（生物化学与分子生物学专业论文）tα1在原核细胞中的融合表达及活性研究.pdf

摘要 胸腺素n1 ( ta1 ) 是由动物或人胸腺组织分泌的一种多肽激素，由2 8 个氨基酸组 成，等电点4 r 2 ，分子量3 1 0 8 d 。td1 是一种生物反应调节因子，主要是t 淋巴系统的 免疫增强剂，用于免疫缺陷和免疫受抑制的疾病。当病人感染某些病毒如h i v 、h b v 或癌症以及经过放疗或化疗后，其免疫系统往往会被逐渐抑制乃至破坏而不能发挥对病 毒或癌症细胞的正常杀伤作用。tn1 可以恢复t 淋巴细胞的功能并促进成熟t 细胞的 增殖，促进淋巴细胞在病原组织及癌细胞周围的聚集，促进淋巴因子及淋巴因子受体的 产生，这样就大大增强了对病毒和癌症的抵抗能力。 由于t 。l 的肽链较短，很难利用基因工程方法实现直接表达，所以目前商用的多 是化学合成产品，价格较昂贵，而从动物胸腺提取的t a1 纯度和活性都较低，使其临 床应用受到限制。 为了探索大规模生产t n1 或相近生物活性产物的可能性，我们采取融合表达方式 设计构建了p e 髓8 - a t 1 融合表达载体，将重组质粒转入大肠杆菌b l 2 1 ，对工程菌进 行培养并对融合蛋白进行纯化，而后对融合蛋白的活性进行测定，从而为进一步研究奠 定了基础。 关键词：胸腺素n1 ：t d1 ：融合表达；活性 a b s t r a c t t h y m o s i nc l1 ( t d 1 ) ，a2 8 一a m i n oa c i dp e p t i d ew i 也a ni s o e l e c t r i cp o i n to f4 2 a n da m 0 1 e c u l a rw e i g h to f310 8d a ，i sap e p t i d eh o m l o n es e c r e t e db y 血e 幽a 1o fh 岫a i lt h y m u s o r g a 工1 i z a t i o n s tq1 i sab i o l o 百c a lr e s p o n s em o d 湎c a t o r ，m a i n l ya st h ee 1 1 王l a l l c e ro ft l y m p h a t i ci 咖u n es y s t e mf o rt h ep a t i e n t sw i t hi 吼u n ed e f i c i e n c i e so rc o n s 订a i n e di m m u l l e s y s t e nw h e np a t i e n t sw c r ei n f e c t e dw i t hc e r t a i nv i r u s e ss u c ha sh i v ，h b vo r 订e a t e d 、 t i t h r a d i o t h e r a p yo rc h e m o t h e r a p y ，t 1 1 ei m m l m es y s t e mt e n d s t ob ec o m p r o m i s e da n de v e n d e s 订o y e da n dc a l ln o tk i l lc e l l sc o n t a i nav i r u so rc a n c e rc e l l s t 1c a i lr e s t o r et h ef h n c t i o n o ftl y m p h o c y t e ，i n d u c et l l ep f o l i f e r a t i o no ft h em a t u r etc e l l s ，p r o m o t et h el y m p h o c y t et o g a t h e ra r o u 工l dc 孤c e ra n dp a t h o g e n yt i s s u ea n da c c e l e r a t et h cg e n e r a t i o no f1 y m p hf a c t o r sa n d 1 ) ，1 1 1 p h a t i cf a c t o rr e c e p t o r s ，t 1 1 u s 铲e a t l ye 1 1 h a n c ep a t i e m s f e s i s t a n c et ot h ev i n l sa n dc a n c e r - b e c a u s eo fi t si e n 垂h ( 2 8 a a ) ，t h et 1i sd i 街c u l tt os 删h c s i z eb yg e n c t i ce n g i n e e r i n g m e t h o d s ；t h ec u r r e n tc h e m i c a lp m d u c t so ft 1a r ee x p e n s i v e ；i na d d i t i o n ，w ec a ne x t r a c tt 1 丘o ma n i m a lt h y m u s ，b u tt h ep u r i t ya n da c t i v i t ya r el o 、v e rs oi t sc l i i l i c a la p p l i c a t i o ni s l i m i t e d t be x p l o r et h ep o s s i b i l m e so fm a s sp r o d u c t i o no ft lo rs i m i l a rb i o l o g i c a lr e a c t i v e p r o d u c t ，w ed e s i g n e da n dc o n s t r u c t e dt h ef t l s e de x p r e s s i o np l a s m i do fp e t 2 8 a ta 1a n d t r a n s f e c t e di ti m oe c o ，fb l 2 l ，t 1 1 e nc u l t u r et 1 1 ee n g i n e e 血培b a c t e r i aa 1 1 dp u r e f yt h ef u s e d p r o t e i n ，a tl a s tw em e a s l l r et h ea c t i v i t yo ff u s e dp r o t e i n k e y w o r d ：t h y m o s i n c c1 ；f u s e dp r o t e i ne x p r e s s i o n ；a c t i v i t ) r i i 独创性声明 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取 得的研究成果。据我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中 不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得东北师范大学 或其他教育机构的学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研 究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示谢意。 学位论文作者签名：身生墼j 耋日期：五! 6 、 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解东北师范大学有关保留、使用学位论文的规 定，即：东北师范大学有权保留并向国家有关部门或机构送交学位论文的复 印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅。本人授权东北师范大学可以将学位论 文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或其它 复制手段保存、汇编学位论文。 ( 保密的学位论文在解密后适用本授权书) 学位论文作者签名：蔼鳖窒丝指导教师签名：扇垒遁 日 期：宠! ， 玉 日 期：纽! ! 学位论文作者毕业后去向 工作单位： 通讯地址： 电话：! ! 垒丝鲤科 邮编：z 型! f妊 一、ta1 的分子生物学 第一章、引言 胞腺素( t h y l o s i n ) 1 9 6 6 年首次被发现“3 。该激素样物质从小牛胸腺中提取获得，并 具有初步的生物活性。随后的研究表明，其由胸腺上皮细胞所分泌，是一类多肽激素的 混合物，而其中的第5 组分( t h y m o s i nf r a c t i o n5 ，t f 一5 ) 最为重要”1 。其中，t f 一5 又 可根据等电聚焦电泳时等电点( i s o e 【e c t r i c p o i n t ，p i ) 的不同而分成三类：p i 小于 5 0 的为胸腺素a ，介于5 0 7 0 的为胸腺素b ，而大于7 o 的则为胸腺素￥。在胸腺 素q 中，又以对胸腺素l ( t h y m o s i n ltd1 ) 的研究最为深入。 tdl 是由2 8 个氨基酸组成的酸性多肽，等电点4 2 ，n 端被乙酰化，其氨基酸顺序 是：n a c s e r a s p a l a a 1 a v a l a s p t h r s e r s e r g 1 u i l e t h r t h r l y sa s p l e u l y s g 1 u l y s l y s g l u v a l v a 卜g 1 u g 1 u a 1 a g 1 u a s n c 0 0 h ，不含甲硫氨酸、半胱氨酸和芳 香氨基酸。1 。从人、鼠、牛来源的t a1 多肽序列完全一致。tal n 端乙酰化与否对其活 性影响不显著。ta1 来源于一前体p r o t h y m o s i nq1 ( 简称p r o ta1 ) 。p r o t h y m o s i n d1 是有1 1 3 个氨基酸的酸性蛋白质，tn1 处于萁2 2 9 位“1 。入与鼠的tn1 前体之间有9 0 以上的同源性。p r o t 1 m r n a 广泛分布于肾、肝、脾以及淋巴组织，其合成受细胞分裂因 子的诱导。值得注意的是，在目前发现的p r o tal m r n a 中不包含翻译信号肽的序列，也没 有糖苷化位点，因此其翻译产物不大可能以常见的方式分泌到细胞外：而且p r o tn1 m r n a 在各组织中的广泛存在与ta1 作为细胞外信使似乎有些矛盾。对这一现象的解释有两 种：( 1 ) p r o tql 的基因多态性。某些基因突变使编码框架发生变化，从而使t 。1 分泌。 事实证明确实不仅只存在一种p r o ta1 的基因。( 2 ) 蛋白质的分泌机制有多种，可能tol 以至今未知的某种方式得以分泌。 二、tq1 的分布 tnl 具有高度的保守性，广泛分布于哺乳动物的胸腺、脾、肺、肾、脑、血液和 其他一些组织中，在胸腺中浓度最高。tnl 在各种组织器官中的蛋白质结构均相同。 利用n c b i 、p i r 及s _ i i i r i s s p r o t 等蛋白质数据库，对已知的t 1 进行蛋白质序列联配， 发现从大肠杆菌到哺乳动物，来自不同种属的ta1 其氨基酸组成均高度保守( 图1 1 ) 。 利用间接免疫荧光抗体技术，发现tql 在人胸腺中专一性地定位于囊下皮质及髓 质上皮细胞中，而在深层皮质中并没有分布5 1 。在髓质中，to1 阳性上皮细胞的数目随 年龄增长而下降。另外，在培养的胸腺上皮细胞、微孔小室胸腺上皮细胞的上清液中也 存在t 。1 的高水平表达。同时，ta1 也在其他上皮细胞中存在表达，1 郊人乳腺癌细胞 系m c f 一7 ( 分泌细胞) 及结肠腺细胞( 非分泌细胞) 。值得注意的是，tq1 的表达水平在胸 腺切除后并不下降，表明t al 还存在其他的生物来源。而后者可能是td 1 的主要来 源之一，或许是在tn1 缺乏状态下的补充途径。研究表明，激活的淋巴细胞可能是血 清t nl 的主要来源，这与血清ta1 水平在放疗后下降及淋巴细胞在增殖时可产生 tn1 的事实一致。 三、td1 的作用机制 图1 1 目前对t n1 的作用机制仍不十分了解。在体内或体外实验中，t n1 对细胞因子的 分泌、淋巴细胞的表面标志及淋巴细胞的功能均有影响，被认为具有生物反应调节物 ( b i o l o g i c a lr e s p o n s em o d i f i e r ，b r m ) 的功能删。 ( 一) t n1 对于胸腺细胞调亡的调节 凋亡是程序性细胞死亡，在t 细胞的分化成熟过程中起着关键作用。一般认为，最 后只有少于5 的胸腺细胞能成功分化为成熟的循环细胞，其余的则进入凋亡程序而被 清除。来自骨髓的于细胞在胸腺增殖发育为成熟t 细胞( 图1 2 ) ，其发育过程包括： 1 编码t 细胞受体( t c e l lr e c e p t o r ，t c r ) 的基因重排； 2 阳性识别，即只有可识别胸腺基质细胞上的主要组织相容性复合物 ( m a j o r h i s o c o m p a t i b i l i t y c o m p l e x ，m h c ) 分子的胸腺细胞才能继续存活并发育成熟； 3 阴性选择，不能适当的重排它们的t c r 也不能识别自身抗原m c 复合物的胸腺细胞 通过细胞凋亡而清除。tal 通过调节t 细胞的凋亡，从而影响t 细胞免疫功能的实现。 t l 能够拮抗地塞米松( d e x a j n e t h a s o n e ，d e x ) 及c d 3 抗体的作用，抑制c d 4 + c d 8 + 双阳 性胸腺细胞的凋亡，从而增加后者的数量，增强免疫反应。r o y ”3 等利用t a1 来拮抗 小鼠道尔顿一淋巴病诱导的凋亡，并发现t n1 激活的信号转导级联反应活化了蛋白激酶 c ( p r o t e i nk i n a s ec ，p k c ) ，从而导致凋亡基因前体( 如b a x 、b a d ) 表达的蛋白质水平的 下降及b c l 一2 基因表达的蛋白质水平的上升。 图1 2 ( 二) t a1 作为b 脯的作用机制 td1 具有b r m 的功能，其作用机制可用o l d h a m 的生物反应调节理论来解释”1 ，其 主要内容包括： 1 tql 可恢复t 细胞的功能，并促进成熟t 细胞的增殖、细胞因子及其受体的产生， 从而增强机体对肿瘤的免疫应答能力； 2 ，修饰肿瘤细胞，比如诱导肿瘤细胞在胞膜上合成m h c ( a j o rh i s t o c o m p a t l b i l i t y c o m p l e x ，主要组织相容性抗原复合物) 1 类分子，这对于c d 8 + c t l 识别和杀伤是非常 重要的，因为肿瘤细胞心c 1 类分子的下调是肿瘤逃避机体免疫清除的一个重要机制。 3 促进肿瘤细胞的分化成熟，使恶性增殖细胞恢复正常化； 4 减轻化疗、放疗的副作用。一般认为，tni 通过其受体来实现对靶细胞的作用，尽 管相应受体至今未获得克隆。有证据表明，t ol 可结合某些细胞表面的受体，如免疫 荧光实验观察到t al 与小鼠淋巴细胞表面发生结合。 另外，ta1 也可与干扰素( i f n ) 受体、肠血管活性肽( v a s o a c t i v ei n t e s t i n a l p e p t i d e ，v i p ) 受体等发生结合。在对犬鼠、小鼠腹腔的巨噬细胞及大鼠外周血淋巴细 胞、脾淋巴细胞进行研究时发现，tql 可与v i p 受体的效应系统发生相互作用。对tnl 的全序列及其n 端部分进行分析，发现其与v i p 多肽家族在结构及物理化学性质上均 极为相似。实验表明，tn1 是v i p 家族的拮抗剂“3 。值t ql 究竟通过与何种受体的结 合而发挥生物活性，仍有待研究。目前认为，胸腺激素不是诱导胞浆分泌的第一信使， 而更可能作为超强附属诱导信使，但仍不清楚究竟何种第二信使介导了t a1 的诱导作 用。早期的研究提示，此过程可能有环磷酸核苷及c a 2 + 的参与，而近几年的研究也发 现花生四烯酸、腺苷酸环化酶、p k c 均可能参与了此过程9 1 。m o o d y 等发现，t n1 与体 外培养肺癌细胞表面的结合，刺激后者释放花生四烯酸，从而抑制了后者的生长。同时， 磷酯酶a 2 被认为充当了t a l 的第二信使。 四、t q1 在临床上的应用 ( 一) 应用范围 ta1 在临床上的应用主要有以下几个方面： 1 癌症的治疗： 恶性肿瘤是严重危害人类生命与健康的疾病，在多数国家恶性肿瘤的死亡率占各病 因死亡率的第二位，仅次于心血管系统疾病，因此针对恶性肿瘤的治疗研究已成为当 务之急。在迄今的研究中，tal 因其具有免疫增强作用和直接的抗肿瘤作用而同传统 治疗协同试用于肺癌、肝癌、肾癌、乳腺癌及恶性黑色素瘤等的治疗，并取得了一定的 疗效。 r a s i “”等用tn1 联合5 一f u ，i l 2 治疗直肠癌大白鼠时发现，联合治疗组的中位 存活时间 ( 1 2 2 1 6 + 1 1 1 1 ) d 与对照组 ( 8 0 1 5 十1 2 1 5 ) d 和5 一f u 组 ( 9 9 1 7 + 1 8 1 6 ) d 相比，有显著性差异( p = o 0 0 8 ，0 0 0 5 ) 。1 5 0d 后未用t n1 组的大白鼠全部死亡， 用t n1 组有9 1 5 的存活，肝外转移在对照组和5 一f u 组分别为1 0 0 和8 9 ，而t 1 组仅为9 1 5 。同时研究发现，ta1 可增加直肠癌大鼠c d 4 + 细胞和淋巴细胞i l 一2 受体的数量。此为临床治疗恶性肿瘤特别是发生转移的肿瘤提供了重要的实验基础。 b e n t h “等研究了tnl 对荷瘤b a l b c 小鼠的抗肿瘤效果。致瘤方式为分别静脉和 皮下注射l 一1 肉瘤细胞以建立肺肝癌和局部皮下癌块模型，经连续7d 皮下应用tn1 后，在致瘤第1 4 天发现tq1 治组小鼠局部肿瘤重量和肝肺的侵入性比对照组明显下 降( p o 0 5 ) 。研究还发现，tal 可上调肿瘤小鼠的胸腺细胞和外周血细胞数量。结 果表明，ta1 可增强荷瘤小鼠的免疫反应，提高抗肿瘤的能力。 s i l e c c h i a “”等对tnl 、i l 一2 和5 一f u 多疗程联合化学一免疫治疗肿瘤进行了比较 研究。研究对象是d h d k 1 2 细胞诱发的结直肠癌转移的多发性肝癌b di x 鼠，结果显 示，用三种药物联合进行两个周期的化学一免疫治疗方案比一个周期和未经治疗的对照 组或单独用5 一f u 治疗的小鼠平均存活时间明显延长。1 5 0d 后有两只经三药两疗程的 小鼠被治愈，解剖未发现有癌块存在，其他老鼠在此之前全部死亡。而且发现，两周期 联合治疗组表达i l 一2 受体和c d 4 、c d 8 抗原的外周t 细胞的绝对数明显升高。这意味 着免疫一化学联合的多疗程治疗比单疗程或单药物治疗有明显优势，而且联合治疗是通 过提高效应t 细胞的数量而起作用。这种方法为临床治疗难以切除的结直肠沧转移癌提 供了新的途径。 p i c a “3 1 等研究了高浓度的tn1 和化学一免疫联合治疗抗肿瘤功能，用鼠b 1 6 黑色 素瘤作实验对象，结果环磷酰胺、i f nab 和t a1 联合应用组比环磷酰胺组及对照组的 小鼠肿瘤明显抑制，肿瘤复发延迟，而且ta1 的作用与剂量有关，剂量越高，抗瘤能 力就越强。进一步研究发现，高浓度tnl 治疗鼠的脾细胞有明显的抗瘤细胞毒活性， 并使由肿瘤引起的c d 3 + 和c d 4 + 数降低得到纠正，同时c d 8 、b 2 2 0 和i l 一2 受体阳性的 b 细胞的比率也超过了非肿瘤对照组。实验说明，高剂量ta1 的化学一免疫治疗可增强 抗b 1 6 黑色素瘤的功能，而且这些效果可能是通过刺激机体的免疫反应介导。 2 h b v 的治疗： 乙型肝炎是我国病毒性肝炎发病率最高的疾病，我国的乙肝携带者约有1 1 3 亿， 其中有约十分之一为乙肝患者，部分患者转为肝硬化或肝癌，对人类健康危害极大， 因此加强防治尤为重要。病毒性肝炎是肝炎病毒本身及自身免疫等多种因素长期作用引 起的病理性肝脏损害，主要机制是由于机体赖以清除受病毒感染肝细胞的细胞免疫功 能低下造成的。由于tnl 可恢复在抗病毒过程中发挥重要作用的细胞毒性t 细胞和nk 细胞的功能并促进i l 一2 等多种细胞因子及其受体的产生，从而增强机体的抗病毒免疫 功能，有利于体内病毒的清除，而且tol 还具有直接抗病毒作用。因此，考虑tal 在 慢性病毒性肝炎的治疗会起一定的作用，在实践中应用tal 治疗慢性乙型肝炎也取得 了明显的疗效。 a i n a r a p u r k a r 等“”对t a1 治疗乙型肝炎及相关疾病的疗效和副作用进行了研究。 其结果显示，在实验剂量( ta11 6 g ，皮下注射，1 周2 次) 治疗6 个月的条件下， tq1 对i i b vd n a 阳性和a l t 明显高于正常值的c 耶患者有很好的治疗效果，且没有出 现严重的不良反应，说明tn1 是一种可替代i f n 治疗c 1 b 的安全而有效的的药物。 吴福全等“”对拉米夫定联合td1 治疗6 4 例c h b 患者的效果作了观察，分为联合 治疗组和拉米夫定治疗组。结果显示，联合治疗组无论是治疗6 个月后的血清h b e ag 阴转率、h b e ag 抗一h b e 的血清转换率还是1 2 个月的a l t 的复常率都显著高于拉米夫 定组。表明联合治疗不仅可提高抗病毒的疗效，而且可减少停药后的反跳现象。 3 h i v 的治疗： t 1 对 l i v 的治疗也进入了临床试验。患者感染眦v 一段时间后，免疫系统会遭受 毁灭性的打击，病人往往死于一些对正常人来说微不足的感染。tal 在眦v 临床医疗中 的使用，一方面可提高抗病毒药物的疗效，另一方面可逐渐恢复病人的免疫能力，以抵抗 致命的次生感染。 一项发表在国际临床及实验室研究杂志上的研究，以4 0 名艾滋病患者为研究 对象( 都受到轻到中等程度的免疫损害) ，比较下述四种治疗方案：( 1 ) 只用 z i d o v u d i n e ：( 2 ) z i d o v u d i n e 与一干扰素合用：( 3 ) z i d o v u d i n e 与胸腺素ql 合用：( 4 ) 三者合用治疗。 在经过一年治疗期的2 8 名病人中，最佳的c d 4 细胞反应出现在三者合用治疗组：c d 4 细胞数目平均增加1 8 7 个。其余几组情况是：z i d o v u d i n e 与胸腺素n1 合用，c d 4 细胞增 加3 5 个：z i d o v u d i n e 与d 一干扰素合用，c d 4 细胞数减少4 个：而z i d o v u d i n e 单独用，c d 4 细胞数减少了5 1 个。另外，经过1 8 个月治疗期的2 3 个病人中，三者合用组c d 4 细胞数 又增加5 0 个，其增加数超过1 2 个月治疗期的数值。而其它三组则c d a 细胞数目维持不 变或有所减少n 。 4 其他： tal 除了治疗肝炎和肿瘤，作为种免疫调节剂还有许多其他用途，例如，a d e m o gh l 【”1 等研究ta1 对兔动脉硬化作用，结果发现t q1 可使兔血脂水平趋于正常， 这意味着ta1 在治疗动脉硬化方面可能发挥有意义的作用。 此外n a z “”等发现tnl 能显著增强受精功能，有望在临床上用于男性不孕症的治 疗。 ( 二) 使用方法 ta1 在目前的医疗研究中有三种使用方法： 1 单独使用。 2 与淋巴因子联用，如与a 一干扰素或白介素一2 一同使用。 tn1 作为一种免疫调节分子，研究者发现它与淋巴因子联合使用有更好的医疗效 果。白介素一2 和_ 一干扰素等淋巴因子被广泛应用于病毒或癌症的治疗，但是都有一定的 副作用，而且某些方面疗效也不特别显著。由于这些因子的作用都与淋巴细胞的功能有 关系，而tal 恰恰能促进淋巴细胞的功能，而且可以促进人体自身淋巴园子和其受体特 别是自介素一2 受体的生成，就能大大加强医疗效果。另一方面，tn1 与白介素2 等淋巴 因子联合使用后，不产生不良的副效应，对提高持续治疗的效果很有好处“。ta1 也应用 于放疗和化疗病人的免疫系统恢复。 3 与化疗试剂如5 一氟尿嘧啶、环磷酰胺以及淋巴因子三合一联用。 在联合运用中，取得了更快速、更明显的效果。在医疗实践中越来越倾向于联合使 用。 l a u 等锄1 将9 6 例c 耶病人随机分为三组：接受联合用药，单用法苷洛伟 ( f a 皿i c i c l o v i r ，f c v ) ，或不接受任何治疗。结果发现，三个组的反应性外周血单核细 胞数目及细胞因子的分泌，均无显著差异。但到了第2 6 周，第一组的核心抗原、表面 抗原及一系列血清耶v d n a 下降的中位数( 0 9 4l 0 9 1 0 c o p i e s m 1 ) 明显高于第二组 ( o 7 0l o g1 0 c o p i e s 1 ) ，且第一组中有5 例病人于5 2 周时h b v e a g 血清转阴，而第 二、三组中并无转阴的病例。 五、t q1 的制备 ( 一) 从动物胸腺提取 主要流程是：最初胸腺一绞碎，高速捣碎匀浆、冷重蒸水提取( 一2 0 ，4 0 h ) 一提取液 8 0 ，5 m i n ，一2 0 ，2 4 3 6 h 融化一离心( 5 0 0 0 r m i n 4 0 m i n ) 上清液超滤，收集分子量 1 0 0 0 0 滤液一分装成品。 这种工艺提取的胸腺肽，含量较低，大约为o 6 一1 ，用量大，治疗效果不理想。“。 ( 二) 化学合成法 化学合成法分液相法与固相法，主要应用的是以f m o c 固相合成法为代表的固相合 成法，其原理是：首先将所含的1 0 种氨基酸分别制成nn 一芴甲氧羰基( f m o c ) 氨基 酸，然后从c 端开始将氨基酸的羧基以共价键形式与一个不溶性高分子树脂相连，就以 这氨基酸的氨基作为合成的起点，使其同排列顺序中相邻的氨基酸的羧基发生酰化反 应，形成酰胺键( 肽键) ，然后再让这一包括两个氨基酸的树脂肽的氨基与下个氨基酸 上的羧基形成肽键并不断重复这一过程，即可逐渐延长肽键，直至胸腺素的n 端形成为 止”“。因化学合成法产品价格较贵，且合成过程可能引入一定的毒性，限制了临床应用 范围。 ( 三) 基因工程方法 目前，ta1 分别在原核、真核和螺旋藻中均实现了表达。其中以大肠杆菌为代表 的原核重组表达系统为多。 薛晓畅等。3 1 获得了序列正确的三串体基因，实现原核表达，获得纯化的融合蛋白。 石继红等将tnl 串体与硫氧还蛋白融合，获得高效表达的可溶性融合蛋白，该 蛋白质占菌体总蛋白的4 0 。同时，利用所设计的c n b r 裂解位点，获得n 端缺少乙酰 基，而c 端多一个同型丝氨酸内酯的tal 单体类似物，后者经纯化后具有与天然tal 相当的活性。但是由于毒性较高，不能应用于临床。为了避免c n b r 的毒性污染，后来 选用毒性较小的羟胺作为裂解剂，获得产物与天然ta1 具有完全相同的结构。但该法 效率远不及c n b r 法，仍需要进一步完善。 修朝阳等。“研究了t 1 与谷胱甘肽一s 一转移酶( g l u t a t h i o n es t r a n s f e r a s e ，g s t ) 在大肠杆菌中的融合表达。由于采用了大肠杆菌的偏好密码子构建肽基因，不仅提高了 tn1m r n a 的翻译效率，也有效避免了来自宿主菌蛋白酶的攻击，在宿主细胞内获得较 高的表达。经发酵后，tn 卜g s t 融合蛋白的表达量达到了细胞总蛋白的3 5 左右，高 于g s t 的平均重组表达水平。 曹俊霞等。7 1 用质粒p p i c 9 k 中信号肽基因与质粒p p i c 3 5 k h ta 卜r p 构建表达质粒 p p i c g k s h ta 卜r p ，电转化至毕赤酵母g s l l 5 菌株中，g 4 1 8 筛选获得高拷贝酵母菌株。 利用甲醇诱导表达，每升菌液可产约为1 5m g 的目的蛋白。 徐峰等。1 构建了人胸腺素真核表达重组体p b k tnl ，并研究了其对人外周血淋巴细 胞免疫活性的影响。 另外，徐虹等。”将外源tql 基因转入钝项螺旋藻( 跏j 川勘a 脚a r e 肿，固，也获 得了有效表达。 鉴于目前获取tal 单体主要利用溴化氰裂解融合蛋白，再经离子交换色谱纯化可 得tal ，但由于产物具有毒性，不能用于临床应用，所以目前如何高效表达具有与ta l 相似生物学活性的融合蛋白和进一步探索融合蛋白裂解方法是tnl 基因工程制备杰 法的关键。 六、tal 的活性检测 ta1 的检测法有抗体免疫测定和生物活性测定两种。 抗体免疫测定有r i a 和e l i s a 法。由于td1 只有2 8 肽，分子量仅3 1 0 8 ，需要与载体 蛋白连接以后才有免疫原性。研究人员通过在td1 n 末端添加一额外酪氨酸残基与b s a 或k l h 载体蛋白相连再去免疫老鼠等动物，获得了ta1 的单克隆抗体。以此为基础，建 立了t l 的e l i s a 和r i a 检测方法。 生物活性检测有下列方法：e r o s e t t e 玫瑰花实验法，巨噬细胞移动抑制因子 ( 丌】a c r o p h a g e m i g r a t i o n i n h i b i t o r y f a c t o r ，m i f ) 法，l y t l + 、2 + 、3 + 淋巴细胞表面标记 法，n k 杀伤活性法，白介紊一2 及其受体诱导法等。“。e 玫瑰花法的原理基于t al 可体外 增加胸腺缺陷的病人外周血中表达特定的绵羊红细胞受体的t 淋巴细胞的数目，从而有 更高的与绵羊的红血球发生凝集反应的百分比。l y t l + 、2 + 、3 + 表面标记诱导法的原理 基于tal 可以诱导来自骨髓的淋巴细胞带上t 细胞的表面标记。m i f 法的原理是tal 可以诱导外周血淋巴细胞合成更多的巨噬细胞移动抑制因予，这样可以造成巨噬细胞的 聚集发挥免疫功能。 七、本论文的研究目的和意义 虽然目前已有利用基因工程表达载体表达t c 1 蛋白的研究，但是还没有利用 p e t - 2 8 a 质粒作为载体的报道，所以我们设计将t 旺l 大肠杆菌偏爱密码子克隆到p e t - 2 8 a 质粒构建了p e t - 2 8 a - t d l 融合表达载体，将重组质粒转入大肠杆菌b l 2 l 中，对工程菌 进行培养并对融合蛋白进行分离纯化，然后对融合蛋白进行活性测定。 通过基因工程获得重组t al 的方法具有操作简便、表达高效、成本低等优点，这 样就提高了t a1 单位成本的生物学活性。而且纯化的重组蛋白可以大规模生产。为进 一步研究tal 的生物学活性及临床开发应用奠定了基础。 第二章、实验材料与方法 一、实验材料 ( 一) 材料和试剂 1 ，大肠杆菌菌株d h 5n 和b l 2 1 ( 本实验室保存) ； 2 i p t g 、低分子量蛋白标准、氨苄青霉素、n i ”一n t a 、卡那霉素等购自上海生物工程 技术服务有限公司； 3 l b 液体培养基：胰蛋白胨1 0 9 ，l ，酵母提取物5 l ，n a c l l o l ； 4 p b s 缓冲液：n a c l l3 7 m m ，k c l2 7 m m ，n a h 2 p 0 41o m m ，k h 2 p 0 42 m m ； 5 洗涤缓冲液( p h 6 0 ) ：n a 3 p 0 42 0 m m ，n a c l5 0 0 m m ： 6 眯唑洗脱液( p h 6 0 ) ：在洗涤缓冲液( p h 6 0 ) 中加入适量3 m 的嘧唑，分别配成 1 0 m m 、5 0 m m 、1 0 0 m m 、1 5 0 m m 的咪唑洗脱液； 7 分离胶缓冲液：1 5 m t r i s h c l ( 口h 8 8 ) ； 8 浓缩胶缓冲液：1 o mt r i s h c l ( p h 6 8 ) ； 9 1 0 s d s ： 1 0 1 0 过硫酸铵； 11 3 0 丙烯酰胺溶液( 2 9 丙烯酰胺+ 1 亚甲基双丙烯酰胺) ； 1 2 四甲基乙二氨( | ! m e d ) ； 1 3 ，考马斯亮蓝染液：考马斯亮蓝r 一2 5 01 ，0 9 ，l ，甲醇4 5 0 m 儿，冰醋酸1 0 0 m l l ，蒸馏 水4 5 0 m l 几； 1 4 脱色液：甲醇4 5 0 m 儿，冰醋酸1 0 0 r n l 几，蒸馏水4 5 0 m l l 。 ( 二) 仪器设备 实验中所用主要仪器有超净工作台( a j rt e c h ，苏州净化仪器厂) 、电泳仪及电转移装 置( b i o r a d ) 、t h m e rd e s i g l l st d 2 0 2 0 光度计等。 二、实验方法 ( 一) 重组质粒构建 1 ta1 基因片段： 根据td1 多肽序赇按大肠杆菌偏爱密码子，设计了t 。1 基因片段，然后由大连 宝生物公司合成。 2 载体制备： 用b a j n 眦和x h o i 双酶切p e t 一2 8 a 质粒，凝胶回收相应大小片段。 3 扩增质粒： 将t d1 片段与p e t 一2 8 a 载体按5 ：l 摩尔比用t 4d n a 连接酶进行定向克隆连接， 转入d h 一5a 感受态细胞扩增质粒。 ( 二) 原核表达 1 制备感受态细胞 ( 1 ) 将保存菌种( b l 2 1 ) 3 0 “l 接种于3m ll b 液体培养基过夜。 ( 2 ) 取培养的菌液1m 1 转至1 0 0 ll b 液体培养基摇至o d 6 0 0 = 0 3 5 。 ( 3 )将1 0 0m l 菌液转至两支冰预冷的5 0m l 离心管，冰上置1 0 i n 。 ( 4 )4 4 0 0 0r p m 离心1 0m i n 。 ( 5 )倒置离心管，弃残培养基。 ( 6 ) 每管加1 0m l 预冷的o 1m o l lc a c l 2 溶液，重悬细胞沉淀。 ( 7 ) 4 4 0 。or p j 丑离心1 0m i n 。 ( 8 )倒置离心管，弃残培养基。 ( 9 ) 每管加2m 1 预冷的o 1 i 1 0 1 lc a c l 2 溶液，重悬细胞沉淀，加2m l4 0 甘油。 ( 1 0 ) 以1 5m le p p e n d o r f 管按2 0 0 “l 量分装。 2 转化 ( 1 ) 取l “lp e t 一2 8 a ta1 质粒加入感受态细胞，冰浴3 0m i n 。 ( 2 )4 2 热激9 0s 。 ( 3 ) 冰浴1 - 2m i n ，加入6 0 0 p l 培养基预培养5 0m i n 。 ( 4 )1 3 0 0 0 r p m 离心2m i n ，吸出6 0 0ul 上清，余下部分用移液器吹打混匀。 ( 5 )涂平板，封口后3 7 正置培养1h ，然后倒置培养过夜。 3 小提质粒 ( 1 ) 挑单菌落至l b 液体培养基，3 7 培养1 2h 。 ( 2 )以事先灭菌的4 0 甘油：菌液= l ：l 的比例( 各6 5 0 “1 ) 在超净台内分装1 2 支 e p p e n d o r f 管，保存菌种。 ( 3 )1 2 0 0 0 r p m 离心1m i n ，收集菌种，弃上清。 ( 4 )s t e l m l 洗涤， 1 2 0 0 0r p m 离心lm i n 。 ( 5 ) 弃上清，控干。 ( 6 ) 溶液i1 5 0 ul 重悬沉淀。 1 0 ( 7 ) 溶液1 1 1 5 0 ul ( 等体积，现用现配) ，轻轻混匀。 ( 8 ) 溶液i i l l 5 0 u1 ，轻混，冰浴1 0m i n 。 ( 9 )1 2 0 0 0 r p m 离心1 0m i n ，移上清至新管。 ( 1 0 ) 加入酚：氯仿( 1 ：1 ) 振荡，1 2 0 0 0r p m 离心4m i n ，移上清至新管。 ( 1 1 ) 加2 倍体积无水乙醇，一2 0 醇沉2 0m i n ，1 2 0 0 0r p m 离心1 0m i n ，弃上清。 ( 1 2 ) 7 0 乙醇洗涤( o 5m 1 ) ，1 2 0 0 0r p m 离心5m i n 。 ( 1 3 ) 弃上清，干燥。 ( 1 4 ) 加2 0 u lt e r 溶解核酸，( 并贮存于一2 0 ) 。 ( 1 5 )d n a 电泳验证。 小量表达及分析 挑取p e t 一2 8 a tq1 质粒转化菌，接入含有5 0 “g m l 卡那霉素的l b 液体培养基中。 3 7 培养至对数生长期。 加入终浓度为1 m o l l 的i p t g 诱导表达4 h 。 收集菌体，超声裂解菌体，离心分离上清和沉淀0 s d s p a g e 蛋白电泳分析。 大量诱导及蛋白纯化 接菌3 0 u l 于1 0 m ll b 液体培养基，3 7 过夜培养。 转接5 m l 至2 0 0 m 1l b 液体培养基培养至o d 聃。= o 6 。 加i p t g 诱导( 至终浓度为1 【i m ) 4 小时。 1 l 乱 豇 ( 4 )离心收集菌体，加裂解b u f f e r5 m 1 。 ( 5 )超声裂解至澄清。 ( 6 )离心收集上清。 ( 7 )装柱，4 0 0pln i n t aa g r o s e 与样品上清孵育3 0 m i n 。 ( 8 )上样，收集穿透液。 ( 9 ) 加洗涤b u f f e r ，两次，每次4 l 。 ( 1 0 ) 加洗脱b u f f e r ，4 次，每次5 0 0u l 。 ( 1 1 ) s d s - p a g e 蛋白电泳分析蛋白表达状况。 ( 三) 活性测定 活性测定采用经典的e 玫瑰花环法，具体方法如下： 用淋巴细胞分离液分离健康人外周血单个核细胞，以p b s 缓冲液制成5 1 0 5 细胞 m l ，加入等体积1 绵羊红细胞悬液和一定浓度的重组tn1 ，3 7 孵育3 0 m i n ，5 0 0 0 r 1 2 m i n 离心5 m i n ，4 放置2 0 m i n ，弃上清，轻轻摇匀，加l 滴o 8 的戊二醛，4 放 置1 5 m i n ，涂片，瑞氏染色液染色，于高倍镜下计数单位淋巴细胞中形成玫瑰花结的细胞 数“。 第三章、结果与讨论 一、质粒构建及其验证 为了扩增t n1 基因，我们根据tnl 基因序列，设计引物，并分别引入了b a i t l i i 和 x h o i 限制牲内切酶酶切位点，进行p c r 扩增，在t 4d n a 连接酶作用下将p c r 产物连 接到质粒p e t 一2 8 a 上( 1 6 过夜) 。然后转化大肠杆菌d h 5 q 。 重组质粒p e t 一2 8 a ta1 经酶切后，通过琼脂糖凝胶电泳分析，结果表明，在5 5 0 0 b p 左右处有明显的条带，表达载体构建成功( 图3 1 ) 。 456 图3 1 用1 琼脂糖凝胶电泳检测酶切的p e t - 2 8 a ta1 重组子 l 一5 均为d e t 一2 8 a t al 重组子 6 为小分子量m a r k e r e c o t l 4 二、原核表达 挑取p e t 一2 8 a - t ql 质粒转化菌，在含有5 0ug m l 卡那霉素的l b 液体培养基中3 7 培养至对数生长期，加入终浓度为l m m 0 1 l 的i p t g 诱导表达4 h ，收集菌体，s d sp a g e 蛋白电泳分析蛋白表达状况( 图3 2 ) 。 电泳结果显示，经i p t g 诱导后在p e t 一2 8 a t 。l 质粒转化菌中新出现条分子量约 4 k d a 的条带，且此条带与预期的融合蛋白大小相符，而p p e t 一2 8 a 空质粒转化菌没有相 应条带。说明此载体表达了tn1 融合蛋白。 234 图3 21 5 s d s 聚丙烯酰胺凝胶电泳检测p e t - 2 8 a t n1 融合蛋白的表达 l 小分子量蛋白m a r k e r 2 p e t - 2 8 a 空质粒转化菌 3 、4 p e t - 2 8 a t al 质粒转化菌 三、大量诱导及蛋白纯化 接菌3 0 u 1 于l o m ll b 液体培养基，3 7 过夜培养。转接5 m 至2 0 0 m ll b 液体培养 基培养至o d 。= o 6 。加i p t g 诱导( 至终浓度为1 吐) 4 小时。 离心收集菌体，加裂解b u f f e r5 m l 。超声裂解至澄清。离心收集上清。装柱，4 0 0 u1n i n t aa g r o s e 与样品上清孵育3 0 m i n 。上样，收集穿透液。加洗涤b u f f e r ，两次， 每次4 m l 。加洗脱b u f f e r ，4 次，每次5 0 0 ul 。s d s p a g e 蛋白电泳分析洗涤及洗脱液中 蛋白表达状况。 经电泳观察，在洗脱液1 中出现了4 k d a 左右的条带，这样说明目的蛋白在沈脱液l 中。 图3 3 凝胶电泳检测洗涤、洗脱液中融合蛋白情况 i 小分子量蛋白m a r k e r 2 裂解b u 髓r 3 洗涤b u f f e r 4 7 洗脱b u 髓r 1 4 7 四、融合蛋白的活性测定 e 玫瑰花法进行活性测定的原理基于tn1 可体外增加胸腺缺陷的病人外周血中表 达特定的绵羊红细胞受体的t 淋巴细胞的数目，从而有更高的与绵羊的红血球发生凝集 反应的百分比。 用淋巴细胞分离液分离健康人外周血单个核细胞，以p l ；s 缓冲液制成5 1 0 。细胞 m l ，加入等体积1 绵羊红细胞悬液和一定浓度的重组ta 【，3 7 孵育3 0 m i n ，5 0 0 0 r i n 离心5 m i n ，4 放置2 0 m i n ，弃上清，轻轻摇匀，加l 滴o 8 的戊二醛，4 放 置1 5