（工业催化专业论文）酶解大豆蛋白制备寡肽的研究.pdf

摘要 摘要 大豆是蛋白质含量最丰富的粮食作物之一，其蛋白质含量与动物食品中蛋白质含量 很接近。但长期以来，人们对大豆的利用主要是榨油和生产传统大豆食品，这是对大豆 蛋白资源的很大浪费。与大分子蛋白和小分子氨基酸相比，肽更易被人体和动物吸收， 可透过血液直接进入人体器官内参与机体代谢，具有各种生理功能。同时肽具有很好的 物理性能：低粘度、易溶解、高浓度下流动性好等。因此，大豆通过酶解制得的大豆肽 除了具有很高的生理活性和营养价值外，还具有很好的加工性能。大豆蛋白活性肽的应 用将具有广阔的发展前景。 本文主要研究大豆蛋白酶解及对水解物的脱苦和脱色。提出了用a l c a l a s e 和 黑曲霉酸性蛋白酶在p h 渐变条件下协同水解大豆蛋白的方法，通过正交实验确定 复合酶水解的最优条件；采用吸附法、氧化剂氧化法解决对水解液的脱色问题。此外， 在水解体系中引入抗色变抑制剂的方法，可在源头上消灭部分色素；采用端肽酶水解掉 苦肽末端氨基酸的方法可脱除水解液苦味。 研究结果表明：a l c a l a s e 和黑曲霉酸性蛋白酶双酶协同水解大豆蛋白在不加碱，底 物浓度4 0 9 l ，a l c a l a s e 与底物l l l 5 p u g ，黑曲霉酸性蛋白酶与底物比6 ( w w ) ，反应 温度6 0 c ，反应时间1 8 4 , 时的条件下，大豆蛋自的水解度和降解率分别可达到2 6 和 7 6 。由于黑曲霉酸性蛋白酶含有羧肽酶，有脱苦的效果，因而在水解的同时又脱除了 部分苦肽。在黑曲霉酸性蛋白酶的作用下，水解液的苦味值降至6 ，经酿酒酵母迸一步 处理后，水解液苦味值降至3 。在不凋节p h 值条件下，吸附脱色法与氧化剂法脱色效果 不明显，但引入抗色变抑制剂方法的脱色效果突出。在水解体系中引入0 0 9 5 ( w w ) 的h 2 0 2 抑制美拉德反应，水解液的色素抑制率达到了3 6 ，水解液颜色由深褐色转为 黄色。采用s e p h a d e x g 2 5 层析分析方法对水解产物的分子量分布进行分析可知：大豆多 肽的分子量主要集中在5 0 0 0 以下，特别是分子量1 3 5 0 以下的最多，具有生理活性的肽多 集中在这部分。通过高效液位相色谱分析可以看出，水解液由1 6 种氨基酸组成，其中含 有八种人体必需氨基酸，其含量占总氨基酸的3 8 2 9 ，只有蛋氨酸含量偏低，氨基酸比 例比较合理。这种大豆蛋白水解物可开发成功能性营养口服液、特殊人群的优质营养补 充剂。 关键词：大豆蛋白；寡肽；a i c a i a s e ；黑曲霉酸性蛋白酶；脱色；脱苦 a b s t r a c t a b s t r a c t s o y b e a np e p t i d e s a r eo b t a i n e df r o ms o y b e a r lp r o t e i nb yh y d r o l y s i s p e p t i d e sa r e a b s o r b e dm o i _ eq u i c k l yt h a nh i g hm o l e c u l a rw e i g h tp r o t e i na n dl o wm o l e c u l a ra m i n oa c i d sb y h u m a nb o d ya n dt r a n s p o r t e dd i r e c t l yi n t oo r g o n so ft h eb o d yt h r o u g hb l o o d t h e ya l s oh a v e m a n yp h y s i o l o g i c a lf u n c t i o n s m o r e o v e r , p e p t i d e sh a v ee x c e l l e n tp h y s i c a lp r o p e r t i e ss u c ha s l o wv i s c o s i t y , d i s s o l v e n t i n ge a s i l y , ag o o df l o w i n g 、 r i t hh i g hc o n c e n t r a t i o na n ds oo n t h i sp a p e rp r i n c i p a l l ys t u d i e st h r e ep o i n t s ：e n z y m a t i ch y d r o l y s i so fs o y b e a np r o t e i n ， d e b i t t e r i n ga n dd e c o l o u r i n go fh y d r o l y z a t e f i r s t l y , a l k a l i n ep r o t e a s ec o o p e r a t e sw i t l l s p e r g i l l u sn i g e ra c i d i cp r o t e a s et oh y d r o l y z es o y b e a np r o t e i nw i t h o u tf i x i n gp h s e c o n d l y , t h e m e t h o d so fa c t i v ec a r b o na b s o r p t i o na n do x i d a n to x i d a t i o na l ec h o s e nt od e c o l o u rt h e h y d r o l y s a t e f u r t h e r m o r ea n t i b r o w n i n ga g e n t s c a na b a t et h ep i 豇n e n tr e a c t e d l a s t l y , e x o p e p t i d a s e sc a nd e b i t t e rp r o t e i nh y d r o l y z a t e t h er e s u l t si n d i c a t et h a tt h eo p t i m a lc o n d i t i o n sa l ea sf o l l o w s ：h y d r o l y z i n gt e m p e r a t u r e 6 0 ，r a t i oo fb a c i l l u sa l k a l i n ep r o t e a s e s u b s t r a t e1 5 i - q g ，r a t i oo fa s p e r g i l l u sn i g e ra c i d i c p m t e a s e s u b s t r a t e6 ( w w ) ，c o n c e n t r a t i o no fs u b s t r a t e4 0 9 l ，t o t a lh y d r o l y s i st i m e18 h t h ed e g r a d a t i o np e r c e n t a g ec a nr e a c h7 6 ，w h i l et h eh y d r o l y s i sd e g r e ec a nr e a c h2 6 ， o l i g o p e p t i d e so fm o l e c u l a rw e i g h tb e l o w1 3 5 0c a nr e a c h6 6 b e c a u s ea s p e r g i l l u sn i g e r a c i d i cp r o t e a s cc o n t a i n sc a r b o x y p e p t i d a s e ，w h i c hc a nd e b i t t e rt h eh y d r o l y z a t e ，t h ep r o c e s so f d e b i t t e r i n ga n dh y d r o l y s i si ss i m u l t a n e o u s a f t e rt h a t , t h ev a l u eo fb i t t e rt a s t ef a l l s t o6 ， m o r e o v e r , i td r o p st o3a f t e rt h eb r e w i n gy e a s th y d r o l y z e sb i t t e rp e p t i d e sf u r t h e r t h e m e t h o d so fa c t i v ec a r b o na b s o r p t i o na n do x i d a n to x i d a t i o na l en o tw o r ku n d e rt h ec o n d i t i o n o f w i t h o u tf i x i n gp h ，b u tb r o w n i n gi n h i b i t o r sc a ne f f e c t i v e l yc o n t r o lt h em a l l l a r dr e a c t i o na n d a b a t et h ep i g m e n tr e a c t e du n d e rt h eh y d r o l y s i sc o n d i t i o n a r e ra d d i n g0 0 9 5 ( w w 1h 2 0 2 i n t ot h es y s t e m ，t h er a t eo fb r o w n i n gi n h i b i t i o nc a nr e a c h3 6 t h r o u g ht h ea n a l y s i sb y h p l c t h ea m i n oa c i d sc o m p o s i t eo ft h eh y d r o l y z a t ew a sa b t a i n e d t h er e s u l ta sf o l l o w s ： t h e r ea r e1 6k i n da m i n oa c i d si n c l u d i n g8k i n dn e c e s s a r ya m i n oa c i d sf o rh u m a ni nt h e h y d r o l y z a t e ，a n dt h e ya c c o u n tf o r3 8 2 9 o ft o t a l t h i sh y d r o l y z a t ep r o d u c tc a nb ee x p l o i t e d a sa ne x c e l l e n tn u t r i t i v ed r i n ko rf u n c t i o n a lp r o d u c tf o rs p e c i a lp e o p l e k e yw o r d s ：s o y b e a np r o t e i n ；o l i g o p e p t i d e ；b a c i l l u sa l k a l i n ep r o t e a s e ；a s p e r g i l l u s n i g e ra c i d i cp r o t e a s e ；d e c o l o r a n t ；d e b i t t e r i n g 前言 0 前言 蛋白质是生物有机体中含量最丰富、功能最重要的一类生物大分子。它存在于所有 的生物细胞中，约占干质量的5 0 以上，是一种极为重要的生物资源。目前食用蛋白质 主要来源于农畜产品，随着人口的增长，对蛋白质的需求量日益增加。由于人口增长速 度过快，世界人口迄今已逾6 0 亿，其中因蛋白质匮乏而患营养不良症的人竟高达8 1 2 亿，在发展中国家这种现象尤为严重。为缓解这种供需矛盾，一方面要继续增加农畜产 品的产量，另一方面，如何更有效、更合理的利用已有的蛋白资源尤显重要。从世界角 度来看，能提供蛋白资源的食品中植物蛋白占蛋白总产量的7 0 以上，而动物性蛋自不 足3 0 。在植物蛋白中，除谷类种子外，以油料种子包含的蛋白质所占比例最大，约为 1 3 ，这是一个较大的数量，受到了人们的高度重视并得到了大力开发。我国主要的植 物蛋白资源有大豆和玉米，我国是大豆的故乡，大豆作为一种重要的经济作物，在我国 有大面积的栽培，长期以来传统的豆制品一直是我国人民摄入的植物蛋白质的一个主要 来源。 大豆蛋白水解制得的大豆蛋白肽，不仅具有良好的溶解性、流动性、热稳定性，而 且其粘度低、浓度高，在体内吸收快、利用率高。大豆蛋白经酶解变成分子量较小的肽 还可以释放出降低胆固醇、抗过敏、抑制血压、提高机体耐力等生物活性作用。大豆肽 的开发成功将会对大豆深加工业产生重大影响，也将为人们的健康提供一个良好的新食 物源，是一种比较理想的新型大豆深加工产品。由于该产品的应用范围很广，市场开发 潜力很大，因此，潜藏着巨大的商机和很好的经济效益。 目前，在我国市场上蛋白肽在食品中的应用还很少，原因有很多。酶解生产工艺中 的一些难题就是制约其应用的一个主要问题。在大豆蛋白酶解的过程中，很多生产工艺 需加碱维持体系的p h 值以得到高的水解度，最终会生成大量的盐，而脱盐又是一个高能 耗的步骤。另外采用酶法制得的大豆蛋白水解液颜色较深，使其在食品中的应用受到限 制。此外现有的酶解蛋白工艺中苦味的产生及其脱除又是一个非常难解决的问题。 为了解决上述问题，对酶解进行研究，提出了用碱性蛋白酶a l c a l a s e 和黑曲霉酸性 蛋白酶协同水解大豆蛋白的方法。大豆蛋白溶液的自然p h 值为7 0 ，枯草杆菌碱性蛋白 酶可在水解之初发挥主要作用，当水解液的p h 值随着降解率增加下降较多时，酸性蛋 白酶的活性开始大大提高，于是，在较低p h 值下，大豆蛋白可在酸性酶的作用下继续 水解，这样在不加碱、p h 变化的情况下可获得较好的降解率和水解度。 大多数苦肽含有较多的疏水性氨基酸，而且主要位于苦肽的末端，如果切除此类疏 水性氨基酸，苦肽的苦味将会明显下降。黑曲霉酸性蛋白酶中含有羧肽酶，可以从c 一 端将疏水性氨基酸脱掉，起到脱苦的作用。而酿酒酵母具有产氨肽酶体系，又可以从 n 端将疏水性氨基酸脱掉，起到脱苦的作用。 在大豆蛋白水解过程中，蛋白质和糖会发生副反应美拉德反应，美拉德反应生 成色素，因此，抑制水解过程中发生的美拉德反应可在源头上消灭色素。本文重点研究 双氧水及亚硫酸钠在大豆蛋白水解反应中对美拉德反应的抑制。 大连理工大学学位论文版权使用授权书 本学位论文作者及指导教师完全了解“大连理工大学硕士、博士学位论文版 权使用规定”，同意大连理工大学保留并向国家有关部门或机构送交学位论文的 复印件和电子版，允许论文被查阅和借阅。本人授权大连理工大学可以将本学位 论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，也可采用影印、缩印或扫描等 复制手段保存和汇编学位论文。 保密叵在j 匕年解密后适用本授权书。 本学位论文属于 不保密口。 ( 请在以上方框内打“”) 作者签名： 习j 孟风 特导臌：辇苎竺 2 1 二生年月日 酶解大豆蛋白制备寡肽的研究 1 文献综述 我国有丰富的蛋白资源，按其来源不同，可分为植物蛋白源和动物蛋白源。我国主 要的植物蛋白资源有大豆、玉米；主要的动物蛋白资源为各种畜禽的肉、皮和骨等：海 洋生物资源是一个新兴的资源，具有很大的开发潜力。大豆是蛋白质含量最丰富的粮食 作物之一，其蛋白质含量为4 0 ，这与动物食品中蛋白质的含量很接近。大豆蛋白是一 种高级蛋白，由1 8 种氨基酸组成，含有8 种人体必需的氨基酸，比例较合理，其中赖 氮酸相对稍高，含硫氨基酸( 蛋氨酸、胱氨酸) 含量稍低。我国大豆产量居世界第三 位，因此大豆蛋白资源十分丰富。但长期以来，人们对大豆的利用主要是榨油和生产传 统大豆食品，大豆蛋白资源浪费很大。为此，世界上一些发达国家正积极致力于大豆蛋 白开发利用新途径的研究。 1 1 大豆肽的生产 通过水解方法提高蛋白食品的加工性能、营养性以及释放出生理保健功能已经受到 广泛重视。经过水解的蛋白一般都能增加其在水中的溶解度，降低粘度，增加流动性， 热稳定性，易被人体吸收，降低食品的抗原性。些原来隐藏于蛋白质分子内部的具有 特定氨基酸序列的肽段被释放出来，形成具有各种不同生理活性的小肽分子i z 】。例如酶 解大豆蛋白、玉米蛋白及酪蛋白可以释放出抗高血压活性的小肽即5 i ：用胃蛋白酶等水 解动物乳清蛋白可得到具有抗菌作用的活性肽旧1 等等。 制各蛋白水解物的工艺包括预处理、水解、脱苦、脱色、脱盐、浓缩及干燥等步骤。 其中，水解、脱苦和脱色步骤最为重要。 1 1 1 大豆及大豆蛋白 大豆原产于中国，是世界上产量最大的食用和饲用蛋白资源，据报道1 9 9 9 2 0 0 0 年度，全世界大豆总产量为1 5 6 7 2 亿吨。其中中国大豆总产量为1 4 2 9 万吨，排在美国巴 西之后与阿根廷并列世界第三1 7 j 。通常大豆中含蛋白质约4 0 ，脂肪2 0 ，碳水化合物 2 0 ，水分1 0 粗纤维5 ，灰分5 。大豆的个重要用途就是提取豆油，但过去对 榨油后剩下的大量蛋白质却未能充分利用，只是用作饲料和肥料，蛋白资源浪费很大。 随着食品工业的发展，人们采用先进的工艺技术将脱脂豆粕加工威多种大豆蛋白制品， 如浓缩大豆蛋白、分离大豆蛋白、组织化大豆蛋白等，这些大豆蛋白制品中蛋白质含量 普遍在5 0 以上，其中大豆分离蛋白的蛋白质含量更高达9 0 左右，而且具有许多功能 特性，如乳化性、持水性、持油性、起泡性等，在肉类制品、饮料、冰淇淋、焙烤食品 及各种保健食品中具有广泛的应用。高品质系列化大豆蛋白产品的工业化大舰模生产， 极大地拓宽了大豆蛋白的应用范 羽 8 , 9 a 0 1 。大豆中含有4 0 左右的蛋白质，超过其它任何 粮食作物的蛋白质含量。大豆蛋白是生产大豆多肽的原料，不仅蛋白含量高，而且质量 酶解大豆蛋白制备寡肚的研究 也好。根据世界卫生组织( w h o ) 建立的蛋白质推荐摄入量，大豆蛋白含有人体必需的 所有氨基酸，其营养价值与动物蛋白相当，能够很好地满足人类的营养需要m 1 。尽管 和鸡蛋、牛奶相比大豆蛋白所含必需氨基酸的比例稍差，但却是植物蛋白质中营养价值 最高的蛋白质，其所含八种人体必需的氨基酸含量接近或高于联合国粮农组织( f a o ) 和 世界卫生组织( w h o ) 建议的理想构成，见表1 1 i r a - t 3 1 。 表1 i 一些食品中的必须氮基酸含量( ) t a b l e l 1t h en e c e s s a r ya m i n oa c i dc o n t e n to f s o m ef o o df ) 由表1 1 可以看出，大豆蛋白中赖氨酸的百分含量较高，利用这一特点将其添加进 谷类食品中可弥补谷类蛋白赖氨酸含量不足的缺点，尽管蛋氨酸含量稍许偏低，为大豆 蛋白的第一限制性氨基酸，但通过添加适量蛋氨酸可以弥补这一不足。将大豆蛋白添加 到其它食品中，也可以提高该食品的蛋白效率比。例如，玉米粉中添加8 一1 0 大豆蛋 自，蛋自效率比由l 提高到2 5 ；大米粉中添加8 大豆蛋白，蛋白效率比由2 1 7 提高到2 5 6 。 大豆蛋白是一种优质植物蛋白，但它的生产成本却只是生产同量猪肉蛋白的二十分之 一，牛肉蛋白的四十分之一。f a o 己将大豆蛋白定为二十一世纪重点开发的蛋白质食 品资源。 1 1 2 大豆蛋白的水解 大豆蛋白是大豆中含有的诸多蛋白质的总称。大豆蛋自是一种优质植物蛋白，具有 较高的营养价值，但由于其溶解度低、粘度随着浓度的增高而急剧升高、有一定的抗原 性、消化率和生物效价远不及牛奶、鸡蛋等动物性蛋白，限制了大豆蛋白在食品加工中 的应用。研究表明，通过水解可以改善大豆蛋白的功能性质，从而使其在食品工业中显 示出更广泛的用途和更广阔的开发前景。目前，关于蛋白质的水解研究己曰趋成熟。另 外，大豆蛋白水解物中一些多肽具有的大豆蛋白无可比拟的生理活性及营养功能，出促 使人们开始以来源丰富、质优价廉的大豆蛋白为原料研究开发大豆多肽，全方位提高大 豆蛋白的营养与商品价值。 水解蛋白质的反应式如下”4 。”： 酶解大豆蛋白制备寡肚的研究 h 2 0 y x n l h 蛋白质的水解可以用酸或碱处理得以实现，也可以利用蛋白酶的催化作用来达到目 的。用酸法或碱法水解蛋白质至今已有1 0 0 多年的历史，在7 0 年代以前，工业上普遍 采用水解效率高的盐酸作为催化剂来制造水解蛋白。 1 1 2 1 酸解 用酸水解生产水解蛋白的一般过程如图1 1 所示 原料一酸水解一碱中和一过滤一脱色精制一过滤一浓缩一喷雾于燥一蛋白水解物 图1 1 蛋白质酸水解的生产流程 f i g 1 ，1f l o wd i a g r a mo fa c i dh y d r o l y s i so fp r o t e i n 酸解工艺一般做法为：先用6 m o y l 的盐酸在1 0 5 下反应，反应过程中要密封或 通氮气。酸水解时若反应时间过长，容易将蛋白质完全水解成氨基酸，所以要严格控制 反应时间。反应完毕，用n a o h 中和水解液至p h 约5 - 6 ，将水解液漂白精制。用活性 炭进行脱色，除去活性炭即可。 酸解是一种高效的蛋白质水解方法，其优点是可以获得深度水解而使蛋白质中呈鲜 味的谷氮酸、天冬氨酸及呈甘味的甘氨酸、丙氨酸、苏氨酸、丝氨酸等呈味氨基酸游离 出来，使最终产品具有较强的鲜味。同时，酸水解不易产生苦味。其缺点是水解程度难 控制，对设备要求高，活性肽含量偏低而赫分含量偏高，并且水解过程中色氨酸和羟氨 酸全部被破坏，丝氨酸、苏氨酸和酪氨酸也遭到部分破坏，同时天冬酰胺和谷氨酰胺的 酰胺基也被水解下来，生成相应的游离氨基酸和氨离子。酸解制成的植物蛋白水解物 ( h v p ) 含有微量的一氯丙醇( m c p ) 、二氯丙醇( d c p ) 致癌物【1 8 1 ，目前，d c p 、m c p 含量已被日本、美国等国家列为h v p 重要的卫生指标，如德国规定h v p 中m c p 含量 s i m g k g ，d c p 含量! o 0 0 5 m g k g t 。 1 1 2 2 藏解 碱水解一般采用6 m o l l n a o h 在1 0 0 条件下，水解6 小时。此法最大优点是水解 完全，色氨酸不被破坏，工艺简单、对设备腐蚀小( 与酸法相眈) 。但缺点是碱解时丝 氨酸、苏氨酸、精氨酸等大部分被破坏，且大部分氨基酸会发生消旋化，即将l 型氨基 酸转化成l 一型和r 型的混合物，营养成分损失很大。由于人体只能吸收l 型氨基酸( 蛋 氨酸除外) ，因此很少采用碱解法来制取供人类食用的水解蛋自。其应用主要限于对蛋 白质水解改性，借以生产非营养目的的产品。如蛋白灭火剂、发泡剂等。 目前，蛋白的酸解和碱解方法已逐渐被酶解方法所取代。 y 一 (-ojnu 。 一 rfclh 一一 h+ h o 0 8 hf卜l黾 c 0 0 。 一 rfcih n 1 h 一 0 8 hf(!)i r h x 酶解大豆蛋白制各寡肽的研究 1 1 2 3 酶解 与酸解或碱解相比，酶解效率商、条件温和、水解程度易于控制、且在营养成分的 保留上具有不可比拟的优点。同时，随着酶工业固定化技术和膜反应器的发展，蛋白酶 的成本不断降低，酶技术的应用更加深入，酶解过程更趋于自动化、简单化。因此，目 前酶解己逐渐成为代替酸法水解和碱法水解的有效方法。酶法水解生产蛋白水解物的一 般流程如图1 2 所示。 原料一酶水解一杀酶一过滤一脱苦脱色一过滤一减压浓缩一喷雾干燥一蛋白水解物 匿i 2 蛋自质酶水解的生产流程 f i g 【2f l o wd i a g r a mo fe n z y m ah y d r o l y s i so fp r o t e i n 酶解过程不破坏任何氨基酸，因而在营养成分的保留上有着酸解和碱解不可比拟的 优点。酶解过程中，水解程度能够得到很好的控制，所以不像酸解和碱解那样得到的水 解产物大部分是氨基酸。酶解蛋白质得到的水解液中含有大量肽类物质，包括很多分子 量在1 0 0 0 以下的寡肽。 酶解使蛋白质的分子量降低、离子性基团数日增加，这是酶解改善蛋蛊质理化性质 的基础。酶切断蛋白质的肽键使其成为小分子肽的程度，可用蛋白质的水解度( d h ) 表示。 水解度1 2 0 j 定义为在水解过程中打开的肽键占蛋白质中肽键总量的百分比。水解度是描述 蛋白质水解程度的一个非常重要的指标，可以通过对水解度的控制来实现对产品质量和 性质的调控。水解度越高，表示肽键被打开的数目越多，同时游离氨基酸和低分子量肽 的生成量就越多，蛋白水解产物的各种理化性质的改变越大。 酶的种类、酶的用量、底物浓度、底物自身的性质与变性程度、承解液的口h 值与 离子强度、酶解的温度与时间，都会影响d h 值的大小及蛋白质水解液的性质。 蛋白酶可根据它们的使用条件、对肽键的作用位置或来源来分类。 根据其作用的最佳p h 值，蛋白酶可分为酸性蛋白酶、中性蛋白酶和碱性蛋白酶； 按照酶的来源蛋白酶可分为植物蛋白酶、动物蛋白酶和微生物蛋白酶。 常见的植物蛋白酶如木瓜蛋白酶、菠萝蛋白酶和无花果蛋白酶等，它们价格低但酶 解效率也较低；常见的动物蛋白酶如胰蛋白酶、糜蛋白酶和胃蛋白酶等，它们的特点是 酶解效率高，但是价格也比较昂贵；微生物酶来源广、种类多，食品蛋白的酶解中常用 的几种微生物蛋白酶见表1 2 。微生物蛋白酶的特点是酶解效率高、价格低，兼有植物 酶和动物酶的优点。 表1 2 蛋白酶解过程中常用的儿种微生物蛋白酶2 1 】 t a b l e 12m i c r o b i a lp r o t e i n a s ec o m m o n l yu s e di nt h eh y d r o l y z i n go f p r o t e i n 4 酶解大豆蛋白制备寡肚的研究 根据其作用于蛋白质肽链的位置，蛋白酶又可分为内切酶和外切酶1 1 4 , 1 5 a 不同酶 作用于蛋白质肽键的不同位景，所以常以多酶水解蛋白质以获得更多的切割点，从而有 利于制备小分子肽。 内切酶切开蛋白质分子内部肽键一c o n h 一，将蛋白质水解成分子量较小的多肽 类。内切酶包括动物蛋白酶，如胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、胃蛋白酶等；植物蛋白酶， 如木瓜蛋白酶、菠萝蛋白酶、无花果蛋白酶等；以及微生物来源蛋白酶，如国产的碱性 蛋白酶地衣型芽孢杆菌2 7 0 9 ，中性蛋白酶枯草杆菌1 3 9 8 、放线菌1 6 6 、栖曲霉3 9 4 2 、 酸性蛋白酶黑曲酶3 3 5 0 以及丹麦n o v o n o r d i s k 公司生产的碱性蛋白酶a l c a l a s e 、复合蛋白 酶p r o t a m e x 、中性蛋白酶n e u t r a s e 等。外切酶切开蛋白质或多肽分子氨基或羧基末端的 肽键，而游离出氨基酸。其中又把作用于氨基末端的外切酶称为氨肽酶，作用于羧基末 端的外切酶称为羧肽酶。如丹麦n o v o n o r d i s k 公司生产的f 酶就含有外切酶。外切酶的一 个重要特性就是能够把处于肽链末端的疏水性氨基酸水解出来，降低多肽的苦味。此外 有些蛋白酶还能够水解蛋白质或多肽的酯键和酰胺键。 蛋白酶水解蛋白质时，作用部位因肽键种类而异。如胰蛋白酶的切点是羧基侧为碱 性氨基酸( 精氨酸、赖氨酸) 的肽键：胃蛋白酶要求切点两端有芳香族氨基酸5 “ ：枯 草杆菌碱性蛋白酶要求切点的羧基侧为疏水性芳香族氨基酸( 色氨酸、酪氨酸、苯丙氨 酸) 。这种蛋白酶对切点的特异性要求叫做蛋白酶的底物专一性。利用蛋白酶的底物专 一性可以定向获得特殊结构的多肽。表1 3 列出了部分常见蛋白酶的主要切割位点和最适 d h 值。 表1 3 一些蛋白酶的切割位点和最适d h t a b l e l 3t h ec l e a v a g es i t ea n do p t i m u mp ho f s o m ep r o t e a s e 1 1 3 蛋白水解物的褐变及脱色 在蛋白质水解过程中，一般色泽都会发生变化，即发生褐变。随着水解度的增加， 水解液的颜色会不断的加深，一般为深黄色甚至褐色。颜色过深会影响产品的色泽，降 低产品质量。 1 1 3 1 传统的脱色方法 酶解大豆蛋白制备寡肽的研究 一般来说脱色可采用活性碳、活性白土等具有强大表面张力的多孔性吸附剂，利用 疏水作用将色素分子吸附到吸附剂上。采用纳滤膜可以分离分子体积较小的色素l z z j ， 达到脱色的效果。 以上都是在色素物质产生后再脱除的办法。可以针对引起食品褐变的原因，消除引 起褐变的因素，在源头上消灭有色物质。在非酶褐变成因中美拉德反应可通过加入抑制 剂得到有效控制”。 1 1 。3 ，2 美拉德反应的抑制 引起食品褐变的原因很多，主要分为酶促褐变和非酶褐变。酶促褐变主要发生在水 果和蔬菜中，其原因为所含的多酚在酚酶的作用下氧化成醌，醌再进一步氧化聚合成褐 色素。而在蛋白质水解中的褐变主要是非酶褐变。在蛋白质水解中非酶褐变的原因有两 种情况，一种是由于蛋白质和糖发生了美拉德反应产生褐变【2 ”。在大豆蛋白中存在微量 的糖分，因此在酶解大豆蛋白过程中可能会发生美拉德反应。抑制美拉德反应即可避免 色素的产生。另一种非酶褐变的原因是在蛋白质水解时，其肽键的打开使得原来隐藏于 蛋白质内部的色素分子被释放出来，例如在水解鱼肉蛋白的过程中，随着水解度的增加， 水解液的颜色加深，就是由于蛋白质的水解造成色素分子的释放【z “，此时褐变是不可避 免的。 美拉德反应( m a i l l a r dr e a c t i o n ) 也称为羰氨反应，是氨基酸与还原糖及还原糖的分 解物反应，反应经过复杂的历程，最终生成棕色甚至黑色的大分子物质类黑精或称 拟黑素。在大豆蛋白中含有微量还原糖，这些还原糖在水解过程中会与蛋白质作用发生 美拉德反应，产生褐色甚至黑褐色的物质，所以可通过抑制大豆蛋白水解反应中发生的 美拉德反应来减少水解物色素物质生成。 美拉德反应一般可分为两个反应阶段、三条反应路线： 1 初级美拉德反应 还原糖的羰基与氨基之间进行加成加成后失去一分子水而转化为希夫碱。经 a m a d o r i 重排为1 氨基1 脱氧2 酮糖，称为阿马多利化合物。反应方程式如下： c h o c h o h 一哪一c h r j r c h o h c h o h c o o h j j 玎成 l h2 n - - c 。h c c x ) h + c h o h ：= 二= ：+ c h o h li c h 0 c h ( ) h l q h o h c h o h i i c h ，o hc 1 2 0 h 氨基酸醛糖加成化合物( n 配糖物) 酶解大豆蛋白制备寡肽的研究 c h = n 一口一r l h 。0 h a m a d o r i c h o h + f重排 删 c h ，0 h 皿一n h 一甲一r c = o c o o h l c h o h i c h o h c 2 0 h 希夫碱阿马多利化合物 2 高级美拉德反应 a 还原酮路线由阿马多利化合物在2 - - 3 位置上不可逆烯醇化，从c - 消去胺基生 成甲基二羰基中间体，进一步生成5 一羟基麦芽酚或甲基醛类、酮醛类、二羰基化合物 等裂解产物( 反应式略) 。 b o s u l o s e 路线阿马多利化合物在l 2 位置上烯醇化，消去c 3 上的羟基，水解成 3 一脱氧已酮糖，然后脱水生成糖醛类成份( 反应式略) 。 c s t r e c k e r 降解洳氨基酸和叶二羰基化合物反应，失去一分子c 0 2 而降解成为少 一个碳原子醛类及烯醇胺。烯醇胺进一步缩合、脱氢而生成毗嗪衍生物( 反应式略) 。 综上所述，美拉德反应产物可分为三大类：( 1 ) 吡喃类衍生物与酮醛类：( 2 ) 呋喃 类衍生物；( 3 ) 醛及吡嗪类衍生物。美拉德反应可按上述多种路线进行，但在特别的条 件下，反应路线及产物是有限的。阿马多利化合物9 8 以环形存在，仅有2 以开链形 式存在。而在环形的阿马多利化合物中，6 4 1 3 - - 吡哺、1 5 旺一吡喃、1 5 o 一呋喃、6 a 一呋喃，因此美拉德反应产物主要是吡喃和呋喃类衍生物。影响美拉德反应因素除氨基 酸种类及糖的类别外，它与水分、p h 、温度、时间等因素有关。美拉德反应一般随p h 值的升高而加剧，在酸性介质中，美拉德反应受抑制，而在碱性介质中则反应加速。因 为在碱性介质中，由于邻近n 原子的电子密度增大，使l 2 一烯醇化困难，所以在碱 性介质中，一般进行2 3 一烯醇化。在酸性条件下，n 原子被质子化。由于带正电荷n 原子的吸引，电子离开c 。，而使l 2 烯醇化较为容易。本文涉及的反应是在偏酸性 的条件下进行，因而阿马多利化合物主要发生在1 2 一烯醇化，丽2 3 一烯醇化则较 缓慢，即美拉德反应产物一般是进行1 2 一烯醇化而得。 抑制美拉德反应有如下方法： 1 去除促进褐变反应的化合物 2 调节促进因子 3 使用褐变抑制剂 4 其它方法 其中最有效的方法是使用褐变抑制剂和去除促进因子。美拉德反应是一个十分复杂 的反应，温度、p h 值、水分活度、氧气、金属离子等因素都会影响美拉德反应。因温 度、p h 值、水分活度等由酶反应条件而定，所以调节促进因子来抑制美拉德反应空间 有限。 酶解大豆蛋白制各寡肽的研究 美拉德反应褐变抑制剂包括有还原剂和氧化剂： 1 还原剂亚硫酸盐是广泛使用且有效的美拉德反应褐变抑制剂。通常使用的亚 硫酸盐包括了一组化合物，主要有：亚硫酸钠( n a 2 s 0 3 ) 、亚硫酸氢钠( n a h s 0 3 ) 、焦 亚硫酸钠( n a 2 s 2 0 5 ) 、保险粉( n a 2 s 2 0 4 ) 。 2 氧化剂由于氧化剂的氧化作用强烈，所以在食品脱色中氧化剂的使用不如盐 硫酸盐广泛。一些效果好的氧化型抑制剂有n a c i o 、h 2 0 2 、0 3 。 1 1 4 蛋白质水解物的苦昧及脱除问题 蛋白质经酶解后会产生苦味物质，这些苦味物质除少量是氨基酸外，主要是分子量 较小的苦肽【2 “。采用不同的酶水解蛋白质所制得的水解液的苦味轻重有很大的不同。水 解度增加时，水解液的苦味将加重，这将严重地影响产品的口感和质量。因此对蛋白质 水解液的脱苦成为整个酶解蛋白工艺的关键之一。蛋白质酶解液脱苦的难点在于既要有 好的脱苦效果，又要做到蛋白质损失率小及成本低。蛋白水解物的脱苦工艺极大地影响 了蛋白质酶解技术的实际应用。 1 1 4 1 影响苦味大小的因素 苦肽的苦味大小主要受以下两个因素的影响： 1 ) 与分子量( 或肽链的长度) 的大小有关。从苦昧肽的分子量来看，其链长主要 是从三个氨基酸到十五个氨基酸不等，而超过2 0 个氨基酸的肽类则没有苦味【2 ”。 2 ) 与疏水氨基酸的含量、序列及所处的位置、空间结构等有密切的关系 2 引。肽的 苦味随着疏水氨基酸含量的增加而加重。当疏水性氨基酸位于肽链的端位时，苦味最强。 其它非巯水性氨基酸对苦昧的大小也有作用，因为这些氨基酸残基在肽链中的位置影响 肽链的空间结构。 1 1 4 2 苦昧的脱除方法 去除蛋白质水解液苦味的方法主要有掩蔽法、物理吸附法以及酶改造法。 掩蔽法 掩蔽法可分为两种，一种是采用向水解产物中加入某些呈味剂对酶解液本身的苦味 进行掩盖。柠檬酸和苹果酸是常用的呈味剂，其中苹果酸对蛋白质水解液的苦味掩蔽效 果虽好1 2 。另一种方法是利用非蛋白的大分子物质与苦肽分子的交联作用对酶解液的苦 味进行掩蔽。如交联淀粉能把苦味藏于淀粉分子结构的内部，从而阻止它们接触味蕾而 起到掩盖苦味的目的。将苦味肽与浓缩乳清蛋白、脱脂奶或大豆蛋白混合也有掩蔽苦味 的作用，其原因是蛋白质、氨基酸和肽之间存在着亲和作用【30 1 。 掩蔽法的优点是可以在不损失氨基酸的条件下减轻蛋白水解液的苦味。其缺点是会 引入异物，影响蛋白水解物本身具有的风味。 物理吸附法 酶解大豆蛋白制备寡肚的研究 吸附法的原理就是利用疏水性吸附剂吸附具有疏水性的苦肽，从而达到除去苦肽的 目的。活性炭是一种常用的吸附剂，其对疏水性物质具有很强的吸附作用。经过活性炭 处理的蛋白质水解物的苦味基本被脱除，但是活性炭处理的选择性较差，用此法处理的 蛋白质水解液氨基酸和肽的损失率较高【3 ”。另外活性炭超细粉末的残留对产品的质量 也有不良的影响。 分离法 可以通过有机溶剂萃取的方法脱除苦肽。用异丁醇，乙醇，异丙醇等有机溶剂与水 形成的共沸物对苦肽进行萃取可使苦肽富集于有机相，从而达到脱苦的目的1 3 “，此法也 存在蛋白损失的问题。此外，利用疏水性层析也可以很好的脱除和分离苦肽，利用苦肽 末端的疏水性氨基酸残基在有机相中溶解度大的性质，可以将苦肽分离除去【3 3 】。采用膜 分离技术对水解产物的苦肽进行分离可以有效的去除苦味1 3 ”，但此法的缺点是在分离苦 肽的同时，一些与苦肽分子量接近的可能具有功能性的小分子肽也被分离出去。 采用物理吸附和分离的方法可以有效的去除苦味，但是其普遍存在的缺点是设备投 资大，操作费用高，选择性差及氨基酸损失率高。 酶改造法 酶改造法包括两种，一种是水解法，即采用端肽酶水解苦肽分子【3 ”。端肽酶可以 水解掉肽链末端氨基酸残基，利用端肽酶的这种性质可以把苦肽中对苦昧影响最大的末 端疏水性氨基酸残基去掉，同时一些水解下来的氨基酸也具有掩盖苦味的效果( 比如甘 氨酸和谷氨酸) 。端肽酶分为氨肽酶和羧肽酶，这两种酶分别作用于肽链的n 端和c 端。但是端肽酶的价格较贵，在工业中应用成本较高。在工业中可应用产生端肽酶的微 生物如酿酒酵母p “，达到同样的目的。另一种酶改造的方法是缩合法，即利用水解作 用的逆反应，使水解产物在水解酶的作用下合成类蛋白物质分子。类蛋白物质的特性与 原始蛋白不同，易被消化，这样的类蛋白物质称作“改造蛋白” 3 7 1 ，有关改造蛋白形成 的酶反应称改造蛋白反应。改造蛋白反应表现出非常有效的脱苦作用。 酶改造法不引起蛋白水解物中氨基酸的损失，也不引入其它杂质，是一种很有前途 的脱苦方法。 1 1 5 关于大豆蛋白水解的研究 刘大川等对五种蛋白酶水解大豆分离蛋白的特性进行了比较，筛选出水解能力最强 的碱性蛋白酶，水解产物经超滤膜分离后的混合物溶解性良好，采用活性炭粉有效地吸 附了苦肽c 3 8 o 黄惠华等研究了木瓜蛋白酶对大豆蛋白的水解作用，并通过电泳实验和 氨基酸分析分析了水解前后水解物组成的变化。”。崔继科等不仅研究了酸、碱及加热 处理对大豆蛋白酶解的影响，还探讨了大豆蛋白采用木瓜蛋白酶水解后对其溶解性、乳 化性、粘度、起泡性的影响，针对大豆肽的苦味。研究了活性炭吸附、柠檬酸掩盖等方 法对大豆肽苦味的影响，分析了大豆蛋白的酶水解机理h 0 ，4 。w e n d e ec h i m l g 等采用酶 膜反应器连续生产大豆肽，由于及时分离了酶解生成的多肽，消除了产物反馈干扰，提 高了酶解效率，并且采用氧化稳定指数( o s i ) 检测了大豆分离蛋白及其水解物的抗氧化 活性，结果显示大豆分离蛋白酶水解后抗氧化性提高h 引。曹玉华等进行了应用固定化 9 酶解大豆蛋白制备寡肽的研究 胰蛋白酶制各大豆肽的研究，结果表明：采用固定化酶水解大豆蛋白，水解效果较好， 实现了酶的重复使用 4 3 1 。a d l e r - n i s s e n 认为，将大豆蛋白部分水解，使其分子量与鸡蛋 清蛋白相当，则可提高大豆蛋白的发泡性1 。刘通讯等研究了多酶协同作用生产大豆 多肽，由于不同的酶切断肽键位电不同，因此提高了酶解效率，并且复合酶中含有端肽 酶时，还具有脱苦的效果 4 53 0y o s h i k a w am 等的研究表明大豆球蛋白a l 亚基( 氨基酸序 列g l y - a r g p r o a r g ) 、大豆蛋白的胰蛋白酶解物( 氨基酸序列h i s - c y s - g i n - a r g - p r o - a r g ) 分别具有免疫活性。而且大豆球蛋白a l 亚基还具有抑制肿瘤生长的作用【4 6 j 。吴建平等采 用不同的蛋白酶水解大豆蛋白，研究了单一酶水解物和复合酶水解物对大自鼠血管紧张 素( a c e ) 的抑制活性，证实大豆蛋白的酶水解液中含有降血压功能因子，得出了生产大 豆降压肽的最佳条件，并分析了大豆降压肽的分子量分布、氨基酸组成和肽谱w “。 刘粼研究了大豆蛋白酶水解的机理，在此基础上推导出了大豆蛋白酶水解的动力学方 程，指出水解过程中，大豆蛋白底物浓度的上限约为1 0 ，超过此浓度，反应速率显著 下降，并通过实验进行了验证 5 0 j 0 1 1 6 大豆多肽工业化生产 蛋白质水解产物的工业化生产最早出现在1 9 1 4 年，酶解物作为食物则出现在第二次 世界大战期间，一些西方学者在进行蛋白质改性研究时，用酶法改性蛋白质来补充极其 缺乏的鸡蛋。由于受技术水平的限制，水解过程不易控制。水解物的苦味、臭味等问题 未能解决，大豆多肽的研究无多大进展。1 9 7 4 年，c p u s k i 对蛋白酶改性大豆分离蛋白的 功能特性进行研究，结果发现，酶改性后的大豆分离蛋白溶液粘度很低，不形成凝胶。 正是基于这种原理，7 0 年代初，美国开发出新型大豆深加工产品一大豆多肽，之后，美 国d e l t o w ms p e c i a t i e s 公司建成了年产5 0 0 0 吨大豆肽的工厂。日本在大豆肽开发研究方面 也已进入生产阶段，据报道，他们己经克服了水解产物产生苦味和蛋白酶菌种的选育难 关。经改善风味后