e c h a n i s mo f t h e s ei n t e r a c t i o ni nd e t a i lw eg o ts o m e c o n c l u s i o n sa sf o l l o w i n g ： b o t hz n 2 。a n dc d 2 + i o n sc a nc h e l a t ew i t hp 0 2 a n dc o m ei n t ob e i n g p 0 2 。 m e 斗n 7 ( p u r i n e ) c h e l a t e a st oz n 2 + i o n s ，w h e nr 2 0 ，t h eq u a n t i t yo f p 0 2 z n 2 + n 7i sd i r e c t l vl i n c a rw i t hr w h e nr 2 0 ，z n 2 一i o n se v e nc a l lc h e l a t ew i t hc a tn 3 0 2s i t e sa n dt h i sc h e n t i o nw i l ld i s r u p tt h eh b o n db e t w e e ng cb a s ep a i r sa n d m a k et h ed n as t r u c t u r eu n s t a b l e a st oc d ”i o n s ，o n l yw h e nri sw i t h i n1 0 1 5c a n t h i sc h e l a t i o nt a k ep l a c ea n dt h er e l a t i o no ft h eq u a n t i t yo ft h i sc h e l a t ew i t hri sn o t e a s yt oc o n c l u d e b o t hz n 2 + a n dc d 2 + i o n sc a ni n t e r a c tw i t ha ta n dg cb a s e sb u tt h eb i n d i n g d e g r e ei s d i f f e r e n tf r o md i f f e r e n ti o n sa n de v e nt ot h es a m ei o n si tw i l lc h a n g ew i t h t h ec h a n g eo fi o n sc o n c e n t r a t i o n s i nl o wm e t a li o n sc o n c e n t r a t i o ne n v i r o n m e n t ，z n 2 + i o n sb i n dt oa ta r ee a s i e rt h a nt og c ，w h e r e a si nh i g h e rm e t a li o n sc o n c e n t r a t i o n s u r r o u n d i n g s ，z n 2 + i o n sb i n dt og ca r ee a s i e rt h a nt oa t , s oi nh i g h e rz n 2 + i o n s e n v i r o n m e n t ，g cb a s e sa r ed a m a g e dl a r g e rt h a na t c d 2 + i o n sm a i n l yb i n dt oa t b a s e sa n dt h e s ei n t e r a c t i o n sw i l ld i s r u p tt h eh - b o n db e t w e e na tb a s ep a i r s ，d e s t r o y t h es t a b i l i t yo fd n aa n dl e a dt h e p e r c e n to f g ct oi n c r e a s e i naw o r d ，b o t hz n 2 7a n dc d 2 + i o n sc a ni n t e r a c tw i t hd n aa n dm a k ei ta l t e ri t s c o n f o r m a t i o nf r o man o r m a lb d n ai n t oam o d i f i e db 一d n a a tl a s t , ap r o s p e c to fr a m a n s p e c t r o s c o p yi ni t sd e v e l o p m e n t sa n da p p l i c a t i o n s w a s p r o p o s e d t h ee f f e c t so fr a m a ns p e c t r o s c o p yb e c a m em o r ea n dm o r ei m p o r t a n t w i t ht h ep r o g r e s s e so fl a s e rb e a na n dt h ep u t t i n gi np r a c t i c eo fa m e l i o r a t em e a s u r e s a n dt h i st e c h n i q u ew i l le x p a n dt oo t h e rf i e l d s k e y w o r d s ：r a m a ns p e c t r o s c o p y , s t a b i l i t y , c o m f o r m a t i o n a lc h a n g e s ，c d 针，z n 2 + v i i h 再 刖茜 d n a 双螺旋的弯曲和变形在d n a 一蛋白质的识别、基因的表达和遗传方面起着 重要的作川。近年来，d n a 的构象变化、浓缩特性以及动力学特性成了研究的热点， 而对金属阳离子跟d n a 相互作用的研究更是热点之中的热点。r a z m i a f s h a r i 曾利 用缩氨酸与c r 形成的配合物间接研究c d ”与d n a 的相互作用，发现c 矿能以高的 亲和力结合到双螺旋d n a 上；陈霞用不同的方法研究了单一浓度c d 2 - 诱导d n a 构象 的变化，得出d n a 由b 型变成了a 型：花尔并等人得出：由于c 与p o l y ( i ：c ) 的 磷酸根的静电作用，c d = + 对a 型双股螺旋p o l y ( i ：c ) 起到稳定性作用。e u g e n 、s a n d r a 和h e l m u t 等从理论上分析了z n ”跟d n a 各组成成份之间结合所需的能量、两者之 问结合的键长、键角大小的变化等；郑文竹则着重分析了在温度变化下，z n ”对d n a 结构稳定性的影响。此外，还有m r e v l i s h v i l i 等研究了l i + m 9 2 + 和c u ”等在加热的 情况下能促使d n a 变性；柯德森等研究了维生素c c u 菲咯啉系统对d n a 的定位 损失作用；a i l i s o n 和c h a l l a 金属络合物能诱导d n a 断裂，杨频则综述了国内外 有关金属配合物跟d n a 相互作用方面的研究等等。 纵观国内外的文献及综述，发现所有这些研究基本上都只是着重讨论了当温 度不同或d n a 碱基对数目不同或在m e 2 + 浓度单一的情况下，金属离子跟d n a 之 间相互作用的情况，而对于在恒温( 或基本不变) 下，同种金属离子在不同浓度情 况下，不同利t 金属在不同浓度下对d n a 构象变化影响的却未见报道。为深入了解 m e ”对d n a 的影响情况，了解多大浓度的m e 2 + 才会对d n a 造成损伤以及不同金属离 子在不同浓度下对d n a 的损伤情况，更好地掌握金属离子对d n a 的损伤作用，防治 由金属离子引起的疾病，我们设计了一套实验方案，利用喇曼光谱技术来研究和 分析金属离子对d n a 结构的影响情况，以期找到金属离子对d n a 损伤的浓度闽值。 本文主要介绍了喇曼光谱技术的基本原理及装置，汇报了金属离子对d n a 结 构影响的实验研究结果，并分别对这两种金属对d n a 结构的影响进行了详细地分 析和讨论，初步得到一些结论。论文最后简单介绍了喇曼光谱技术的应用前景， 并对今后的研究作出展望。 第1 章金属离子对d n a 的毒害性及研究意义 第一章金属离子对d n a 的毒害性及研究意义 重金属在地球上是广泛存在的，它们对于高等动物而言，一半认为是必需的 元素，但尽管这些金属元素跟人体的营养作用有关，但是大多数金属离子都带有 毒性，当其在人体内的浓度超过一定的值后，它就会对人体产生毒害性。近年来 在环境科学巾，重金属对于生物( 特别是人) 的影响已经成为重要的科研课题， 并且几乎毫无例外的以重金属过剩引起的危害作为研究的课题。本章简单地介绍 了d n a 的。1 些基本情况，特别重要地叙述了金属离子的毒害性及研究意义。 1 1 d n a 简介 1 9 4 4 年，艾弗里( o t a v e r y ) 等人的著名的肺炎球菌转化试验确立了d n a 是主要遗传物质。紧接着，郝尔歇( a d h e r s h e y ) 。1 等人用同位素标记法进一 步肯定了d n a 的遗传作用。其间，c h a r g a f f ，m a r k h a m 。”等提出了a t 、g - c 之间 互补的概念。这一极其重要的发现，为以后w a t s o n - c r i c k 建立d n a 双螺旋结构模 型提供了重要依据。1 9 5 3 年d n a 双螺旋结构模型的提出，被认为是2 0 世纪在自然 科学中的重大突破之一9 。“。分子生物学所取得的突飞猛进的发展与d n a 双螺旋结 构模型的建立是分不开的。 1 1 1 碱基之间的关系 2 0 世纪4 0 年代后期，c h a r g a f f 等应用纸层析及紫外分光光度计得出各种生物 d n a 的主要四种碱基( 腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶、胸腺嘧啶) 的组成之问有着不同 的碱基比例，不同碱基在数量上是紧密相关的，并得出如下规律【3 , 4 】： ( 1 ) 所有d n a 中腺嘌呤与胸腺嘧啶的摩尔含量相等，即 a = i t ；鸟嘌呤与 胞嘧啶的摩尔含量相等，即 g = c 。因此，嘌呤的总含量与嘧啶的总含量相等， 即 a + g = c + t 。 ( 2 ) 不同生物种的d n a 具有自己独特的碱基组成比例( 又称不对称率比率 d i s s y m m e t r yr a t i o ) ，可表示为( a + f t ) ( g + c ) 。亲缘相近的生物，其 d n a 的碱基组成相似，即不对称比率相近。 2 第一章金属离子对d n a 的毒害性及研究意义 ( 3 ) 同一种牛物d n a 的碱基组成没有组织和器官的特异性。 1 1 2 二级结构 在不同湿度和盐浓度下，d n a 的双螺旋可采取不同的构象，呈现这些构象类型 的d n a 分为a - d n a 、b - d n a 、c - d n a 、d - d n a 、z - d n a 。下面主要介绍了b - d n a 、a - d n a 、 z - d n a ： ( 1 ) b - d n a 的结构特征( 见图i i ) “” 1 两条反向平行的多核苷酸链围绕同一中心轴相互缠绕。 2 碱基位于双螺旋的内侧，磷酸与核糖在外侧，彼此通过3 ，5 一磷酸二酯键 相连接，形成d n a 分子的骨架。两条链均为右手螺旋。双螺旋结构上有二条螺形 凹沟，深沟( m a j o rg r o o v e ) ，浅沟( m i n o rg r o o v e ) 。 3 双螺旋的平均直径为2 n m ，碱基堆积距离为0 3 4 n m ，两核苷酸之间的夹角 为3 6 。因此，沿中心轴每旋转一周有l o 个核苷酸。每一圈的高度( 即螺距) 为 3 4 n m 。 4 两条核苷酸链依靠彼此碱基之问形成的氢键相连而结合在一起。a 与t 相 配对，形成两个氢键；g 与c 相配对，形成三个氢键。所以g c 之间的连接较为稳 定。 ( 2 ) a - d n a 的结构 在相对湿度为7 5 以下所获得的d n a 具有不同于b - d n a 的结构特点，称为 a - d n a 。若降低湿度或在水溶液中加入乙醇，可使b - d n a 转变为a - d n a 。a - d n a 的 螺体较宽而短，碱基对与中心轴的倾角也不同。 ( 3 ) z - d n a 分子的结构 除了a - d n a 和b - d n a 以外自然界中还发现有种z - d n a 。它不是右手螺旋， 而是左手螺旋。z - d n a 只有一条大沟，而无小沟。天然b - d n a 的局部区域可以出 现z d n a 的结构，说明b d n a 与z d n a 之间是可以互相转变的。 第一章金属离子对d n a 的毒害性及研究意义 1 1 3 性质 ( 1 ) 一般性质”4 核酸和核苷酸既有磷酸基，又有碱性基团，所以都是两性电解质，因磷酸的 酸性强，通常表现为酸性。 d n a 为白色纤维状固体，溶于水，不溶于一般有机溶剂。大多数d n a 为线形分 子，分子极不对称，其长度可以达到几个厘米而分子的直释只有2 n m 。因此d n a 溶液的粘度极高。 d n a 可被酸、碱或酶水解成为各种组分，用层析、电泳等方法分离，其水解程 度因水解条件而不同。 ( 2 ) 变性和复性。_ 4 1 高温、酸、碱以及某些变性剂( 如尿素) 能破坏d n a 中的氢键，使有规律的螺 旋型双链结构变成单链的、无规律的“线团”，此作用称为d n a 的变性。 d n a 水溶液加热变性时，双螺旋的两条链分开。如果将溶液迅速冷却，则两条 单链继续保持分开。但是，如果缓慢冷却，则两条链可能发生特异的重组合旃恢 图1 1d n a 双螺旋的结构模型 f i 9 1 1t h ed o u b l e h e li c a ls t r u c t u r eo fd n a 4 第一章金属离子对d n a 的毒害性及研究意义 复成双螺旋。因此d n a 的变性在1 定条件下是可逆的。变性d n a 恢复其原有结构 和性质称为复性。 d n a 的变性并不涉及核苷酸问共价键的断裂，因而并不引起分子量的降低。多 核苷酸链的磷酸二脂键断裂称为降解。d n a 变性或降解时其紫外吸收值增加，这种 现象叫做增色效应，与增色效应相反的现象称为减色效应。变性d n a 复性时发生 减色效应。它们是堆积碱基的电子问相互作用的变化引起的。 ( 3 ) 稳定性“” d n a 双螺旋结构在生理状态下是很稳定的。维持这种稳定性的主要因素是 碱基堆积力( b a s es t a c k i n gf o r c e ) 。嘌呤与嘧啶碱形状扁平，呈疏水性，分布于 双螺旋结构内侧。大量碱基层层堆积，两相邻碱基的平面十分贴近，于是使双 螺旋结构内部形成个强大的疏水区，与介质中的水分子隔开。其次，大量存 在于d n a 分子中的其他弱键在维持双螺旋结构的稳定上也起一定作用。这些弱 键包括：互补碱基对之间的氢键；磷酸基团上的负电荷与介质中的阳离子之间 形成的离子键；范德尔引力。 1 2 金属离子的毒害性及其对d n a 的影响 1 2 1 金属离子的毒害性 m n 、c u 、z n 等重金属元素是生命活动不可或缺的微量元素，但是大部分重金 属并非生命活动的必须品，而且所有重金属元素在人体内的含量超过一定浓度都 会有毒害作用，其中以h g 毒性最大，c d 次之，p b 、c r 、a s 也有相当的毒害，有 人将这五种危害较大的重金属戏称为“五毒”。3 。1 9 3 1 1 9 7 2 年，日本曾发牛举 世震惊的水俣病和骨痛病( i t a i i t a id i s e a s e ) 事件“1 ( 如下是患病者的模样) ， 经过长期研究发现，这两种病都是由于金属离子经过食物链使人中毒，从而导致 疾病的发生。1 9 6 0 年，我国大余县也出现了钨矿镉的污染。并不是一定出现临床 症状才表明已有中毒发生。以p b 为例，当血铅值低于1 0 0 “g l 时，身体处于相 对安全状态：当血铅值为1 0 0 2 0 0 肛g l 时，属于轻度铅中毒，影响造血l 、神经传 兰：至全壁童王型旦坚垒塑童查竺垦竺塞童墨 导和认知能力，易出现头昏、烦躁、注意力涣散、多动、厌食、腹胀、轻度贫血 等现象，但有时也无明显症状：当血铅值达到2 0 0 4 4 0 g l 时，为中度铅中毒， 能引起缺钙、缺锌、缺铁，免疫力低下，运动不协调，视力和听力受损，智商下 降，生长发育迟缓，贫血、腹绞痛、食癖、反应迟钝等症状；当血铅值达到4 4 0 7 0 0 几时，就是重度铅中毒，可出现性格改变，易激怒，有攻击性行为，运动失调、 贫血、腹绞痛、高血压、心律失常和痴呆等症状；当血铅值大于7 0 0 i _ t g l 时，为 极重度铅中毒，可导致瘫痪、昏迷，甚至死亡。不同的重金属的摄入临界值是不 同的，目前世界卫生组织暂时规定允许摄入量是c d 为4 0 0 5 0 0 9 9 人周：p b 为 0 0 5 m g k g 体重周“1 。 图1 2 骨痛病患者的模样 f i 9 1 2t h ea p p e a r a n c eo f p a t i e n tw h oi ss u f f e r i n g f r o mi t a i i r a id i s e a s e 但是在多数情况下，生物体对重金属的一次摄入量不会超过中毒反应的临界 浓度，正如上面“衄铅值”的例子所述，当血液中铅的浓度低于2 0 0 “g l 时就很 可能没有什么临床症状。但这并不意味着没有问题，反而隐藏着更为巨大的危险。 由于食物链的生物放大作用以及某些重金属元素所形成的化合物不易分解的特 性，加之人类通常处于食物链的末端，重金属元素会在我们身体的某些器官内逐 渐富集而造成慢性中毒。正是因为这种慢性中毒有很长的潜伏期和隐蔽性，所以 更容易为人们所忽视，而且旦事故出现，就会造成灾难性的后果。我们前面所 提到的骨痛病就是一个很好的例子。经历了这样漫长的毒物积累，治愈的希望已 经非常渺茫了。1 。因此可知，金属离子在体内的积累问题是一个不可忽视的问题。 6 第一章金属离子对d n a 的毒害性及研究意义 圈1 3 金属离子跟三螺旋d n a 的相互作用图( 黄色为氢离子，浅蓝色为钠离子， 深兰色为氯离子) f i 9 1 3t h ei n t e r a c t i o no fb e t a li o n sw i t ht r i p l - h e l i c a ld n a t h ey e l l o w d e n o t e sh c a m b r i d g eb l u ed e n o t e sn a + a n dd e e p - b l u ei sc 1 一 癌症也是一类严重危害人类健康及生命安全的常见病、多发病，其发生是多 种因素引起，其中以化学物质砷、镉、镍及苯等为主吼”。金属汞、银、铅、镉、 砷、铬、镰等对胤 、刚a 、酶、蛋白质以及细胞膜的损伤非常大，从而引起它们 的致癌、致突变作用，以破坏细胞的正常代谢和分裂；降低机体的免疫功能、防 癌和抗癌能力。最近发现，某些肺癌、前列腺癌是由于金属离子跟狲l 的相互作 用引起的。d n a 决定着生物体的遗传和变异，因此，研究金属离子与d n 的相互作 用对于橱述金属离予的中毒机理以及防治疾病有着重要的意义。 1 2 2 盒离子对眺结构的影响 多价阳离子可中和d n 分子中带负电的磷酸基团，使得d m 分子螺旋间的静 电排斥力降低a 在这里，我们主要讨论了金属离子跟d n a 的结合理论以及金属离 子对d n a 的断裂作用。图1 3 是金属离子跟三链埘姐的作用图示。 ( 1 ) 结合理论“” 第一章金属离子对d n a 的毒害性及研究意义 双配位键合理论：对于过渡金属离子来说，由于外层电子失去，存在着d 、f 空穴轨道或成单电子，根据泡利不相容原理，每个轨道需要自旋反平行的电子去 填充，满足它的饱和性，而d n a 分子中氨举( 一n h 。) 上的n 原子，磷酸根中的0 原子，都有孤对电子，这些孤对电子正好与过渡金属离子的空穴轨道配位，形成 稳定的络合物。 两极互补理论( t p c t ) ：两极互补理论是我国的科研工作者杨频教授等创立 的，此理论分为三个层次：分子结构的两极可= 补，即药物分子结构和性质上总 是存在着亲水性和疏水性，正电性和负电性的两极。受体一底物作用方程式的 两极互补，即药物分子与靶分子的相互作用总是经由“活性r f l 间体”通过电荷控 制和轨道控制这种电价分性和共价性两极可补的作用方式与d n a 骨架上的磷酸氧 位点( 电价性) 和嘌呤、嘧啶的氧位点( 共价键) 键合。受体、底物在对称上 的两极互补，即对于手性分子与d n a 的作用，表现出分子的右手性对应体与左手 d n a 的键合，形成左手和右手两极互补的复合体。 ( 2 ) 断裂作用” 金属阳离子对d n a 结构的影响主要表现在金属离子对d n a 的氧化断裂、水解 断裂以及改变d n a 的构象方面。d n a 容易被金属断裂的方式主要显示在两个方面： 糖环被攫取氢导致d n a 降解：d n a 的各个碳原子上的氢都能被金属自由基攫 取，但最容易的是4 - 及5 一位的氢被取代，这些氢被取代的顺序为： h 一5 h - 4 h 一2 h 3 h 1 。 碱基的氧化损伤也是d n a 断裂的主要途径之。：富含电子的嘌呤及嘧啶杂环 是金属氧化剂进攻的首选靶之一。其中g 是最容易被氧化的碱基，其被氧化的产 物一般是g 自由基阳离子。 迄今为止设计的d n a 断裂试剂多以氧化机理断裂d n a ，氧化断裂试剂的特异 性主要依赖于在d n a 不同位置的反应性差异以及断裂试剂与d n a 的特异性结合造 成的局部自由基富集；但由于自由基的高反应性和扩散性，其特异性一般较差， 8 第一章金属离子对d n a 的毒害性及研究意义 反应难于控制，产物种类较多，从而大大限制了其应用。而以水觯机坪断裂d n a 的试剂分子则必须与d n a 链结合并相互作用，通常是金属离子直接或问接与d n a 磷酸骨架上的氧原子配位，进攻磷酸二脂键引起水解或酯转移反应并导致链断裂， 其机理与天然核酸酶基本相同。冈此水解断裂与氧化断裂试剂相比具有相当的优 越性。尽管水觯机理断裂d n a 双链的特异性优于氧化机理，但是由于双螺旋d n a 有显著的稳定性，所以与氧化断裂剂相比，成功的d n a 水解断裂分子极少。 1 3 研究目的及意义 对于金属离子对d n a 的毒害性，迄今为止，国内外已经有大量的研究文献和综 述。我们将这些文献和综述分成六类。1 ) 氧化断裂：氧化断裂丰要是过渡金属 离子、过渡金属络合物以及稀土配合物等对d n a 的氧化作用，这利r 氧化作用主要通 过对碱基和脱氧核糖c l ，c 一4 氢原子的作用，使得脱氧核糖开环，并经一系列消除 反应，导致磷酸二脂键断裂，从而促使d n a 断裂。m i n 、p r i y a m v a d a 、e r n s t 以及宋 元宗等“。”研究了业铁离子f e ”在h ：0 ：的辅助下，能断裂d n a 双链结构，i b r a h i m 等 “”研究t f e 3 。- 甲胺嘧啶络合物和心0 ：一起能将d n a 双链“剪断”。吴霞琴等“”研究了 稀土配合物铕苯丙氨酸对d n a 分子链切断作用的影响，得到随着配合物浓度的增 大，d n a 的这种切断作用就越明显。这种氧化断裂方法能快速断裂d n a 链，但严重 破坏t d n a 链上的碱基和脱氧核糖，因而其使用受到了极大的限制。2 ) 水解断裂 作用：水解断裂主要是通过金属离子c e 来断裂d n a 的磷酸二脂键，国内在这方面的 研究文献相当多。d n a 的磷酸二脂键是极难水解的，如果没有天然酶的参与，其半 衰期大约是2 亿年，即使有催化剂参与，其水解速度也远没有天然酶和氧化切割快， 因此，催化水解长期得不到发展。近年来经研究发现，l a 系中的c e ( ) 具有较强 的催化水解作用，在温和条件下能水解单链和双链的d n a ，生成3 一或者5 一末端。 倪家缵等“4 发现只有c e ( ) 离子对单核苷酸具有快速断裂作用，且具有较高的选 择性。康玉专、沈鹤柏等“”也发现c e 离子对d n a 的催化水解切断功能。3 ) 热变性： d n a 在温度改变或加入已醇等条件下，由双链分开为单链的过程。m r e v l i s h v i l i 等 “”研究t l i + ，m g “和c u 2 + 等在加热的情况下能促使d n a 变性；兰金贵等“研究了不同 浓度的y “，s 血”。l a 3 + 等离子对d n a 的热变性研究，郑文韵。”研究了不同浓度的金属 笙二至垒旦曼兰翌里! 坠塑童查堡墨塑至重墨 k f、2 f u 2 妫2 5 53 0 5弱55 j ，i i 僦 图1 4d n a 和d n a c d 。的紫外光谱( 左) 和c d 谱( 右) f i 9 1 4t h ev i o l e ts p e c t r a ( 1 e f t ) a n dt h ec ds p e c t r a ( r i g h t ) o fd n aa n dd n a c d 2 离子在不同温度时对d n a 性质的影响，发现不同的金属在不同浓度时对d n a 的热 变性影响不同，她得出：在温度升高时，z n ”能使d n a 变性，在温度降低时，z n ” 又可以使d n a 复性，她认为这主要是因为z n ”在d n a 结构中起到了一个离子桥的缘 故。此外，她还发现f e ”和a l3 + 对d n a 的变性起到了很大作用，但是却不能使d n a 复性。4 ) 构象变化：构象变化是指d n a 由一种构象向另种构象转化，这利t 转化 在生物医学上有很大的研究价值和应用价值。a n d r u s h c h e n k o 等”研究了c u ”。 c 酽+ 和m n ”等在一定情况下能诱导d n a 由b 型向a 型转化，j i a n p i n g 等。研究发现 m g ”，c a ”，s r ”和b a ”等金属离子也能不同程度地诱导d n a 由b 型向a 型转化， k o r n i l o v a 等。”研究发现，c a “，c u “和m 一等不同金属离子跟d n a 相互作用时，都 能促使d n a 的构象发生变化，由b - d n a 转化成a - d n a ，甚至有些部位出现z - d n a 构象。陈霞等。”1 用不同的方法研究了单一浓度c 矿诱导d n a 构象的变化。首先，她 们利用紫外光谱和c d 谱检测了c d 2 + 跟d n a 的相互作用( 图i 4 ) ，发现c 矿的加入 使d n a 分子的构象发生了变化。然后，她们利用付里叶喇曼光谱技术进行检测( 图 1 5 ) ，发现在纯d n a 中的4 9 4 o c m l 处的强p 吼一剪式振动带在加入c 矿之后消失了， 同时其他与p - o 键和磷酸二脂键相关的振动带也都发生了很大的变化，因而她们 得出：c r 与d n a 分子中的磷酸根发生了配位。并且她们还得出在儿0 0 1 7 0 0c m - 碱基振动区域的谱带强度也明显减弱，同时，在她们的实验图谱里，还有个最明 显的变化，就是8 0 3 o c m l 处出现了新的振动带，这个振动带是表征a 型d n a 结构 l o 第。章金属离于对d n a 的毒害性及研究意义 的，因此，她f i j a j , jd n a 在c d ”的作用下其构象已经从b 型转化成a 型。5 ) 理论 计算：对于金属离子跟d n a 的相互作用原理，在理论上进行估算的文献口前见报 导的还不多。e u g e n 、s a n d r a 和h e l m u t 等。3 ”从理论上分析了z n ”跟d n a 各组成成 份之间结合所需的能量、两者之间结合的键长、键角大小的变化。6 ) 定位损伤： 柯德森等”3 研究了维生素c c u 菲咯啉系统对d n a 的定位损失作用。 基o 奇l 格o16 一 图1 5 纯d n a ( a ) 和c d 2 + - d n a ( b ) 的付里叶喇曼光谱图 f i 9 1 5t h ef t r a m a ns p e c t r ao fp u r ed n a ( a ) a n dc d ”一d n a ( b ) 尽管在研究金属离子跟d n a 之间的相互作用的文献和综述相当多，但是这些文 献都只是讨论了当温度不同或者d n a 碱基对数日不同或者在m e ”浓度单一的情况 下，金属离子跟d n a 之间相互作用的情7 兄，而对于在恒温( 或基本不变) 下，同种 金属离子在不同浓度情况下对d n a 构象变化影响的研究却未见报道。因此，为了了 解同种金属离子在不同浓度时对d n a 结构的影响情况、不同金属离子在同一浓度时 对d n a 结构的影响情况及这些金属离子在什么浓度时对d n a 的损伤最大等等，我们 选取了锌、镉两种金属离子作为我们的研究对象，并因此设计了一套实验方案。 我们之所以选择锌、镉这两种金属离子作为研究对象，是因为这两种离子在 过渡金属中是很具有代表性的。其巾，镉作为一种环境微量元素，是通过呼吸、 7 6 5