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浙江工业大学硕士学位论文 反胶束水合萃取藻蓝蛋白研究 摘要 藻蓝蛋白是螺旋藻的主要组成成分，广泛应用于食品、化妆品、医 药等行业。藻蓝蛋白的生理活性如抗氧化、抗肿瘤、抗病毒等特性已被 不断证实，使之更具广阔的应用前景。 反胶束水合萃取技术是将反胶束萃取和水合物生成耦合在一起形成 的一项新型、有发展潜力的分离技术，可应用于生物物质的活性控制及 提取。反胶束水合萃取藻蓝蛋白在保证藻蓝蛋白活性的同时完成萃取和 反萃取过程，操作较为简单。本文构建了删( 正辛烷一正戊醇) 反胶 束体系，通过研究此体系中水合物生成对其内的藻蓝蛋白的萃取作用及 纯化效果，获得反胶束水合萃取藻蓝蛋白的动力学规律以及温度、压力、 伽浓度和初始含水量甄等对反胶束水合萃取藻蓝蛋白的影响规 律，为进一步开展水合物法生物质滑| 生控制及反胶束水合萃取技术的研 究提供依据。 纯水体系和反胶束体系中乙烯水合物对比实验表明：两种体系中水 合物生成动力学特性差异较大，乙烯在反胶束体系和纯水体系中溶解度、 溶解速率和体系中水含量的差别是造成反胶束体系和纯水体系中乙烯水 合物生成动力学特性区别的本质所在。 藻蓝蛋白的反胶束水合萃取实验表明：乙烯水合物的生成动力学曲 线与不含藻蓝蛋白的反胶束中的生成动力学曲线基本相似。研究表明， 在初始温度3 o ，初始压力4 om p a ，c m 姐；浓度o 0 5m 0 1 l ，初始含 水量4 0 的条件下，水合萃取藻蓝蛋白的萃取率e 可达8 1 3 ，表明该 浙江工业大学硕士学位论文 条件时的萃取效果比较好。由于水合萃取实验中气液比较大，所以在一 定范围内初始温度和压力对萃取效果影响不大，属于非显著性因素，而 较大的反胶束浓度和初始含水量有利于提高藻蓝蛋白萃取率。 关键词：反胶束，水合物，藻蓝蛋白，萃取 n 浙江工业大学硕士学位论文 s t u d y o fp h y c o c y 舢n i ne x t r a c t e d f r o m 刚r u u l 7 、hp 乙4 磁? 、陋z su s i n g r e v e r s em i c e l l a rh y d r a t e d e x t r 加o nt e c h n o l o g y a b s t r a c t p h y c o c y a n i n ，a so n eo ft h em a i l lc o m p o n e 鹏i i l 印砌砌口p 缸觚括，h a s b e e na p p l i e di i lf o o d ，c o s i n e t i ca i l dm e d i c i i l ei n d u s t r i e s ，e t c s o m ei m p o r t a n t p h v s i o l o g i c a la c t i v i t i e ss u c ha sa i l t i o x i d a n t ，a j l t i t u m o ra n da n t i v i f a le 虢c ta r e g e n e r a l l yi d e n t i 丘e d ，t h u sp h y c o c y a n i i lh a sw i d e ra p p l i c a t i o np r o s p e c t t h en e wa n di i l n o v a t i v es e p a r a t i o nt e c h 0 1 0 9 yn a m e da s“r e v e r s e t n i c e l l a u rh y d r a t e de x t r a c t i o nt e c h n o l o g y ”，w h i c hi n t e 伊a t e dh y d r a t es e p a r a t i o n w i t hr e v e r s em i c e a re x t r a c t i o n ，i su s e df o rt h ec o n t r o lo fb i o l o 西c a la c t i v i t y a n de x t r a c t i o no fb i o p r o d u c t t h el ( i n e t i cr e s e a r c hw a si i l l p l e m e n t e do nt h e e x t r a c t i o no fp h v c o c v a n i n 舶mt h er e v e r s e1 1 1 i c e l l a rs y s t e m ，w h i c hw a s f b m e db yc m 惦，n - o c t a i l ea n dn - p e n t a i l 0 1 c o r r e s p o n d i i l g l y ，t h ee x t r a c t i o n b e h a v i o ro fp h v c o c v a n i n 矗o mt h er e v e f s em i c e l l a u rs y s t e ma sw e ht h ee 虢c t m e c h a n i s mo ft e m p e r a t u r e ，p r e s s l l l e ，! 【abc o n c e n t r a t i o n ，a 1 1 di 1 1 i t i mw a t e r c o n t e n tw 名o np h y c o c y a n i ne x t r a c t i o nw e r ea c q u i r e d 1 h er e s u l t sc o n t r i b u t e d n e wi n f o r m a t i o nf o rt h ef u r t h e rr e s e a r c ho nt h ec o n t r o lo fb i 0 1 0 9 i c a la c t i v i q a n dr e v e r s em i c e u a rh v d r a t e de x t r a c t i o no f b i o p r o d u c t c o n t r a s te x p e i i l l l e n t so fe t h y l e n eh y d r a t ef o m l a t i o ni i lp u r ew a t e rs y s t e m a n dr e v e r s en l i c e l l a rs v s t e ms h o w e dm a tm ek i l l e t i c so fh y d r a t ef o 珊a t i o nh a d l a r 2 - ed i f f e r e n c eb e t w e e nt 、7 l ，os v s t e m s ，w h i c hw a sc a u s e db yt h ed 赶e r e n t s o l u b i l i t v ，d i s s o l u t i o nr a t eo fe t h v l e n ea n dt h ew a t e rc o n t e mo ft w os y s t e i i 坞 t h er e | v e r s en l i c e h a rh v d r a t e de x t r a c t i o ne x p e r i ：m e n t ss h o 、) l ，e dt h a t ， l 【i n e t i cc u e so fe t h v l e n eh v d r a t ef b 咖a t i o ni nt h er e v e r s ei i l i c e u a rs y s t e m c o n t a i n i n gp h y c o c y a i l i i lw e r es i m i l a rt ot h o s eo ft h er e v e r s em i c e l l a rs y s t e m n o tc o n t a i n e dp h v c o c v a n i n 1 h em a x 曲u me x t r a c t i o ny i e l do f8 1 3 w a s o b t a i l l e da ti n i t i a lt e m p e r a t u r eo f3 o ，i i l i t i a lp r e s s u r eo f4 on 皿a ，c i ：a b l c o n c e n t r a t i o no fo 0 5m o 。a n di 】 1 i t i a lw a t e rc o n t e n to f4 0 b e c a u s eo ft h e l a r g e ：g a sl i q u i d r a t i of o rt h er e v e r s er n i c e l l a rh y d r a t e d e x t r a c t i o n e x p e r i i l l e n t s ，t h e 枷a lt e i n p e r a t u r ea n dp r e s s u r ew e r en o n - s i g n i 乱a n tf a c t o r e 骶c t i n ge x t r a c t i o ny i e l d a n dt h em c r e a s e d 吼蝠c o n c e n t r a t i o n a n di n i t i a l w a t e rc o n t e n tf a v o r e dm ee x t r a c t i o ny i e l do fp h y c o c y a n i n k e yw o r d s ：r e v e r s e1 1 1 i c e 甄h y d r a t e ，p h y c o c y a n m ，c 彤蝠，e x t r a c t i o n 摘要i a b s t ra ( 了 前言1月l j舌l 第一章文献综述3 1 1 藻蓝蛋白3 1 1 1 藻蓝蛋白的结构3 1 1 2 藻蓝蛋白的溶解性及光谱特性3 1 1 3 藻蓝蛋白稳定性研究4 1 1 3 1 温度对藻蓝蛋白稳定性的影响4 1 1 3 2d h 值对藻蓝蛋白稳定性的影响4 1 1 3 3 乙醇对藻蓝蛋白稳定性的影响4 1 1 3 4 n a a 对藻蓝蛋白稳定性的影响 1 1 3 5 光照强度对藻蓝蛋白稳定性的影响4 1 1 3 6 糖类和金属离子对稳定性的影响4 1 1 4 藻蓝蛋白的功能及应用5 1 1 4 1 营养功能5 1 1 4 2 抗辐射能力5 1 1 4 3 抗炎性5 1 1 4 4 抗氧化性5 1 1 4 5 抗癌功能6 1 2 螺旋藻藻蓝蛋白的提取6 1 2 1 藻蓝蛋白提取纯化工艺6 1 2 1 1 离子交换色谱和体积排组色谱法6 1 2 1 2 反胶束萃取法6 1 2 1 3 硫酸铵沉淀结合柱层析分离方法6 1 2 1 4p b s 缓冲液直接提取法6 1 2 1 5 十二烷基苯磺酸钠处理结合柱层析分离法。7 1 2 1 6b 0 u s s i b a 等电点法分离改进法7 1 2 1 7 氯化钾溶菌酶或冻融提取法7 1 2 1 8 膨胀床吸附色谱法7 1 2 1 9 双水相萃取法7 1 2 2 分离纯化方法分析7 1 2 3 目前存在的问题。8 1 3 反胶束萃取技术。8 1 3 1 反胶束基本概念8 1 3 2 反胶束体系的性质9 1 3 3 反胶束萃取技术应用9 1 3 3 1 纯化和分离蛋白质1 0 1 3 3 2 从植物油料中同时提取油和蛋白质1 0 1 3 3 3 反胶束萃取用于蛋白质的复性。1 0 1 3 3 4 提取纯化蛋白酶1 0 浙江工业大学硕士学位论文 1 4 水合物分离技术n 1 4 1 能源利用1 1 1 4 2 近临界和超临界萃取1 1 1 4 3 生物酶活陆控制及提取1 2 1 4 4 海水脱盐淡化。1 3 1 4 5 气体混合物分离1 4 1 5 蛋白质分析方法。1 4 1 5 1f o l i i l 酚试剂法1 5 1 5 2 凯氏定氮法1 5 1 5 3 考马斯亮蓝染色法1 5 1 5 4 紫外吸收光谱法1 5 1 6 总结1 6 第二章反胶束水合萃取实验设计1 7 2 1 引言1 7 2 2 实验体系选择1 7 2 3 仪器与试剂1 8 2 3 1 藻体1 8 2 3 2 蛋白浓度测定试剂1 8 2 3 3 其他试剂1 9 2 3 4 水合反应装置1 9 2 3 5 其它仪器2 0 2 4 实验内容2 0 2 4 1 反胶束的制备2 0 2 4 2 样品含水量测定。2 1 2 4 3 不同c m 气b 浓度对反胶束体系及萃取藻蓝蛋白的影响2 1 2 4 4 藻蓝蛋白浓度分析。2 1 2 4 4 1 标准曲线的绘制。2 1 2 4 4 2 样液测定2 2 2 4 5 藻蓝蛋白萃取率和纯度计算2 2 2 4 6 螺旋藻细胞破壁。2 3 2 4 6 1 细胞破壁方法选择。2 3 2 4 6 2 浸泡时间影响。2 3 2 4 6 3 冻融次数及温度影响2 3 2 4 7 反胶束水合萃取2 4 2 4 7 1 纯水和反胶束体系乙烯水合物动力学实验2 4 2 4 7 2 反胶束水合提取藻蓝蛋白实验2 5 2 4 7 3 水合物动力学实验。2 5 第三章实验结果与讨论2 7 3 1 引言2 7 3 2 结果与讨论2 7 3 2 1 反胶束体系含水量与电导率的关系2 7 3 2 2 不同( 姬浓度对增溶水量的影响规律2 8 浙江工业大学硕士学位论文 3 2 3 蛋白质检测2 9 3 2 4 螺旋藻陂壁2 9 3 2 5 纯水和反胶束体系乙烯水合物动力学对比试验3 0 3 2 6 反胶束水合实验中乙烯溶解过程描述3 4 3 2 7 藻蓝蛋白的反胶束水合萃取实验3 4 3 2 7 1 反胶束水合萃取藻蓝蛋白的动力学规律3 4 3 2 7 2 藻蓝蛋白反胶束水合萃取效果分析3 7 3 2 7 3 温度、压力、碥等对反胶柬水合萃取藻蓝蛋白的影响规律3 9 3 2 7 4 反胶束水合萃取藻蓝蛋白过程分析。4 0 第四章总结与展望4 3 4 1 结论 4 2 存在的问题。 4 3 展望 参考文献4 6 到e 谢5 0 攻读硕士期间发表的学术论文5 l 浙江工业大学硕士学位论文 - - - k 刖吾 螺旋藻是一种多细胞的螺旋形原核藻类生物，其细胞之内没有真正的细胞核，螺 旋藻的细胞壁不是由纤维素组成，而是由一些多糖类物质组成，易于消化吸收，由于 螺旋藻富含藻蓝蛋白，而导致外观呈现蓝绿色。螺旋藻具有蛋白质含量高、繁殖速度 快等特点【1 2 】。现已发现的螺旋藻共有3 6 种，多数是淡水种，而其中用于工业生产的 有两个种，分别是钝顶螺旋藻与极大螺旋测引。 藻蓝蛋白( p h y c o c y a n i n ) 在螺旋藻之中主要是以藻胆蛋白体的形式存在，藻胆蛋白 体是由多种藻胆蛋白和连接蛋白组成的。藻胆蛋白根据存在的不同发色团可以分为以 下3 大类：( 1 ) 藻红蛋白，( 2 ) 藻蓝蛋白和藻红蓝蛋白，( 3 ) 别藻蓝蛋白1 4 】。在总的藻 胆蛋白之中，藻蓝蛋白的含量大于2 0 。藻蓝蛋白是一种强荧光的色素和蛋白质的 络合物，是螺旋藻中重要的捕光色素蛋白，可以以近1 0 0 的高效率把光能优先地传 递给光系统【5 】o 有一些研究表明，螺旋藻表现出的生理功能与藻蓝蛋白及其含量有着 密切的关系。 工业中，藻蓝蛋白广泛应用于染料、食品、化妆品等行业，其本身具有强烈荧光， 可以制成荧光探针等，同时又作为一种安全无毒的蛋白质资源，可以制成药品用于医 疗保健的方面。由于藻蓝蛋白具有良好的开发前景，而且在螺旋藻中的含量比较高， 所以其理论研究和应用现在已经成为螺旋藻类蛋白质研究的热剧昏1 0 j 。 藻蓝蛋白是一种胞内蛋白质，- 因此需要先破碎细胞壁、细胞膜使藻蓝蛋白以溶解 的状态溶于提取液之中，然后再将其沉淀出来，在提取过程应保持藻蓝蛋白的活性 1 1 1 】。细胞破碎的方法有反复冻融法、超声波法、溶胀法、化学试剂处理法和组织捣 碎法等方法。蛋白质沉淀方法主要有等电点沉淀法、盐析法、结晶法和超滤法等一些 方法。 反胶束萃取技术是一项新型的、有发展潜力的生物物质分离技术。在反胶束萃取 技术的应用过程中，表现出许多方面的特点：不存在毒性试剂，成本低，可以连续操 作，处理量大，而且反胶束溶液可反复利用，以及近年来它与其它应用技术如超临界 分离技术、色谱分离技术等的联合操作，这些特点使其在工业化生产方面都表现出了 较大的应用潜力。近一些年来，国内外对反胶束萃取技术的研究主要集中以下方面： 物理化学性质，反胶束形成热力学，反胶束在蛋白质等生物物质的分离过程中的应用。 其中反胶柬萃取的工业化模拟和蛋白质反萃取方法的改进成为近些年来的研究热点。 大多数蛋白质对所处环境很敏感，在p h 1 0 、较高温度情况下会表现 出不稳定、易变性失活【1 2 1 。而反胶束体系内的“微水池”是一种类生命环境介质，其内 的蛋白质不易变性，所以反胶束萃取技术可广泛应用于生物质活性控制及提取。反胶 浙江工业大学硕士学位论文 束萃取技术在单一或混合氨基酸的分离中表现出了很大优越性，萃取机理也有了论 断，不过仍然存在许多问题需要解决，例如萃取机理的实验验证掣1 3 j 。 反胶束水合萃取分离技术是将水合物的生成与反胶束萃取耦合在一起的一种新 型分离技术，由于水合物分离技术适合于低温溶液，水合物形成消耗水分可改变反胶 束的含水量及反胶束的尺寸，此过程可以促进反萃取过程的进行，所以水合物分离技 术被很自然的应用于反胶束溶液内的生物蛋白质活性控制以及提取方面。p h m i p s 掣1 4 j 曾利用水合物的生成从生化溶液中回收蛋白酶，但是其它的相关研究稀少。 藻蓝蛋白的应用前景十分可观，但是由于螺旋藻藻蓝蛋白的提取工艺较为复杂， 而且稳定性较低，于是限制了螺旋藻藻蓝蛋白的工业化生产m j 。所以针对螺旋藻中 藻蓝蛋白进行的规模化提取以及纯化的研究一直是研究的热点，其相应的提纯技术也 在不断创新和改进。本文采取的反胶束水合萃取藻蓝蛋白在保证藻蓝蛋白活性的同时 完成萃取和反萃取过程，操作较为简单。 为了做好水合物法生物物质活性控制及提取研究的前期工作，必须使得实验条件 适合生物活性物质保持活性，选择的水合物生成气能在此条件的范围之内生成水合 物。本论文选择乙烯作为实验中的水合物生成气，因为在同等的实验条件下乙烯较甲 烷、乙烷等容易形成水合物，而且在它的常规区、近临界区和超临界区都可以生成水 合物。乙烯水合物生成的温度和压力条件又比较温和，适合大多生物活性物质在实验 中保持活性。 本实验对螺旋藻细胞破壁条件进行考察，以及通过构建a 郑( 正辛烷正戊醇) 反胶束体系，研究此体系中水合物生成对其内的藻蓝蛋白的萃取作用及反萃取效果， 考察破壁条件、温度、压力、c 聊圆浓度和初始含水量等因素对反胶束水合萃取 藻蓝蛋白的影响。 2 浙江工业大学硕士学位论文 第一章文献综述 1 1 藻蓝蛋白 藻蓝蛋白是存在于螺旋藻之中的一种少见的天然营养元素，其在钝项螺旋藻 藻粉中的含量高达2 0 。藻蓝蛋白富含人体八种必需的氨基酸，是自然界中一种具 有重大开发价值的蛋白质资源。它具有明显的抗氧化、抗肿瘤、抗病毒等特性，在医 疗保健方面有着很好的作用【蛤1 9 】。藻蓝蛋白在染料、食品、化妆品等行业也有广泛的 应用前景。 1 1 1 藻蓝蛋白的结构 藻蓝蛋白中包含了一个发色团和一个蛋白，蛋白是由分子量在1 8m u 和2 0m u 的a 亚基和b 亚基所组成。藻蓝蛋白的亚基在体内时以多聚体的形式存在，主要有 二聚体、三聚体、六聚体，以及比六聚体聚集度更高的聚集体。a 亚基和b 亚基首先 是通过分子间的一些相互作用力( 离子键、疏水键和氢键等) 形成单体( a b ) ，然后单体 ( a b ) 之间又借助连接多肽的作用聚合成为三聚体( a b ) 3 和六聚体( a b ) 6 等聚合体。藻蓝 蛋白的a 亚基上有一个藻蓝素，b 亚基上有两个，所以一个藻蓝蛋白的( a b ) 3 三聚体上 就有9 个藻蓝素，三聚体是一种圆盘形的聚集体，厚度大约为3i l i i l ，直径大约为1 1 m ，在中间还有一个直径约为3 5n m 的洞。 藻蓝蛋白以何种聚集的形态存在受多种因素的影响，例如p h 值、蛋白质浓度、 离子强度、辐射以及光照时间和光照强度等，都能使藻蓝蛋白聚集状态发生改变例。 1 1 2 藻蓝蛋白的溶解性及光谱特性 藻蓝蛋白可以溶于水、乙醇等一些极| 生溶剂，不溶于乙醚、氯仿等非极性溶剂， 其中在高浓度乙醇中，藻蓝蛋白会发生凝聚现象。 光谱是藻蓝蛋白的重要特性之一，藻蓝蛋白具有强烈的荧光性，发出橙红色的荧 光，而其本身却呈现蓝色，利用其最大吸光度可以进行藻蓝蛋白的含量测定。殷钢等 【2 1 】的研究表明螺旋藻藻蓝蛋白的紫外可见光光谱中，在波长2 7 8i 蚰、3 6 0 姗、和6 2 0 锄这3 处有特征吸收峰。王勇掣硐研究结果表明，在p h = 7 o 的条件下，螺旋藻中 藻蓝蛋白最大的特征吸收峰处波长为6 1 5 衄，而随着p h 变小，藻蓝蛋白可见光最大 特征吸收峰会发生蓝移，随着p h 变大则发生红移；藻蓝蛋白在中性条件的下荧光激 发峰有两个，分别位于5 9 0 姗和6 3 5m 处，荧光发射峰仅有一个位于6 5 0n m 处。 3 浙江工业大学硕士学位论文 1 1 3 藻蓝蛋白稳定性研究 藻蓝蛋白及其色素的稳定性受多种因素的影响，例如温度、p h 值、金属离子等。 1 1 3 1 温度对藻蓝蛋白稳定性的影响 温度在4 0 以内，藻蓝蛋白表现非常稳定；温度在4 5 时，藻蓝蛋白色素开始 出现分解；温度在5 0 的条件下，发现藻蓝蛋白色素分解急剧增加；当温度到达7 5 时，藻蓝蛋白的特征吸收峰出现明显的变化，这时候的藻蓝蛋白迅速变性，并伴随有 沉淀出现瞄列。 1 1 3 2p h 值对藻蓝蛋白稳定性的影响 藻蓝蛋白在p h 4 o p h 8 5 的环境中表现十分稳定，而在p h 小于4 或者大于9 的条 件下，藻蓝蛋白都会发生不同程度的变性【掬。 1 1 3 3 乙醇对藻蓝蛋白稳定性的影响 藻蓝蛋白在乙醇溶液中，稳定性随着乙醇浓度的增加而逐渐下降洲。 1 1 3 4n a c l 对藻蓝蛋白稳定性的影响 藻蓝蛋白在n a c l 溶液中是比较稳定的，n a c l 溶液浓度变化对藻蓝蛋白影响不大， 可能n a c l 在一定的程度上对藻蓝蛋白起到保护作用例。 1 1 3 5 光照强度对藻蓝蛋白稳定性的影响 取2 组藻蓝蛋白溶液，分别置于室内自然光和强日光下，放置一段时间后，测定2 组藻蓝蛋白吸光度的变化。结果表明，在室内自然光下放置6 oh 的藻蓝蛋白吸光度值 基本不变，放置1 8h 后出现浑浊；而经过强日光照射1 0h ，藻蓝蛋白溶液的颜色就消 褪至近无色，这说明藻蓝蛋白光稳定性较差，在光照条件下不宜久置。有研究表明在 弱光环境中藻蓝蛋白表现较为稳定i 弘2 5 1 。 1 1 3 6 糖类和金属离子对稳定性的影响 蔗糖的存在基本上对藻蓝蛋白不产生影响，但是葡萄糖的存在会加快藻蓝蛋白的 降解，以致产生大量的绿色沉淀。 在所有金属离子中，当锌离子和铁离子存在时，藻蓝蛋白会慢慢出现沉淀，随着 锌离子和铁离子量的增大，藻蓝蛋白颜色由蓝色变绿后转黄色，但是钙离子和钾离子 4 浙江工业大学硕士学位论文 对藻蓝蛋白没有影响。 1 1 4 藻蓝蛋白的功能及应用 1 1 4 1 营养功能 由于藻蓝蛋白的氨基酸的组成比例非常合理，其中人类八种营养必需氨基酸的含 量接近或超过了f a o 推荐的标准【刎，所以藻蓝蛋白用于化妆品之中能提供皮肤所需 要的氨基酸等多种营养活性成分，能起到皮肤表面和深层营养及护理作用，对皮肤没 有刺激和致敏作用，而且使用十分安全；藻蓝蛋白用于食品强化方面可以提高谷物的 生物效率和蛋白质的利用率。 1 1 4 2 抗辐射能力 藻蓝蛋白拥有能够有效抵抗紫外线和其它电离射线辐射的重要生物学属性，还能 够有效抑制造血干细胞的减少。 造血干细胞的损伤或修复在造血功能型辐射疾病中是至关重要的【捌，藻蓝蛋白 能够降低造血干细胞的光敏感性，防止干细胞的减少，从而促使细胞进入增殖状态， 有助于造血功能的恢复。 1 1 4 3 抗炎性 通过大量的体外和体内实验模型也发现了藻蓝蛋白有抗炎活性。础c a 】r ( 1 0 等【冽曾 对藻蓝蛋白和已知的抗炎剂5 a s 舢拄行抗炎活性比较实验，结果发现，藻蓝蛋白有显 著的抗炎活性。 1 1 4 4 抗氧化性 藻蓝蛋白是一种功能强大的抗氧化剂，能够清除一系列的有毒自由基，最重要的 是，藻蓝蛋白是一种天然的化合物，不具有毒性，所以可以作为一种治疗药剂。有报 道显示，藻蓝蛋白对活性氧有着清除行为，能够清除羟基等基团，也能有效抑制线粒 体的脂质过氧化反应。 p i i l e r o 等【则曾经对藻蓝蛋白纯化过程中得到的不同阶段提取物的抗氧化活性进 行了研究。实验中发现，在不同的纯化阶段中，随着藻蓝蛋白含量的增加，提取物体 现出的抗氧化活性也随之增加，所以判断藻蓝蛋白具有抗氧化活性。 v 砌r a i a 等【3 1 l 曾经研究过藻蓝蛋白清除过氧亚硝酸盐阴离子的能力，发现藻蓝蛋 白能够有效地除去阴离子o n o o - 。也有其他文献证明，藻蓝蛋白能显著地抑制o n o o 5 浙江工业大学硕士学位论文 造成的超螺旋d n a 链的断裂。 1 1 4 5 抗癌功能 浙江医科大学曾苏等把从螺旋藻中抽提取出藻蓝蛋白作为一种新型治疗癌症的 新药物。i i m a 等认为藻蓝蛋白能促进免疫系统，以抵抗各种疾病，哈佛医学院的 s c h w a n z 和s h l 【i a r 等也发现螺旋藻藻蓝蛋白对一些癌细胞有明显的抑制作用，从以 上研究中发现，藻蓝蛋白具有一定的抗癌作用。 1 2 螺旋藻藻蓝蛋白的提取 1 2 1 藻蓝蛋白提取纯化工艺 1 2 1 1 离子交换色谱和体积排组色谱法 c a n n 等人f 3 2 】采用溶菌酶法对螺旋藻藻蓝蛋白进行了粗提取，然后他们采用 q s e p h a r o s e 飚tf 1 0 w 填充的阴离子交换色谱( 1 5 锄1 0c m ) ，对藻蓝蛋白进行进一步 纯化，可以使粗提液的中藻蓝蛋白的纯度达到2 2 ，浓度可以达到9 3 。 1 2 1 2 反胶束萃取法 刘杨等【3 3 】做了a 队b 正戊醇正辛烷( 体积比1 ：4 ) 反胶束溶液萃取螺旋藻藻蓝 蛋白的性能的研究，研究后发现，o 0 4m o l lc r a b 的反胶束体系萃取p h = 7 o ，包含 0 1m o l l k c l 的螺旋藻细胞破碎液，藻蓝蛋白萃取率可达9 6 3 ，分配系数达到2 6 0 ； 然后采用p h 5 0 ，包含2 m o l lk b r 的反萃液用来反萃取藻蓝蛋白溶液，反萃取率可以 达到9 0 6 。 1 2 1 3 硫酸铵沉淀结合柱层析分离方法 张成武等p 4 】通过反复冻融法对螺旋藻溶液进行预处理，使用硫酸铵对螺旋藻藻 蓝蛋白进行沉淀，然后依次通过羟基磷灰石( 柱层析和s e p h a d e x g - 1 0 0 柱层析进行 纯化，可以分离较高出高纯度的藻蓝蛋白。 1 2 1 4p b s 缓冲液直接提取法 张健等初步研究表明用p h = 6 0 的p b s 缓冲液能较好地直接从螺旋藻中提取出藻 蓝蛋【3 5 1 。实验步骤简单，所需仪器少，但是所得藻蓝蛋白样品做进一步鉴定发现样 品纯度不高。 6 浙江工业大学硕士学位论文 1 2 1 5 十二烷基苯磺酸钠处理结合柱层析分离法 林卫红等1 3 6 】用0 3m m o 扎的十二烷基苯磺酸钠处理螺旋藻，并用硫酸铵溶液进行 盐析处理，然后在硅藻土5 4 5 柱上分级洗脱，最后经过d e a e 纤维素层析柱进一步纯 化，可提取浓度为9 8 以上的高纯度藻蓝蛋白。 1 2 1 6b o u s s i b a 等电点法分离改进法 陈兴才等根据利用b e u m 锄动态规划原理，对姗i b a 等提出的电点法分离藻蓝 蛋白进行改进，对抽提工艺参数进行优化处理，提出优化的工艺条件。 1 2 1 7 氯化钾溶菌酶或冻融提取法 张以方等【3 7 】用氯化钾溶菌酶法或冻融法破碎钝顶螺旋藻细胞壁，盐析，提取藻 蓝蛋白。 1 2 1 8 膨胀床吸附色谱法 n i u 等尝试了采用膨胀床吸附技术作为螺旋藻藻胆蛋白的提取分离技术。 1 2 1 9 双水相萃取法 用p e g 硫酸钠双水相体系对螺旋藻细胞破碎液进行处理，萃取分理出藻蓝蛋白。 1 2 2 分离纯化方法分析 通过上述几种螺旋藻中藻蓝蛋白的提取及纯化方法的比较，可以总结出螺旋藻藻 蓝蛋白的提取通常分为蛋白溶出和蛋白沉淀两个过程。 藻蓝蛋白是一种胞内蛋白质，因此需要先破碎细胞壁、细胞膜使藻蓝蛋白以溶解 的状态溶于提取液之中，然后再将其沉淀出来，在提取过程应保持藻蓝蛋白的活性。 细胞破碎的方法有反复冻融法、超声波法、溶胀法、化学试剂处理法和组织捣碎法等 方、法【搏删。蛋白质沉淀方法主要有等电点沉淀法、盐析法、结晶法和超滤法等一些方 沣【4 蚴l t 、o 因为藻蓝蛋白提取物中杂质蛋白的含量很高，而且藻蓝蛋白的纯度比口6 z 洲2 舳) 要达到4 1 以上才具有实际应用价值。因此，实际中必须对藻蓝蛋白粗提物进一步的 分离纯化，清除杂质蛋白，以提高藻蓝蛋白的纯度。目前纯化方法有凝胶层析法、羟 基磷灰石柱层析法、离子交换法及较少使用的硅藻土柱层析法等附4 4 】。在实际应用中 常常是需要两种或两种以上的方法同时联用才能收到较好的纯化效果。 7 浙江工业大学硕士学位论文 1 2 3 目前存在的问题 目前国内外有许多实验室在研究螺旋藻藻蓝蛋白提取纯化工艺，但基本上都还处 在实验室阶段，在提取工艺中存在着难以保证蛋白质活性、工艺流程较复杂、生产成 本居高不下、产品质量不稳定的缺陷。 p b s 缓冲液提取法等步骤简单的提取方法得不到高品质的藻蓝蛋白。硫酸铵盐 析和柱层析的串联使用以及阴离子交换色谱和体积排阻的串联使用等方法是现在普 遍使用的螺旋藻中藻蓝蛋白的提取纯化方法，这样得到的藻蓝蛋白的纯度虽然较高， 但是由于纯化步骤多会大大降低产品收率。尤其在这些方法中如何保证蛋白质的活性 也是需要克服的难题。 采用反胶束萃取法分离纯化藻蓝蛋白能保证蛋白质活性，但是反萃取时需加盐处 理，所以还需分离盐类，使得分离纯化难度加大。 本文将水合物分离法与反胶束法进行耦合，无需通过加盐进行反萃取，降低操作 难度。 1 3 反胶束萃取技术 1 3 1 反胶束基本概念 表面活性剂分子是由疏水基( 非极性尾) 和亲水基( 极| 生头) 两部分组成。将表面活 性剂溶解在极生溶剂，如水中，形成的一种亲水基团朝外，疏水基团朝内的具有非极 性内核的多分子聚集体，即为正常胶束。 表面活性剂分散于连续非极性溶剂中，当其浓度超过临界胶束浓度( 既t i c a l m i c e u ec o n c e 曲i o n ) 时，表面活性剂会自发的形成一种稳定的大小为纳米级的聚集 体，这种聚集体与上述正常胶束相反，称为反胶束( r e v e r s e dm i c e u a r ，也称反胶团) 。 此时表面活性剂的排列方向是亲水基向内，疏水基向外，里面形成了球状的极性 核( p o l a rc o r e ) ，极性核中能溶解一定数量的水，从而形成宏观上透明均一、热力学 稳定的微乳状夜，而微观上观察则是一个个纳米级大小的小“水池川蜘。 _ _ _ 一 表面活性剂分子 亲水头 疏水头 ( a ) 水溶液中的胶柬( b ) 非板- | 生溶剂中的反胶柬 图1 1 正反胶束结构示意图 f i 9 1 - 1 c t u r ed i a 娜o f n l i c e u a r a n d 卿e r s en l i c e u a r 8 浙江工业大学硕士学位论文 表1 1 常用的表面活性剂及相应的有机溶剂 t a b l e1 - 1f r c i q u e n 吐y u ds u 哟c t a n t 铷融o r g 姐i cs 0 1 v e n t 表面活性剂有机溶剂 a o t t o m a c b 埔6 0 1 矗t o n x 磷脂酰胆碱 磷脂酰乙醇胺 c i ：a j 3 n 烃类，异辛烷，环己烷，四氯化碳，苯 环己烷 辛烷 己醇环己烷 苯，庚烷 苯，庚烷 己醇异辛烷，戊醇辛烷，三氯甲烷辛烷 1 3 2 反胶束体系的性质 反胶束体系的性质常用职和9 等参数表示，其中( 有机溶剂中水的摩尔 浓度与表面活性剂的摩尔浓度之比1 是反映反胶束大小的一个重要参数。是组成反 胶束微粒的表面活性剂分子堆砌数，9i n o l l 是增溶的水相对于有机相总体积的浓度。 越大，反胶束中增溶水越多。一般形越大，有机相形成反胶束微粒的直径越大； 当一定时，9 与决定了反胶束微粒的相对浓度。另外反胶束的大小还与水相 酸碱度、离子强度、溶剂和表面活性剂的种类和浓度以及温度等因素有关。 1 3 3 反胶束萃取技术应用 反胶束萃取技术作为一种新型分离技术，较传统方法有众多优点，近年来在生物 工程领域引起了广泛重视，特别是近年来成为研究热点的反胶束蛋白质萃取和反胶束 酶催化技术。 8 0 年代，科学家逐步开始进行反胶束萃取蛋白质的研究。在蛋白质提取技术中， 反胶束萃取技术具有成本低，溶剂可反复利用，萃取效率高，条件温和不会引起生物活 性物质变性，选择性高，使用范围广，操作简单等优点。 9 浙江工业大学硕士学位论文 1 3 。3 1 纯化和分离蛋白质 蛋白质可以采用3 种形式增溶于反胶束体系：注入法、溶解法和相转移法， n i s h n d 等人m 在二烷基磷酸盐异辛烷的反胶束体系中进行溶菌酶和肌红蛋白的 分离行为的研究，实验结果发现，当水相k c l 的浓度为o 1m o l l ，p h - 9 0 时，溶菌 酶基本进入反胶束微粒，而肌红蛋白则留在水相；调节水相p h 在1 1 1 2 时，9 0 以 上的溶菌酶可以反萃取到浓度为1 5m o l i 。的i 王a 溶液中。 y e e 等人【4 7 】用反胶束萃取技术分离混合蛋白质体系中的a 乳白蛋白和b 乳球蛋 白，实验发现，当初始的水相总蛋白质的浓度为1 om 鲈n l ，p h = 9 o ，n a + 的浓度为 o 1m 0 1 l 时，萃取后有8 5 的a 乳白蛋白进人a o t 异辛烷反胶束粒，而大约有8 0 的b 乳球蛋白仍残留于水相溶液。 1 3 3 2 从植物油料中同时提取油和蛋白质 陈复生等【铝】研究用a o t 异辛烷反胶束体系同时萃取花生蛋白和花生油，油被直 接萃入有机相，而蛋白质则进入反胶束的极性核中，再通过离心方法将两相分离。油 与有机溶剂用蒸馏方法分离，对含蛋白的反胶束层进行反萃取，可得到未变性的蛋白 质。 1 3 3 3 反胶束萃取用于蛋白质的复性 文酬4 9 】介绍了将单个蛋白质分子置于反胶束中，也能阻止蛋白质变性这种有害 的作用。有研究显示，用a o t 异辛烷反胶束溶液萃取变性的核糖核酸酶，然后将负 载有机相连续与水接触，除去变性剂盐酸胍，再用谷肤甘肽的混合物重新氧化二硫键， 使酶的活性完全恢复，最后由反萃取液回收复性的、完全具有活性的核糖核酸酶，总 收率可以达到5 0 。 1 3 3 4 提取纯化蛋白酶 、“5 0 1 报道了用t o m a a 异辛烷反胶束体系萃取a - 淀粉酶。c o l 【l e n 【5 1 】等首先报道 通过控制离子强度和p h ，用反胶束萃取分离了溶菌