（预防兽医学专业论文）三黄鸡CD4胞外区基因的克隆表达及其多抗的制备.pdf

摘要c d 4 分子是一类主要存在于t 细胞表面的单链跨膜糖蛋白，它在淋巴细胞分化和参与细胞免疫方面起重要作用本研究根据已经发表的莱航鸡c d 4 分子基因序列，设计合成一对引物，通过p c r 的方法从三黄鸡的e d n a 文库中克隆出了其c d 4 胞外区基因片段，构建重组质粒p g e m c h c i m 将克隆获得的目的片段与表达载体p m a l - p 2 x 连接而构建重组表达质粒构建的重组表达质粒转化到大肠杆菌t b i 中，筛选含重组质粒的基因工程菌重组工程菌经i p t g 诱导得到高效表达，其细胞裂解物用s d s - - p a g e 进行检测，并经a m y l o s e 树脂亲和层析柱纯化表达蛋白，纯化蛋白命名为m b p - c h c d 4 用m b p - c h c d 4 按照常规的方法免疫清洁级b a l b c 小鼠，6 周后收集血清，用间接e l i s a 法测定抗血清的效价结果表明，本研究成功地克隆了三黄鸡c d 4 胞外区基因，其大小为1 2 0 6 b p 。所构建的表达质粒p m a l - p 2 x c h c d 4 在e c o gt b i 中成功表达了分子量约为8 7 5 k d a 的融合蛋白，与预测的大小一致表达产物经a m y l o s e 树脂亲和层析柱分离纯化，得到了高纯度的鸡c d 4 胞外区的融合蛋白。利用此蛋白免疫小鼠，制备了e l i s a 效价达h8 1 9 2 x1 0 6 的鼠源抗三黄鸡c d 4 胞外区的抗体，证明该蛋白具有良好的抗原性，为进一步研究鸡c d 4 分子的结构和功能及其之间的关系奠定了基础。关键词：鸡c d 4 ) 胞外区；克隆；原核表达；e l i s aa b s t r a c tc d 4i sas i n g l ec h a i n 仃a n s m e m b r a n eg l y c o p r o t e mm a i r d y 佣tc e l l 皇, w h i c hp l a yac e n t r a lr o l ei nl y m p h o c y t ed i f f e r e n t i a t i o na n dc e l l - m e d i a t e di m m u n i t y ap a i ro fp r i m e rw ud e s i g n e da ) r d m st ot h ep u b l i s h e dc h i c k e nc d 4g e n es e q u e n c e s , a n dt h eg e n ef r a g m e n to f l h ec h i c k e nc d 4a 血a l l u i 盯托g i o nw 笛d o n e df r o mc d n al i b r a r yb yu s i n gi t t h ed n af i a g m e n tw a st h e ns u c c e s s f u l l yc l o n e di n t op g e m - t - e a s yv e c t o r , w h i c hw a sc o n f n m e db ys e q u e n c ea n a l y s i sa n dr e s 城c te n z y m ei d e n t i f i c a t i o n t h e nt h ed n af r a g m e n ta n dt h ep l a s m i dp m a l - p 2 xw e l i g a t e dt oc o n s t r u c tt h er e c o m b i n a n te x p r e s s i o np l a s m i d ，a n dt h er e c o m b i n a n te n g i n e e r i n gb a c t e r i aw e i d e n t i f i e db ys e q u e n c ea n a l y s i sa n dr e s t r i c te n z y m ei d e n t i f i c a t i o n a f 嘲- w a r d s ,t h er e c o m b i n a n t 目嚼删：e r i n gb a c t e r i aw c l q ，i n d u c e dt oe x p r e s sf o r e i g np r o t e i n , w h i c hw a sp u r i f i e dw i t ha m y l o s ea f f i n i t yr e s i nc o l u n m p u r i f i e dr e c o m b i n a n tp r o t e i n , n a m e dm b p - c h c d 4 ，w a sa n a l y z e db ys d s - p a g ei no r d e rt og e ta n t i b o d y ，t h eb a l b cm i c ew e r ei m m u n i z e dw i t ht h ep r o t e i nm b p - c h c d 4a c c o r d i n gt ot h er o u t i n em e t h o da n dt h e nc o l l e c t e dt h es e r u n lt h ef i t e ro f t h em i c ea n t i - m b p - c h c d 4a n t i b o d yw a sm e a s u r e db ye l i s aa s s a y t h er e s u l t ss h o w e dt h a tc h i c k e nc d 4g e n ew s ss u c c e s s f u l l yc l o n e df r o mc d n al i b r a r y , w h i c hw a s1 2 0 6 b pi nl 即g 札e c o f it b is t r a i n sw i t hp m a l - p 2 x c h c d 4s u c c e s s f u l l ye x p r e s s e dt h er e c o m b i n a n tp r o t e i nb e a r i n g n - t e r m i n a lm a l t c r 5 eb i n d i n gp r o t e i nt a gw i t hm o l e c u l a rw e i g h to f8 7 5 k d a ，w h i c hw a sc o n s i s t e n tw i t ht h ep r e d i c t e dp u t a t i v em o l e c u l a rw e i g h t so fm b p - c h c d 4 t h et i t e ro ft h ea n t i - m b p - c h c d 4 w a sh8 1 9 2 x 1 0 m e a s u r e d b y e l i s a w h i c hs h o w e d t h a t t h e f u s i o n w a so f g o o da n t i g e n i c i t y k e y w o r d s ：c h i c k e nc d l 4 ：e x t r a c e l l u l a rr e g i o n ；c l o n e ；p r o k a r y o t i ce x p r e s s i o n ；e l i s a缩略词表n i独创性声明本人声明所呈交的论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果尽我所知，除了文中特另玎加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其它人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得中国农业大学或其它教育机构的学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示了谢意。研究生签名- 王关于论文使用授权的说明本人完全了解中国农业大学有关保留、使用学位论文的规定，即：学校有权保留送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。同意中国农业大学可以用不同方式在不同媒体上发表、传播学位论文的全部或部分内容。( 保密的学位论文在解密后应遵守此协议)研究生签名：王啦一各，呼沁帆干乡月日时间：刎年厂月加f 。第一章前言c i m 分子是主要存在于t 细胞表面的一种单链跨膜糖蛋白，包含四个类免疫球蛋白的胞外区，一个疏水跨膜区和一个较长的胞浆区l j “。它在淋巴细胞分化和参与细胞免疫方面起着中心作用，一方面，c d 4 分子能增强m h c i i 类分子与t 细胞受体( t c r ) 之间的结合力，对诱导b 细胞的体液免疫起重要的辅助作用；另一方面，c d 4 分子还具有信号传递功能，促进t 细胞的激活”4 1 。此外，c d 4 + t 细胞还具有诱导肿瘤细胞凋亡、导致迟发型变态反应及免疫黏附等功能，可见，c d 4 分子对维持机体的健康状态有着十分重要的作用。1 10 0 4 分子氨基酸序列及分子结构圈1 - 1c i m ，c d 8 分子结构示意图o1 1 1 胞外区圈1 - 2 人与鸡c d 4 分子胞外区立体结构图，黑色为鸡，红色为人1 5 7 1鸡c d 4 分子信号肽的长度为2 8 个氨基酸，它的切割位点可以通过与哺乳动物c d 4 分子序列的比对确定。c d 4 分子成熟肽长度为4 5 9 个氨基酸，分子量为5 2 ，0 3 9 ，等电点为1 0 1 t ”。通过对鸡c d 4 分子胞外区的序列分析及以人和鼠的c d 4 分子的三维结构进行同源模建，可以推测鸡c d 4 分子胞外区与哺乳动物一样依次包含v ，c 2 ，v ，c 2 四个i g 样区，与哺乳动物c d 4 分子具有很大的相似性5 问。氨基酸的插入和缺失可以计算在三维模型的环内结构中去，使它能够保持基本的i g 样结构。c d 4 胞外区最值得人们注意的是其n 端的两个i g 样区，因为它们是与m h c i i 结合区域，并且也是h i v g p l 2 0 结合位点0 1 ( 对人的c d 4 而言) 。最近研究表明，中国农业大学硕士学位论文第一章前言在t c r 识别抗原的过程中，( 2 d 4 分子近膜端区域参加该分子的二聚化过程。c d 4 分子第一个i g 样区v 高度保守b 和f 段半胱氨酸所形成的规范的二硫键及c 段的色氨酸高度保守( 图1 - 3 ) ，而i g 或t c r v 区的典型结构( 天冬氨酸x - 甘氨酸柄氨酸x 酪氨酸x 半胱氨酸) 则在1 3 段f 之前i l “在人的c d 4 分子中，天冬氨酸可以与d 段5 4 位的精氨酸形成盐桥。但在鸡c d 4 分子中，则与5 8 位的精氨酸形成盐桥在c 段2 7 位和f 段的8 5 位上，分别有两个多余的半胱氨酸残基形成一个额外的内部1 3 片层二硫键( 图l _ 3 ) 因此，如果没有这个额外的内部1 3 片层二硫键，鸡c d 4 分子第一个i g 样区便是一个典型v 区结构 i 靠_ 主艄氍弹- r a 肌蕾雹一商朱；k 舞融如霄稍b a q 硝札h _ c 删让“l 舭辟 帅坼t t t 一柏h t m 吐l i 舟赢仉穰删b - 坤瞰4 z ，- d k 删帆曩- 蕾珥，臀甜 i d 岫群吊i 警f 爿“w 曩袁气再m 错 鼬栩_ 矗- 宝商_ h hh 日旺l s w n 胂呲- ql 口撙哪一日剐隅 h 嘲4 玛_ 一l 胍一一1 皿0 明日m no 辩书仲，4 曲m 4n胤m 日1 i l l - k q 山1 j l n s ，a 帆翻鸪曲l 。t 帏蠢点b m 啸赢娥“再鼻琵墨氖 z l _ 扎，a 箍u 。晡础i 豫觑t 獬口啦# 圳肌l 口fi 1 ，啪什栅i 曩- ：tu “v ，栅q 0 讳1 1 7，蛀n 1 l 一_ 口t v t 目_ n t w o ”月口悔口】* ，tt 1 ，一lt ad l i d - - “ ，i i la i “o a mu 4 * ml “_ 哪删瓣肿删i o 0 h 帆啪1 ，n 一h l 帆_ q m g _ 1 ，n tl 蕊嘣j 体骱一蛳，肾一q m l s 黼弗瞄晌h 靠舞b 1 丽f “嗤矗d f h 啊弹耳! b 氘 _ 珥t - f 埘m - q n e hi z ，一 口- 鞋v ，田，憎丹；_- 膏t 札口蕾啊埘u 觯珏i 靠批睇玎种j 0 1“l 岱蕾一啪u 圳抖1c n tc ，矗i c 确- 瓢孺柚礤白日l ”_ 穗辐畦塌帮n 蛳疽f 亩l 嘲耐4 “h l - 4k t 嘎碍舢0 u ”自毗删v w d p 44 n鼎一 t j 精i 目x ，d m 一珏啦弭啦 l n3 “翱tt 0 e 啊一璩mi t 日哪址i 瞒靶腻“m l 日一j l - d d d - 坤，a ，f 口a w x c 钆t = 卜 m r 珏f m ”- 一，uh - 矗档阻，褂玑t j 日a 4 jq r 憎 j * 一m i 吼，0 矾t 矶t 仙删q 嘣1 抖，f 聃社一- 惭咖q ，辨，【也t 衅舶甜州 抖l。j l l“d t d 呻1 i l “嘲a 目n 删v “o 呲u 日i h 日喇$ 目口m ，q一p 一一t 0 叫t - # - * 一怙黜卜- - v 脯j ”_ 1 i _ o 帆，t | 一日幢脚- 哥胛日”1聃t i 删。l k 口一j 耐h 蔗 】l l h 一，j k ，j lu o n t 一啦【q j 州u w 嵋ny i 靠洲1 2h - 一- 0l # 船口 l 瞄l i e l n q 阳m 叽l i_ 口u 竹 ，叩删口埘一 “口n c 亿0 ， ，址啪，喃，曩4 4 耵 q 啦u d m 卿月挪n k v 一- h = -曲i _ w l 乱 嘲in 州_ 0 * n h - 畸i 铆岫斜e 咖e 1 r ”，t - ： ，h ，口，l日r l f o 嘻一c 吖d m 稍口 一z 札薅乱0 一抻f _ 口z ，棘砷m z t 一q 删图1 3 鸡与人、鼠c d 4 分子氨基酸序列比对图朔v 区l ，d 3 区) b 段用字母删c d e f g 标注，c区( d 2 。d 4 区) 8 段用字母a b c c e f g ，跨膜区用单横线表示，相同的氨基酸用点表示，缺失的氨基酸用破折号表示，右侧的数字表示氨基酸的位置。在鸡c d 4 分子的第二个i g 样区中，f 段的半胱氨酸是保守的，但位于c 段的半胱氨酸为一异亮氨酸残基所替代。在许多哺乳动物中这个c 段的半胱氨酸也常被一个异亮氨酸残基不规则地替代，如在猫、狗和兔的c d l 4 分子上，这个c 段上的半胱氨酸是被色氨酸替代0 7 1 3 1 4 1 鸡c d 4分子的第三个i g 样区不含二硫键，这与哺乳动物相似( 图1 - 3 ) 但是，鸡c d 4 分子的f 段含有一个典型的i gv 区的酪氨酸和一个半胱氨酸，而在哺乳动物却没有( 图l - 3 ) 然而，c 段的色氨2中同农业大学硕士学竹论文第一章前言酸是保守的。具有保守性的半胱氨酸在第四个i g 样区b 区和f 区形成一个典型的二硫键。此外，该k 样区含有一个i g 区特异性的色氨酸( 3 4 4 位) ，而在人和鼠的该区域，被一个亮氨酸所取代。显然，在细胞膜附近存在一个较大的环，组成9 个氨基酸残基插入环中的a 和b 段( 图i 3 ，1 - 4 ) 。各个i g 样区之间的连接序列的高度保守性，表明他们在维持和改变c d 4 分子的构象过程中是非常重要的( 图1 3 ) 。例如，在哺乳动物中，第一个k 样区的g 段紧跟的就是第一个k 样区的a 段。在第二个i g 样区和第三个i g 样区的之间的铰链区，保守序列v a l l e u g l y p h e 在维持其构象中就显得非常重要，使这个分子能够弯曲”。一个完全保守的四肽( l e u g | y m e t ) 连接第三和第四区的g a 段，即而形成了g a 连接的核心。因此，在鸡的c d 4 分子中，这些区域的结构关系就格外保守，暗示了一个比较强的选择压力。总之，在氨基酸序列水平上，鸡的c d 4 分子与哺乳动物相比，具有较低的保守性，但在结构特征上保守性较大，仍然保留了一些哺乳动物已经失去的典型的免疫球蛋白超家族的特征。鸡c d 4 分子中的高碳含量表明了他所含有的7 个潜在的糖基化位点中的多个已经被利用，从而形成与其他物种不同的特殊的糖基化的c d 4 分子这些糖基化位点分别位于近膜端( 3个) 、第二i g 样区( 2 个) 和第三k 样区( 2 个) 。人c d 4 分子仅含有两个糖基化位点，分别于胞外区的第三区和第四区n 7 1 。小鼠c d 4 分子含有4 个糖基化位点，而大鼠有3 个并且与小鼠的位点相同呲1 。1 1 2 跨膜区及胞浆区图l - 4 人( 右边) 和鼠( 坐边) n 端区域结构图i 卅二硫键用黄色表示，图上所标注氨基酸为与m h ci i类分子结合有关的氨基酸。3中国农业大学硕士学位论文第一章前言研究表明，鸡与哺乳动物c d 4 分子的胞浆区具有较高的同源性，鸡与人和鼠的同源性分别为5 5 d 日5 2 。它开始于第4 2 7 位的精氨酸，比人和鼠的c d 4 分子少5 个氨基酸( 如图1 - 3 ) 但与人和鼠一样，它包含磷酸化激酶识别位点p 5 6 戡i ( , k t c q c ( 如图1 - 3 ) ，能与细胞磷酸化激酶相互作用 2 0 , 2 ”在p 5 6 h 绑定位点上又有一个双亮氨酸基序，这个基序可能与抗原介导的c d 4 分子的内化有关。这个内化过程需要胞浆色氨酸残基的磷酸化 2 2 2 3 1 有趣的是，这个在哺乳动物上高度保守的色氨酸残基( 位于4 0 扯- 4 1 5 位) ，在鸡的c d 4 分子上并不存在，这可能是鸡在受到佛波醇醋类刺激后表达下降的原因，然而，在该位置有两个酪氨酸残基，他们的磷酸化可能替代色氨酸的磷酸化i 州( 图1 - 3 ) 1 2c d 4 分子基因的结构特点1 2 1 鸡o d 4 分子基因的组织结构鸡c d 4 分子基因总长为1 1 5 k b ，包含l o 个外显子刚内含子的分布与人和鼠的基本一致。特别是在c d 4 胞外区4 个i g 样区的一致性上更加突出人和鼠的c d 4 分子的n 端被一个大的内含子分开口5 捌，这个内含子在鸡上同样存在，只不过在鸡上只有8 9 b p u l 。鸡c d 4 分子的其他i g区域和跨膜区均由单个外显子编码，而在哺乳动物上，跨膜区则由两个外显子编码。同其他大多数鸟类的基因一样，鸡c d 4 分子的基因与哺乳动物相比更加紧凑鸡c i m 分子的c _ , - c 含量与鸡其他g c 含量较高的基因相比( 如 3 2 微球蛋白基因) 较低，仅为4 4 1 2 q 内含子拼接位点符合g t a g 法则闭内含子l 一7 的拼接是普通的1 型拼接，而内含子8 的拼接是罕见的0 型拼接，内含子9 为2 型拼接。一般而言，这些内含子比哺乳动物相对应的内含子小的多。蛋白编码区域总长度为3 8 k b ，在5 端前导序列上游7 1 b p 处有一个5 6 k b 的内含子，在人( 1 0 4 k b ) 和鼠( 8 6 k b ) 类似的内含子早已被证明，其中含有重要的调控元件1 2 9 一日嘲03 4 ，7 s ”卜 h 制d _ 啊- ，w。v - i ai q “c y t l l tv m卜丹 斗* d m m t a ，i ，rl v ilavl 俐lc 图1 5 鸡与鼠的c d 4 分子基因组成图洲用数字标注的黑色方块为外显子，外显子下方标注相应蛋白结构区4中国农业大学硕士学位论文第一章前言1 2 2 启动子区域的结构特点与哺乳动物的类似，鸡c d 4 分子启动子区域包含两个潜在的转录起始位点。该区域缺乏t a t a序列这两个转录起始位点经5 r a c e 分析，分别在距第一个甲硫氨酸1 4 7 b p 和1 6 l b p 处】这些位点存在于i m 序列( 5 0p _ c p _ p p _ ，p 。p _ ，3 或h 盯样序列周围，表明与许多缺少t a t a 序列的启动子一样，h 样序列在起始鸡c d 4 分子的转录中起重要作用i 让翔i 此外，在转录起始位点前或周围，这个区域与人和鼠分别有6 3 和5 9 的同源性，而对这两个物种而言，启动子区域的平均同源性低于4 0 鸡c d 4 分子启动子所包含的潜在的转录因子绑定位点，在鼠c d 4 分子转录过程中起重要作用州其中一个位点是核癌蛋白m y b 结合位点，这个蛋白在鼠c d 4 分子的表达中是必要的。m y b绑定位点下游3 个核苷酸是m y c 相关锌指蛋白m a z 结合位点【m j 。m a z 能够诱导d n a 弯曲从而影响转录过程m i 。在鸡上，m y b 结合位点下游3 个核苷酸处，有一个序列a g g a g g ，与m a z绑定位点l o g o ( t a ) g g 】仅有一个核苷酸差别l 卅此外，e l f - ! 转录因子绑定在鼠c d 4 转录起始位点，序列t c c 为主要绑定作用位点聊1 而在鸡上，一个潜在的e 忸家族绑定位点在两个转录起始位点之间，与i n r 样区域重叠。1 2 3 内部沉默子的特点在哺乳动物c d 4 基因的第一个内含子中包含一个沉默子，在t 细胞发育的不同时期，这个沉默子下调c d 4 分子的转录，并且有可能通过l i n l 2 n o t c h 信号影响t 细胞的命运随”, 3 s 1 这条路径的终点是基本环一螺旋环蛋白( h e s - i ) ，h e s - i 同样绑定在哺乳动物c d 4 沉默子上，并且抑制它的启动子和加强子的功能。这个绑定位点是一个n b o x ( 重复序列c a c n a g ) p 9 1 多种物种c d 4 分子沉默子的核苷酸序列已有研究1 2 9 , 4 0 ) 在鼠的c d 4 沉默子中，有三个d n a酶i 型超敏反应足迹法( f b ) 位点，但在人上只发现了两个f b 位点m 在人和鼠上高度保守，f b i 的一个h e s - i 绑定在nb o x 序列匕融州在鼠与鸡之间，f b i 序列从6 2 4 到6 3 8 位有6 7 的同源性，然而整个基因的同源性只有不到4 0 在鸡上，有一个n b o x 序列c a c t a g 为l i e s 1蛋白潜在绑定位点，我们可以推测鸡c d 4 分子的沉默区起始位点从这里开始在4 , gc d 4 沉默子上下，转录因子c - m y b 具有反向调节c d 4 分子表达的功能，并且绑定在f b i i 匣点l - t 4 ”。在人的相应区域没有c - m y b 绑定位点。鸡可能的h e s - i 绑定位点下游1 5 0 m 处有一个潜在的v - m y b ( c - m y b 的缩短形式) 绑定位点鼠的第三个f p ( f p m ) 位点有一个沉默子相关因子( s a f ) 绑定位点，该因子是一个螺旋转角- 螺旋因子家族成员p 羽。s a f 位点是一个1 6 b p 长的片断，含有两个c t g t g 序列，中间有6个碱基的间隔。在鸡c d 4 分子上，类似的区域在推定的鸡c d 4 分子的沉默子上也被发现( 第1 4 0 9 - 1 4 2 4 位) ，此外，在更靠近潜在m y b 绑定位点有两个单独的c t g t g 亚单元。据报道，突变中国农业大学硕士学位论文第一章前言两个s a f 中的重复序列的任何一个都会影响s a f 在e m s a 竞争分析中的s a f 结合位点 3 a 1 尽管鸡与哺乳动物c i m 分子基因同源性比较低，其潜在功能的结构和调控元件的保守性相对恒定鸡c d 4 分子与人和鼠的c d l 4 分子相差太大而难以比较和发现保守区域，但是人和鼠的却因太相似而无法分辨出各自得特征区域1 3 鸡0 0 4 分子作用机制的分析1 3 10 d 4 分子与洲ci i 类分子的结合机制对人的c d 4 分子的研究表明，c d 4 分子与m h c 类分子的结合区域为第一个i g 样区的大部分区域和第二个的少数几个氨基酸残基1 2 , 4 3 , 4 4 相互作用的氨基酸位于分子的两侧，包括一侧c d 的p h e ( 4 3 位) ，l y s ( 4 6 位) ，a r g ( 5 9 位) ( 1 51 - 4 ) 在鸡c d 4 分子只有l y s ( 第5 0 位)是保守的，但是在其第4 9 位有个暴露的p h e 与上述人c d 分子4 3 位上的p h e 相对应。此外，氨基酸在c c 及d e 环区域的插入和缺失也会影响c d 4 分子此处的构象。但是，在同一个面上的带正电荷的l y s ( 4 5 ，5 0 ，5 2 位) 可以与m h c i i 类分子b 链上带负电荷的g l u 残基结合实现c d 4与m h ci i 类分子的结合即1 ( 图i - 4 ) 在人的c d 4 分子上，这个区域还有暴露于表面的带正电荷的氨基酸残基( 4 6 位的l y s ，5 9 位的a r g ) ，也可以与m h c 类分子上带负电荷的氨基酸残基结合( 图l 4 ) 电荷在c d 4 分子与m h c 类分子结合中所起的作用还需要进一步研究。在人的c d 4 分子第一个i g 样区的c d 区有可溶性的暴露的s e t ( 第1 9 位) ，g i n ( 第8 9 位) ，并且在第二个培样区上有一个g i n ( 1 6 5 位) ( 图l 4 ) ，这些氨基酸残基都参加c d 4 分子与m h c类分子的结合但是，这些氨基酸在鸡的c i m 分子上并不保守，鸡c i m 分子在这个区域与m h c 类分子的相互作用还需要进一步阐明忡朋1 3 20 0 4 分子的二聚化作用机制人c d 4 分子近膜端i g 样区的二聚化分别有c c 环区域，f 段及g 段参与p 1 基于人c d 4 分子二聚化结构，模拟鸡c i m 分子进行二聚化结构，结果表明该结构类似于外表面凹陷的两只手扣合在一起( 图i - 6 ) 在哺乳动物上绝对保守的第3 4 4 位的g l u ，在鸡c d 4 分子上为3 7 5 位上的相对较短的a s n 所替代，导致分子中间界面出现了配对连接的缺失( 图l - 6a ) 。但是，对可能介导二聚化的连接的分析相互作用的分子的几个氨基酸残基是相互连接的。3 7 3 位上的l e u 可能形成疏水配对，与人c 1 m 分子二聚体中3 4 2 位上对应的m e t 类似3 8 4 位上的l y s 和3 4 5 位上的g l u能够发生电荷相吸作用，相对应的在人c d 4 分子二聚体中3 1 8 位l y s 和3 5 6 位上的g l u 可能形成两个盐桥9 j 此外，3 4 8 位上的a s h 可能与另一个分子上的3 8 9 位上的a s n 通过氢键相互作用( 图i - 2 ) 这些a s n 残基便是潜在的糖基化位点并且位于相互作用区域的边缘。因为来自这两个分子的残基紧挨在一起，如果其二聚化过程与人类c d 4 分子的一样，巨大的糖链的连接将会对其二聚化过程产生巨大的立体阻碍3 8 9 位上的a s n 最可能阻碍这个过程，因为最可能被包入二聚体内但是，3 4 8 位上的a s n 最可能糖基化，因为它暴露于分子表面如果假定鸡c i m 分子二聚化6中国农业大学硕士学位论文第一章前言与人相同，一些在人类c d 4 分子上并不十分保守的反应也会在鸡上观察到圈1 - 6c d 4 分子近膜端潜在二聚化作用图，侧链为参与二聚化的氨基酸残基， 为鸡c d 4 ，b 为人c d 4 p 1 3 3c d 4 分子与h i vg p l 2 0 的结合机制h 1 v g p l 2 0 与人c d 4 分子的结合区域位于其第一个培样区的c - d 区域附近【4 7 ”4 9 划。鸡c d 4分子的结构在这个地方与其类似但是，它的构象受c c 环附近三个氨基酸插入和d e 环附近5 个氨基酸插入的影响，尽管如此，他仍然存在与h i v g p l 2 0 结合的潜在的氨基酸残基( 图1 - 4 ) 此外，鸡c d 4 分子的该区域表面暴露的氨基酸与人c d 4 分子的性质不同，可能阻止了h i v 对该分子的识别。1 4c d 4 1 细胞的发育与功能1 4 1t 细胞发育的阳性选择早期胸腺细胞位于胸腺皮质，表达c d 2 和c d 5 分子，但不表达c d 4 和c d 8 分子，为双阴性细胞a d o u b l e n e g 砒i v ec e l l ，d n ) 随着胸腺细胞向皮质深层迁移，同时发生1 r b 基因重捧和表达，后者可使c d 4 d 8 细胞免于凋亡( a p o p t o s 岣，并促使其逐渐发育为c d l 4 + c d s + 双阳性细胞( d o u b l ep o s i t i v ec e l l ，d p ) d p 细胞的表面标志为t c r + 、c d 2 + 、c d 3 + 、c d 4 + 、c d s + ，亦称为前7t 细胞m 卫1 d p 细胞继而经历由t c r 邮介导的阳性选择过程若d p 细胞的t c r c q l 能与胸腺皮质细胞表面m h c - i i 或m h c - i 类分子以适当亲和力结合，即继续分化为c d 4 + 或c d 8 + 单阳性细胞( s h a g l ep o s i t i v ec e l t , s p ) ：与基质细胞表面m h c - i 类分子结合的d p 细胞其c d 8 表达水平增高，c d l 4 表达水平下降直至丢失；与m h c 分子结合的d p 细胞其c d 4 表达水平增高，c d 8 表达水平下降直至丢失若d p 细胞不能与m h c 分子有效结合或发生高亲和力结合。则在胸腺皮质中发生凋亡，或称程序性死亡仅约5 d p 细胞经历阳性选择而存活这种选择过程赋予成熟c d 4 c d 8 + t细胞具有识别自身m h c - i 类分子复合物的能力，而c 1 m + c d 8 - r 细胞则具有识别m h c 类分子复合物的能力，此乃t 细胞获得m h c 限制性的基础p 划。通过免疫荧光分析显示，在1 3 日龄鸡胚中1 0 3 0 的胸腺细胞表达c d 4 和c d 8 分子，到1 6 日龄鸡胚时，7 0 - 8 0 的胸腺细胞呈阳性，但2 周龄小鸡c d 4 和c d 8 胸腺细胞降到7 0 左右p e f t 等用三色荧光和流式细胞术分析了2 - 7 周龄肉鸡的胸腺和脾脏中c d 4 和c d 8 分子表达的比率随着日龄的增大，胸腺中的c d 4 + c d 8 。细胞的百分比增加，c d 4 c d 8 + 细胞百分比基本保持不变，c d 4 + c d 8 + 细胞百分比减少；脾脏中c i m + c d 8 细胞的百分比减少，c d 4 c d 8 + 细胞和c d 4 + c d s +细胞百分比增加 5 6 1 。k a t e v u o 等采用胸腺内荧光素原位标记的方法研究3 周龄雏鸡胸腺细胞的迁移情况，发现每天分别有0 7 和o 4 的胸腺细胞从胸腺迁移到血液和脾脏p ”。像哺乳动物一样。大部分胸腺细胞在胸腺中凋亡1 4 2t 细胞发育的阴性选择经历阳性选择的t 细胞还须通过阴性选择，才发育为成熟的、能识别外来抗原的t 细胞。位于胸腺皮质与髓质交界处的树突状细胞( d e n d r i t i cc e i l d c ) 和巨噬细胞均高表达m h c - i 和m h c - i i 类抗原，后者与自身抗原结合成复合物通过阳性选择后的胸腺细胞若能识别此自身抗原- m h c 分子复合物，即被激活而发生程序性死亡，或成为无能细胞，而不能识别该复合物的胸腺细胞则能继续发育由此，胸腺细胞通过阴性选择而获得对自身抗原的耐受性唧捌经历上述与m h c 有关的选择过程，t 细胞才分化为成熟的、具有m h c 限制性、可识别异物抗原的c d 4 + c d f 或c d 4 c d 8 + 单阳性细胞，即具有免疫功能的成熟t 细胞，进而离开胸腺迁移到外周血液中，并移居于周围淋巴器官1 5g d 4 + t 细胞的功能性分化1 5 10 d 4 1 细胞的分化依据c d 4 + t 细胞分泌细胞因子的类型可以将其大致分为t h l 和t m 两个亚群。t i n 亚群分泌白介素- 2 ( i l - 2 ) m 干扰素( i f n - 7 ) , 肿瘤坏死因子m i n f 鼽i l - 1 0 等，t m 亚群分泌广4 ，i l - 5 ，i l - 6 ，i l - 1 3 ，i b - 1 0 等两类细胞参与不同的免疫反应：t m 细胞主要介导迟发性超敏反应8中国农业大学硕士学位论文第一章前言哪，1 m 细胞更有助于i 班的产生但有的单个c d 4 + t 细胞可分泌多种细胞因子，如几一2 ，i ，i l - 5 ，i f n 吖i l - 1 0 、转移生长因子p ( t g f - d 等，这种可分泌多种细胞因子的前体细胞称为t a o t m 和1 m ，类细胞的分化方向与其前体细胞所处的环境和刺激方式有关，丽细胞因子本身是刺激其分化的最有力因素旧某些细菌产物、病毒胞内细菌和原生动物等均可话化巨噬细胞和树突状细胞，使这些细胞分泌i l - 1 2 ，从而诱导向t 函细胞分化删c d 4 + t 细胞中，仅t 面细胞和早期活化的未定型细胞可表达功能性 l - 1 2 受体，t m 细胞则不表达”i i ，1 2 活化3 种转录因子：s t a t l 。s m o 和s t a t 4 其中s t a r 4 是i l - 1 2 特异性的，但有研究证实人类i f n 吖也可活化s t a r 4 ，敲除i l - 1 2 或s t a t 4 基因均可显著减弱t a l 类反应【蚴| 3 1 儿4 诱导t u 0 细胞向b n 细胞分化它通过活化的j a k l , j a l o ，s t a r 6 和i r s - 2 ( 胰岛素反应物) 完成信号转导嗍i l 4 的启动子上有一个s t a t 6 结合位点，该位点能刺激与m _ 4 作用后受体基因的转录敲除s t a r 6 或几4 基因均可导致1 m 细胞分化缺陷关于促使c d 4 + t 细胞向t h 2 细胞分化的m - 4 的来源问题目前认为细胞活化时可产生少量i l - 4 ，其产量随t 细胞的活化而增加。由于1 m 细胞主要分泌i l - 4 ，当c d 4 + t 细胞分泌的儿- 4 累计达到一定量时，就会诱导t r i o 细胞向细胞分化，进而产生更多的一这表明c d 4 + t 细胞被反复刺激和大量活化是t m 细胞分化的重要因素i o ，j 。c d 4 + t 细胞亚群依靠两个重要因素调节其分化平衡。抗原的剂量和浓度。低抗原剂量和浓度有利于t 函分化，反之倾向于t m 分化阱l 。低剂量抗原时，主要的抗原递呈细胞s ) 是树突状细胞。它们分泌i l l 2 以促进c d 4 + t 细胞向t h l 分化；高剂量抗原经a p c $ 递呈后不分泌i l - 1 2 ，因此向t m 分化或诱导一种免疫耐受( 无免疫) 状态。不同浓度的抗原也可通过结合c d 4 + t 细胞表面不同的受体转导不同的信号而影响c d 4 + t 细胞的分化，如抗原结合t 细胞受体( t c r ) 后可通过活化的r a s 裂原蛋白激酶途径诱导t m 细胞分化i j 共刺激c d c t 细胞分化需要两个刺激信号，一是t 细胞受体t t c r ) 与主要组织相容性复合物分子，外界抗原( m h c a g ) 复合物形成的第一信号，其次是a p c s 的b 7 分子与t 细胞上c d 2 5 细胞毒性t 细胞抗原( c t l a 4 ) 结合形成的第二信号，即共刺激信号。最佳的共刺激分子是结构相似的两种蛋白，如b t - i 和b 7 - 2 它们通过与特异性受体c d 2 8 c t l a - 4 结合而活化c d 4 + t 细胞t i l 和t m 细胞的分化都需要共刺激信号高水平的共刺激信号促进t m 反应，这可能是通过增加幼稚c d 4 + t 细胞的活化而增加i l 广4 产量；同理，t h l 细胞的活化也需要a p c s 分泌的i l - 1 2 和共刺激分子的参与，并且这类反应很少受参加反应的c d 4 + t 细胞量的影响也有研究提出b 7 - l 和b 7 - 2 分别调节t 函和t m 细胞的分化，但不能证明这两种共刺激分子可传递给c d 4 + t 细胞不同的信号，故只能推测某一共刺激分子的表达影响c d 4 + t 细胞向某一方向的分化，如未活化的a p c $ 主要表达b 7 - 2 ，当a p c $ 受到炎症刺激时则b 7 1 表达增加州前面提到共刺激通过增强a p c s 的递呈作用而促进1 证细胞的分化；相反，分化完全的t m 细胞可不依赖共刺激分子b 7 直接对抗原起反应，而1 k 细胞在活化过程中离不开b 7 因此，决定t 细胞分化的关键因素是共刺激存在的时间和水平。而不是它们存在与否c d 4 + t 细胞和a p c s 上其它的表面分子也调节c t ) 4 + 细胞分化，如c d 4 + t 细胞的c d 4 0 配体和9中国农业大学硕士学位论文第一章前言a p c $ 的c d 4 0 的反应也是c d 4 + t 细胞发生效应所必须的吲，但这对配受体对c d 4 + t 细胞亚群分化方向的影响并不清楚1 5 2c d 4 t 细胞的功能1 5 2 1t m 效应细胞的功能t h l 细胞主要的细胞因子i f n - , f 有两大主要功能。可活化巨噬细胞，加强其杀菌能力可刺激产生i g g 类抗体，后者与高亲和性的研受体和补体蛋白结合参与对微生物的调理和吞噬作用。鼠类最有代表性的i f n - 7 依赖性i g g 是i g g 2 a 和理【g 3 ，人类中类似的i g g 是l g g l 和i 9 0 3 ，但它们不是i f n - 7 或t 南依赖性的悯总之，t 面细胞的主要功能是加强巨噬细胞介导的抗感染反应由于i f n - 1 3 和i f n - 7 均可募集、活化炎性白细胞，故以t h l 细胞为主的免疫反应常和炎症组织损伤有关，典型的炎症反应即d t h ，它常常是抗分支杆菌感染的保护性免疫反应某些t 函细胞消除体内微生物的另一途径是通过分泌1 i , - 2 和i f n 吖，它们促进c d g 细胞转化为细胞毒性t 细胞，后者分泌的淋巴毒素能溶解细胞。1 5 2 2k 效应细胞的功能t 白主要的细胞因子是几- 4 ，i l - 5 i 【4 是诱导b 细胞合成i g e 的关键因素。i l - 5 主要诱导嗜酸粒细胞( e o s ) 的活化，缺乏i l - 5 或其相应受体的小鼠对蠕虫感染缺乏e o s 反应 c 0 1 t m 可同时分泌这两种细胞因子使得在1 m 细胞为主的免疫反应中活化的e o s 常伴有高水平的i g e ，例如过敏和蠕虫反应e o s 的募集是由化学因子介导的，如e o t a x i n 它可由t i l ，t m 和非t 细胞分泌，并由局部的儿_ 4 。i l - 5 增强其活性。t m 细胞也可刺激b 细胞产生高水平的i g m 和不依赖补体的i g 3亚类物i g g 4 1 6 7 1 t m 细胞产生的几种细胞因子也有抗炎作用。几4 i l - 1 3 可抵消i f n 吖的巨噬细胞活化作用；i l - 1 0 可抑制大量的巨噬细胞反应；t g f - p 可抑制白细胞的活化和增殖。总之，t k 细胞活化形成的细胞因子网络可抑制急，慢性炎症反应，包括d t h t m 细胞不仅是免疫反应的效应细胞，同时也是一种调节因子，有时t m 细胞在免疫反应中可很晚才出现，其作用是阻止t 如细胞介导的免疫反应引起的损伤，如体外某些早期以1 h 为主的反应随时间的延长则t m 反应逐渐增强 2 0 1 1 6c d 4 分子的功能在免疫应答中，c d 4 的功能主要表现在两个方面：首先，c d 4 分子对m h ci i 类分子有特异的亲和力，所以它是作为细胞粘附分子发挥作用的。对诱发b 细胞的体液免疫起重要的辅助作用；其次。它是一个传递信号的分子，促使t 细胞的激活。c d 4 分子具有粘附作用，这在很多实验中得以证实 4 1 ，如把c d 4 基因转染到成纤维细胞中，则能表达m h c 类分子的细胞系都可吸附到单层成纤维细胞上；又如，t 细胞要对表达m h c l o中国农业大学硕士学位论文第一章前言类分子的抗原递呈细胞作出应答，在自身表面必须有c d 4 分子的存在由于t c r 对特异抗原- m h c 复合物的亲和力是广谱的，因此当亲和力较弱时，c d 4 的这种粘附功能将起着决定性作用c d 4 分子还具有传递信号的功能用抗c i m 单抗对t 细胞的激活或抑制作用并不依赖于m h c分子或c d 3 分子，而是直接通过c d 4 传导的：在用抗原m i - i c 或用抗t c r 单抗激活t 细胞的过程中，都发现c d 4 分子在胞质部分的丝氨酸迅速被磷酸化，显示出c d 4 的传递信号的功能有些研究表明c d 4 和t c r 起着协同调节作用，所以在细胞内很可能c d 4 与t c r - c d 3 复合物结合在一起，共同对免疫应答起着调节作用1 7 本研究的目的和意义鸡是世界上养殖量最大的家禽，从二十世纪中期以来，世界鸡的存栏量一直处于上升趋势。中国是世界第一养鸡大国，占世界蛋鸡存栏的4 0 ，中国蛋鸡产业的快速发展，成为农村劳动力转移、致富的有效方式。随着养殖量的增加，鸡的疾病逐渐增多，并日趋复杂但是，目前，对于鸡传染性疾病病原学及免疫学的研究仍难以满足生产需要，特别是对这些疾病的分子病原学及分子免疫学的研究仍处于初级阶段。对现代疫苗免疫效果的评价，已经由过去的单纯强调体液免疫应答水平，上升到对体液免疫、细胞免疫、黏膜免疫的综合评价。针对鸡c d 4 和c d 8 分子的单抗可以分选出c d 4 + 和c d 8 + t 细胞，从而能够分别研究c d 4 + 和c d s + t