（化工过程机械专业论文）β榄香烯脂质体的制备工艺研究及生产设备开发.pdf

中文摘要b 一榄香烯作为一种高效、低毒的抗肿瘤药物，有着广泛的应用前景，目前常制作成乳剂使用。但b 一榄香烯乳剂经静脉注射后静脉炎发病率高，这就限制了它的应用。为了解决这个问题，本研究结合脂质体的靶向性和缓释性，探索把b 一榄香烯制备成1 3 一榄香烯脂质体。本研究中采用实验室最常用的两种脂质体制各方法一薄膜水化法和逆相蒸发法。以脂质体的药物包封率为实验指标，通过多次实验发现当原料配比为：薄膜水化法中，卵磷脂、胆固醇、b 一榄香烯的质量比为4 0 0 ：4 0 8 ：1 0 8 ，缓冲液用1 2 0 p b s ；逆相蒸发法中，卵磷脂，胆固醇、b 一榄香烯的质量比为4 0 0 ：5 1 ：5 4 ，缓冲液用i i p b s 时所制备的脂质体的药物包封率均在8 5 以上。达到了药典的要求，说明b 一榄香烯这种药物是适合脂质体包封的药物。针对脂质体的生产目前还没有实行工业化的这个问题本文将实验室常用的逆相蒸发法和高压均质法进行整合，提出一种适合于在工业上生产放大的新方法一逆相高压均质法。以此方法为基础设计了一套生产能力为5 升批的小型脂质体生产工艺。并在新工艺上分别进行了脂溶性药物1 3 一榄香烯和水溶性药物熊菜苷的脂质体实际生产实验。结果表明，用新工艺生产的1 3 一榄香烯脂质体的粒径为1 0 8 n m 、包封率为9 6 4 0 8 。生产的熊蕖苷脂质体的粒径为7 0 n m 、包封率为1 6 5 3 2 。新工艺的制各结果与实验室中少量制各的结果基本相同，说明新工艺适合脂质体的实际生产要求。关键词；b 榄香烯，脂质体，高压均质法，包封率a b s t r a c ta sak i n do fm f i c i e n tm a dl o wp o i s o na n t i - t u m o rm e d i c i n e ，d e l e m e n eh a sg o tt h ee x t e n s i v ea p p l i e df o r e g r o u n d i tw a su s u a l l yu s e d e m u l s i o n b e c a u s ep m e b i t i sw a so f t e na r o s e da t t e rt h ee m u l s i o nm a d ef r o m1 3 - e l e m e n ew i n j e c t e di n t ov e i n , i t s1 1 9 ew a sl i m i t e db a d l y t or e s o l v et h ep r o b l e m , w em a k eb e l e m e n ei n t o8 - e l e m e n el i p o s o m e su t i l i z i n gf u l l yt h ec h a r s o t e r so fl i p o s o m e s t w om e t h o d s - - r 目c c r s ep h a s ee v a p o r a t i o nm e t h o da n dt h i n - f i i mh y d r a t i o nm e t h o dw e r eu s e di nt h ee x p e r i m e n t s r e g a r d i n ge n v e l o pr a t i o t h et e s ta i m w el o c a t e dt h eb e s tm a t e r i a lr a t i oo i lt h o s ep r e p a r i n gm e t h o d sb ye x p e r i m e n t s a st h el i p 0 8 0 l l l e sa r ep r e p a r e db yt h i n - f i l mh y d r a t i o nm e t h o d ，t h eb e s tw e i g h tr a t i oo fl e c i t h i nt oc h o l e s t e d na n df l - e l a r n e n ei s4 0 0 ：3 4 ：4 0 8 ：t h el i p o s o m e sa r ep r e p a r e db yr e v e r s ep h a s ee v a p o r a t i o nm e t h o d t h eb e s tw e i g h tr a t i oo fl e c i t h i nt oe h o l e s t e r i na n di b e l e m e n ei s4 0 0 ：5 l ：5 4 t h ee n v e l o pr a t i oo ft h e mi so v e r8 5 ，i ts h o wt h a t1 3 - e l e m e n ei sp r o p e rt ob ee n v e l o p e db yl i p o s o m e s i no r d e rt op r o d u c el i p o s o m e si nt h eg r o s s , af l e wm e t h o d - - - r e v e r s ep h a s eh i 曲p r e s s u r ee x t r u s i o nt h a tw a ga d a p t e d 协i n d u s t r i a lp r o d u c tw a gp u tf o r w a r db yi n t e g r a t i n gs e v e r a ld i f f e r e n tm e t h o d so f p r e p a r i n gl i p o s o m e s b a s e do ni t ar i e wt e c h a n o l o g ya n de q u i p m e n t sw e r ed e s i g n e d t h ec a p a c i t yo ft h es y s t e mi s5l i t r e sp e rb a t c h u t i l i z i n gt h el l e we q u i p m e n t s w ep r e p a r e dg r e a s e - s o l u b i l i t yb - e l e m e n el i p o s o m e sa n dw a t e r - s o l u b i l i t ya r b u t i nl i p o s o m e s t h ed i a m e t e ro ft h e1 3 - e l e m e n el i p o s o m e sp r e p a r e dt h r o u g ht h en e we q u i p m e n ti s1 0 8 a ma n dt h ee n v e l o p 豫t i ei s9 6 。4 0 8 1 1 1 ed i 8 n l 妇o ft h ea r b u t i nl i p o s o m e sp r e p a r e dt h r o u 曲t h en o we q u i p m e n ti s7 0 n ma n dt h ee n v e l o pr a t i oi s1 6 5 3 2 t h er e s u i t sa r ec l o s et 0t h o s ee d u c e df r o mt h el a b o r a t o r ya n d 曲i si l l u m i n a t et h en e wc r a f t 咖s a t i s 母t h ed e m a n do ft h ea c t u a lp r o d u c t i o ni nq u a l i t y k e yw o r d s ：1 3 - e l e m e n e ，l i p o s o m e s , h i g hp r e s s u r ee x t r u s i o nm e t h o d ，e n v e l o pr a t i o独创性声明本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作和取得的研究成果，除了文中特别加以标注和致谢之处外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得叁壅盘堂或其他教育机构的学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示了谢意。学位论文作者签名枞签字日期年多月巧日学位论文版权使用授权书本学位论文作者完全了解墨洼盘堂有关保留、使用学位论文的规定。特授权鑫鲞盘堂可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，并采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编以供查阅和借阅。同意学校向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘。( 保密的学位论文在解密后适用本授权说明)学位论文作者签名签字日期：k i 年；月巧日天津大学顽士论文第一章文献综述第一章文献综述1 1 脂质体及其应用脂质体是磷脂分子的自由组装体，是由一个或多个磷脂双分子层包裹图卜1 脂质体的结构图f i g 1 1c h a r to f l i p o s o m es t r u c t u r e微水相而构成的微囊，其结构如图卜l 所示。它是由英国科学家b a n g h a m 于1 9 6 5 年发现的，他把磷脂这种天然的表面活性剂分散到过量水中，发现磷脂在水中形成了一种由双分子膜组成的闭合囊泡，这种囊泡就是脂质体，这也是人类首次制备出脂质体。构成脂质体双分子层的磷脂分子属于两亲分子，分子结构中包含亲水的头部和亲油的尾部两部分。在脂质体的形成过程中，亲水的头部形成膜的内外表面层，而亲油的尾部则处于膜的中间，膜壁厚度约为5 - 7 r i m ，而囊的直径一般在2 5 5 0 0 n m “。之间。脂质体的这种结构使其能够携带各种亲水的、亲脂的和两亲的物质，这些物质或被包入脂质体内部水相，或插入类脂双分子层中间。根据形状和结构的不同，脂质体一般可分为小单层脂质体( s t j v ) ( 图卜2 ) 、多层脂赝体( m l v ) ( 图1 3 ) 、和大单层脂质体( l u v ) 。各种类型脂质体的性能因结构不同而芹。就稳定性方面考虑，小单层脂质体最稳定，而多层和大单层脂质体相对来说不太稳定，不容易保存。无津人学顽- ：论文第一章文献综述图1 2 单层脂质体结构图f i g 1 - 2c h a r to f m o n o l a y c rl i p o s o m es t n m t u r o水溶性药物脂溶性药物类腊双分子层水膜图1 3 多层脂质体结构图f i g 1 - 3c h a r to f m u l t i l a y e rl i p o s o m es t r u e t u r o由于脂质体具有与细胞膜相似的结构，因此早期的脂质体多用于生物膜的结构与功能的研究。经过4 0 多年的发展脂质体和很多领域得到了应2天律大学硕t 论文第章文献综述用：用脂质体包裹血红蛋白可以代替红细胞给病人供氧，用脂质体包裹显影剂能改变这些显影剂的药动学，能使其选择性达l 某些器官或损伤部位；近年来遗传基因成为研究的热点，也有人将d n a 、r n a 这些遗传基因包入脂质体中将其引入细胞为遗传工程提供了新的途径和方法。但其目前最主要的应用还是在医药和化妆品中作为药物载体。1 1 1 在医药中的应用脂质体是日前在体外实验中能够将各种物质引入细胞的最有效的载体己有数百种不同的物质可被包于脂质体中，其中包括酶、糖脂、免疫球蛋白、单克隆抗体、药物( 尤其是抗肿瘤、抗关节炎、抗感染、抗寄生虫和抗真菌药物) 、抗原、生物调节剂( 如淋巴因子和胞擘双肽) 、螯合剂、标记物、抗生素、离子、疫苗和染色体等。目前脂质体作为药物载体目前已经实现了商业化。美国f d a 己审批了数种脂质体类药物：如阿霉素脂质体t l c i ) 9 9 、两性霉素b 脂质体、柔红霉素脂质体和庆大霉素脂质体、治疗干眼病的脂质体滴眼剂等。n 1 9 9 9 年，这些药物产品的销售额就已经超过2 5 亿美元。脂质体作为药物载体与其它载药系统相比具有靶向性、延长药物作用时白j 、降低药物毒性以及保护被包封药物等多种优点。脂质体的靶向性靶向性是脂质体作为药物载体最突出的特征。脂质体的靶向性有四种类型”1 ；被动( 天然) 靶向性这是脂质体静脉给药时的基本特征，是由于脂质体进人体内即被巨噬细胞作为外界异物吞噬的天然倾性向产生的体内分布特征。一般脂质体主要被肝和脾中网状内皮细胞所吞噬，是治疗肝寄生虫病、利什曼病等网状内皮系统疾病理想的药物载体。利用脂质体剂型包封药物治疗这些疾病可显著地提高药物的治疗指数，降低毒性，提高疗效。脂质体的这种天然靶向性也被广泛用于肿瘤的治疗和防止肿瘤的扩散和转移。物理和化学靶向性这种靶向性是在脂质体的设计中，应用某种物理因素或化学因素的改天律大学顶l ：论文第一章文献综述变( 例如用药局部的p h 、病变部位的温度等) 来改变脂质体膜的通透性。使脂质体有选择性的释放药物。目i i 利用物理靶向性设计最成功的例子是温度敏感脂质体( t e m p e r a t u r e s e n s i t i v e l i p o s o m e ) ，这种脂质体是使用具有特定的相变温度的脂质混合物作为膜村，使所制备的脂质体相变温度在4 1 左右。在热疗机对肿瘤局部的作用下，当温度敏感脂质体进入肿瘤区的毛细血管床时，脂质体达到液晶态相变温度，导致脂质体迅速完全地释放药物，使血管内外的药物浓度达到平衡。转移靶向性这种靶向性是采用封闭网状内皮系统或减少网状内皮系统对药物的摄取。可预先注射空白脂质体，使肝脾摄取脂质体呈饱和状态，然后再给药物脂质体以增加非网状内皮系统的摄取嘲。主动靶向性这种靶向性是在某种脂质体上联接一种识别分子，即所谓的配体。通过配体分子的特异性专一地与靶细胞表而的互补分子相互作用。而使脂质体在靶区释放药物t 4 8 。脂质体的长效作用脂质体作为药物载体还具有延长药效的作用。实验证明，脂质体及包封的药物在血循环中保留的时间，多数要比游离药物长得多。利用脂质体缓慢释放药物的机制可以有效地和延长药物在体内的半衰期。脂质体降低药物毒性药物被脂质体包封后，主要被网状内皮系统的吞细胞所摄取，在肝、脾和骨髓等网状内皮细胞较丰富的器官中集中，而药物在心脏和肾脏中的累积量比游离药物低得多。因此，如将那些对心脏、肾脏有毒性的药物，尤其是对正常细胞有毒性的抗肿瘤药物，包封成脂质体可以明显降低药物的毒性。脂质体保护被包封的药物将一些不稳定、易氧化的药物包封在脂质体中，药物因受到脂质体双层膜的保护，在很大程度上就提高了药物的稳定性。同时脂质体也增加了药物在体内的稳定性。4天津大学坝士论文第一章文献综述i a 2 在美容化妆品中的应用8 0 年代初期，为了实现特殊的美容作用，或者为了制造一种有别于其同类竞争者的产品，化妆品的研制者开始把目光投向脂质体的应用。目前日本ni k k oc h e m i c a lc o l t d 已经用氢化卵磷脂制成包埋v a 、v e 醋酸盐和脾脏提取物的ni k k oaq u a s o m e 系列脂质体化妆品。此外还有用脂质体包埋增加皮肤细胞活性的s o d 、b z 胡萝p 素、黄酮类物质等等。脂质体美容化妆品有其它传统化妆品相无可比拟的优点：脂质体可以促进皮肤对包埋成分的吸收通常化妆品所用的活性物质尤其是亲水性物质很难穿透受胰酶作用的皮肤深层细胞而发挥作用，这些药物经脂质体包封后则很容易被吸收9 1 。脂质体能够缓慢释放出所包埋的皮肤活性物质跟在药物载体上的应用相同，化妆品药物通过脂质体的包封后能够显著增加活性物质对皮肤的作用时间。对皮肤的保湿作用保持皮肤光滑、柔软，有弹性的关键成分是水，而皮肤中对保湿起关键作用的是皮肤的角质层。由于构成脂质体双分子膜的主要成分是磷脂，且因脂质体特殊的类细胞结构，使之可以比其它物质( 包括游离的磷脂) 更容易渗透至皮肤的角质层中，并很好地分布在那里。同时脂质体不仅对皮肤有保湿作用，还能吸湿以保持皮肤的水分。保护被包封的药物由于脂质体的包裹作用，可以防止许多活性物质的降解与变质，许多美容物质如ve 、v c 、s o d 都是较好的抗氧剂，容易在空气中氧化变质，经过脂质体包封以后可大大降低被氧化的风险。在防晒化妆品中，已有用脂质体包封紫外吸收剂。据析，经如此处理能使紫外吸收荆最佳地分布在角质层中。另外，利用脂质体在皮肤上形成的薄层油膜，使紫外吸收剂不易受汗水影响而流失。天津大学碗上沧文第一章文献综连1 2 抗肿瘤药物b 书香烯简介及其作用机理鼍瓤呱h 2 c v 人、厂c h 3c h zc h 2图卜4b 一榄香烯结构f i g 1 4s t r u c t u r e c h a r t o f1 3 一e le m e n eb 一榄香烯( 8 一e l e m e n e ) 是从中药温莪术根茎提取的有效单体。是榄香烯抗肿瘤的3 种有效成分之一，其结构式如图卜4 所示。其乳剂是临床用于治疗恶性浆膜腔积液、肺癌、消化道肿瘤、脑瘤以及其它浅表性肿瘤的二类新药，具有很强杀火肿瘤细胞及抑制肿瘤生长作用“”。其抗癌谱广、高效、安全、无毒，对肝肾功能无损害，无骨髓抑制，不同于一般细胞毒性化疗药物 1 1 o 大量豹研究表明其抗肿瘤作用机制与传统的化疗药物有所不同，故日益受到l 临床及科研t 作者的关注。b 一榄香烯的抗肿瘤作用机理主要表现在以下几个方面：1 2 1 真接抗肿瘤作用作用于肿瘤细胞的生长周期6 一榄香烯能够影响肿瘤细胞的生长周期而抑制肿瘤细胞的生长，可使肿瘤细胞的生长阻滞在某一时期。p 一榄香烯明显干扰肿瘤细胞的代谢途径，阻碍肿瘤细胞从s 期进入| ( 3 2 m 期，使肿瘤细胞的生k 下降，抑制肿瘤细胞的增殖并迅速导致其凋亡“。诱导肿瘤细胞凋亡8 榄香烯可诱导多种肿瘤( 包括小鼠黑色素瘤b 。人白血病细胞k 5 6 2 、h l f i 0 等) 细胞凋亡。袁静等用流式细胞仪检测到渐强的凋亡峰( b 一榄香烯对孵育k 5 6 2 细胞) ，电泳发现明屁的阶梯带，电镜观察到染色体聚集，凋亡小体形成。揭示诱导细胞凋亡是b 一榄香烯抗肿瘤的一个重要机理之一“。诱导分化( 肿瘤逆转)6天津大孝颀_ 上硷文第一章文献综述诱导分化是指恶性肿瘤细胞在体内外分化诱导剂的作用下，再分化向正常方向逆转的现象。钱军等观察到经b 榄香烯处理后的肺癌细胞增殖减慢，并出现肺癌细胞缩小变圆，形态趋于一致，细胞核浆比例下降，常染色质减少、异染色质增多等分化成熟的表现。提示榄香烯可逆转人肺癌细胞的表型，具有一定程度的分化诱导作用”“。1 2 2 抗肿瘤转移作用研究表明，e 榄香烯有抑制肿瘤细胞浸润、转移等作用。吴伟忠等用b 一榄香烯处理后的荷瘤小鼠实验表明，b 一榄香烯具有抑制肿瘤细胞转移作用。用尾静脉注射小鼠b 。黑色素瘤肺转移模型研究0 一榄香烯抗肿瘤转移作用，结果表明，b 榄香烯可以影响细胞运动及盲接抑制各个环节而发挥抗肿瘤转移作用。临床用p 一榄香烯治疗骨转移性肿瘤，胃肠道肿瘤腹腔转移取得了较好的疗效。1 2 3 影响癌基因bc - 2 蛋白的表达袁静等用流式细胞术分析技术检测b 榄香烯对自血病k 5 6 2 癌基因b e - 2 蛋白的表达指标，结果显示，口一榄香烯在诱导缨胞凋亡的同8 寸 下调致癌基因b c - 2 蛋白的表达。因b e - 2 基因可抑制白血病癌变细胞凋亡，并促进肿瘤发展，揭示b 一榄香烯抑制k 5 6 2 细胞凋亡作用可能通过降低b c 2 的表达而诱导细胞凋亡“。1 2 a 抗肿瘤免疫机制b 一榄香烯复合瘤苗具有主动免疫保护作用。金梅等试验结果表明，b 一榄香烯复合瘤苗对l 6 1 5 白血病有明显的主动免疫保护效应，能激发机体产生特异性抗肿瘤免疫“”。红细胞免疫在肿瘤的发生、侵袭和转移过程中起着重要的阻遏作用。恶性肿瘤患者红细胞免疫功能明显降低，应用b 一榄香烯治疗后，患者的红细胞受体花环率( e _ c 3 b r r ) 升高、红细胞免疫复合物花环率( e _ i e r ) 和c l c 降低。显示b 一榄香烯对红细胞免疫功能有促进作用”“。近期报道，b 一榄香烯能显著提高肺瘤患者体内t 淋巴细胞亚群功能，对辅助性t 细胞和杀伤抑制性t 细胞均有促进作用。改善肿瘤患者的细胞7天津大学预卜论文第一章文献综述免疫和体液免疫”3 1 。1 2 5 抗氧化作用临床资料显示，b 一榄香烯可显著提高肿瘤患者血清的s o d 活性。超氧化离子的产生是导致肿瘤的原因之一。s 0 d 可消除超氧离子而保护细胞膜“。1 3 一榄香烯也可通过s o d 防御系统抑制肿瘤生长，消除自由基对机体的损伤。b 一榄香烯作为一类高效、低毒、有别于传统化疗药的新型抗癌药物，有着广泛应用前景。目前已开发出注射用乳剂用于临床，并且取得了较好的疗效。但是由于b 一榄香烯是脂溶性药物，刺激性较大，该制剂绎静脉应用后静脉炎的发生率较高，有时会有疼痛、发热等症状出现，影响了该药在临床上的推广与应用。为此，本研究结合脂质体的特点，探索把8 榄香烯这种药物做成脂质体，以减少其刺激性，降低不良反应，提高疗效。并实现缓释性和靶向性的效果。以促进这种新型抗癌药物的推广应用。1 3 脂质体的制备磷脂与水相互作用的结果是磷脂膜自发形成脂质体，当两亲分子分散在水中时，其亲水基团很稳定，而疏水基团不稳定，整体上来说，是能量不稳定体系( 图卜5 ) 。两亲分子在热力学上要处于低能量，首先要使其疏水链浮到水面上指向空气当水表面上铺满分子而水中分子无法进入表面时，为了减少体系的能量，这些分子在水中抱成一团，使分子的亲水基团指向水介质，从而形成自组装体，在溶液中自组装体是能量的稳定形态“。因此制备脂质体的关键不是膜的组装，而是如何使膜形成适当大小、适当结构材料的包封率高的囊泡，并使包封药物在形成脂质体后不漏出。也就是要控制它的粒径均匀度和提高包封率。8天律大学硕上论文第章文献综述图卜5 脂质体形成示意图f i g 1 5 c h a r t o f f o r m i n g l i p o s o m e s目前脂质体的制各还没有实现工业化，还处于在实验室中进行研究制各的阶段。实验室制备方法很多，主要有薄膜水化法、逆相蒸发法、高压均质法、注入法、钙融合法、超声波分散法、去污剂法、冷冻干燥法、熔融法、中和法等等。制备脂质体的所有方法都包括3 4 个基本步骤( 图卜6 ) ：磷脂、胆固醇等脂质与所要包裹的脂溶性物质溶于有机溶剂形成脂质溶液，过滤去除少量不溶性成分，然后在一定条件下除去溶解脂质的有机溶剂。使脂质分散在含有需要包裹的水溶性物质的水溶液中形成脂质体。纯化形成的脂质体，去除未包封药物。对脂质体进行质量分析，检测包封率、粒径、包药量等。各种制备方法的主要差别是脂质双分子层闭合以前膜分散在水溶液中的方式。制备方法按三种分教的基本模式分类，即物理分散、两相分散和去污剂溶解。目前主要的制备方法有一下几种。9天津大学硕十论文第一章文献综述胆吲醇卵磷膳干燥出去来包封物质图卜6 脂质体制备示意图f i g 1 6c h a r to f p r e p a r i n gl i p o s o m e s析1 3 1 薄膜水化法将磷脂、胆固醇等成膜材料溶解在有机溶剂中，在旋转蒸发器上减压蒸发除去有机溶剂，则脂质材料会在旋转烧瓶内壁上形成一层薄膜，这时加入适量缓冲液，充分水合分散，即形成乳白色的脂质体混悬液“，为减小脂质体的粒径并提高脂质体粒径的均匀度，可在一定压力下通过一定孔径的滤膜。该法是脂质体制备方法中最原始也是迄今为止最基本和应用最广泛的方法。它操作简单，包封率高。但薄膜蒸发法由于成膜面积的限制，每批的生产量很小，并且由于中间要停下来加缓冲液分散，导致连续性差，所以不适合工业化生产，现在主要应用在实验室研究中。步天津大学碗七论文第一章文献综连小h l v 5图1 - 7 脂质体通过滤膜示意图f i g 1 7c h a r to fi i p o s o m e sp e r m e a t i n gf i l t r a t i o nf i l m13 2 逆相蒸发法将磷脂等成膜材料溶于有机溶剂如氯仿、乙醚等，加入待包封药物的水溶液进行短时超声，直至形成稳定的水油乳剂。然后减压蒸发有机溶剂，待达到胶态后，加入缓冲液，再旋转蒸发彻底除去有机溶剂，即制得脂质体的乳浊液”。它同薄膜水化法一样，为了降低脂质体的粒径也需要在一定压力下通过一定孔径的滤膜。该种方法能够一次性制备较大的量，但因为要在制各完成后通过滤膜，导致制备不连续，所以要实行工业化生产，必须解决工业化生产所要求的连续性问题。天律大学_ 哦七论文第一章文献综述1 3 3 溶剂注入法1 8 溶剂注入法示意图f i g 1 - 8c h a r to f s o l v e n ti n j e e t i o nm e t h o d将磷脂与胆固醇等成膜材料及脂溶性药物溶于有机溶剂中( 如图1 8 所示) ，经注射器缓缓注入加热至5 0 并用磁力搅拌的磷酸盐缓冲液( 可含水溶性药物) 中，不断搅拌至乙醚乙醇除尽为止。即得脂质体乳剂。将其混悬液通过高压乳均机两次，所得成品大多为单室脂质体，少量为多室脂质体，粒径绝大多数在2 u m 以下。该方法的优点是方法较温和，包封率高且被氧化的可髓性小，缺点是制备周期长，不适合大量制备。天津大学硕上论文第一章文献综述1 3 4 去污剂法洗脱液出口图l 一9 去污剂法制备脂质体工艺f i g i 一9t e c l u f i c so f p r e p a r a t i o nl i p o s o m e sb ye r a d i c a t o rm e t h o d此方法主要是通过去污剂去除法来实现脂质体的制备，其主要的装置为渗透槽、洗脱液储液槽、泵等( 图卜9 ) 。制各时将药物溶液及去污剂放入渗透槽m c 中，去污荆与磷脂分子相连，掩蔽磷脂分子中的疏水部分，磷脂通过去污剂介导与水相密切接触形成混合微团。由于存在浓度差，混合微团会向四周扩散，外有一层选择透过膜，去污剂分子可通过透过膜，容易从混合微团中去除，因此u j 通过透析降低水相中去污剂的浓度，自发形成单层脂质体。该方法的缺点包括脂质体的形成过程中药物的漏出和稀释，脂质体形成后，难以去除微量的去污剂。去除去污剂所用的技术( 如透析、柱层析) 不可避免地去除其它小分子的水溶性物质，该法可以制成粒度较小的脂质体，但增加了除去表面活性剂的透析、超声离心或胶体过滤步骤，而月有许多药物不宜使用表面活性剂，制备的脂质体中有去污剂残余。因此去污剂方法并不是包裹水溶性物质最有效的方法。1 3 5 冷冻干燥法将磷脂高度分散在水溶液中，冷冻干燥，然后再分散到含药的水性介天津大学硕士论空第一荤文献综述质中，形成脂质体，整个过程应在无菌的条件下进行。”。此法尤适用于过热不稳定的药物。有文献报导，冷冻干燥法是目前制备储存脂质体的最佳方法。但在冷冻过程形成的冰晶使脂质体聚集融合，在冷冻和解冻的过程中，膜内外冰晶形成速度不n = 3 1 起渗透压差，造成脂质体裂解，所以在冷冻干燥过程中，应加入冷冻保护剂以减少破坏3 。1 3 6 高压均质法将成膜材料( 卵磷脂和胆固醇) 和待包封药物( 水溶性药物) 分散在磷酸盐缓冲液中，搅拌后循环通过均质机过均质，可得脂质体的乳液。这种方法主要是通过均质机的均质乳化作用促进膜材在缓冲液中的分散，进而形成粒径均匀的脂质体。这种方法操作简单且可大量生产，缺点是该方法因不用有机溶剂导致胆固醇在缓冲液中分散性差，导致形成脂质体的稳定性差。另外，该方法也不适于腊溶性药物脂质体的制各。1 3 7 钙融合法在磷脂丝氩酸所构成的单层脂质体中加入钙离子，使之相互融合成蜗牛壳形圆柱状，加入e d t a ，除去钙离子。即产生大单层脂质体，直径在2 0 0一l 0 0 0 n l i l 之间。这种方法限于磷脂酸、磷脂酰甘油、磷脂酰丝氨酸等酸性磷脂。特点是形成的单层脂质体大条件缓和，可包封d n a 、k n a 等生物高分子。1 3 8 超声波分散法在漳膜分散法基础上，再经超声波处理，制得均匀的单室脂质体：将水溶性药物溶于磷酸盐缓冲液中，并与磷脂、胆固醇与脂溶性药物共溶于有机溶剂的溶液，搅拌蒸发除去有机溶剂，残液以超声波处理，然后分离出脂质体再混悬于磷酸盐缓冲液中，制成脂质体的混悬型注射剂f “。如维生素e 脂质体等的制备。该法制备的脂质体。本法制备的大多为单室脂质体，半径较小( 篓j l o ) 。但其包封率低，且不稳定田1 。1 4天津大学硕士论文第一章文献综述壳氮气制备的脂压体悬浮液图l 1 0 超声波分散法s 示意图f i g 1 1 0c h a r to f u l 仃a s o n i ed i s p e r s i o nm e t h o d1 3 9 复乳法本法是指将少量水相与较多量的磷脂油相进行乳化( 第1 次) 形成w 0的反相胶团，减压除去部分溶剂( 或不除去也可) ，然后加较大量的水相进行( 第2 次) 乳化，形成w o w 型复乳，减压蒸发除去有机溶剂，即得脂质体。此法包封率为2 0 - - 8 0 。1 3 ，1 0 中和法首先将卵磷脂和药物溶于冰醋酸中，然后加入碳酸氢钠中和，使卵磷脂与药物共沉淀。在共沉淀的过程中包裹药物形成脂质体，其中的小离子通过生理盐水透析去除。1 4 各种制备方法的分析上面几种脂质体的制各方法中，现在发展较为成熟、应用最广的的是薄膜水化法，逆相蒸发法。所以本课题采用这两种方法进行了榄香烯脂质体的制备研究。另外，对上述几种制备方法进行分析可以看出，高压均质法和逆相蒸发法具有很大的互补性，逆相蒸发法开始的水油乳剂的形成和最后通过滤膜这两步，可以用高压均质法中的均质处理来代替。另外，逆1 5天津大学顽上论文第一章文献综述相蒸发法是将成膜材料和药物溶于有机溶剂中，这样高压均质法中胆固醇和脂溶性药物在缓冲液中不易扩散的问题就得到了解决。由此，可以将这两种方法进行整合成一种新的方法逆相高压均质法。并以次方法为基础设计一套脂质体的生产工艺及设备。i 5 影响脂质体制备效果的几个因素影响脂质体制备效果的几个因索主要有：卵磷脂、和变温度、胆固醇的含量、加药量、缓冲溶液p i l 值、药物的性质等。1 51 卵磷脂不同性质的卵磷脂对脂质体稳定性和包封率的影响程度不同。其中饱和脂质优于非饱和脂质，蛋黄卵磷脂与大豆卵磷脂制备的腊质体比较：前者均匀圆滑，而后者有微小粒子；前者稳定性较后者好，包封率较后者高。另外，卵磷脂的纯度越好，所形成脂质体的包封率越高c 3 0 jo1 5 2 相变温度脂质体双分子层由凝胶相转变为液晶相时的温度称为帽变温度t m ，卵磷脂的t m 为5 0 。制备脂质体时的温度在其t m 以上时，脂质体双分子层排列紧密，脂质体的稳定性增强。当温度过高时又会导致脂质体双分子层巾疏水链从有序排列变为无序排列，膜的厚度减小，流动性以及通透性增加，脂质体的稳定性减小，药物释放快。“。所以制备脂质体时的温度必须在相变温度t m 以上，但不能过高：在脂质体储存时，储存温度必须远低于相变温度。如果储存温度高于相变温度，就会发生如图卜1 9 所示的药物泄漏现象3 2 1 。1 6最津大学硕上论文第一章文献综述升温至嘶图1 - 1 1 脂质体药物泄漏示意图f i g i - 1 1c h a r t o f m e d i c i n e l e a k i n g f r o m l i p o s o m e s1 5 3 胆固醇的含量脂质体中胆固醇可改变脂质体的相变温度，对膜的流动性产生双向调节作用：在相变温度以上时，它能抑制脂质分子的旋转异构，降低膜的流动性；在相变温度以下时，它又能增加脂质双分子膜的不对称性，增加膜的流动性，由此提高脂质体的稳定性和包封率瞰1 。在一定比例范围内，胆固醇比例越大，包封率越高，因为胆固醇表面活性剂作用使w o 乳液能稳定形成：但胆固醇比例过大时，组成腊质体的磷脂量变少，脂质体膜形成困难，而且不牢固，且由此形成的脂质体膜亲水性太强，膜也容易破坏“”。15 4 加药量脂质体制备中加药量太少会导致所得脂质体的药脂比太低，失去了脂质体的制各意义；但是加药量过大就会导致脂质体包封率低，导致贵重药物的浪费，甚至影响脂质体的形成。“，需要通过实验对最佳加药量进行测定。15 5 磷酸缓冲溶液( p b s ) 的p h 值在p h 为中性条件下脂质体稳定性较好，随着环境液碱性的增加，包封天津大学硕七论文第一章文献综述率下降；在酸性条件下j 】s r l 目 质体不太稳定，随着环境液酸性的增加，包封率也下降 s t j 。1 5 6 药物的性质药物本身的性质对脂质体包封率的影响主要表现在以下几个方面”：药物的溶解性；脂溶性好或者是水溶性特别好的药物容易制得包封率高的脂质体，而中州值的药物就很难制成包封率高的脂质体，通常把他们制成盐或脂化后再制备脂质体。在脂和水中溶解性都比较好的药物，脂质体对该药物从里面到外面没有屏障作用。很难制各包封率高的脂质体。药物电性，与脂质体膜电性相反的药物包封率高。药物分子量，一般分子量大的比分子量小的包封率高。药物的浓度，一般随着药物浓度的增加，容积包封比率瓯下降，药物包封比率e ，上升。l | 6 本课题的提出脂质体作为一种国家认可剂型，已经被收录在2 0 0 0 版药典中，由于在药物包封方面良好的性能，国内众多的制药企业纷纷在进行脂质体方面的新药开发和研究，并且取得了良好的效果，目前已经有多种脂质体药物成功上市，如多柔比星、阿糖胞苷、两性霉素b 、柔红霉素、长春新碱脂质体注射剂等。而6 榄香烯作为一种高效、低毒的抗肿瘤药物，其乳剂存临床用于治疗恶性浆膜腔积液、肺癌、消化道肿瘤、脑癌等方面有着广泛的应用前景，但该制剂在经静脉后静脉炎的发生率较高，有时会有疼痛、发热等症状出现，影响了该药在临床上的推广与应用。为此，本研究结合脂质体的特点，探索把b 榄香烯这种药物做成脂质体，以进一步增加这种新型抗肿瘤药物的应用范围。任何一种药物或约剂要想真l l 三服务于人类，必须要适合工业化生产，否则就很难大范围推广，脂质体也是如此。脂质体的制备目前围内还没有实现工业化，现存的制各基本上都是在实验室中进行的，是为了进行脂质体的性能研究而进行的少量制各，现在国内还没有真正能够大量生产脂质体的生产设备。现在只有深圳绿泰保生物工程有限公司在较大量生产脂质灭津大学硕士论文第一章文献综述体( 5 升批) 绿泰保口服液，但它们所用的设备是通过把实验室中的制备方法一薄膜水化法中的旋转烧瓶几何放大几十倍柬生产的，这也限制了它的产量最大只能是5 升批，并且设备也显得很庞大。这只是实验仪器的简单放大，并不是真正意义上的工业化生产设各，离真正的工业化生产还有一定距离。脂质体工业化生产的问题导致目前脂质体药物面市品种少，并且价格昂贵，这就限制了它应用的推广。为了使药物脂质体更好地发挥它的作用，尤其是在抗肿瘤方面的独特功效，本研究在完成榄香烯脂质体的制各后，以实验室榄香烯脂质体的制备原理为基础并进行了适当改进，设计了一整套生产工兰及设备，希望为脂质体这种新型药剂的推广应用提供一条薪的探索途径。1 7 本课题的主要工作不同浓度缓冲液的配制：不同浓度的缓冲溶液具有不同的p h 值，对脂质体的包封率有一定的影响。为此，需要针对不同的缓冲溶液进行试验研究。分别采用薄膜水化法和逆相蒸发法制各榄香烯脂质体并进行包封率的测定。主要设备的设计、部分设备的采购及工艺的组装。利用新工艺设备进行实验，并进行设备的进一步改进。9天律大学颐十论文第一章实验步骤和方法2 1 实验所用仪器和药品2 1 1 主要实验仪器t u - 1 9 0 1 双光束紫外可见分光光度计8 8 2 3 a - 紫外检测仪r e - 5 2 c 旋转蒸发器s m 一9 5 循环水式多用真空泵8 0 _ 2 离心机k q - - 2 5 0 b 超声波清洗器e y e l an - 1 0 0 0 旋转蒸发仪c l2 0 2 b s 电热恒温干燥箱g c - 1 4 c 气相色谱仪n - 2 0 0 0 双通道色谱工作站电子天平激光粒度仪高压均质机透视电子显微镜21 2 实验所用药品9 一榄香烯( 实验室自行提纯纯度9 7 )胆划醇( 北京化学试剂公司2 5 9 装)卵磷脂( 北京美亚思磷脂技术有限公司)正十六烷( 北京化学试剂公司含量9 9 5 )三氯甲烷( 北京化学试剂公司)( 北京普析通用仪器有限责任公司)( 北京市新技术应用研究所)( 上海浦东物理光学仪器厂)( 河南省予华仪器有限公司)( 上海浦东物理光学仪器厂)( 昆山市超声仪有限公司)( 上海爱朗仪器有限公司)( 天津市中环实验电炉有限公司)( s h i m a i ) z u )( 浙江大学智能信息工程研究所浙江大学智能信息工程有限公司)( m e t t l ea e l o o )( h o l i b al b5 5 0 ，j a p a n )( n i r o s o a v i ，i t a l y )( t e c n a if 2 0 ，p h i l i p s )天津大学硕十论文第二章实验步骤和方法无水乙醇( 北京化学试剂公司)石油醚( 北京化学试剂公司)2 2 实验设计本实验以b 一榄香烯的包封率为实验指标，用正交分析的方法对脂质体包封率影响最大的三个因素迸行实验。采用三因素( 胆固醇，药量，缓冲液) 三水平正交分析法进行实验。2 2 1 卵磷脂与胆固醇的比例根据前人的实验研究，当包封脂溶性药物时，卵磷脂与胆固醇物质的量之比为5 ：ic m l 左右时具有较高的包封率，因此本实验中分别对4 ：1 、5 ：1 、6 t1 进行了研究。2 2 2 加药量的选择在进行脂质体制备时发现，当卵磷脂与胆固醇的物质量之比为4 ：1 时所制备的脂质体的包封率接近1 0 0 ，说明加药量还有增加空间。当把加药量增加到2 ：3 时，脂质体的包封率不到2 0 ，并且经过长时问的超声分散后旋转蒸发器的烧瓶内壁上仍秸有大的卵磷脂颗粒无法分散。这说明由于加药量太大导致部分卵磷脂无法形成脂质体。因此本实验中选择卵磷脂与榄香烯的物质量之比为：l ：1 、2 ：l 、3 ：1 。2 2 3 缓冲溶液的浓度缓冲溶液的p i 值对脂质体的包封率有一定的影响，本实验分别用实验室配常的标准的、稀释l o 倍的和稀释2 0 倍的不同p h 值的缓冲溶液进行实验。2 3 不同缓冲溶液的准备2 3 1 标准磷酸盐缓冲溶液( 1 l p b s ) 的配制天津大学碗t 论文第二章宴验步骤和方法表2 - 1 标准磷酸盐缓冲溶液配料表t a b l e2 - 1d i s p e n s a t i o nt a b l eo f n o r m a lp h o s p h a t ec u s i o ns o l u t i o n将表2 - 1 所示的药品溶解到1 0 0 0 毫升超纯水中，制成标准磷酸盐缓冲溶液。2 321 1 0 0 b , g 的配制将标准磷酸盐缓冲溶液用超纯水稀释至l o 倍即得1 1 0 p b s 的缓冲液。2 331 2 0 p b s 的配制将标准磷酸盐缓冲溶液用超纯水稀释至2 0 倍即得1 2 0 p b s 的缓冲液。2 4 榄香烯脂质体包封率的测定方法( 气相色谱法)2 4 1 测定榄香烯校正因子选用正十六烷作内标物，称取正十六烷1 4 9 2 7 m g 于5 0 m l 的容量瓶中，用无水乙醇定容至5 0 m l 。精确称取榄香烯纯品i o m g 于1 0 m l 容量瓶中，加入内标液l m l ，用无水乙醇定容至1 0 m l 。色谱分析条件色谱柱：毛细柱s e - 5 4 ( 2 5 - 3 0 m ，0 2 - - 0 5 3 m m ，0 2 5 1 j m ) ，柱温：1 6 0 c ，保持7 m i n ，程序升温2 0 c m i n 到2 8 0 c ；进样温度与检测温度：3 0 0 1 2 。载气：n 2 ，1 5 m l m i n ，检测器：f i d ( 氢离子火焰检测器) 进样l u l ，2 0 ：1 分流。测定b e t a 榄香烯和正十六烷的响应峰面积。计算校正因子f 。靠测标( 2 - - 1 )a 标，抑待涮天津人学硕| 论文第二牵实验步骤和方法以表2 2 中的( 1 ) 为例进行计算；取纯度为9 5 5 的b 一榄香烯1 2 r a g ，则榄香烯的量为：1 2 x 0 9 5 5 = 1 1 4 6m g 正十六烷的纯度9 9 5 取l m l ，则币十六烷的量为：1 4 9 2 7 5 0 0 9 9 5 1 0 0 0 = 2 9 7 0 4 3 m g r n l ，根据公式：f | 2 1 9 0 4 5 7 8 6 3 11 4 6 2 9 7 0 4 7 3 = 0 9 8 1 2 1 3 4 1 2表2 2 榄香烯校正因子计算表t a b l e2 - 2t a b l eo f c a l c u l a t i n ge m e n d a t i o ng e n e则平均校正园子f = 1 0 0 5 6 8 0 8 9 7 。2 4 2 溶剂萃取法分离游离榄香烯取榄香烯脂质体5 m l 于5 0 m 1 分液漏斗中，加入1 5 m 1 石油醚。振荡半分钟，静置5 分钟。再次振荡半分钟，静置分层。于1 0 h a l 容量瓶中加入内标液l m l 。( ) 用石油醚萃取液定容至1 0 r a l 并混合均匀。2 ，4 3 包封率的测定取上述样品作气相色谱实验，测定榄香烯与正十六烷的峰面积比，如图所示。根据校正因子，计算游离榄香烯的含量。计算榄香烯的包封率。聊删2 等芋一黼舞。h ，天津尢学硕，1 论文第二章实验步骤和方法图2 1 石油醚萃取液的气相色谱图f i g 2 - 1g a sc h r o m a t o g r a p h yc h a r to f e x t r a c t i o ns o l u t i o no f p e t r o l e u me t h e ra r 计算举例：根据上面公式a 榄香烯a 内标= 峰面积比为3 7 9 2 5 4 5 7 1 9 = - 0 8 2 9 5 2 3 8 3 ，再乘公式( 2 2 ) 计算出游离榄香烯的量：w * = 0 8 2 9 5 2 3 8 3 1 0 0 5 6 8 0 8 9 7 2 9 7 0 4 7 3 0 6 = 4 1 0 6 1 4 2假定榄香烯的总加药量为1 0 7 9n a