（分析化学专业论文）生物金属化增强电化学免疫传感器信号的研究.pdf

摘要 对蛋白质的检测在生命科学领域具有重要的意义。目前，已经有 一些重要的对蛋白质的检测方法，比如放射免疫分析，酶联免疫分析 等。但是，随着生命科学的发展，这些方法的缺点已经越来越明显，这 使得这些方法的应用受到了一定的l ；f f ：带r j ，尤其是在一些高灵度检测的 领域比如对疾病的早期诊断方面。所以，很有必要建立一些具有高灵 敏度、易操作和有通用性的蛋白质检测方法。显然，对免疫传感器的 信号进行增强会大大改善它的灵敏度。电化学装置因为具有简单、灵 敏和易于微型化的优点，正越来越受到人们的关注。毫无疑问，对电 化学免疫传感器进行信号增强技术研究会加快免疫分析的进步。本研 究在增强免疫电化学传感的信号方面做了以下三个方面的工作： 第一部分：提出了一种基于适配体识别和生物催化金属沉积的电 化学免疫传感对血小板源生长因子b b ( p d g f - b b ) 进行高灵敏检测。在 本方法中，首先把固定抗体固定到电极的表面，接着，依次把抗原和 生物素标记的适配体溶液滴加到电极表面进行反应以形成免疫复合 物。然后，通过生物素和亲合素的特异性反应，把亲合素标记的碱性 磷酸酶固定到电极表面。碱性磷酸酶可以催化抗坏血酸磷酸酯镁 ( a a p ) 水解成抗坏血酸，后者把溶液中的银离子还原成金属单质沉 积到电极的表面。最后用线性扫描伏安法对电极表面沉积的金属银进 行测量。基于生物金属化的高灵敏度，本方法在对p d g f - b b 的检测中， 在l 至l j l o o o n g m l 的范围保持很好的线性关系，检测下限为0 8 n g m l 。 第二部分：提出了一种基于功能化的硅纳米粒子的免疫传感器对 前列腺特异性抗原( p s a ) 进行检测。在这种方法中，第一次提出了同 时修饰上了检测抗体和碱性磷酸酶两种物质的硅纳米粒子用于对p s a 电化学免疫检测。当固定抗体通过一层自组装单分子膜被连接到电 极的表面上以后，接着通过一个免疫夹心反应把碱性磷酸酶固定到 电极的表面。当a l p 酶催化从一p 水解生成抗坏血酸以后，银离子在 电极的表面被还原。最后，在电极表面沉积的金属银的量与被固定到 电极表面的抗原的量成一定的比例关系。因为本方法中用s in p s 来 作为酶的载体，可以极大的提高检测的灵敏度，电化学峰电流和抗原 浓度在l 到3 5 n g m l 范围内保持良好线性关系，检测下限为 0 7 6 n g m l 。 ：- 第三部分：提出了一种基于脂质体包埋碱性磷酸酶和生物催化金 属沉积的超灵敏免疫传感器。为了对这种提出来的免疫分析方法的可 行性进行检测，采用免疫夹心反应的原理对p s a 这目标检测物进行了 检测。当固定抗体、抗原和检测抗体修饰的脂质体在电极的表面形 成免疫夹心复合物以后，向电极的表面滴加表面活性剂，使脂质体破 裂释放出所包含的碱性磷酸酶，接着利用碱性磷酸酶的催化特性引 发电极表面的银沉积反应，以在电极表面形成一层银纳米粒子。脂 质体用做酶的载体结合酶的高催化活性成功的提高了免疫分析方法 的灵敏度。该方法在对人体p s a 进行检测时，在0 0 1 到1 0 0 0 n g m l 的范围内都保持了较好的线性，最低检测下限可以达到0 0 0 7 n g m l 。 关键词：电化学免疫分析法：适配体：血小板源生长因子b b ： 硅纳米粒子：银沉积：脂质体：前列腺特异性抗原： 生物催化沉积 n a b s t r a c t t h ei m m u n o a s s a yf o rt h ed e t e c t i o no fp r o t e i np l a y sav e r yi m p o r t a n tr o l ei nl i f e s c i e n c e s a tp r e s e n t ，d e t e c t i o nm e t h o d ss u c ha sr i a ，e l i s a ，w e s t e r nb l o tp l a y i m p o r t a n tr o l e si np r o t e i nd e t e c t i o n b u t ，w i t ht h ed e v e l o p m e n to ft h el i f es c i e n c e s ， t h ed i s a d v a n t a g eo ft h er o u t i n em e t h o d sh a sa l r e a d yb e e nr e v e a l e dw h i c hm a d et h e m l i m i t e di ns o m ef i e l d sr e q u i r i n gh i 曲s e n s i t i v i t ys u c ha se a r l yd i a g n o s i s o fd i s e a s e s t h e n ，i ti sv e r yn e c e s s a r yt os t u d yt h en e wa n a l y s i sm e t h o d so fh i g hs e n s i t i v i t y , s i m p l eo p e r a t i o n a n du n i v e r s a l a p p l i c a b i l i t y o b v i o u s l y , t h e e n h a n c e m e n to f i m m u n o a s s a ys i g n a li sv e r yi m p o r t a n tt oi m p r o v et h es e n s i t i v i t yo fi m m u n o s e n s o r e l e c t r o c h e m i c a la p p a r a t u sg a i nm o r ea n dm o r ea t t e n t i o nb e c a u s et h e yw e r es i m p l e ， s e n s i t i v ea n de a s yt ob em i n i s i z e d s oi ti su n d o u b t e dt h a t t h es t u d yo fn e w e l e c t r o c h e m i c a l i m m u n o a s s a y w i t h s i g n a l e n h a n c e m e n tc a l la c c e l e r a t et h e d e v e l o p m e n to fi m m u n o a s s a y t h e r e f o r e ，t h i sr e s e a r c hf o c u s e so nt h ee n h a n c e m e n to f t h es i g n a lo fe l e c t r o c h e m i c a li m m t m o a s s a y t h i sr e s e a r c hc o n s i s t so ft h r e ef o l l o w i n g p a r t s ： i nt h ef i r s tp a r t ，an o v e le l e c t r o s e n s o rb a s e do na p t a m e rr e c o g n i z a t i o na n d b i o c a t a l y t i c m e t a l d e p o s i t i o n w e r e p r o p o s e d f o rt h es e n s i t i v ed e t e c t i o no f p l a t e l e t d e r i v e dg r o w t hf a c t o rb b ( p d g f b b ) i nt h i sm e t h o d ，t h ec a p t u r ea n t i b o d y w a si m m o b i l i z e do n t ot h ee l e c t r o d ef i r s t ，t h e n ，a n t i g e na n db i o t i n y l a t e da p t a m e rw e r e d r o p p e do n t ot h ee l e c t r o d et of o r ms a n d w i c hi m m u n o c o m p l e x f o l l o w i n gw i t ha a v i d i n b i o t i nr e a c t i o n ，a l pw h i c hc a ni n i t i a t et h eh y d r o l y s i so fa s c o r b i c a c i d 2 - p h o s p h a t e ( a a - p ) t op r o d u c ea s c o r b i ca c i dw a s i m m o b i l i z e do n t ot h eg o l de l e c t r o d e t h el a t e r ，i nt u r n ，r e d u c e ss i l v e ri o n so nt h ee l e c t r o d es u r f a c e ，l e a d i n gt od e p o s i t i o no f t h em e t a lo n t ot h ep r o t e i nm o d i f i e de l e c t r o d es u r f a c e t h ed e p o s i t e ds i l v e rm e t a lw a s d e t e c t e db yl i n e a rs w e e pv o l t a m m e t r y ( l s v ) b a s e do nt h eh i 曲s e n s i t i v i t yo f b i o c a t a l y t i cm e t a ld e p o s i t i o n ，t h i sm e t h o d s h o w e dag o o dl i n e a r i t yw i c h t h e c o n c e n t r a t i o no fp d g fi nt h er a n g eo f1t o10 0 0n g m lw i t had e t e c t i o nl i m i to f 0 8 n g m l i nt h es e c o n dp a r t ，a ne l e c t r o c h e m i c a li m m u n a s e n s o rh a sb e e nd e v e l o p e db a s e d o nf u n c t i o n l i z e ds in a n o p a r t i c l e s ( s in p s ) f o rt h ed e t e c t i o no fp r o s t a t es p e c i f i c i t y a n t i g e n ( p s a ) i nt h i sm e t h o d ，s in p sf u n c t i o n l i z e dw i t hd e t e c t i o na n t i b o d ya n d a l k a l i n ep h o s p h a t a s e ( a l p ) w e r ef o rt h ef i r s tt i m eb e e ns y n t h e s i z e da n du s e di n e l e c t r o i m m u n o a s s a yf o rt h ed e t e c t i o no fp d g f - b b t h ec a p t u r ea n t i b o d yw a sf i r s t i m m o b i l i z e do n t oag o l de l e c t r o d ev i aas e l f - a s s e m b l e dl a y e r t h e n ，a l pw a sb o u n d t ot h ee l e c t r o d et h r o u g has a n d w i c hi m m u n o r e a c t i o n f o l l o w i n gw i t ht h ec a t a l y t i c h y d r o l y s i so fa a - pc o n d u c e db ya l p ，s l i v e ri o n sw a sr e d u c e da n dd e p o s i t e do nt h e e l e c t r o d e t h ea m o u n to fs i l v e rd e p o s i t e do nt h ee l e c t r o d ew a sp r o p o r t i o n a lt ot h e a m o u n to fa n t i g e nc a p t u r e do nt h ee l e c t r o d e f o rh i sm e t h o du s e ds in p sa se n z y m e c a r r i e rc a l le n h a n c e dt h es e n s i t i v i t yo ft h ei m m u n o s e n s o rd r a m a t i c a l l y ，al i n e a r r e l a t i o n s h i pb e t w e e na n t i g e na n dp e a kc u r r e n tw a so b t a i n e di nt h er a n g eo f1t o3 5 n g m lw i t had e t e c t i o nl i m i to f0 7 6 n g m l i nt h et h i r dp a r t ，a nu l t r a s e n s i t i v ei m m u n o s e n s o rb a s e do ne n z y m e e n c a p s u l a t i n g l i p o s o m ea n db i o c a t a l y t i cm e t a ld e p o s i t i o nf o rt h ed e t e c t i o no fp s a w a sd e s c r i b e d t h ef e a s i b i l i t yo ft h ep r o p o s e di m m u n o a s s a ym e t h o dw a si n v e s t i g a t e du s i n ga s a n d w i c hi m m u n o a s s a yf o r m a tw i t hh u m a np s aa st h ea n a l y t e d e t e c t i o na n t i b o d y , a n t i g e n a n dd e t e c t i o na n t i b o d ym o d i f i e dl i p o s o m ew e r ed r o p p e do n t ot h eg o l d e l e c t r o d ei nt u r nt of o r mi m m u n o c o m p l e x t h e n ，b o u n dl i p o s o m e sw e r el y s e dw i t h s u r f a c t a n tt or e l e a s et h ee n c a p s u l a t e da l pw h i c hw a su s e dt oi n i t i a t et h ed e p o s i t i o no f s i l v e rn a n o p a r t i c l e so nt h ee l e c t r o d e t h eu t i l i z a t i o no ft h el i p o s o m ea se n z y m ec a r r i e r a n dh i 曲c a t a l y s i sa c t i v i t yo fe n z y m ee n h a n c e dt h es e n s i t i v i t yi ni m m u n o a s s a y t h i s m e t h o ds h o w e da g o o dl i n e a r i t yw i t ht h ec o n c e n t r a t i o n so fp d g f i nt h er a n g eo f0 01 i v t ol0 0n g m lw i t had e t e c t i o nl i m i to fo 0 0 7 n g m l k e y w o r d s ：e l e c t r o c h e m i c a li m m u n o a s s a y ；a p t a m e r ；p d g f - b b ；s in a n o p a r t i c l e ； s i l v e rd e p o s i t o n ；l i p o s o m e ；p s a ；b i o c a t a l y t i cd e p o s i t i o n v 附录2 湖南师范大学学位论文原创性声明 本人郑重声明：所呈交的学位论文，是本人在导师的指导下，独 立进行研究工作所取得的成果。除文中已经注明引用的内容外，本论 文不含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的作品成果。对本文的 研究做出重要贡献的个人和集体，均已在文中以明确方式标明。本人 完全意识到本声明的法律结果由本人承担。 学位论文作者签名：( 钠针乏嫡睁6 月午日 湖南师范大学学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定， 研究生在校攻读学位期间论文工作的知识产权单位属湖南师范大学 同意学校保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版， 允许论文被查阅和借阅。本人授权湖南师范大学可以将本学位论文的 全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫 描等复制手段保存和汇编本学位论文。 本学位论文属于 ， 1 、保密口，在年解密后适用本授权书。 2 、不保密回。 ( 请在以上相应方框内打“ ) 作者签名：i 胡纠殳日期：厶坼移月4 日 钟擀：趁傻蝴：硝月6 日 生物金属化增强电化学免疫传感器信号的研究 第一章绪论 1 1 引言 蛋白质( p r o t e i n ) 是由氨基酸组成的一类生物大分子，它与核酸等 其它生物大分子共同构成生命的物质基础蛋白质是生命活动的主要 承担者，一切生命活动都与蛋白质有关。新陈代谢是生命的主要特征， 而构成新陈代谢的所有化学变化都是在酶的催化之下完成的，酶的化 学本质都是蛋白质。生物体的各种活动如生长、运动、呼吸、免疫、 消化、光合作用，以及对外界环境变化的感知和所做出的必要反应等， 都必须依靠蛋白质来实现。虽然遗传信息的携带是核酸，但遗传信息 的传递和表达需要有酶的催化，受到各种蛋白质的调节控制，并通过 编码蛋白质来实现。生物体内蛋白质的种类繁多，单细胞的大肠杆菌 就含有3 0 0 0 种。人体结构复杂，含蛋白质种类多达1 0 万种，占人体干 重的4 5 ，各种蛋白质都有其特定的结构和功能【l 】。所以，蛋白质的 分析一直是生命科学中的重要课题。生命科学和化学在相互渗透及彼 此促进的发展进程中不断的向分析化学提出更高的挑战。在生命科学 和化学的研究中，不仅需要了解各种类型的蛋白质结构和性能关系、 蛋白质的存在状态及其与小分子的相互作用，而且还必须可以检测生 物样品中微量，甚至极微含量的蛋白质。蛋白质的定量测定是研究蛋 白质的基础，对蛋白质结构和功能研究、人体营养健康研究、疾病诊 断、药物和食品及临床分析都具有非常重要的意义【2 1 。然而，由于蛋 白质具有分子量大、结构复杂和种类繁多等特点，决定了蛋白质分析 的特殊性。目前，蛋白质检测方法主要有：分光光度法、荧光光度法、 光散射法及化学发光法等。但随着人类基因组计划的基本完成，蛋白 质组研究的计划已经启动，蛋白质检测己从简单的分析测定，转变为 集成化的蛋白质微量化学表征中的关键步骤，己有的蛋白质检测技术 硕十学位论文 已不能满足其需求，因此，研究普遍适用性好、操作简便、灵敏度高 的蛋白质检测技术的具有重要的意义【3 4 】。 抗体分子作为一种特殊的蛋白质，是有机体在外来蛋白的刺激下 产生的，并可与外来蛋白特异性结合，广泛的存在于人的免疫系统中， 对生命活动尤其是在疾病控制中起着举足轻重的作用。因此免疫分析 也是生命科学中的前沿课题，免疫分析在生物化学、分子生物学、生 物技术和临床诊断等各领域具有很大的发展潜力。免疫分析主要是基 于免疫反应的高度特异性，即抗体对抗原的特异性识别，以及抗体抗 原相互结合的高度稳定性的基础上发展起来的。目前已有的分析方法 如放射性免疫分析法，酶联免疫分析法及质谱免疫分析法等，但这些 分析方法都存在一些不足之处，需要寻求一种操作简单，灵敏度高而 且价格比较便宜，适用性强的分析方法。 1 2 免疫分析方法基础 1 2 1 免疫分析基础 ： 免疫分析( i m m u n o a s s a y ) 是指利用抗原( a n t i g e n ，a g ) 与抗体 ( a n t i b o d y ，a b ) 之间高特异性的反应( 即免疫反应) 实现对抗体、抗 原或相关物质进行检测的分析方法。免疫分析在临床化学分析中占有 极其重要的地位，有着广泛的应用，免疫分析的主要特点是高特异性、 高灵敏度，能够检测大多数临床上有意义的物质。由于免疫分析的高 特异性，因而能用于复杂样品如尿液、血液等的分析，且操作简单，所 以，免疫分析技术在临床实验室和化学分析实验室收受到极大重视。 在免疫测定中，抗原是能在机体中引起特异性免疫应答的物质。 抗原具有免疫原性和抗原性两种特性。免疫原性是指能引起免疫应答 的性质，而抗原性是指与抗体反应的性质，两者并不一致。抗原进入 机体后，可刺激机体产生抗体和引起细胞免疫。能在机体中引起抗体 产生的抗原多为分子量大于5 0 0 0 的蛋白质，例如乙型肝炎病毒表面抗 生物金属化增强电化学免疫传感器信号的研究 原( h b s a g ) ，甲胎蛋白( a f p ) 等。小分子化合物在与大分子蛋白质 结合后z 日匕v - , 引起机体产生特异性抗体的，称为半抗原( h a p t e n ) ，例如 某些激素、药物等。抗原的反应性取决于抗原决定簇( a n t i g e n i c d e t e r m i n a n t ) ，或称为表位( e p i t o p e ) ，一个抗原分子可带有不同 的决定簇。 抗体是有机体在抗原刺激作用下由淋巴细胞合成的一类能与该 抗原发生特异性球蛋白，世界卫生组织和国际免疫学联合会先后决 定，将具有抗体活性以及与抗体相关的一类球蛋白，通称为免疫球蛋 白( i m m u n o g l o b u l i n ，i g ) ，所有的抗体都是i g 。i g 分五类，艮1 i g g 、i g a 、 i g m 、i g d $ 1 l g e 。与免疫测定有关的i g 主要为i g g 和i g m 。抗体主要分 布在体内血清中。 以免疫球蛋白g 为例对抗体基本结构说明如下：它的分子由两个 轻链( l ) 和两个重链( h ) 构成的对称四肽链。x 射线晶体结构分析 发现，i g g 分子由三个相同大小的节段组成，位于上端( n 端) 的两 个臂，各含一条轻链和一条重链的1 2 ，由易弯曲的铰链区连接到主 干上( 两条重链的各1 2 ) ，形成一个“y 形分子，称为i g 分子的单 体，是构成i g 分子的基本单位。在二条h 链间、h 链和l 链间、以及四 条肽链内部都有二硫键相连，形成多个球形结构，构成不同的功能区。 每个i g 分子含有两个抗原结合部位，只与相应的抗原决定簇匹配，发 生特异性结合，是抗体专一性结合抗原的结构基础。 抗原抗体反应实质上是抗原决定簇与抗体结合部位的结合，且 只局限于大分子的表面特定部位，其间并无共价键形成，只是由氢键、 范德华力、静电作用力和疏水作用力等相互作用结合在一起。分子结 构上的互补性，决定了反应的特异性。抗原抗体反应的这种特异性使 免疫测定能在非常复杂的蛋白质化合物( 例如血清) 中测定某一特定 的物质，而不需先分离待检物。 硕十学位论文 免疫分析，是基于抗原对其抗体进行免疫结合进行的分析【5 】。基 于抗原抗体反应的特异性和敏感性，免疫测定的应用范围遍及生化测 定及医学检验的各个领域。任何物质只要能获得相应的特异性抗体， 即可用免疫测定进行检测。可测定的对象包括：具有免疫活性的免疫 球蛋白、补体、细胞因子等【6 ，7 1 。 1 2 2 免疫分析法的分类 ，根据是否有标记物的引入，免疫分析法可分为非标记免疫分析法 ( 又称n o n 1 a b e l l e di m m u n o a s s a y ) 和标记免疫分析法。免疫沉淀分析 法、脂质体溶解分析法、免疫粘连凝集法、浊度分析法等都属于非标 记免疫分析法。这些分析方法在分析过程中检测相不需要与过量试剂 分离，然而遗憾的是灵敏度较低，一般只能用于定性或半定量分析。 针对上述非标记免疫分析法的缺点，人们想到了在分析体系中引入探 针系统及标记技术以实现超灵敏检测。根据检测方法的不同，标记免 疫分析法又可分为荧光免疫分析、化学发光免疫分析、电化学免疫分 析法等。现代的免疫分析基本上都采用标记免疫分析法。 1 2 3 现代免疫分析的进展 1 2 3 1 放射免疫分析法 、 放射免疫分析法是将同位素分析的高灵敏度与抗原抗体反应的 特异性相结合，以放射性同位素作为示踪物的标记免疫测定方法。该 法是1 9 5 4 年i 主i y a l o w 和b e r s o n 首先创建的阳9 1 ，当时用于血清中胰岛素 含量的测定。放射免疫方法的建立是免疫检测方法的重大突破，其基 本原理是建立在r i a 是标记抗原和未标记抗原对有限量抗体的竞争 性结合或竞争性抑制反应基础上的。在r i a 反应系统中，标记抗原 ( a g 木) 、未标记抗原( a g ) 和特异性抗体( a b ) 三者同时存在时， 由于两种抗原具有相同的决定簇，互相竞争结合抗体的能力相同，结 果形成a g * - a b 和a g a b 复合物。当a g 木和a b 的量固定时，二者结合形 生物金属化增强电化学免疫传感器信号的研究 成免疫复合物就受f 1 a g 含量的制约。因此，a g * - a b 复合物的形成量 与a g 含量之间呈一定的函数关系，由此可以测定目标抗原的相关信 息。 由于此项技术具有灵敏度高( 可检测出n g 级甚至p g 级的超微量物 质) ，特异性强( 可分辨结构类似的抗原) 、不改变样品活性、重复性 强、样品及试剂用量少、测定方法易规范化和自动化等多个优点，因 此，在医学及其他生物学科的研究领域和临床实验诊断中广泛应用于 各种微量蛋白质、激素、小分子药物及肿瘤标志物等的分析与定量测 定。但是，放射免疫检测方法同时存在着很大的缺点，由于放射性同 位素的使用带来了污物处理的难题，不仅损害操作人员的健康，污染 环境，而且限制了试剂的寿命，难以获得长期稳定的检测标准。因此， 在r i a 的启发下，逐步发展了一系列非放射性的标记免疫检侧方法。* 1 2 3 2 酶标记免疫分析法 、， 酶免疫法( e n z y m ei m m u n o a s s a y ，e i a ) 是将抗原、抗体的特异 性免疫反应和酶的高效催化作用有机结合起来的一种免疫分析方法。 该方法从1 9 6 6 年开始被采用n 刳，与放射免疫法类似，酶标记免疫分 析法是通过测定结合于固相的酶的活力来确定被测物的量，不需要 引进发出信号的化合物，只是在反应后生成可发出检测信号的物质。 常用作标记物的酶有辣根过氧化物酶( h o r s e r a d i s hp e r o x l d a s e ，h r p ) ， 半乳糖苷酶( p d g a l a c t o s i d a s e ，g l a ) 和碱性磷酸酶( a l k a l i n e p h o s p h a t a s e ，a l p ) 等。酶免疫分析的灵敏度接近放射免疫技术，而可 借助于简单的仪器作定量测定，是目前使用广泛的免疫分析技术。 e i a 法包括酶联免疫吸附分析法( e n z y m e l i n k e di m m u n o s o r b e n t a s s a y ，e l i s a ) ，酶免疫试验法( e n z y m e m o n i t o r e di m m u n o t e s t ， e m i t ) 、竞争结合酶免疫分析法( c o m p e t i t i v eb i n d i n ge n z y m e i m m u n o s o r b e n ta s s a y ，e i a ) 和免疫酶分析法( i m m u n o e n z y m o m e t r i c 硕十学何论文 a s s a y ，i e m a ) 。其中基于竞争吸附的酶联免疫法( e l i s a ) 是酶免 疫法中应用最广泛的一种，常被用作检测其它方法可靠性的标准方 法。 e l i s a 的基础是抗原或抗体的固定化及抗原或抗体的酶标记。结 合在固相载体表面的抗原或抗体仍保持其免疫学活性，酶标记的抗原 或抗体既保留其免疫学活性，又保留酶的活性。在测定时，待测样品 ( 测定其中的抗体或抗原) 与固相载体表面的抗原或抗体起反应。用 洗涤的方法使固相载体上形成的抗原抗体复合物与液体中的其他物 质分开，再加入酶标记的抗原或抗体，通过免疫反应而结合在复合物 上。此时固相上的酶量与待测样品中受检物质的量呈一定的比例。加 入酶反应的底物后，底物被酶催化成为有色产物，产物的量与标本中 受检物质的量直接相关，故可根据呈色的深浅进行定性或定量分析， 定量分析一般用紫外一可见分光光度法测定。由于酶的催化效率很 高，间接地放大了免疫反应的结果，使测定方法达到很高的敏感度。 1 2 3 3 荧光免疫分析 ， 用荧光物质作标记的免疫分析法称为荧光免疫分析法( f i a ) 。 本世纪4 0 年代，c o o n s 采用荧光素标记抗体检测可溶性肺炎球菌多糖 抗原，首次创建了荧光抗体检测技术n 引。荧光免疫法具有专一性强、 灵敏度高、标记物不易失活、价格低廉、无放射性污染等优点。至今， f i a 已广泛应用于微量、超微量物质分析测定。f i a 常用的荧光标记 试剂有：荧光素、异硫氰酸酯( f i t c ) 、罗丹明和四甲基异硫氰基 荧光素( f 砌t c ) 等n 4 。1 5 1 。常用的方法有荧光显微法、荧光偏振法、 荧光淬灭法和荧光增强法。 在免疫分析中，时间分辨荧光免疫分析是当今免疫分析研究的热 点之一n 。用荧光素作为标记物的荧光免疫测定往往受样品成分、 试管、仪器组件等的本底荧光干扰，以及激发光源的杂散光的影响， 生物金属化增强电化学免疫传感器信号的研究 使灵敏度受到很大限制。而时间分辨荧光免疫分析具有灵敏度高、特 异性强、所用的试剂稳定性良好、检测线性范围较宽、尤其是能消除 常规荧光测定中的高背景等优点，所以是荧光免疫分析中很有发展潜 力的分析方法。该分析方法中最重要的是高效鳌合物探针的研究。目 前最理想的鳌合物探针是镧系元素铕( e u ) 鳌合物。其基本原理是利 用这类荧光物质有长荧光寿命的特点，延长荧光测量时间，待短寿命 的自然本底荧光完全衰退后再行测定，所得信号完全为长寿命镧系鳌 合物的荧光，从而有效地消除非特异性本底荧光的干扰。时间分辨荧 光免疫分析技术将荧光免疫分析的灵敏度提高了几个数量级，达到了 放射免疫分析法的水平。 荧光偏振免疫分析n 刚是免疫分析中的另外一个热点。荧光物质 ，。经单一平面的偏振光蓝光( 波长4 8 5 n m ) 照射后，可吸收光能跃入激 发态在恢复至基态时，释放能量并发出单一平面的偏振荧光( 波长5 2 5 n m ) 。偏振荧光的强度与荧光物质受激发时分子转动的速度成反比。 大分子物质旋转慢，发出的偏振荧光强；小分子物质旋转快，其偏振 荧光弱。利用这一现象建立了荧光偏振免疫测定( f p i a ) ，常用于 小分子物质特别是药物的测定。 1 2 3 4 电化学免疫分析 电分析化学是一门具有悠久历史的学科，它具有灵敏度高、仪器 简单、方法灵活多样等特点，电化学免疫分析法( e l e c t r o c h e m i c a l i m m u n o a s s a y ，e c i a ) 就是将免疫技术与电化学检测技术相结合的一 种免疫分析新方法。19 51 年b r e y e r 和r a d c l i f f - 首次用极谱方法测定了由 偶氮标记的抗原，这成为电化学免疫分析的开端 2 0 1 。最初由于受到电 化学分析技术及仪器的限制，这种种方法在将近3 0 年里没有引起科学 家的重视，最近几十年才得到了突飞猛进的发展。电化学免疫分析法 可以分为直接电化学免疫分析法和间接电化学免疫分析法。直接电化 硕+ 学位论文 学免疫分析法又称非标记电化学免疫分析法，这种方法不需要标记免 疫试剂，它依靠免疫结合后引起转换器的电荷密度或导电性的变化而 实现分析检测的目的，主要包括一些电位型、电流型、电容型和阻抗 型免疫传感器。电位型免疫传感器是基于测量电位变化来进行免疫分 析的生物传感器。1 9 7 5 年j a n a t a 等首次报告了这种免疫分析方法【2 1 1 ， 他是通过聚氯乙烯膜把抗体固定在金属电极上，当待测抗原与固定在 电极表面上的抗体特异性结合后，使电极上的膜电位发生相应的变 化，膜电位的变化值与待测抗原浓度之间存在对数关系。电流型免疫 传感器基于抗原抗体结合时引起电极电流密度的变化进行测定，电位 脉冲技术是最常用的检测手段。b e n d e r t 2 2 】等用基于这种原理，将抗体 电聚合于聚吡咯导电膜中，制备了一种多氯化联( 二) 苯免疫传感器， 可以测定0 3n g m l 的多氯化联( 二) 苯。电容型免疫传感器就是基于将。 抗体固定在电极表面，当抗原抗体在电极表面复合时，界面电容相应 地降低，据此检测抗原的量。j i a n g e 2 3 】等把抗体包埋在y a 1 2 0 3 溶胶凝 胶中制备电容型免疫传感器，具有很高的灵敏度，可以测出l n g m l 的 人i g g 。阻抗型免疫传感器的分析原理是基于抗原抗体之间的结合降 低了电活性探针分子同电极之间的电子转移速率，即增加了电子转移 阻抗。通过测量免疫结合前后电子转移阻抗之差可以实现高灵敏检测 的目的。d i j k s m a t 2 4 】首先将半胱氨酸或乙酰半胱氨酸子组装于电化学 处理后的金电极表面，电极表面的羧基经活化后可以直接铰链抗体， 由于电极表面的非特异性吸附可以用轻易除去，这种免疫传感器有着 很高的灵敏度，可以检测到2 p 舢的丫干扰素。在间接电化学免疫分 析法中，抗原抗体之间的结合需要通过与标记试剂的反应间接表现出 来。免疫分析的标记物主要有两类：生物酶及电化学活性物质。最常 用的是碱性磷酸酯酶( a l p ) 和辣根过氧化物酶( h r p ) 。磷酸苯酯和 对氨基磷酸苯酯经常用作a l p 的底物，其酶催化产物苯酚和对氨基 生物金属化增强电化学免疫传感器信号的研究 苯酚可以用安培法或伏安法检测。邻苯二胺、邻联茴香胺等可以用作 h r p 的底物，在h 2 0 2 存在下酶催化氧化产生的偶氮产物通常以极谱 法或伏安法检测。用作标记物的电化学活性物质为具有电化学氧化还 原性质的金属离子和电活性的有机功能基团。金属离子通过螯合剂如 二亚乙基三胺五乙酸与抗原结合，经过酸化再释放出来，可用电化学 方法测定。许多有机活性功能基团可以通过引进抗原，从而进行电化 学测定。 1 2 3 5 化学发光免疫分析 化学发光免疫分析( c l i a ) 技术( c h e m i l u m i n e s e n ti m m u n o a s s a y ， c l i a ) 是免疫测定技术继放射免疫技术( r i a ) ，酶免疫技术( e i a ) 。 荧光免疫技术( f i a ) 之后发展的一项新兴测定技术。它是将化学发 光法的高灵敏性与免疫法的高选择性结合而产生的一种新型的免疫 法。化学发光免疫测定法【2 5 。2 7 】就是用化学发光催化剂或者光敏物质标 记抗体或抗原，再通过测定化学发光催化剂或者光敏物质来确定目标 抗原的量。就目前来说，化学发光免疫测定分为三种类型。第一种化： 学发光酶免疫测定，是以发光剂作为酶免疫测定的底物，通过发光反 应增强测定的敏感性；第二种化学发光免疫测定，是以发光剂作为抗 体或抗原的标记物，直接通过发光反应检测标本中抗原或抗体的含 量；第三种电化学发光免疫测定，是以电化学发光反应的底物为标记 物，通过在电极表面由该标记物引发的电化学发光反应检测样品中抗 体或抗原的含量。 化学发光免疫分析具有灵敏度高、特异性强等优点，受到人们的 青睐。c l i a 分析方法多样，适用面广，广泛地用于抗原、抗体和半 抗原的免疫测定，其线性范围也较宽，符合临床检验的需要。目前， c l i a 在免疫分析方面取得了一些成就，但其远不能满足临床分析的 要求。研究者在如何提高免疫诊断的敏感性和特异性，发展新的分析 硕十学位论文 技术等方面仍在不断努力。c l i a 技术的发展趋势在于合成新的发光 标记物、优化抗体制备、标记技术以及建立新的免疫分析方法等。 1 3 免疫分析信号增强技术 免疫分析过程中，由于有一些物质的浓度非常低，所产生的免疫 分析信号很低，导致对这些物质进行高灵敏分析具有一定的困难。于 是，各种各样的信号增强技术应运而生，通过对信号的增强，可以实 现对一些在生物体内含量极低的物质的高灵敏度分析。下面，对常用 的信号增强技术进行简单总结： 1 3 1 酶催化产物沉积法 酶催化产物沉积法是指利用酶的高度催化性能，催化产生一种不 溶于水的有机物，并使有机物在传感器表面沉积的分析方法。有机物 在传感器表面沉积可以改传感器界面的性质，这种性质的改变可以采 用电化学交流阻抗泌3 0 1 、计时电位等方法进行 31 - 3 2 】测量；有机物在传 感器表面沉积同样会产生质量效应，而质量的变化可以通过压电晶体 传感器【3 3 3 卅以及磁致弹性感应【3 5 】进行测量。在这一方面，生物金属化 技术得到了更大的关注。生物金属化是指在酶的作用下，金属离子还 原为金属单质或某种不溶物的形式，并沉积于传感器表面。h w a n g 3 6 】 等人利用碱性磷酸酯酶催化对氨基磷酸苯酯水解为对氨基苯酚，后者 可以将银离子还原为银单质并沉积于电极表面及d n a 骨架上，随着 催化反应的进行，越来越多的银单质被富集，采用阳极溶出伏安法可 以测出电极表面还原的银的量，实现对了d n a 的灵敏检测，检测限 达1 0z m 。与直接用电化学方法测定酶的催化产物不同，催化产物刚 一产生就被银离子氧化从而累积到传感器的表面，实现了对目标检测 物的放大检测。 一 1 3 2 多酶标记增强法 。 传统的蛋白质酶标记法是在蛋白质上直接标记酶，其酶标记量的 生物金属化增强电化学免疫传感器信号的研究 多少由蛋白质本身所含有的赖氨酸或巯基的量来决定。这种方法虽然 简单易行，但直接将蛋白质进行修饰时，会或多或少的会影响蛋白质 的活性，且标记的酶量有限，标记过多，往往会使蛋白质失去活性。 为了增加酶在蛋白质上的标记量以实现免疫信号的增强，d h a w a n t 3 7 】 设计了一种新的多酶标记方案。首先将抗体活化后，再向抗体上连接 上含有2 0 个赖氨酸残基的肽链，这样就向抗体上增加了2 0 个氨基， 新增的氨基同样可以用来结合酶，通过这种方法可以实现对抗体的多 酶标记，有利于免疫信号的增强，实验结果表明，这种方法可以使免 疫信号增强3 倍。w a n g t 3 8 】等以碳纳米管作为酶的载体，将亲合素标记 d n a 链和碱性磷酸酯酶同时修饰于碳纳米管，这种修饰过的碳纳米 管可以直接用于免疫或d n a 分析，由于每个碳纳米管平均可以承载 9 6 0 0 个碱性磷酸酯酶，这种方法极大地提高了酶的标记量，而且由于 碳纳米管对酶催化产物的吸附富集作用，大大地提高了分析灵敏度， 使其电化学信号可以增强1 0 0 0 倍，即便是8 0 p g m l 的i g g 也可以产生 相当明显的信号，可以检n 1 0 p g m l 的d n a 。 1 3 3 纳米粒子标记增强法 纳米粒子一般是指颗粒尺寸在1 1 0 0n m 范围内的超微粒子。当 物质的尺寸减d , n 纳米范围时就会表现出量子效应、表面效应、宏观 量子隧道效应等特性。除此之外，一些纳米粒子还具有性质稳定，有优 良的生物兼容性等特性，这使得它们在日常的免疫诊断，临床诊断及药 物检测等方面的应用已受到广泛重视。最常用到的纳米粒子包括金纳 米粒子，硅纳米粒子，碳纳米管和脂质体等等下面，对上面提到的纳米 粒子在