（临床兽医学专业论文）应用SSH技术筛选和克隆奶牛乳房炎抗性相关基因.pdf

y9 3 7 4 1 6 摘要 乳房炎是造成奶牛业损失最严重的疾病之一，尽管在许多国家都广泛地实旖 了乳房炎防制措施，但它仍然是世界奶牛业面临的最大威胁。研究表明，奶牛乳 房炎抗性在种间和种内都存在显著的遗传差异，通过遗传选择提高乳房炎抗性可 能是解决这一重大疾病最好的长期策略。由于人们目前对控制奶牛乳房炎抗性的 相关基因及其分子机制等还不清楚，这就严重阻碍了人们通过治疗、免疫接种和 遗传选择等途径来显著提高奶牛对乳房炎的整体抗病力。本研究旨在通过分离和 克隆与奶牛乳房炎抗性相关基因的探索性研究，初步揭示参与乳房炎抗性的基因 种类和数量，为进步深入丌展乳房炎抗性的分子机理研究及将来通过遗传选择 提高乳房炎的抗性提供理论基础。本研究取得的主要结果如下： 1 应用抑制性消减杂交( s s h ) 技术成功构建了患乳房炎奶牛与健康奶牛外周 血白细胞差异表达c d n a 文库。以经产荷斯坦奶牛外周血白细胞为材料，分离 p o l y ( a ) + r n a ，反转录合成单链及双链c d n a ，经酶切成为平均大小4 0 0 6 0 0 b p 的片段。将患乳房炎奶牛c d n a 分成两组，分别与2 种不同的接头连接，再与 健康奶牛c d n a 进行2 次消减杂交和2 次抑制性p c r 扩增，将第2 次p c r 产物 纯化后与p g m te a s y 载体连接，转化大肠杆菌t o p l 0 感受态细胞进行文库扩增， 最终构建得到了具有高消减效率的奶牛乳房炎抗性相关c d n a 文库。文库扩增 后得到6 1 0 个白色阳性克隆，随机挑选1 6 个克隆进行p c r 鉴定，鉴定结果表明 插入片段主要分布在2 5 0 - 7 5 0 b p 之间。 2 应用反向n o r t h e r n 斑点杂交技术从消减c d n a 文库中高通量筛选得到5 0 个差异表达的克隆。分别用地高辛标记患乳房炎奶牛和健康奶牛c d n a 作为杂 交探针，对构建的c d n a 消减文库利用反向n o r t h e r n 斑点杂交技术筛选了5 0 个 差异表达克隆，测序后得到4 8 个质量合格的e s t 序列。根掘在g e n b a n k 非冗余 核酸数据库( n r ) 和e s t 数据库中b l a s t n 序列比对结果，将这些e s t 分为3 类： 第一一类代表已知基因，共3 5 个；第二类代表已知e s t ，共5 个；第三类为新e s t ， 共3 个。代表已知基因的e s t s 按照基因功能分为八类：信号转导与细胞间通信、 细胞结构与运动、细胞凋亡、细胞与机体防御、物质转运、翻译与表达调控、代 谢及其它。结合相关文献初步探讨了部分患乳房炎奶牛差异表达基因的作用和意 义，其中w i p 、b n b d 5 、a h c y 、s i o o a l 2 、m n s o d 、吼上等基因可能在奶牛乳 房炎抗性中发挥重要作用。 3 电子克隆了牛z n f 3 1 3 基因完整编码序列。将差异表达克隆编号为6 8 的e s t 序列在国际互联网h t t o ：v n v w n c b i n l m n i h g o v 一上进行电子克隆，根据序列拼接结 果设计引物，进行r t - p c r ，扩增产物克隆入质粒载体，测序得到的序列已被 g e n b a n k 收录，序列号为d q 0 1 0 4 0 9 。该基因被命名为牛锌指蛋白3 1 3 ( z n f 3 1 3 1 基因，丌放阅读框1 - 6 9 3 b p ，编码2 3 0 个氨基酸，预测其编码蛋白分子量为 2 5 6 7 k d ，等电点6 9 0 。 4 电子克隆了牛p s m e l 基因完整编码序列。以人p s m e i 基因完整编码序列 n m0 0 6 2 6 3 为种子序列电子克隆了牛p s m e i 基因完整编码序列，设计引物进行 r t - p c r ，扩增产物克隆入质粒载体，测序得到的序列已被g e n b a n k 收录，序列 号为d q 0 1 0 4 1 0 。该基因被命名为牛p s m e i 基因，开放阅读框3 4 7 8 3 b p ，编码 2 4 9 个氨基酸，预测其编码的蛋白分子量为2 8 ，6 6 k d ，等电点5 8 7 。 关键词：奶牛：乳房炎抗性；抑制性消减杂交；基因表达；p s m e l 基因：z n f 3 1 3 基因；差异筛选：c d n a 文库 s u m m a r y b o v i n em a s t i t i si sac o m p l e xd i s e a s e ，w h i c hr e m a i n st h em o s tc o s t l yd i s e a s et ot h e w o r l d w i d ed a i r yi n d u s t r y , d e s p i t et h ew i d e s p r e a di m p l e m e n t a t i o no fm a s t i f f sc o n t r o l s t r a t e g e s g e n e t i cd i f f e r e n c e so f m a s t i t i sr e s i s t a n c eb e t w e e nb r e e d sa n dw i t h i nb r e e di n d a i r yc o w sa r es i g n i f i c a n t ，s og e n e t i cs e l e c t i o nt oi m p r o v em a s t i f f sr e s i s t a n c em a yb e t h eb e s tl o n g - t e r ms t r a t e g eb a c a u s ei to f f e r st h ep o s s i b i l i t yf o rp e r m a n e n tr e s o l u t i o no f t h i sc o m p l e xd i s e a s ep r o b l e m s i n c et h em o l e c u l a rm e c h a n i s m s ，g e n es y s t e m sa n d e x p r e s s i o nr e g u l a t i o no fm a s t i f f sr e s i s t a n c e i nd a i r yc o w sr e m a i nu n c l e a r , i th a s s e r i o u s l yi m p e d e do u ra b i l i t yt os u b s t a n t i a l l yi m p r o v eo v e r a l lr e s i s t a n c et om a s t i t i s t h r o u g ht h e r a p i e s ，v a c c i n a t i o np r o g r a m sa n dg e n e t i cs e l e c t i o ns c h e m e s t h ea i mo f t h ec u r r e n tr e s e a r c hw a st oi s o l a t ea n dc l o n et h em a s t i t i sr e s i s t a n tg e n e st ot o o ki n t o m o l e c u l a re v e n t sa s s o c i a t e dw i t hm a s t i t i sr e s i s t a n c ea n de s t a b l i s hf u n d a m e n t a l m a t e r i a l sa n dt e c h n i q u e sf o rf u r t h e rs t u d ya n dg e n e t i cs e l e c t i o n t h em a i nr e s u l t s o b t a i n e da r el i s t e db e l l o w t os c r e e na n dc l o n em a s t i f f sr e s i s t a n tg e n e si nd a i r yc o w s ，d i f f e r e n t i a l l ye x p r e s s e d c d n al i b r a r yo fp e r i p h e r a lb l o o dl e u k o c y t ew e r ec o n s t r u c t e du s i n gs u p p r e s s i o n s u b t r a c t i v eh y b r i d i z a t i o nt h r o u g hf o l l o w i n gp r o t o c o l ：p o l y ( a ) + r n aw e r ep u r i f i e d u s i n go l i g o t e xm r n ak i t s ( q i a g e n ) f r o mp e r i p h e r a lb l o o dl e u k o c y t e so f2 0h o l s t e i n c o w sw i t hm a s t i f f sa n d2 0h e a l t hh o l s t e i nc o w si nl a c t a t i o na sc o n t r o l ；s i n g l e - a n d d o u b l e s t r a n d e dc d n aw e r es y n t h e s i z e df r o mt h ep o l y ( a ) + r n au s i n gp c r s e l e c t t m c d n as u b t r a c t i o nk i t ( c l o n t e c h ) a n df u r t h e rd i g e s t e du s i n gr s ai i n t oc d n a f r a g m e n t ss i z e df r o m4 0 0t o6 0 0b p ( d s c d n a ) ，d s c d n a sf r o mt h em a s t i f f sc o w s ( a s t e s t e r ) w e r ed i v i d e di n t ot w op o r t i o n sw h i c hw e r el i g a t e ds e p a r a t e l yw i t had i f f e r e n t c d n aa d a p t o r ；t h el i g a t e de d n aw e r eh y b r i d i z e dt w i c ew i t ht h ed s c d n ao ft h e h e a l t h yc o w sa t6 8 cf o r8he a c h ；t h ep r o d u c t sa f t e rd o u b l eh y b r i d i z a t i o n sw e r e d i l u t e db y2 0 0t i m e sa n dt h e nu s e df o rs u p p r e s s i o np c rt w i c e ；t h es e c o n d a r yp c r p r o d u c t sw a si n s e r t e di n t op g m te a s yv e c t o ra n dt r a n s f o r m e di n t oe c o l it o p l 0 c o m p e t e n tc e l l s ；6 10p o s i t i v ec l o n e sw e r eo b t a i n e d ；i d e n t i f i c a t i o no ft h ei n s e r t e d c d n af r a g m e n t si ns u b t r a c t i v el i b r a r yw a sd o n eu s i n gp c r t h er e s u l t ss h o w e dt h a t t h e r ew e r ei n s e r t e df r a g m e n t so f2 5 0 - 7 5 0b pi nt h e1 6r a n d o m l ys e l e c t e dp o s i t i v e c l o n e s ，w l f i c hw o u l dp r o v i d eu s e f u lb a s e l i n ef o rt h es c r e e n i n ga n dc l o n i n go fs p e c i f i c m a s t i f f sr e s i s t a n tg e n e sa n du n d e r s t a n d i n gt h em o l e c u l a rm e c h a n i s mo fm a s t i f f s r e s i s t a n c ei nd a i r yc o w d i f f e r e n t i a l l ys c r e e n i n gw a sp e r f o r m e du s i n gt h er e v e r s en o r t h e r nd o t - b l o w i n g 1 i l m e t h o d at o t a lo f5 7 8c l o n e sw e r es p o t t e do n t o m a g n a p r o b en y l o nm e m b r a n e s ， p o s i t i v e l yc h a r g e d ( u s ao s m o n i c s la n dh y b r i d i z e dw i t ht e s t e re d n aa n dd r i v e r e d n a p r o b ew h i c hw a sl a b e l e du s i n gd i gh i g hp r i m el a b e l i n ga n dd e t e c t i o ns t a r t e r k i ti ( r o c h e ) ，f i r ys t r o n gs i g n a l sc l o n e sw e r ei s o l a t e da n ds e q u e n c e d r e s u l t i n gi n4 8 s e q u e n c e s as e a r c hf o rs e q u e n c eh o m o l o g yi nt h eg e n b a n k n ra n de s td a t a b a s eb y b l a s t nr e v e a l e dt h a tt h ed i s t r i b u t i o no fe s tc l u s t e r sf o rh i g hh o m o l o g yg e n e s ，h i g h h o m o l o g ye s t sa n dn o v e le s t sw e r e3 5 ，5a n d3 ，r e s p e c t i v e l y ，i nc o w si n f e c t i o n m a s t i t i ss p e c i f i cc d n a s t h eh i g hh o m o l o g yg e n e sw a sg r o u p e di n t o8c l u s t e r sb a s e d o nt h eb e s tk n o w nf u n c t i o no ft h e r e p r o t e i np r o d u c t s ：s i g n a l i n g t r a n s d u c t i o n c o m m u n i c a t i o n ， c e l l s t r u c t u r e m o b i l i t y , t r a n s p o r t e r s ，a p o p t o s i s ，m e t a b o l i s m ， t r a n s l a t i o n e x p r e s s i o nr e g u l a t i o n ，c e i l b o d yd e f e n c ea n d o n ec l u s t e rt h a tf u n c t i o ni s u n k n o w no rw i t h o u ta no n t o l o g i c a lt h e m e r o l e so fm a s t i t i sr e s i s i t a n c eo fp a r t i a ld i f e r e n t i a l l ye x p r e e s e dg e n e si nc o w sw j t h m a s t i f f sw e r ep r e s u m e db a s e do nr e f e r e n e e sa n do u rr e s e a r c hr e s u l t s 聊p ，b n b d 5 ， a h c es l i o o a l 2 ，m n s o da n ds e l lw e r ec o n s i d e r e dp l a y i n ga ni m p o r t a n tr o l ei n m a s t i t i sr e s i s t a n c ei nc o w u s i n gt h es t r a t e g yo fi n s i l i c oc l o n i n g ，b o v i n ez n f 313g e n ec o m p l e t ec o d i n g s e q u e n c e ( c d s ) w a so b t a i n e d t h er e s u l t o fi ns i l i c o nc l o n i n gw a sc o n f o r m e db y r t - p c r t h eb o v i n ez n f 313c o n t a i n sa6 9 3 b po p e nr e a d i n gf l a m e ，e n c o d i n g2 3 0 a a p r o t e i n ，p u t a t i v ep r o t e i nm w i s2 5 6 7 k d ，i s o e l e c t r i cp o i n ti s6 9 0 t h es e q u e n c eh a s b e e ns u b m i t t e dt og e n b a n kw i t ht h ea c c e s s i o nn u m b e rd q 0 1 0 4 0 9 u s i n gt h es t r a t e g yo fi n s i l i c oc l o n i n g ，b o v i n ep s m e lg e n ec o m p l e t ec o d i n g s e q u e n c e ( c d s ) w a so b t a i n e d ，t h ee d n a i s8 8 3 b p ，c o n t a i n sa7 5 0 b po p e nr e a d i n g f r a m e ，e n c o d i n g2 4 9 a ap r o t e i n ，t h i sp u t a t i v ep r o t e i nw e i g h tm o l e c u l a ri s2 8 6 6 k d ， i s o e l e c t r i cp o i n ti s5 8 7 t h es e q u e n c eh a sb e e ns u t ) m i t t e dt og e n b a n kw i t ht h e a c c e s s i o n n u m b e rd q 0 1 0 4 1 0 k e y w o r d s ：c o w ，m a s t i f f sr e s i s t a n c e ，g e n ee x p r e s s i o n ，p s m e lg e n e ，z n f 3 1 3g e n e ， d i f f e r e n t i a l l ys c r e e n i n g ，s u p p r e s s i o ns u b t r a c t i v eh y b r i d i z a t i o n ( s s h ) ， e d n al i b r a r y 缩写符号 a m p b l a s t b p c d n a c m c m t c o n a 2 。d d d d e p c d sc d n a e b e d t a e s t s g 3 p d h i p t g k d l p s m a s m r n a n m c o d p b s p c r p m n q t l r n a r r n a r i ) m r t - p c r s a g e s c c s d s s s c s sc d n a s s c p s s h jr l s x g a l 缩略词( a b b r e v i a t i o n s ) 英文全称 中文全称 a m p i c i l l i n氨苄青霉素 b a s i cl o c a la l i g n m e n ts e a r c ht o o l b a s ep a i r c o m p l e m e n t a r yd n a c l i n i c a lm a s t i f f s c a l i f o r n i am a s t i t i st e s t c o n c a n a v a l i na t w o - d i m e n s i o n a lg e le l e c t r o p h o r e s i s m r n ad i f f e r e n t i a ld i s p l a y d i e t h y l p y r o e a r b o n a t e d o l l b l e s t r a n dc d n a e t h i d i u mb r o m i d e s o d i u me t h y l e n e d i a m i n e t e t r a a c e t i ca c i d e x p r e s s e ds e q u e n c et a g s g l y c e r a l d e h y d e - - 3 - p h o s p h a t ed e h y d r o g e n a s e i s o p r o p y l t h i o - b - d g a l a c t o s i d e k i l o d a l t o n l i p o p o l y s a c c h a r i d e m a r k e ra s s i s t e ds e l e c t i o n m e s s e n g e rr n a n a t i o n a lm a s t i t i sc o u n c i l o p t i c a ld e n s i t y p h o s p h a t e - b u f f e r e ds a l i n e p o l y m e r a s ec h a i nr e a c t i o n p o l y m o r p h o n u c l e a rn e u t r n p h i l q u a n t i t a t i v et r a i tl o c u s r i b o n u c l e i ca c i d r i b o s o m a lr n a r o u n dp e rm i n u t e r e v e r s e t r a n s c r i p tp c r s e r i a la n a l y s i so f g e n ee x p r e s s i o n s o m a t i cc o l lc o u n t s o d i u md o d e c y ls u l f a t e s o d i u mc h l o r i d ea n ds o d i u mc i t r a t e s i n g l e - s t r a n dc d n a s i n g l es t r a n dc o n f o r m a t i o np o l y m o r p h i s m s u p p r e s s i o ns u b t r a c t i v eh y b r i d i z a t i o n t r i h y d r o x y m e t h y la m i n a r n e t h a n e 5 - b r o m o 4 c h o l o 3 一i n d o l o l y l - b - d - g a l a c t o s i d e v i i l 局部比对基本检索工具 碱基对 互补脱氧核糖核酸 临床乳房炎 d h , j , i , i l 房炎试验 伴刀豆凝集素a 二维凝胶电泳 m r n a 差异显示 二乙基焦碳酸盐 双链互补d n a 溴化乙锭 乙二胺四乙酸二钠 表达序列标签 甘油醛- 3 - 磷酸脱氢酶 异丙基，1 3 一d 硫代半乳糖苷 千道尔顿 脂多糖 标记辅助选择 信使核糖核酸 美国国家乳房炎委员会 光密度 磷酸盐缓冲溶液 聚合酶链反应 多形核嗜中性粒细胞 数量性状位点 核糖核酸 核糖体r n a 转，分 反转录聚合酶链反应 基因表达系列分析 体细胞计数 十二烷基磺酸钠 氯化钠柠檬酸钠缓冲液 单链互补d n a 单链构象多态性 抑制性消减杂交 三羟甲基氨基甲烷 5 溴一4 氯3 - 哼i 哚b d 半乳糖苷 第一章功能基因组学及蛋白质组学在奶牛乳房炎研究中的 应用 1 奶牛乳房炎研究现状 乳房炎是由各种病因引起的乳房炎症，其主要特点是乳汁发生理化性质及细 菌学变化，乳腺组织发生病理学变化。乳汁最主要的变化是颜色发生改变，乳 汁中有凝块及大量白细胞。发生乳房炎时，虽然在许多病例乳腺出现肿大及疼痛， 但大多数病例用手触诊乳腺难于发现异常，肉眼检查乳汁也难于观察到病理性变 化。因此，列这种亚临床型乳房炎的诊断主要是依靠乳汁的白细胞计数，因此有 人乳房炎定义为以感染乳腺乳汁中自细胞计数显著增加的一种疾病而更准确的 定义则依其病原来确定。 奶牛乳房炎是造成世界各国奶牛业损失最严重的疾病之- - 1 2 ，引。美国国家乳 房炎委员会( n a t i o n a lm a s t i t i sc o u n c i l ，n m c ) 1 9 9 6 年的数据显示是每年约三分之 一的奶牛感染乳房炎，直接经济损失达1 7 亿多美元【4 】；而在英国奶牛乳房炎造成 的直接经济损失可达2 6 7 亿英镑【5 j 。在我国，奶牛业因乳房炎造成的经济损失虽 然未见具体数字报道，但从上世纪8 0 年代以来全国各地的调查结果表明，奶牛乳 房炎的发病率也居高不下 6 】n 国外对乳房炎造成的经济损失的传统估计是根据奶产量的损失、替代品费用 的增加、奶的废弃、药费的开支、兽医费用和劳动力费用等项进行统计1 1 ，2 8 1 。一 般认为，在乳房炎引起的经济损失中，由产奶量降低引起的损失占7 0 ，患病而 使奶牛提早淘汰的损失占1 4 ，废弃乳损失占7 ，治疗及兽医费用占8 o 。在奶 牛群中，大多数乳房炎( 约9 0 ) 是隐性乳房炎，因此造成经济损失的主要是隐 性乳房炎，其损失占每头泌乳母牛每年总生产能力的1 0 1 1 。此外，隐性乳 房炎还造成乳品质量大大下降。 1 1 奶牛乳房炎分类 美国国家乳房炎委员会根据乳房和乳汁有无肉眼可见变化，将乳房炎划分为 亚临床型乳房炎( 即隐性乳房炎或潜在性乳房炎) 、临床型乳房炎和慢性乳房炎三 种。这一分类方式非常适于临床诊治，所以目前一般都采用这种分类。 1 1 1 亚临床型乳房炎 亚临床型乳房炎的乳房或乳汁均无肉眼可见的变化，但乳汁电导率、体细胞 数、p h 值等理化性质已发生变化，必须用特殊的理化方法才能检出，通常称为 隐性乳房炎或潜在性乳房炎。隐性乳房炎引起产奶量减少，品质下降，是乳房炎 中发生最多，造成经济损失最严重的类型。 1 1 2 临床型乳房炎 i 晒床型乳房炎的乳房和乳汁有肉眼可见的l l 刍床变化。发病率为2 5 ，管理 好的牛群发病率较低。根据临床变化的程度，临床型乳房炎可分为轻度j 瞄床型、 重度临床型和急性全身性乳房炎。 1 1 3 慢性乳房炎 慢性乳房炎通常由于急性乳房炎没有及时处理或由于持续感染，而使乳腺组 织渐进性发炎的结果。一般l 临床症状不明显，全身情况也无异常，但奶产量下降。 慢性乳房炎可发展成临床型乳房炎，有反复发作的病史，也可导致乳腺组织纤维 化，乳房萎缩。这类乳房炎治疗价值不大，可能成为牛群中一种感染源，宜及早 淘汰。 1 2 奶牛乳房炎的病原学特点 引起奶牛乳房炎的病原微生物种类十分复杂，包括细菌、真菌、病毒、支原 体等1 3 7 种【9 l ，其中最常见的有金黄色葡萄球菌( s t a p h y l o c o c c u sa u r e u s ) 、无乳链 球菌( s t r e p t o c o c c u sa g a l a c t i a e ) 、停乳链球菌( s t r e p t o c o c c u sd y s g a l a c t i a e ) 、乳房链 球菌( s t r e p t o c o c c u su b e r 招) 、副乳房链球菌( s t r e p t o c o c c u sp a r a u b e r i s ) 、大肠杆菌 ( e s c h e r i c h i ac o l o 、支原体( m y c o p l a s m as p ) 等2 0 多种，其中链球菌属和金黄色葡 萄球菌是最主要的病原菌，在舍饲的集约化奶牛场，大肠杆菌也逐渐成为主要病 原菌o 1 3 】。 传统上，乳房炎病原微生物被划分为接触传染性的( 如金黄色葡萄球菌、无 乳链球菌、支原体等) 和环境性的( 如乳房链球菌、大肠杆菌、肺炎克雷伯菌、 凝固酶阴性葡萄球菌、牛棒状杆菌等) 两类，其中金黄色葡萄球菌、无乳链球菌 和停乳链球菌是最主要的接触传染性病原，大肠轩菌和乳房链球菌是最主要的环 境性乳房炎病原。然而，引起奶牛乳房炎的主要病原菌的区系分布也不是固定不 变，而是在不断的发展变化，且与地区、季节和泌乳期等诸多因素相关 1 0 , 1 1 , 1 3 】。 l - 3 乳房炎病原菌致病机理研究进展 。婀z 胯丽嚣园箕锵擎上的转殊性而容易受到病原微生物的入侵而发生炎症， 炎症的发生主要经历微生物入侵、乳腺内建立感染、引起乳腺炎症乃至全身表现 出临床症状的一系列过程。 乳房炎病原菌通过多种策略逃避乳腺的防御体系。病原菌采取黏附和进入 宿主细胞的策略入侵宿主的防御机制，囚在细胞浆中宿主的绝大多数防御机制失 去作用。一旦病原菌内化到宿主细胞浆就可为病原菌提供一个安全的环境。所以， 病原菌黏附和进入乳腺上皮细胞对建立感染非常重要f l 5 ”j 。 病原菌黏附到乳腺上皮细胞是感染过程的早期事件，黏附过程受细菌表面结 构和乳汁与乳腺中的宿主因子调节 t7 - 2 0 。乳房炎病原菌利用宿主因子如细胞外基 质蛋白、蛋白聚糖和乳蛋白增加其黏附于奶牛乳腺上皮细胞的能力1 2 1 - 2 2 ，它们通 过与乳汁中可溶性宿主因子结合进而结合到乳腺上皮细胞。这种“分子桥梁”被 病原菌用来活化宿主细胞即乳腺上皮细胞表面某些特异受体并诱导一系列级联 反应，从而使病原菌进入宿主细胞( 图i i ) 。 一系列研究结果证明，乳房炎病原菌利用宿主细胞获取营养的机制使自己进 入宿主细胞1 2 n ”j ，而且病原菌能够穿过、离丌或仍然停留在宿主细胞内。上述研 究结果阐明了一些自然发生的乳房炎病例持久和反复感染的原因，这也是该类型 乳房炎防制的一个主要障碍。 最常见的环境性乳房炎病原菌如乳房链球菌、大肠杆菌、停乳链球菌、凝固 酶阴性葡萄球菌和接触传染性乳房炎病原菌如金黄色葡萄球菌、无乳链球菌均可 黏附于乳腺上皮细胞。黏附具有时间依赖性，并且黏附速率受到黏附于乳腺上皮 细胞细菌的数量i i i i i i t l 7 ，1 9 , 2 0 1 。 酲1 1 乳屏蔽最骧百弱刚摸望 f 培lim 吐l p 叩e d 甜瑚啦蟊驴i h o 舭a d h e 删_ i c e 2 0 0 0 年，h e b e r t 等【2 4 】首次在慢性感染的奶牛乳汁巨噬细胞和腺泡细胞中发 现存活的金黄色葡萄球菌，证实金黄色葡萄球菌能够侵入腺泡细胞和巨噬细胞。 b a y l e s 等【1 5 】研究发现金黄色葡萄球菌能成功的侵入和定居于乳腺上皮细胞并引 起宿主细胞的凋亡。这也是乳汁中白细胞并不能提供有效防卫及余黄色葡萄球菌 引起的乳房炎很难防制的原因。 1 4 乳房炎的临床症状 乳房炎的主要临床症状包括乳汁异常，乳房大小、质地、温度异常及全身反 应。乳汁的异常主要表现为色泽异常，出现凝块、絮片或脓汁。乳汁出现凝块、 絮片时，常出现颜色的变化，表明乳腺有严重的炎症。发生乳房炎时，因病原、 病程的不同，乳房可出现发热、肿胀、纤维化等症状，这些变化可通过触珍及视 诊来确定。 】5 乳房炎的诊断 奶牛乳房炎的渗断方法因发病率和临床症状而异i ，2 5 , 2 6 ：临床型乳房炎发病 率低，着重在个体病牛的临床诊断：隐性乳房炎发病率高，着重在牛群的整体监 测，因为它反映了整个牛群乳房的健康状况和牛群奶产量的损失，如果检出率高， 出现i 俪床型的危险就大。在奶业发达的国家，最常用的监测措施是桶奶体细胞计 数和微生物评估这两个参数【2 “。我固许多奶牛场对牛群隐性乳房炎的监测，常采 用美国加州乳房炎试验方法定期检查。 隐性乳房炎常用的诊断方法包括美国加l i t 孚l 房炎试验及类似方法、乳汁电导 率测定、乳汁体细胞计数和乳汁微生物鉴定。 1 5 1 加州乳房炎试验( c a l i f o r n i am a s t i t i st e s t ，c m t ) c m t 是粗略测量乳汁中d n a 含量的方法，其值主要随乳汁中有核白细胞的 数量而变化。根据等量乳汁和试剂相互作用产生的凝胶的量，主观地读为阴性、 微量、+ 、+ + 、卅。这些值与表i 1 所列的体细胞数完全一致。我国北京、 e 海、杭州、兰州等地方根据c m t 法原理、分别研制出了以各地地名命名的诊 断隐性乳房炎的试剂，达到了c m t 试剂的国产化。 表1 1c m t 值与体细胞数的关系 t a b l e1 1a s s o c i a t i o n sb e t w e e nc m ta n ds o m a t i cc e l lc o u n t s e m t 值体细胞数( 近似值) 阴性 微量 + + + + + + 0 - 2 0 00 0 0 15 00 0 0 5 0 0 00 0 0 4 0 00 0 0 - 10 0 00 0 0 8 0 00 0 0 - 50 0 00 0 0 50 0 00 0 0 1 5 2 乳汁体细胞计数( s o m a t i cc e l lc o u n t ，s c c ) 乳汁中的细胞统称为体细胞，包括巨噬细胞、淋巴细胞、多形核嗜中性粒细 胞及脱落的腺泡上皮细胞等。乳汁体细胞计数是指每毫升乳汁中体细胞的数量。 体细胞数是广泛用于表示个体和某一群体乳房炎感染程度的重要指标1 1 1 ”j 。 感染是提高体细胞数的主要因素，而体细胞数列高主要是山于中性粒细胞的急剧 增多，乳腺感染时中性粒细胞可占体细胞数的9 5 。 乳汁体细胞计数方法包括体细胞直接显微镜计数法( d m s c c ) 、体细胞电子 计数法( z s c c ) 、奶桶奶细胞计数法( b m c c ) 和牛只细胞计数法( i c c c ) 等。目前有 条件的奶牛场多采用体细胞电子计数法。 奶牛健康乳区的体细胞计数小于1 0 00 0 0 个m l ，但一般体细胞计数低于2 5 0 0 0 0 个l n l 的乳区均可认为是健康乳区。 1 5 , 3 乳汁的细菌培养 培养乳汁从中分离鉴定出病原微生物被认为是乳房炎渗断的标准方法【28 1 。在 大多数临床实验室，主要依靠乳汁中微生物学培养和生化试验进行细菌的分离鉴 定。微生物学培养的优点是可以同时对病原微生物及其药敏性做出鉴定，从而提 供选择何种抗生素进行临床或干乳牛治疗的线索。然而，进行微生物学培养有许 多局限性，如渗断隐性乳房炎时易产生假阴性结果、乳汁中高体细胞计数影响细 菌的生长、工作量大并需要2 3 天时间才能做出鉴定等。此外，一些乳房炎病原 蔺如凝血酶阴性葡萄球菌( c o a g u l a s e - n e g a t i v es t a p h y l o c o c c i ，c n s ) 、乳房链球菌和 剐乳房链球菌等很难或无法用生化试验鉴别。 1 5 4 乳房炎分子诊断技术 近年来，由于人类基因组计划( h g p ) 的实施和推进，已经完成了多种微生 物的全基因组d n a 测序，因此应用多重p c r 技术以细菌1 6 s 2 3 sr d n a 间隔区序 列为扩增靶分予的一套分子水平上快速、敏感、特异和可靠的细菌分类和鉴定技 术应运而生并被广泛应用于医学临床诊断实践1 2 9 - 3 2 1 。随之，这种分子诊断技术 也被移植应用在奶牛乳房炎病原微生物鉴定中【2 8 ，3 ”5 1 。分子诊断技术与乳汁微生 物培养鉴定相比较具有快速、敏感和特异的特点，可以在数小时内对病原微生物 做出鉴定。而且该技术还能对凝固酶阴性葡萄球菌、乳房链球菌( s t r e p t o c o c c u s u b e r i s ) 和副乳房链球菌( s t r e p t o c o c c u sp a r a u b e r i s ) 等用传统的生化试验和血清学 方法很难或无法鉴别的乳房炎病原作出鉴定1 ”j 。 1 6 s 2 3 sr d n a 间隔区序列不仅可应用于奶牛乳房炎诊断，还广泛地用于乳房 炎病原菌的流行病学调查等方面p ”。 1 6 乳房炎的治疗 乳房炎的治疗主要是针对临床型乳房炎而言，对隐性乳房炎则主要是控制和 预防【”。对i | 缶床型乳房炎疗效的判定标准为：( 1 ) 临床症状减轻和消失；( 2 ) 乳汁体 细胞计数降至正常范围( 5 0 万m l 以下) ：( 3 ) 乳汁病原菌转阴率。后两条也是判 断隐性乳房炎防治效果的标准。 抗生素仍是治疗乳房炎的首选药物，常用的抗生素有青霉素、链霉素、新生 霉素、头孢菌素、红霉素、土霉素、喹诺酮类，其次是磺胺类药和中草药。药物 治疗途径，仍采用局部乳房内给药和经肌肉或静脉全身给药。 1 7 奶牛乳房炎防制新策略 1 7 1 免疫调节剂( i m m u n o m o d u l a t o r s ) 病原菌感染后，刺激机体产生大量的细胞因子，如肿瘤坏死因子( t n f ) 、集 落刺激因子( c s f ) 、干扰素( i f n ) 和白细胞介索( i l ) 等，在奶牛乳腺免疫调节中发 挥重要的作用【4 。国外一些学者对应用细胞因子等非特异性免疫调节剂防治乳房 炎进行了有益的探索 4 1 , 4 2 。 1 7 2 细菌素 细菌素是通过分子生物学技术生产出来的天然细菌蛋白，能杀死某些细菌， 可用来治疗葡萄球菌性和链球菌性乳房炎及用于乳头药浴。细菌素可望用于无抗 生素乳房炎治疗。国外已经获得了溶葡萄球菌素( 1 y s o s t a p h i n ) 、链球菌素( n i s i n ) ， 并用于临床 2 7 , 4 3 】。 1 7 3 疫苗接种 利用疫苗防治奶牛乳房炎有很多优点：无药物残留问题、有助于降低乳腺感 染的严重程度和控制亚临床型乳房炎。 目前研究较多的有大肠杆菌j 一5 基因工程疫苗2 ，4 4 , 45 1 、金黄色葡萄球菌疫苗 4 6 4 8 1 和乳房链球菌疫苗4 9 1 ，但目前除j 一5 疫苗有商业化生产外，其它种类疫苗还 均处于试验研究阶段。中国农业科学院兰州畜牧与兽药研究所罗金印等 5 0 】也研制 了奶牛乳房炎多联苗( a ) ，据报道对金黄色葡萄球菌、无乳链球菌、停乳链球菌 等有较好的免疫效果。 1 7 4 基因疗法 通过转基因技术等使一些抗菌蛋白在奶牛乳腺细胞中高表达能提高奶牛对 乳房炎的抗性【5 ”。溶葡萄球菌素是由模仿葡萄球菌( s t a p h y l o c o c c