（法医学专业论文）小鼠大鼠限制性体位致呼吸功能障碍的初步研究.pdf

小鼠，大鼠限制性体位致呼吸功能障碍的初步研究中文摘要中文摘要目的：探讨小鼠大鼠限制性体位致呼吸功能障碍及其类型，并初步探讨其发生机制，为法医学实践和临床诊疗工作提供一定实验依据。方法：建立小鼠多种限制性体位，观察小鼠在不同限制性体位下的死亡时间分布，探索合适的限制性体位导致窒息的啮齿类动物模型；复制大鼠限制性体位模型，实验分为对照组( c 组) 、限制体位6 h 组( r 6 h 组) 和限制体位1 2 h 组( r 1 2 h组) ；检测大鼠的血气分析，判断酸碱平衡紊乱变化：应用透射电镜技术和组织病理方法观察肺组织、膈肌的超微结构及组织病理学改变：应用免疫组织化学技术和免疫印迹法检测膈肌i n o s 蛋白表达变化。结果：l 小鼠不同限制性体位的死亡时间分布( 1 ) 四肢和颈部固定、仰卧位：存活2 4 h 以上；( 2 ) 前肢胸前交叉、后肢和颈部固定、仰卧位：1 0 m i n 左右死亡；( 3 )前肢背后交叉、后肢和颈部固定、仰卧位：存活2 4 h 以上；( 4 ) 四肢和颈部固定、胸背部垫高、仰卧位：死亡时间分布于1 2 h - - 6 0 h 之间，平均为3 2 5 5 4 - 1 5 2 3 h ；( 5 )后肢和颈部固定、胸背部垫高、仰卧位及前肢悬挂标准重物：采用前肢悬挂标准重物的方法，保证了限制程度的持续性和一致性。1 ) 在前肢分另l 悬挂1 0 0 9 、1 2 5 9 、1 5 0 9 标准重物时，小鼠( 鼠龄8 1 0 周) 死亡时间分别为2 4 4 7 士5 7 7 h 、2 1 8 + 3 0 7 h 、8 1 6 - a ：3 4 4 h ( 与前两组分别比较，死亡时间明显缩短p 0 0 1 ) ；2 ) 在前肢分别悬挂1 0 0 9 、1 2 5 9 标准重物时，小鼠( 鼠龄5 6 周) 死亡时间分别为1 6 1 8 4 - 6 2 9 h 、1 0 0 8 + 7 1 2 h ；在前肢悬挂1 0 0 9 标准重物时，鼠龄5 - 6 周的小鼠死亡时间主要分布在1 2 h - 2 4 h 之间，死亡率为7 5 2 6 。3 ) 在前肢悬挂1 2 5 9 标准重物时，小鼠( 鼠龄8 1 0 周) 和小鼠( 鼠龄5 6 周) 死亡时间分别为2 1 。8 ：t ：3 0 7 h 、1 0 0 8 4 - 7 。1 2 h ( 与前者比较，死亡时间明显缩短p 0 0 1 ) 。2 大鼠限制性体位的血气分析变化( 1 ) 血液p h 变化：c 组p h 为7 3 6 - 4 - 0 0 2 ，r 6 h 组、r 1 2 h 组p h 分别为7 1 6 士0 0 4 、7 0 6 - 4 - 0 0 7 ，与c 组比较，明显降低( p o 0 1 ) 。r 1 2 h 组p h 比r 6 h 组明显降低( p o 0 5 ) 。( 2 )血液p a c 0 2 变化：c 组p a c 0 2 为5 0 6 7 + 3 9 8 m m h g ，r 6 h 组、r 1 2 h 组p a c 0 2 分别为7 1 5 0 - a ：1 1 4 1 m m h g 、8 8 5 + 8 7 8 m m h g ，与c 组比较，明显升高( 氏0 0 1 ) 。r 1 2 h组p a c 0 2 比r 6 h 组明显升高( p 0 0 5 ) 。( 3 ) 血液p a 0 2 变化：c 组p a 0 2 为9 3 6 7 4 - 8 9 1 m m h g ，r 6 h 组、r 1 2 h 组p a 0 2 分别为9 0 1 7 士8 1 l m m h g 、7 8 2 0 一- 4 0 7 m m h g ，小鼠大鼠限制性体位致呼吸功能障碍的初步研究中文摘要与c 组比较，r 6 h 组p a 0 2 呈降低趋势，与r 6 h 组比较，r 1 2 h 组p a 0 2 明显降低( 尸 0 0 5 ) 。( 4 ) 血液h c 0 3 变化：c 组h c 0 3 为2 8 2 7 4 - 1 5 8 m m o l l ，r 6 h 组、r 1 2 h组h c 0 3 分别为2 5 6 8 + 2 2 8m m o l l 、2 5 7 6 a ：2 1 7 m m o l l ，与c 组比较，明显降低( 尸 o 0 5 ) 。与r 6 h 组比较，r 1 2 h 组h c 0 3 无明显变化( 胗0 0 5 ) 。3 大鼠限制性体位致肺脏、膈肌形态变化( 1 ) 与c 组比较，r 6 h 组、r 1 2 h 组大鼠肺脏的主要组织病变有，局部肺泡腔狭小、肺泡隔增宽，可见炎症细胞浸润；电镜下见肺泡i i型上皮细胞嗜锇板层小体减少，微绒毛脱失，线粒体空泡样改变，呼吸膜增厚；( 2 )与c 组比较，、r 6 h 组、r 1 2 h 组大鼠膈肌主要组织病变有，局部肌纤维排列扭曲、溶解断裂，肌间隙增宽；电镜下肌原纤维断裂，肌间隙增宽，肌丝排列紊乱：线粒体肿胀、增多呈串珠状排列。4 大鼠限制性体位致膈肌i n o s 蛋白表达在本实验条件下，c 组、r 6 h 组、r 1 2 h 组膈肌中均未检出i n o s 蛋白表达。结论：1 通过观察小鼠多种限制性体位引起的死亡时间分布，确立了胸廓活动限制、仰卧位、后肢和颈部固定、前肢悬挂标准重物的强迫体位为啮齿类动物限制性体位窒息的合适模型；2 该限制性体位导致了严重的呼吸功能障碍，在限制性体位早期以呼吸性酸中毒为主合并代谢性酸中毒，随着限制时间的延长，呼吸性酸中毒加重，出现明显低氧血症；限制性体位导致严重的呼吸功能障碍与其引起的肺组织及膈肌损伤有关；3 在本实验条件下，膈肌中未检出i n o s 蛋白表达，可能与限制刺激较弱或限制时间不适有关。关键词：限制性体位呼吸功能障碍死亡时间血气分析超微结构肺脏膈肌i n o si i作者：宋祥和指导老师：谷振勇t h ep r i m a r ys t u d yo nr e s p i r a t o r yd y s f u n c t i o n si n d u c e db yt h er e s t r a i n tp o s i t i o no fm i c eo rr a t sa b s t r a c ta i m ：t oi n v e s t i g a t et h er e s p i r a t o r yd y s f u n c t i o n sa n dt h e i rt y p e si n d u c e db yt h er e s t r a i n tp o s i t i o no fm i c eo rr a t s ，p r e l i m i n a r i l ye l u c i d a t et h em e c h a n i s mu n d e r l y i n gt h er e s p i r a t o r yd y s f u n c t i o n s m e t h o d s ：t h eo b s e r v a t i o no ft h ed e a t ht i m eo fm i c ei nt h ed i f f e r e n tr e s t r a i n tp o s i t i o n sw a su s e df o rt h ee s t a b l i s h m e n to ft h em o u s eo rr a ta s p h y x i am o d e li n d u c e db yt h er e s t r a i n tp o s i t i o n t h em o d e lo fr a t s r e s t r a i n tp o s i t i o nw a se s t a b l i s h e d ；r a t sw e r ed i v i d e di n t oc o n t r o lg r o u p ( cg r o u p ) ，r e s t r a i n tp o s i t i o n6 hg r o u p ( r 6 hg r o u p ) a n dr e s t r a i n tp o s i t i o n12 h ( r l2 hg r o u p ) t h ec h a n g e so fa c i d b a s em e t a b o l i cb a l a n c ew e r em e a s u r e db yb l o o dg a sa n a l y s i s ；t h eu l t r a s t r u c t u r a la l t e r a t i o n so ft h el u n ga n dd i a p h r a g ma n d。t h e i rh i s t o p a t h o l o g i c a lc h a n g e sw e r ee x a m i n e dw i t he l e c t r o nm i c r o s c o p ya n dr o u t i n a lh i s t o l o g i c a lm e t h o d ；i n o sp r o t e i ne x p r e s s i o ni nd i a p h r a g mw a sd e t e c t e dw i t hi m m u n o h i s t o c h e m i s t r yt e c h n i q u ea n dw e s t e r nb l o t t i n g r e s u l t s ：1t h ed e a t ht i m ea tt h ed i f f e r e n tr e s t r a i n tp o s i t i o no fm i c e ( 1 ) l i m b sa n dn e c kw e r ef i x e d ，i ns u p i n ep o s i t i o n ：m i c es t i l ls u r v i v e da f t e r2 4 h ；( 2 ) f o r e l i m b sw e r ec r o s s e di nf r o n to ft h ec h e s t 、析t l lt h eh i n d l i m b sa n dn e c kf i x e da n di nt h es u p i n ep o s i t i o n ：m i c es u r v i v e da b o u t10 m i n ；( 3 ) f o r e l i m b sw e r ec r o s s e db e h i n dt h ec h e s t 、析mh i n d l i m b sa n dn e c kf i x e da n di nt h es u p i n ep o s i t i o n ：m i c es t i l ls u r v i v e da f t e r2 4 h ；( 4 ) l i m b sa n dn e c kw e r ef i x e d 、析mt h o r a c i cm o v e m e n tl i m i t e da n di nt h es u p i n ep o s i t i o n ：t h ed e a t ht i m eo fm i c ew a sd i s t r i b u t e db e t w e e n12 h - 6 0 hw i t l lt h em e a nt i m eo f3 2 5 5 士15 2 3 h ；( 5 ) f o r e l i m b sw e r es u s p e n d e db ys t a n d a r dh e a v yw e i g h ti na d d i t i o nt oh i n d l i m b sa n dn e c kf i x e d ，t h o r a c i cm o v e m e n tl i m i t e da n di nt h es u p i n ep o s i t i o n ：1 ) w h e nf o r e l i m b sw e r es u s p e n d e db yt h es t a n d a r dh e a v yw e i g h to f10 0 9 ，12 5 9a n d15 0 9 ，r e s p e c t i v e l y , t h ed e a t ht i m eo fm i c eo f8 10w e e ka g ew a s2 4 4 7 士5 7 7 h ，2 1 8 + 3 0 7 ha n d8 1 6 a = 3 4 4 hp o 0 1wt h ef o r m e rt w og r o u p s ) ，r e s p e c t i v e l y 2 ) w h e nf o r e l i m b sw e r es u s p e n d e db yt h es t a n d a r dh e a v yw e i g h to flo o ga n d12 5 9i i it h ep r i m a r ys t u d yo nr e s p i r a t o r yd y s f u n c t i o n si n d u c e db yt h er e s t r a i n tp o s i t i o no fm i c eo rr a t sa b s t r a c tr e s p e c t i v e l y , t h ed e a t ht i m eo fm i c eo f5 - 6w e e ka g ew a s16 18 + 6 2 9 ha n d10 0 8 士7 1 2 h w h e nf o r e l i m b sw e r es u s p e n d e db yt h es t a n d a r dh e a v yw e i g h to f10 0 9 ，t h ed e a t ht i m eo fm i c eo f5 - 6 w e e ka g ew a sd i s t r i b u t e db e t w e e n12 h 一2 4 h ，a c c o u n t e df o r7 5 2 6 3 )w h e nf o r e l i m b sw e r es u s p e n d e db yt h es t a n d a r dh e a v yw e i g h to f12 5 9 ，t h ed e a t ht i m eo fm i c eo f8 - 1 0w e e ka g eo r5 - 6w e e ka g ew a s2 1 8 4 - 3 0 7 ha n d1 0 0 8 + 7 1 2 h ( 尸 0 0 1 粥t h ef o r m e r ) ，r e s p e c t i v e l y 2t h ec h a n g e so fa c i d b a s em e t a b o l i cb a l a n c eb yb l o o dg a sa n a l y s i s ( 1 ) c h a n g e so fp hi na r t e r i a lb l o o d ：p hi ncg r o u pw a s7 3 6 a ：0 0 2 ，w h i l ep hi nr 6 h ，r 12 hg r o u p sw a s7 16 + 0 0 4 ，7 0 6 + 0 0 7 ，r e s p e c t i v e l y , w h i c ho fb o t hs i g n i f i c a n t l yd e c r e a s e d ( p 0 0 1v 6 cg r o u p ) ，p hi nr 12 hg r o u ps i g n i f i c a n t l yd e c r e a s e d ( p 0 0 5 粥r 6 hg r o u p ) ( 2 ) c h a n g e so fp a c 0 2i na r t e r i a lb l o o d ：p a c 0 2i ncg r o u pw a s5 0 6 7 士3 9 8 m m h g ，p a c 0 2i nr 6 h ，r 1 2 hg r o u p sw a s7 1 5 0 a = l1 4 1 m m h g ，8 8 5 + 8 7 8m m h g ，r e s p e c t i v e l y , w h i c ho fb o t hs i g n i f i c a n t l yi n c r e a s e d 0 o1 坩cg r o u p ) ，p a c 0 2i nr 12 hs i g n i f i c a n t l yi n c r e a s e d ( p 0 0 5v sr 6 hg r o u p ) ( 3 ) c h a n g e so fp a 0 2i na a e f i a lb l o o d ：p a 0 2i ncg r o u pw a s9 3 6 7 + 8 9 1 m m h g ，p a 0 2i nr 6 h ，r 1 2 hg r o u p sw a s9 0 17 士8 11m m h g ，7 8 2 0 + 4 0 7 m m h g ，r e s p e c t i v e l y p a 0 2i nr 6 hd e c r e a s e d p 0 0 5wcg r o u p ) ，p a 0 2i nr 1 2 hs i g n i f i c a n t l yd e c r e a s e d ( p 0 0 5v sr 6 hg r o u p ) 。( 4 ) c h a n g e so fh c 0 3 。i na r t e r i a lb l o o d ：h c 0 3 。i ncg r o u pw a s2 8 2 7 士1 5 8 m m o l l ，h c 0 3 i nr 6 h ，r 1 2 hg r o u p sw a s2 5 6 8 + 2 2 8 m m o l l ，2 5 7 6 + 2 17 m m o l l ，r e s p e c t i v e l y , a n ds i g n i f i c a n t l yd e c r e a s e d ( p 0 0 5 坩cg r o u p ) t h e r ew a sn os i g n i f i c a n td i f f e r e n c ef o rh c 0 3 b e t w e e nr 6 hg r o u pa n dr 1 2 hg r o u p p 0 0 5 ) 3t h em o r p h o l o g i c a lc h a n g e s ( 1 ) c o m p a r e dw i t hcg r o u p ，t h eh i s t o l o g i c a lc h a n g e so fl u n g si nr 6 ha n dr 12 hg r o u p sw e r ea sf o l l o w e d ，l o c a la l v e o l a rs p a c ew a sn a r r o w , i n t e r a l v e o l a rs e p t u mw a sw i d e n e d 埘t hi n f l a m m a t o r yc e l l si n f i l t r a t i o n ；u n d e rt r a n s m i s s i o ne l e c t r o nm i c r o s c o p e s ，t h e r ew e r ef e wl a m e l l a rb o d y sa n dm i c r o v i l l u si nt y p ei ia l v e o l a rc e l l ，m i t o c h o n d r i aw a sv a c u o l a t e d , r e s p i r a t o r ym e m b r a n ew a st h i c k e n e d ( 2 ) c o m p a r e d 、7 l ，i n lcg r o u p ，t h eh i s t o l o g i c a lc h a n g e so fl u n g si nr 6 ha n dr12 hg r o u p sw e r ea sf o l l o w e d ，l o c a ld i a p h r a g m a t i cm u s c l ef i b e r sw e r ed i s t o r t e da n db r o k e n ，s p a t i u mi n t e r m u s c u l a r ew a sw i d e n e d ；u n d e rt r a n s m i s s i o ne l e c t r o nm i c r o s c o p e s ，m y o f i b r i l sw e r eb r o k e n ，s p a t i u mi n t e r m u s c u l a r ew a sw i d e n e d ，m y o f i l a m e n t sw e r ea r r a n g e di nd i s o r d e r , w i t hm i t o c h o n d r i a ls w o l l e n ，a r r a n g e di nb e a dl i k e 4i n o sp r o t e i ne x p r e s s i o ni nd i a p h r a mi v墅! ! ! ! 垒翌坠竺璺芝! 望垦! 里! 型旦型里塑鱼璺! ! 1 2 翌! ! 璺! 竺! 鲤垒! 坐! 垦! ! ! 翌尘! ! 箜! ! ! ! 翌竺! 坚! ! ! 旦! 垦苎!垒! ! 竺竺!t h e r ew a sl i t t l eo rn ov i s i b l ei n o se x p r e s s i o ni nd i a p h r a g mi nc ，r 6 ho rr 1 2 hg r o u p c o n c l u s i o n s ：1 t h em o u s eo rr a ta s p h y x i am o d e li n d u c e db yt h er e s t r a i n tp o s i t i o nw a se s t a b l i s h e d埘t l lt h et h o r a c i cm o v e m e n tl i m i t e d ，h i n d l i m b sa n dn e c kf i x e d ，f o r e l i m b ss u s p e n d e db ys t a n d a r dh e a v yw e i g h ta n di nt h es u p i n ep o s i t i o n 2 t h er e s t r a i n tp o s i t i o nl e dt or e s p i r a t o r yd y s f u n c t i o nw i t hb o t hr e s p i r a t o r ya n dm e t a b o l i ca c i d o s i s ，e s p e c i a l l ym o r es e v e r er e s p i r a t o r ya c i d o s i s ，t ow h i c ht h ei n j u r i s eo fl u n ga n dd i a p h r a g mc o n t r i b u t e d 3 i nt h i se x p e r i m e n t a lc o n d i t i o n ，t h e r ei sl i t t l eo rn ov i s i b l ei n o se x p r e s s i o ni nt h ed i a p h r a g m ，w h i c hm a yb er e l a t e dt ot h ei n a d e q u a t es t i m u l a t i o no fc o n f i n e m e n to rd u r a t i o no fr e s t r a i n tp o s i t i o n k e yw o r d s ：r e s t r a i n tp o s i t i o nr e s p i r a t o r yd y s f u n c t i o nd e a t ht i m eb l o o dg a sa n a l y s i su l t r a s t r u c t u r el u n gd i a p h r a g mi n d u c i a b l en i t r i co x i d es y n t h a s evw r i t t e nb ys o n g x i a n g h es u p e r v i s e db yg uz h e n y o n g小鼠大鼠限制性体位致竺堕垫丝堕堡堕垫垄型壅茎奎丝三_ _ - - _ - _ - _ _ _ _ _ - _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ - i - _ _ _ - - - - _ _ - - - l _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ - 。- _ _ _ _ _ 一一一。一缩写b a gt e mn on o si n o sn n o se n o si r l英文缩写英文全称b l o o dg a sa n a l y s i st r a n s m i s s i o ne l e c t r o nm i c r o s c o p en i t r i co x i d en i t r i co x i d es y n t h a s ei n d u c i a b l en i t r i co x i d es y n t h a s en e u r o n a ln i t r i co x i d es y n t h a s ee n d o t h e l i a ln i t r i co x i d es y n t h a s ei n s p i r a t o r yr e s i s t i v el o a d i n g中文译名血气分析透射电镜一氧化氮一氧化氮合酶诱导型氧化氮合酶神经型一氧化氮合酶内皮型一氧化氮合酶吸气阻力负荷苏州大学学位论文独创性声明及使用授权声明学位论文独创性声明本人郑重声明：所提交的学位论文是本人在导师的指导下，独立进行研究工作所取得的成果。除文中已经注明引用的内容外；本论文不含其他个人或集体已经发表或撰写过的研究成果，也不含为获得苏州大学或其它教育机构的学位证书而使用过的材料。对本文的研究作出重要贡献的个人和集体，均已在文中以明确方式标明。本人承担本声明的法律责任。研究生签名：窒叠垫日期：之墨：! ：兰学位论文使用授权声明苏州大学、中国科学技术信息研究所、国家图书馆、清华大学论文合作部、中国社科院文献信息情报中心有权保留本人所送交学位论文的复印件和电子文档，可以采用影印、缩印或其他复制手段保存论文。本人电子文档的内容和纸质论文的内容相一致。除在保密期内的保密论文外，允许论文被查阅和借阅，可以公布( 包括刊登) 论文的全部或部分内容。论文的公布( 包括刊登) 授权苏州大学学位办办理。研究生签名导师签名期：兰翌2 ：! 二期：坐小鼠大鼠限制性体位致呼吸功能障碍的初步研究前言i 上j l -刖吾在法医学实践和临床诊疗过程中，限制性体位引起机体生命器官功能障碍乃至死亡的案例时有发生。限制性体位形式多样，常见的体位有捆绑双上肢悬挂或双下肢倒挂【l , 2 1 、捆绑胸腹部水平悬挂或保险带悬吊【3 - 4 1 、四肢反绑( 或反扣) 俯卧位【5 一、机体卷曲被限制在狭小空间【7 8 1 和头颈部过度屈曲或伸长【9 1 0 】等。限制性体位一般发生于如下情况【1 1 】：( 1 ) 在抓捕和审讯过程中，执法人员针对犯罪嫌疑人的暴力行为而对其采取限制性体位；( 2 ) 运送躁狂、不配合治疗病人至医院过程中，因治疗需要、因特殊外科手术如高位骨盆和下腹部手术需要以及精神病患者急性发作时而对其采取限制性体位；( 3 ) 日常生活意外事件如翻墙、登山运动、跳伞运动造成的限制性体位而无力摆脱时。目前认为，限制性体位所致的死亡多为意外性死亡，自杀或他杀少见。然而，限制体位发生时往往伴有外伤、中毒、药物滥用、醉酒等其它因素的存在。此时，限制性体位所致死亡的方式往往难以判断。目前，限制性体位死亡机制尚未完全阐明，可能涉及呼吸功能障碍、循环功能障碍以及应激反应等。近年来，国内外法医学者进行了一些研究，认为限制性体位致死可能是由呼吸功能障碍而导致的窒息死。研究表明，呼吸动力异常在限制体位致呼吸功能障碍中发挥着重要的作用。正常的呼吸运动取决于三个环节：呼吸道通畅、发生气体交换的肺以及推动外界环境和肺之间的气体的“通气装置 。后者取决于胸廓、横膈、腹壁以及其他呼吸辅助肌的协同运动。三个因素中的任何一个障碍即可发生呼吸衰竭。其中，呼吸肌是呼吸运动的原动力。呼吸肌主要包括膈肌和肋间肌，其中，膈肌作为最主要的呼吸肌，在呼吸过程中，其收缩所产生的通气量约占静息通气量6 0 8 0 【1 2 】，作为机体的通气泵，它实际上与循环泵心脏一样重要，因此，对于维持机体正常的呼吸功能具有重要的作用。限制性体位过程中呼吸动力异常特别是呼吸肌功能障碍的发生机制尚不是很清楚，已经成为研究的热点。业已证实，氧化应激可能是呼吸肌疲劳、呼吸肌功能障碍发生的关键因素之一。一氧化氮( n i t r i co x i d e , n o ) 是一种新颖的气体分子，自上世纪八十年代被发现以来，在多种生理状态和病理生理过程中发挥着重要的作用。n o 在骨骼肌中不断地产生，在静息状态下n o 的生成量比较低，在骨骼肌收缩过程中则生成量较高。小鼠大鼠限制性体位致呼吸功能障碍的初步研究前言研究表明，n o 对包括膈肌在内的所有骨骼肌的收缩和舒张具有明显的调节作用。n o 是一种含不成对电子的气体，化学性质十分活泼，易被氧化为n 0 2 和n 0 3 。，生物半衰期仅3 5 s ，n o 是在一氧化氮合酶( n i t r i co x i d es y n t h a s e , n o s ) 作用下合成的，n o s 催化l 一精氨酸( l a r g ) 和氧气反应，生成n o 和副产物瓜氨酸。n o s 同功酶存在三种形式。在正常膈肌中，膈肌组织组成性地表达神经型n o s ( n e u r o n a ln i t r i co x i d es y n t h a s e ，n n o s ) 和内皮型n o s ( e n d o t h e l i a ln i t r i co x i d es y n t h a s e ，e n o s ) ，前者主要分布于快肌的肌纤维膜上，后者主要分布于线粒体附近及血管内皮上，它们催化合成的n o 参与膈肌的许多生理过程，如抑制肌浆网中c a 2 + 释放、促进葡萄糖吸收、增加局部血流量、抑制线粒体呼吸等f 1 3 州1 。n n o s 和e n o s 的激活是c a 2 + 依赖性的【1 6 】。在静息状态下，膈肌产生低浓度的n o 以维持收缩力，但在病理状态如内毒素血症、败血症或细菌血症下，大量产生的n o 可以损害膈肌的收缩功能和破坏肌细胞膜的完整性，这与炎症刺激下，i n o s 呈诱导性表达上调有关【1 。卜1 9 1 ；不过，i n o s 催化合成的n o 不是由c a 2 + 调节的，可能是由底物量的大小来调节的；因此，i n o s 催化合成的n o l p , 其他两种同功酶催化合成的速率更高，这也就放大了n o 对细胞的作用，因而可能导致氧化应激或亚硝化应激【l6 1 。研究表明，在阻力负荷状态下，膈肌为克服阻力负荷而代偿性运动增强，其中的n o s 的表达也呈现相应的变化。f 吗i i 等【2 0 j 研究发现在吸气阻力负荷实验3 h 后，未发现膈肌中n n o s 和e n o s蛋白的表达，分析可能与阻力负荷的程度和时间不够有关。在随后研究中发现在吸气阻力负荷( 负荷是f u j i i 实验中的3 倍多) 实验6 h 后，膈肌中n o s 蛋白明显表达，其中以n n o s 和i n o s 表达明显且呈时间依赖性【2 l 】。那么，在机体限制性体位过程中膈肌i n o s 蛋白表达、酶活性以及n o 生成变化规律，迄今尚不清楚。有关n o 在限制性体位致膈肌收缩功能障碍中的作用，也未见报道。综上所述，本实验通过建立小鼠多种限制体位，观察小鼠在不同限制体位下的死亡时间分布，探索合适的限制性体位导致窒息的啮齿类动物模型；复制大鼠限制性体位模型，检测大鼠的血气分析，判断酸碱平衡紊乱变化；应用透射电镜技术和组织病理方法观察肺组织、膈肌超微结构及组织病理学改变；应用免疫组织化学技术和蛋白印迹方法检测膈肌中i n o s 蛋白表达变化，以探讨限制性体位致呼吸功能障碍及其类型，并初步探讨其发生机制以及i n o s 在限制性体位致呼吸功能障碍中的可能作用，为法医学实践和临床诊疗工作提供一定实验依据。2小鼠大鼠限制性体位致呼吸功能障碍的初步研究材料与方法1 1 仪器设备与器材材料与方法1 实验材料s z - 9 3 自动双重纯水蒸馏器上海亚荣生化仪器厂d k 6 0 0 型电热恒温水槽上海精宏实验设备有限公司b m j i i i 型包埋机常州市中威电子仪器有限公司r m 2 1 3 5 型石蜡切片机德国l e i c a 公司q p b l 型切片漂烘温控仪安徽电子科学研究所d h g - 9 1 2 a 型电热恒温鼓风干燥箱上海精宏实验设备有限公司b c d - 2 0 0 n i s 型冰箱苏州三星电子c x 3 1 显微镜日本o l y m p u sa l l 0 4 型电子天平梅特勒托利多仪器( 上海) 有限公司r a p i d l a p 8 6 5 血气分析仪德国b a y e r 公司l k b 8 8 0 0 1 1 1 型超薄切片机瑞典l k b 公司h - 6 0 0 透射电镜日本日立公司超低温冰箱美国r e v c o 公司j y 8 8 i i 超声波细胞粉碎机宁波新芝生物科技股份有限公司7 5 2 n 型紫外可见分光光度计上海精密科学仪器有限公司t s - 8 型转移脱色摇床海门市其林贝尔仪器制造有限公司t g l - 1 6 g 台式高速离心机无锡市瑞江分析仪器有限公司x w 8 0 a 漩涡混合器上海医大仪器厂9 5 - l 磁力搅拌器上海安亭电子仪器厂d y c z 2 4 e n 型垂直板电泳仪北京市六一仪器厂d y y - 7 c 型电泳仪北京市六一仪器厂d y c z - 4 0 b 型电泳槽北京市六一仪器厂x o 煳0 0 0 型x 光自动洗片机美国k o d a k 公司自制固定板、铁钉、止血钳、细线、标准重物、垫物( 木块) 。3小鼠大鼠限制性体位致呼吸功能障碍的初步研究材料与方法1 2 药品及试剂i n o s 兔多克隆抗体( l o t # h 0 3 0 7 )h r p 标记的山羊抗兔i g g ( l o t # h 0 813 2 7 )e c l 显色剂( l o t # 4 7 )b c a 蛋白分析试剂盒( l o t # e f 6 0 9 7 5 )d a b 酶底物显色试剂盒s p - 9 0 0 0 免疫组化染色试剂盒彩色预染蛋白分子量标准；k o d a k x - o m a t b tf i l m ( l o t # 0 38 3 218 0 4 )p v d f 膜多聚赖氨酸枸橼酸盐缓冲液( z l i - 9 0 6 5 )肝素钠注射液( 批号：0 8 0 4 4 0 4 )其它试剂均为国产分析纯。1 3 实验动物s a n t ac r u zb i o t e c h n o l o g yb i o w o r l dt e c h n o l o g ya m e r s h a mb i o s c i e n c e sp i e r c e上海西唐生物科技有限公司北京中杉金桥生物技术有限公司碧云天生物技术研究所k o d a k美国m i l l i p o m 公司北京中杉金桥生物技术有限公司北京中杉金桥生物技术有限公司江苏万邦生化医药股份有限公司健康k m 小鼠1 4 0 只，雌雄不拘，鼠龄5 “周，体质量2 8 - 3 2 9 ；健康k m 小鼠2 0 只，雌雄不拘，鼠龄8 - 1 0 周，体质量3 8 - - 4 2 9 ；健康雄性s p r a g u e d a w l e y ( s d )大鼠2 4 只，体质量1 8 0 2 0 0 9 ，清洁级。由苏州大学实验动物中心提供( 实验动物生产许可证x c y k ( 苏) ：n o2 0 0 2 - - 0 0 0 8 ，实验动物使用许可证s y x k ( 苏) ：n o2 0 0 2 - - 0 0 3 7 ) ，标准环境下饲养。2 1 d x 鼠实验部分2 实验方法小鼠限制性体位模型的体位探索( 1 ) 仰卧位、四肢和颈部固定( 2 ) 仰卧位、前肢胸前交叉、后肢和颈部固定( 3 ) 仰卧位、前肢背后交叉、后肢和颈部固定( 4 ) 仰卧位、胸背部垫高、四肢和颈部固定4小鼠大鼠限制性体位致呼吸功能障碍的初步研究材料与方法( 5 ) 仰卧位、胸廓活动限制、后肢和颈部固定、前肢悬挂标准重物2 1 1 小鼠的一般表现观察小鼠在自由体位和限制性体位过程中呼吸变化如频率、幅度、节律，口唇颜色变化，反应表现等。2 1 2 小鼠在限制体位下的死亡时间分布观察小鼠在双前肢不同的限制程度以及不同鼠龄下的死亡时间分布。2 1 3 小鼠的肺脏和膈肌组织病理学改变在小鼠限制性体位致死后，提取右肺中叶组织小块和肋嗝肌组织小块，1 0 中性福尔马林固定4 8 h 后，常规制作石蜡切片，h e 染色后，光镜下观察。具体操作程序如下：( 1 ) 固定( 1 0 中性福尔马林溶液) 4 8 h ；( 2 ) 脱水( 9 5 酒精i1 5 h - - * 9 5 酒精i i1 5 h - - ，1 0 0 酒精il h - - * 1 0 0 酒精i i l h ) ；( 3 ) 透明( 氯仿0 5 h ，二甲苯0 5 h ) ；( 4 ) 浸蜡( 6 7 ，1 h ) ；( 5 ) 包埋；( 6 ) 切片( 4 1 x m ) ；( 7 ) 烤片( 6 7 。c ，1 2 h ) ，备用。苏木素一伊红( h e 染色)( 1 ) 切片脱蜡至水二甲苯i1 0 m i n - 二甲苯i i1 0 m i n - 1 0 0 酒精2 r a i n 一9 5 的酒精l m i n - - * 8 0 酒精l m i n _ 7 5 酒精l m i n _ 蒸馏水洗l m i n ；( 2 ) 苏木素染色5 m i n ，自来水冲洗3 0 m i r a( 3 ) 1 盐酸酒精分化2 0 s ；( 4 ) 自来水冲洗3 0 m i r a( 5 ) 置伊红染液l m i m( 6 ) 常规脱水，透明，封片：9 5 酒精il m i n _ 9 5 酒精i il m i n 一1 0 0 酒精il m i n _ 1 0 0 酒精i il m i n 一二甲苯3 2 m i n - 中性树胶封片。( 7 ) 光镜观察。2 2 大鼠实验部分大鼠限制性体位模型及实验分组实验前1 2 h 禁食、自由饮水。大鼠称重后，用4 水合氯醛( 3 5 m g k gb w ) 腹5小鼠大鼠限制性体位致呼吸功能障碍的初步研究材料与方法腔注射麻醉，复制大鼠胸廓活动限制( 胸背部木块垫高，木块的高度和宽度均为4 0 c m ) 、仰卧位、后肢和颈部固定、前肢悬挂标准重物的强迫体位模型。实验随机分为对照组( c ) 、限制体位6 h 组( r 6 h ) 和限制体位1 2 h 组( r 1 2 h ) ，每组8 只动物。对照组大鼠自由活动，同时禁食、禁水；限制体位组大鼠予以胸廓活动限制、仰卧位、后肢和颈部固定、前肢悬挂标准重物复制强迫体位。脓毒血症动物模型：参照文献【2 2 】，实验前1 2 h 大鼠禁食，自由饮水。4 水合氯醛( 3 5 m g k g ) 腹腔注射麻醉、固定，行盲肠结扎穿孔术( c e c a ll i g a t i o na n dp u n c t u r e ，c l p ) 复制脓毒血症模型。2 4 h 后断头处死，提取膈肌组织。2 2 1 大鼠的一般表现观察大鼠自由体位和限制体位过程中呼吸变化如频率、幅度、节律，口唇颜色变化，反应表现等。2 2 2 血气分析动物模型建立后，在预定时间将大鼠用4 水合氯醛( 3 5 m g k gb w ) 腹腔注射麻醉、固定，由剑突下至耻骨联合纵行切口，将腹腔内容物向右侧推开，充分暴露腹主动脉。5 m l 一次性注射器套上7 号注射针头，抽吸1 25 0 0 u 2 m l 肝素钠注射液l m l ，将针头朝上，缓慢回抽注射器内芯至2 m l 处，然后排出肝素钠，使肝素钠浸润注射器内壁并充满注射针头孔腔。腹主动脉抽取动脉血2 m l ，即刻针头插入胶塞封闭，转动注射器，血液与肝素钠混匀，立即用血气分析仪检测。2 2 3 肺脏及膈肌的超微结构观察在预定时间将大鼠处死后，迅速剖开胸腹腔提取肺脏及肋膈肌，经4 c 生理盐水冲洗干净后，分别切取5 块l m m 3 大小右肺中叶组织块和5 块l m m x2 m m 大小按肌纤维走行方向的膈肌组织条，迅速置入4 戊二醛中固定3 h 以上，4 保存，固定后预冷p b s 充分漂洗，1 锇酸后固定l h ，p b s 充分漂洗，逐级丙酮脱水，e p o n8 1 2 环氧树脂浸透包埋，l k b 8 8 0 0 i i i 型切片机做超薄切片，厚度为5 0 n m ，枸橼酸铅