（化学工程与技术专业论文）以甘油为底物构建肺炎克雷伯氏重组菌生产3羟基丙酸.pdf

摘要 以甘油为底物构建肺炎克雷伯氏重组菌生产3 一羟基丙酸 摘要 3 羟基丙酸( 3 h p ) 是一种重要的平台化合物，其生物合成方法与工业 化程度引起了广泛的重视。本文选取具有高浓度甘油耐受力的肺炎克雷伯 氏菌( k l e b s i e l l a p n e u m o n i a e ) 作为3 h p 的生产宿主，以k p n e u m o n i a e 的组 成型启动子分别构建了醛脱氢酶基因a l d 4 与甘油脱水酶基因d h a b 的串联 共表达质粒p k p 2 8 a a b ，经s d s p a g e 分析，重组菌的关键酶基因得以 有效表达。摇瓶批式发酵显示，重组菌kp n e u m o n i a e ( p k p 一2 8 a h b ) 在有 氧条件下，3 h p 产量为0 3 3 6g l 一，甘油转化率为o 1 ( m o l m o l g l y c e r 0 1 ) 。 以关键酶共表达质粒p k p 2 8 a a b ，分别转化1 ，3 丙二醇高产菌株k p n e u m o n i a ek 2 与乳酸脱氢酶基因敲除菌株kp n e u m o n i a ek p 5 3 ，获得的 重组菌k 2 a b 与k p 5 3 a b 经初步发酵分析显示，重组菌k 2 a b 在小试 条件下的3 - h p 产量为3 0 9g l ，甘油转化率为o 6 8 ( m o l m o l g l y c e r 0 1 ) ， 相比已构建的重组菌具有最高的3 - h p 生成量；重组菌k p 5 3 a b 的摇瓶 批式发酵结果显示，3 - h p 浓度相比对照菌株提高了l 倍，乳酸浓度降低 了1 倍。 建立了两种消除kp n e u m o n i a e 重组型质粒的方法：连续传代法与 s d s 法。其中，用o 2 s d s 复合c a 2 + 处理kp n e u m o n i a e ，能有效消除 其重组型质粒，获得的质粒消除菌可再次导入新的质粒。利用建立的质粒 消除方法，初步研究了抗性胁迫条件对重组菌生产3 - h p 的影响，发酵分 i 北京化工大学硕士学位论文 析显示，新构建的重组菌3 - h p 生成量相比同基因型的对照菌株提高了 2 4 5 7 。 利用合成生物学领域新兴的应用，设计了构建“细胞工厂”的五个通 用研究步骤。将d n a 组装技术引入实验，以p o l y m e r a s ec y c l i n ga s s e m b l y ( p c a ) 的方法研究质粒构建的问题，并依靠两个线性d n a 片段构建出4 5 k b 的完整质粒，为实现快速有效的非连接酶克隆体系做出有益尝试。 关键词：3 羟基丙酸，肺炎克雷伯氏菌，醛脱氢酶，重组菌，发酵，质 粒消除，d n a 组装 p r o d u c t i o no f3 h y d r o x y p r o p i o n i ca c i d f r o mg l y c e r o lb yr e c o m b i n a n t a b s t r a c t 3 - h y d r o x y p r o p i o n i ca c i d ( 3 - h p ) i sa l li m p o r t a n tb a s i cc h e m i c a l ，w h i c h c a nb et r a n s f o r m e dt om a n yc h e m i c a lr a wm a t e r i a l si nas i n g l es t e p ，s u c ha s a c r y l i ca c i da n d1 ，3 - p r o p a n e d i 0 1 i nt h i sp a p e r ，k l e b s i e l l ap n e u m o n i a ew a s e m p l o y e da st h eh o s ts t r a i n f o r3 - h pp r o d u c t i o n t a k i n ga d v a n t a g eo ft h e c o n s t i t u t i v ep r o m o t e ro f k p n e u m o n i a e ，t h ek e ym e t a b o l i ce n z y m e sw e r ew e l l o v e r e x p r e s s e di nat a n d e mw a yb ys d s - p a g ea n a l y s i s u n d e rt h ea e r o b i c c o n d i t i o n ，b a t c hf e r m e n t a t i o nb yr e c o m b i n a n tkp n e u m o n i a e ( p k p 一2 8 a a b ) s h o w e dt h a tt h ec o n c e n t r a t i o no f3 h pw a s0 3 3 6g l i nf l a s k ，a n dt h e c o n v e r s i o nr a t i ow a so 1m o l m o l g l y c e r 0 1 t r a n s f o r m i n gt h ec o - e x p r e s s i o np l a s m i dp k p - - 2 8 a - a bi n t ot h eh o s ts t r a i n k p n e u m o n i a ek 2 ( h i g hp r o d u c t i o no f1 ，3 - p r o p a n e d i 0 1 ) a n dt h es t r a i nk p n e u m o n i a ek p 5 3 ( 1 a c t a t ed e h y d r o g e n a s ed e l e t i o n ) ，r e c o m b i n a n t so b t a i n e d w e r e i n v e s t i g a t e db yf e r m e n t a t i o n ，r e s p e c t i v e l y i t w a ss h o w e dt h a t r e c o m b i n a n t k p n e u m o n i a ek 2 一a b h a dt h eb e s t p e r f o r m a n c e i nt h e p r o d u c t i o n o f3 一h p a m o n go t h e rr e c o m b i n a n t s ( 3 0 9g - l 3 - h p ，0 6 8 北京化工大学硕：学位论文 m o l m o l g l y c e r 0 1 ) a l s o ，r e c o m b i n a n tkp n e u m o n i a ek p 5 3 a bs h o w e da s i g n i f i c a n t l yd e c r e a s e dl a c t i ca c i dc o n c e n t r a t i o na l o n gw i t har a i s e do u t p u to f 3 h p t oe l i m i n a t et h er e c o m b i n a n tp l a s m i d si nk p n e u m o n i a e ，t w oe f f e c t i v e m e t h o d sw e r ed e v e l o p e d ，i n c l u d i n gs u b c u l t u r i n ga n ds o d i u md o d e c y ls u l p h a t e ( s d s ) t r e a t m e n t t h er e s u l t i n gp l a s m i d f r e es t r a i n sw e r ec a p a b l eo fu p t a k i n g n e wp l a s m i d s ，w h i c hc a nb es e r v e da san e wh o s ts t r a i n s i na d d i t i o n ，t h e e f f e c to fr e s i s t a n c es t r e s so np r o d u c t i o no f3 一h pb yr e c o m b i n a n tw a ss t u d i e d ， a n di tw a sr e v e a l e dt h a tt h ec o n c e n t r a t i o no f3 - h pi n c r e a s e db y2 4 5 7 t h a n t h ec o n t r 0 1 i n s p i r e db ya r c h i t e c t u r ee n g i n e e r i n ga n dh i e r a r c h yo fs y n t h e t i cb i o l o g y , g r o w i n gn o v e la p p l i c a t i o n si ns y n t h e t i cb i o l o g ya r e ac a nb ed r a w ni n t oa “f i v e s t e p ”p r i m a r yb l u e p r i n tf o rd e v i s i n gc e l lf a c t o r i e s g i v e nt h ep r o m i s i n g u s e si nd e v i s i n gc e l l u l a ra r c h i t e c t u r e st oa s s i g nd e s i r e df u n c t i o n s ，w eh a v e e m p l o y e dp o l y m e r a s ec y c li n ga s s e m b l y ( p c a ) t oc o n s t r u c t o u rt a r g e tp l a s m i d f o r t u n a t e l y , a - - 4 5k bc i r c u l a rp l a s m i dh a sb e e nc o n s t r u c t e db yt w ol i n e a r d n a f r a g m e n t sw i t h o u ta n yl i g a s e k e yw o r d s ： 3 - h y d r o x y p r o p i o n i c a c i d ， a c e t a l d e h y d e d e h y d r o g e n a s e ， r e c o m b i n a n t ，f e r m e n t a t i o n ， p l a s i m i de l i m i n a t i o n ，d n aa s s e m b l y i v 北京化工大学硕上学位论文 符号说明 缩写 中文名称全称 3 h p 3 一h p a 1 ，3 一p d g d h t p d o r g d h d h a k d h a d h a p g 3 p g k a t p n a d + n a d h t c a a l d 4 d h a b d h a t p k a m p k a r l 0 d 6 0 0 i p t g x - g a l d 1 v r s d s s d s p a g e t e m e d t r i s u 3 羟基丙酸 3 羟基丙醛 1 3 丙二醇 甘油脱水酶 1 3 丙二醇氧化还原酶 甘油脱氢酶 二羟丙酮激酶 2 一羟基丙酮 2 羟基丙酮磷酸 3 磷酸甘油 甘油激酶 5 一三磷酸腺苷酸 氧化型辅酶i 还原性辅酶i 三羧酸循环 酿酒酵母醛脱氢酶 甘油脱水酶基因 l ，3 丙二醇氧化还原酶基因 d h a 操纵子的启动子区域 氨苄青霉素 硫酸卡那霉素 6 0 0 n m 光密度 异丙基硫代p d 半乳糖苷 5 溴4 氯一3 吲哚p d 半乳糖苷 二硫苏糖醇 十二烷基硫酸钠 s d s 聚丙烯酰胺凝胶电泳 四甲基乙二胺 n 三羟基甲基氨基甲烷 酶活力单位 x v i 符号说明 b i o b r i c k p b a p c a 生物砖 p o l y m e r a s c - b a s e da s s e m b l y p o l y m c r a s ec y c l i n ga s s e m b l y x v i l 北京化工大学位论文原创性声明 本人郑重声明：所呈交的学位论文，是本人在导师的指导下，独立 进行研究工作所取得的成果。除文中已经注明引用的内容外，本论文不含 任何其他个人或集体已经发表或撰写过的作品成果。对本文的研究做出重 要贡献的个人和集体，均已在文中以明确方式标明。本人完全意识到本声 明的法律结果由本人承担。 作者签名：至垦日期：望：兰：2 关于论文使用授权的说明 学位论文作者完全了解北京化工大学有关保留和使用学位论文的规 定，即：研究生在校攻读学位期间论文工作的知识产权单位属北京化工大 学。学校有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允 许学位论文被查阅和借阅；学校可以公布学位论文的全部或部分内容，可 以允许采用影印、缩印或其它复制手段保存、汇编学位论文。 保密论文注释：本学位论文属于保密范围，在上年解密后适用本授 权书。非保密论文注释：本学位论文不属于保密范围，适用本授权书。 作者签名： 导师签名： j 晓 日期：堑：皇：f 日期：型：皇：坚 第一章绪论 1 13 羟基丙酸概况 1 1 13 羟基丙酸理化性质与用途 第一章绪论 3 - 羟基丙酸( 3 - h y d r o x y p r o p i o n i ea c i d ，简称3 一h p ) ，又名p 一羟基丙酸 ( 1 3 - h y d r o x y p r o p i o n i ca c i d ) ，也被称作h y d r o c r y l i ca c i d ，化学索引号( c a s ) 为 5 0 3 - 6 6 2 】， 是一种无色无味的油状液体或糖浆状物质，易溶于水、乙醇、乙醚等有机溶剂，无固 定熔点，加热时分解，生成酸性糖浆。具体的物理性质见表1 1 。 表1 13 羟基丙酸的主要物理性质【1 l t a b l e1 - lt h ep h y s i c sp r o p e r t i e so f3 一h y d r o x y p r o p i o n i ca c i d 3 - h p 是同时具有羟基和羧基两个功能基团的三碳化合物( 图1 1 ) ，蒸馏脱水得丙 烯酸，氧化得草酸和二氧化碳，与氢氧化钾共熔得甲酸、醋酸、草酸和乙醇酸盐。和 乳酸为同分异构体，由于其羟基位置的差异，与乳酸相比，3 - h p 可以更容易地合成 丙烯酸、1 ，3 丙二醇、丙烯醛等重要的化工原材料( 图1 2 ) ；并且同乳酸一样，3 h p 可 相互聚合形成高分子聚合物，d o n g h u iz h a n g 等人报道了用锌催化剂将3 一h p 聚合形成 大分子量聚合物，该聚合物在硬度、延展、成膜等方面均具有良好的性能，并可生物 降解。 h 0 o 3 一h y d r o x y p r o pa n oi cac i d 图1 - 13 一羟基丙酸 f i g 1 - 13 - h y d r o x y p r o p i o n i ca c i d l 0 h 北京化工大学硕上学位论文 3 - h pa sap l a t f o r mc h e m i c a l 图1 - 23 羟基丙酸作为重要的平台化合物 f i g 1 - 23 - h y d r o x y p r o p i o n i ca c i da si m p o r t a n tp l a t f o r mc h e m i c a l 3 h p 可以作为生物聚酯的原料。聚羟基烷酸( p h a ) 是生物可降解热塑性材料，具 有广泛的物理特性，由于在许多生物代谢途径中都可发现3 h p 的存在，在自发生物聚 合反应中特别明显，因此可用3 - h p 作为生物塑料的单体，形成聚3 羟基丙酸 p o l y ( 3 h p ) ，或者是和3 羟基丁酸作用形成聚3 羟基丁酸3 羟基丙酸 p o l y ( 3 h b c o 3 h p ) ( 图1 3 ) 【2 。3 】。c a r g i l l 、德固赛等公司已经开始资助3 羟基丙酸聚合 材料的开发，并取得了一定进展。另外，3 h p 还可用于生产涂料、胶黏剂、水处理化 学品和个人护理用品。基于3 h p 的这些优良性质，其在商业上具有重大的开发价值。 2 0 0 4 年8 月的美国能源部报告将3 h p 列为当前世界上1 2 种最具开发潜力的化工产品之 一。美国卡吉尔( c a r g i l l ) 公司和陶氏( c o d e x i s ) 公司的共同合作研究以谷物类碳水化合 物生产3 h p 的发酵新工艺，并致力于将其商品化。 ( g ) - 3 h a 3 - h p 图1 - 3p o l y ( 3 h b c o h p ) 单体结构 f i g 1 - 3m o n o m e ro fp o l y ( 3 一h b - c o - h p l q ；以 r 毗 ； h e 第一章绪论 1 1 23 羟基丙酸的生产方法 目前，3 h p 的生产方法主要为基于石化原料的化学合成法，由于很难在三碳化 合物的一端引入功能基团，因此不仅利用化学合成法生产3 - h p 的难度较大，而且产 品分离纯化工艺较复杂，生产成本较高，只有少量合成供实验室使用。以美国c a r g i l l 公司为代表的利用微生物生物合成3 - h p 的方法，成为颇具前景的生产策略，目前正 处于研究阶段，可望近年投入工业化生产。 1 ) 化学合成法 3 一h p 在工业上主要采用p 一丙内酯水解制备。也可由羟基丙腈在强碱条件下共热 制得，但是羟基丙腈的价格昂贵，且有剧毒，生产和储运等成本很高。此外，环氧乙 烷羰化加氢可制得3 羟基丙酸甲酯，水解可得到3 羟基丙酸，选择率超过9 0 ，但其 生产过程较复杂，原料环氧乙烷价格又较高，仅三星公司有报道且目的为制取1 3 一丙 二醇。据2 0 0 7 年市场调查，3 羟基丙酸的市场价格很高，国内贸易产品价格高达每吨 3 8 0 0 0 元( 上海) ，一定程度上制约了其下游产品的大规模开发。 2 ) 生物合成法 相比化学合成法，微生物发酵法生产3 - h p 具有条件温和，操作简便；选择性好， 转化率高；副产物少，易于分离纯化；节约能源，设备投资少；可利用非石油基的可 再生资源，环境友好的特点，是一种生产成本最低，污染最少的方法。 微生物发酵法向传统的石油化工提出强有力的挑战，近些年越来越受到重视。韩 国l g 化学研究园2 0 0 8 年报道从土壤中分离得到一株能够利用丙烯酸生物合成3 - h p 的红球菌r h o d o c o c c u se r y t h r o p o l i sl g l 2 ，该菌株能够代谢高浓度的丙烯酸，产生1 7 5 g l _ 的3 h p 。韩国釜山国立大学p a r k 研究团队是目前3 h p 生物法合成研究的领先 团队之一，利用甘油为底物构建了3 - h p 基因工程生产菌株，经发酵工艺的优化与遗 传修饰，该团队2 0 0 9 年报道已获得3 8 7g l o 的3 h p 产量，是目前公开报道中的最 高产量【4 1 。 c a r g i l l 公司和美国能源发展署投资1 2 0 0 万美元，合作研究开发以葡萄糖为底物 构建基因工程菌生产3 一h p 的技术。目前，c a r g i l l 公司与c o d e x i s 公司合作，已经将 部分酶的反应活性从5 提高到9 0 【5 】，并申请了专利，预计产品可在近年进入市场。 美国威斯康辛州a l u m n i 研究基金会于上世纪术开始研究构建基因工程菌生产 3 - h p ，并于2 0 0 1 年申请专利，专利号为w o o l 1 6 3 4 6 a 1 。专利表明，克雷伯氏菌 3 北京化工大学硕士学位论文 ( k l e b s i e l l ap 以p “所d 甩切p ) 可以利用甘油生产l ，3 丙二醇。该细菌体内，存在一个代谢途 径可从甘油出发生产3 羟基丙醛。因此构建基因工程菌，利用甘油作为底物，生产 3 - h p ，最后得到3 - h p 产量为o 1 7g l 一。 1 23 羟基丙酸的生物合成途径 基于微生物发酵法的生物合成工艺，不仅克服了传统化学合成法能耗高、分离工 艺复杂等缺点，而且是以可再生的生物质为原料，可不再依赖日益短缺的石化原料， 是2 1 世纪传统化工行业的可靠替代与前景发展。随着石化资源的日益枯竭，生物基 平台化合物的发展越来越引起人们的重视。作为能够经一步或几步简单反应而生成诸 多重要化学品的平台化合物，3 - h p 已被认为是l o 大最具前景的化合物，并对其生物 可行性展开了研究。 生物法生产3 - h p 的优点是原料来源和价格比较稳定，生产条件温和；主要缺点 是产物含量低，工程菌株的构建过程困难。利用基因工程菌株来生产3 - h p 的制备过 程复杂，且生产效率不高；而利用自然界存在的真菌，又面临通气发酵、培养基复杂 的问题，难以大规模生产并且成本较高。如果能够利用基因工程的优势，把自然界存 在的合成3 h p 的相关酶系的基因分离并克隆到工程菌株，生产效率将会大大提高。 1 2 1 代谢途径设计 在已知微生物中，并没有发现以3 h p 作为主要代谢术端产物的微生物，因此， 利用分子生物学手段与已知代谢途径的数据库，对微生物代谢途径进行遗传修饰与途 径整合，成为构建3 h p 生产菌的重要策略。中科院青岛生物能源与过程研究所x i n g l i n j i a n g 等详细的研究了现有的3 h p 生物合成途径，并对物质、氧化还原平衡，以及热 力学反应倾向性进行了全面的评估，总结出了分别以葡萄糖为底物生产3 - h p 的7 条 途径( 图1 4 ) 、以甘油为底物的4 条途径( 图1 5 ) ，以及基于古生菌绿屈挠菌属具有的 3 - h p 循环途径【6 ，7 】。根据工业生产的成本、控制需求与发酵的代谢途径，研究中暗示 了：净生成a t p 、厌氧条件与总反应步骤a g 3 0c y c l e s 7 2 1m i n3 0sj 7 2 1 0m i n 1 6 f o r e v e r 2 3 3 琼脂糖凝胶电泳鉴定和分离目的基因a l d 4 ( 1 ) 琼脂糖凝胶电泳 电泳是分离，鉴定，纯化生物大分子进行基因工程研究的重要手段，操作简便、 快速。主要分为琼脂糖凝胶电泳和聚丙烯酰胺凝胶电泳。琼脂糖凝胶电泳是d n a 分 子在低电压场中从负极向正极迁移，用低浓度的荧光嵌入染料溴化乙啶( e b ) 进行染色， 可在紫外灯下确定d n a 在凝胶中的位置并检出少至1 1 0n g 的d n a 条带。在琼脂糖 凝胶中，d n a 片断迁移距离与碱基对的对数成反比，因此通过已知大小的标准物移 动的距离与未知片段的移动距离进行比较，便可测出未知片段的大小。 ( 2 ) 从普通琼脂糖凝胶中回收d n a 片段 第二章酿酒酵母醛脱氢酶a l d 4 基因的克隆 目的基因或载体电泳鉴定后在进行下一步操作前要回收，d n a 片段回收试剂盒 的具体步骤为： 将d n a 片段经o 8 的琼脂糖凝胶电泳lh ，凝胶成像系统照像后，紫外灯下小 心凝胶上切下d n a 片段，放于1 5m l 离心管中。 加入3 倍体积的溶胶液，室温下放置5m i n 或5 0 保温3m i n ，其间轻摇离心 管使胶完全溶化。 将溶胶液置于吸附柱上，柱的最大吸附量为2 5n g ，1 2 0 0 0r p m 离心3 0s 使滤液 过柱，弃滤液。 加7 0 0l a l 漂洗液( 浓缩漂洗液使用前，按浓缩漂沈液：无水乙醇= 3 - 7 配成工 作浓度) 。1 2 0 0 0r p m 离心3 0s ，弃洗涤液。 重复步骤4 ，弃完漂洗液后1 2 0 0 0r p m 离心1 0m i n ，室温晾干。 将吸附柱放入新的离心管中，加适量洗脱缓冲液( 3 0p l 为一次标准反应) ，静 置2m i n 。1 2 0 0 0r p m 离心lm i n 。回收过柱洗脱液备用。 2 3 4t a 克隆构建质粒p m d18 t - a l d 4 经t a q 酶扩增的p c r 产物在3 末端多出一个碱基a ，p m d1 8 - t ( 图2 一1 ) 正是针对 这个特点设计的高效克隆载体。 图2 - 1p m d1 8 - t 克隆载体示意图 f i g 2 - 1c l o n i n gv e c t o rp m d 18 - t 回收的a l d 4 目的片段直接与克隆载体p m d18 - t 连接，得到质粒p m d18 一t a l d 4 。 在p c r 管中制备如下连接体系( 1 0p l ) ： 1 9 北京化工大学硕上学位论文 a l d 43p l ( 0 ip m o l 一0 3p m 0 1 ) p m d1 8 - tv e c t o r1 “l ( 5 0n g ，约为0 0 3p m 0 1 ) d d h 2 0 l i g a t i o ns o l u t i o ni 1p l 5p l 连接温度1 6 ，反应过夜。 2 3 5 质粒p m d18 - t - a l d 4 转化大肠杆菌 本实验采用热击转化法，c a c l 2 法制备大肠杆菌感受态细胞的步骤为： 1 ) 将过夜培养的e c o l id h 5 a 转接至3 0m l 1 0 0m l 液体l b 培养基中，3 7 2 0 0 r p m 培养lh4 0m i n ( 至o d 6 0 0 为0 4 0 6 ，呈云雾状) 2 ) 将o d 6 0 0 为o 4 0 6 得菌液冰上放置1 0m i n ，( 边冷却边摇匀，放止局部过冷) ，将 菌液转移至5m l 无菌离心管中( 共4 支，每支4m l 菌液) 3 ) 4 c 下离，巴, ( 4 0 0 0r p m ，1 0m i n ) ，弃上清液 4 ) 每支离心管加入8 0 0 “l 冰冷的0 1 mc a c l 2 溶液重悬浮细胞，冰浴3 0m i n 5 ) 4 下离一t 1 , ( 4 0 0 0r p m ，1 0m i n ) ，弃上清液，收集菌体沉淀 6 ) 用6 4 0l a l 冰冷的0 1mc a c l 2 溶液重悬浮细胞 热击转化法步骤： 1 ) 1 0 01 t l 感受态细胞+ 1 0 “l 连接液，混匀，冰置3 0m i n 2 ) 4 2 水浴精确热击9 0s 3 ) 冰浴2m i n ，立即加8 9 01 t ll b 液体培养基( 或s o c 培养基) 4 ) 3 7 1 2 0r p m 培养1h 5 ) 涂布平板，3 7 ，正面放置3 0m i n ，再倒置培养过夜 2 3 6 质粒p m d18 一t - a i d 4 的鉴定 ( 1 ) 蓝白斑筛选阳性重组子 1 ) 蓝白斑筛选平板的制备 2 0m g m l 。1 的5 溴4 氯一3 吲哚p d 一半乳糖苷( x g a l ) 溶液配制：将o 2g 的x g a l 溶 于二甲基甲酰胺，定容至1 0m l 。用锡箔包裹防止x g a l 见光被破坏。贮存于2 0 。 2 0 0m g m l 。的异丙基硫代p d 半乳糖苷( i p t g ) 溶液的配制：将2gi p t g 溶于8m l 第二章酿酒酵母醛脱氧酶a i d 4 基因的克隆 水中，用水调节体积至1 0m l 。分装成lm l 小份，贮存于2 0 。 在已制备好的l b 平板上，均匀涂布4i t li p t g 和4 0 “lx g a l 。 2 ) 将转化后的细胞涂布于a m p 抗性的上述l b 平板，静置培养后，平板上会出现蓝 色和白色的菌落，白色菌落为阳性克隆，蓝色菌落为非阳性克隆。挑取3 个白色 克隆培养后准备抽提质粒。 3 ) 质粒d n a 的分离纯化 本实验中采用质粒小量快速提取试剂盒。具体操作步骤如下： 5m l 溶液i ；0 n 3 , 1 5 0p lr n a s e ( 1 0m g m l 1 ) ，r n a s e 终浓度达到o 3m g m l 。溶液 i4 保存。浓缩洗涤液使用前按1 ：3 加入无水乙醇。 离心收集1 5 3m l 菌液的沉淀于1 5m l 离心管中，加入1 0 0 此溶液i ，振荡至彻 底悬浮。 加入1 5 0p , l 溶液i i ，立即轻柔地颠倒离心管数次，使菌体充分裂解，裂解后的菌体 变得清亮。将离心管放置于冰上1 2m i n 。 加入1 5 0g l 溶液i i i ，立即温和颠倒数次，室温放置5m i n 。1 2 0 0 0r p m 离心1 2m i n 。 将4 2 01 t l 结合缓冲液加入离心吸附柱，将中的上清加入离心吸附柱中，混匀， 1 2 0 0 0r p m 离心3 0s 。倒掉废液收集管中的废液。 加入7 5 0l a l 洗涤缓冲液于离心吸附柱中，1 2 0 0 0r p m 离心3 0s 。倒掉废液收集管中 的废液。 重复。再次1 2 0 0 0r p m 离心2m i n ，彻底除去漂洗缓冲液。 取出离心吸附柱，将其放入1 5m l 离心管中。加入4 0 此洗脱缓冲液，室温放置 2 5m i n 。1 2 0 0 0r p m 离心1m i n 。再次加入洗脱缓冲液2 0 “l ，室温放置1 2m i n ，1 2 0 0 0 r p m 离心1m i n ，扔掉吸附柱。 ( 2 ) 质粒的酶切鉴定 对重组质粒分别进行单酶切与双酶切，反应体系如表2 2 ： 2 l 北京化工大学硕十学位论文 表2 - 2 酶切反应体系 t a b l e2 - 2t h ec o n d i t i o no fr e s t r i c t i o nd i g e s t s 单酶切反应体系双酶切反应体系 d d h 2 0 7p l d d h 2 03 2 9 l 1 0 x hb u f f e r2p l1 0 x mb u f f e r1 0p l e c o ri 1 l e c o ri4p l h i n d i i i 4 “l 重组质粒d n a ( p m d1 8 - t - a l d 4 ) 1 0p l 重组质粒d n a ( p m d18 - t - a i d 4 ) 5 0p l 总体积2 0 此 总体积 1 0 0 p l 酶切温度为3 7 。c ，反应3h 。 电泳鉴定酶切产物的正确性。将双酶切的a l d 4 产物进行凝胶电泳、切胶回收。 ( 3 ) 序列测定和分析 酶切鉴定j 下确的质粒p m d1 8 t a l d 4 进行测序。序列测定由北京三博远志生物技 术有限责任公司完成。测序结果与g e n b a n k 上已公布的& c e r e v i s i a e ( b a k e r sy e a s t ) 的 a l d 4 序列进行比对和同源性的比较。测序正确的质粒可进行下一步实验。 2 3 7 质粒p k p 2 8 a - a l d 4 的构建 回收的a l d 4 两端为粘性术端，上游是e c o ri 酶切末端，下游是h i n di i i 酶切末端。 将质粒p k p 2 8 a - d h a b t 用同样的酶双酶切处理后，凝胶电泳回收p k p 一2 8 a 载体骨架。 将两者连接，重组表达质粒的示意图如图2 2 。 第二章酿酒酵母醛脱氢酶a l d 4 基凶的克隆 f c o i tl- 加d l l if c o ri f a w d t i i 肚 蹙蒙 慨a i d 4 ( 。1 a c b ) 5 a 出 。“ c o ri 埔门d i i i p g p - 2 8 a - a ld 4 7 k b 图2 - 2 重组表达载体p l p 2 8 a a i d 4 构建示意图 f i g 2 - 2c o n s t r u c t i o no fr e c o m b i n a n tp l a s m i dp k p - 2 8 a - a l d 4 基因a l d 4 和p k p 一2 8 a 连接的反应体系( 1 0l x l ) ： d d h 2 0 4 “l a l d 4 ， 5l a l ( 0 1p m o l - 0 3p m 0 1 ) p k p - 2 8 a1 肛l ( 约o 0 3p m 0 1 ) 1 0 x t 4b u f f e r l “l 连接酶 lh l 连接温度为1 6 ，反应过夜。 连接结束后6 5 热失活2 0m i n 。 连接产物经热击转化法转化ec o l id h 5 0 t ，3 7 温育lh 后，涂布于含k a n 的 l b 平板，静置培养待长出菌落进行筛选。 2 3 8 质粒p k p 2 8 a - a l d 4 的鉴定 ( 1 ) 菌落p c r 筛选阳性重组子 菌落p c r 是直接利用菌体变性作为模板进行的聚合酶链式反应。在筛选阳性重 组子时可以省去菌体培养、提取质粒这些步骤，是快速筛选的一个方法。将a l d 4 和 p k p - 2 8 a 的连接产物转化后，挑取k a r l 抗性平板上长出的单菌落溶解于灭菌水中，加 入如下的p c r 反应体系( 2 0p l ) 中： 1 0 x p c rb u f f e r 2 “l 北京化工人学硕：f ：学位论文 引物a l d 4 e c o 1 引物a i d 4 h i n d 2 模板( 溶解菌液) d n t p s t a q d d h 2 0 反应过程同2 3 2 。 1p l 1 “l 1p l 2p l 0 5p l 1 2 5l a l ( 2 ) 酶切鉴定 选择菌落p c r 验证为阳性的重组大肠杆菌提取质粒，双酶切( e c o ri 与h i n di i i ) 对重组质粒p k p 2 8 a - a l d 4 进行鉴定，反应体系( 2 0r t l ) ： 1 0 x mb u f f e r2i t l 重组质粒l ol i l e c o ri 1 l h i n di i ilp l d d h 2 0 6p l 酶切温度为3 7 ，反应4h 。 ( 3 ) 序列测定与分析 酶切鉴定正确的质粒，以p e t 通用引物p e tu p s t r e a mp r i m e r # 6 9 2 1 4 3 与t 7 t e r m i n a t o rp r i m e r # 6 9 3 3 7 3 进行测序( 表2 3 ) 。测序结果确定读码框正确的重组质粒 p k p - 2 8 a - a i d 4 电转化kp n e u m o n i a e 后即可进行表达与目标产物3 h p 的测定。 表2 - 3 p e t 通用引物 t a b l e2 - 3u n i v e r s a l m e r so fp e t 引物名称序列 p e tu p s t r e a mp r i m e r # 6 9 2 14 - 3 t 7t e r m i n a t o rp r i m e r # 6 9 3 3 7 3 5 a t g c g t c c g g c g t a g a 3 5 一t g c t a g l v i a t t g c t c a g c g g 3 2 3 9 重组质粒p k p 2 8 a - a l d 4 电击法转化kp n e u m o n i a e ( 1 ) kp n e u m o n i a e 感受态细胞的制备 足p n e u m o n i a e 感受念细胞的制作步骤为： 将培养好的处于对数生长前期( o d 6 0 0 为0 5 0 7 ) 的菌液置于冰浴2 0m i n ，以后 所有的步骤尽量保持细胞温度在0 左右。 2 4 第二章酿酒酵母醛脱氢酶a i d 4 基因的克隆 将培养液2 5 0m l 装于预冷的离心管中，4 1 2 0 0 0g 离心1 5m i n 。 小心移去上清。若界面不清，可以损失少量细胞。 将沉淀重新悬浮于2 5 0m l 灭菌、冰冷的d d h 2 0 中，4 。c1 2 0 0 0g 离心1 5m i n ， 小心移去上清。 将沉淀悬浮于1 2 5m l 灭菌、冰冷的d d h 2 0 中，4 c1 2 0 0 0g 离心1 5m i n ，小 心移去上清。 将沉淀悬浮于约2 0m l 灭菌、冰冷的d d h 2 0 中，转移至3 0m l 无菌预冷离心 管中。4 。c ，1 2 0 0 0g 离心1 5m i n ，小心移去上清。 最后将细胞重新悬浮于1m l 到2m l 灭菌、冰冷的d d h 2 0 中。 将上步感受态细胞分装成数个5 0 l1 5m l 离心管，2 0 保存待用。 ( 2 ) 重组质粒电击转化尼p n e u m o n i a e 电击法转化的具体步骤为： 在冰上解冻感受态细胞。每个待转化的样品需一个预冷的1 5m l 的离心管和 一个0 1c m 或0 2c m 的电转化杯。 在一个预冷的1 5m l 的离心管中将5 0p l 感受态细胞与l l 到4p l 的d n a 混合( d n a 应保存在低离子强度的缓冲液中，如t e 缓冲液) ，充分混合并在冰上放置 1r a i n 。 使用0 1c m 电击杯时，把仪器调至e c1 ；使用0 2c r n 电击杯时，把仪器调至 e c2 或e e3 。 将感受态细胞和d n a 的混合物移至预冷的电转化杯中，轻敲杯子使悬浮液集 中于杯子底部。将杯子放于滑动条的孔中，把滑动条推进滑动框至电转化杯被基座上 的金属触片夹紧。释放电脉冲一次。 将电转化杯从基座中拿出，迅速向杯中加入s o c 培养基，快速而轻柔地用吸 头吹悬细胞。 将细胞悬浮物移至试管中，3 7 ，1 8 0r p m 培养lh 。 将转化后的细胞涂布于抗性l b 平板上进行筛选。 2 4 结果与讨论 2 4 1 & c e r e v i s i a e 基因组d n a 的提取 提取的酿酒酵母sc e r e v i s i a e 基因组d n a 经琼脂糖凝胶电泳分析，结果如图2 3 。 可以看出，提取的基因组为一整齐的条带，没有降解，可以进行后续实验。但电泳图 北京化i 太学硬士学拉论文 底部有大团小分子显色，可能是提取过程中降解的r n a 未除干净，因此在作为模板 进行p c r 之前，加入少量r n a s o 。 m1 i 3 0 6 5 5 3 凰2 - 3 se e r e v h a e 基困组d n a md n a 分子量标记，l 基因组d n a f 醵2 - 3 t h e g e n o m e d n a o f 8e e r e v r s a e md n a m a r k e r ，1g e a o m e d n a 2 42 聚台酶链式反应扩增基因a i d 4 经过p c r 反应条件的摸索，成功的克隆了编码醛脱氢酶的基因a i d 4 ，分子量大 小为1 5 6 0 b p 。如图2 _ 4 所示r 在一l6 k b 左右有一特异条带。 第= 章酿硒酵母醛脱氢酶a l d 4 基因的克隆 圈2 一p c r 扩增的a i d 4 基困 md n a 分于量标记1 - 3p c r 产物 0 4p c r p r o d u c t o f a l d 4 md n a m a r k 日，i - 3p c r p r o d u c t s 2 43 t 载体重组子的鉴定 在转化a l d 4 基因的l b 平板上随机挑取白色菌落，培养后提取质粒进行单酶切与 双酶切鉴定( 图2 - 5 ) 。结果显示a l d 4 基因已经插入载体，重组质粒命名为p m d1 8 - t a i d 4 。 圈2 重组质粒p m d l 8 - t - a i d 4 的酶切鉴定 m d n a 分子量标记，1 重组质粒p m d l 8 - t a l d 4 烈酶切产物2 - 5 重组质粒p m d l 8 - t - a i d 4 单酶 切产物 北京化工大学碛士学位论文 聪2 - 5 i d e n t i f i c a t i o no f t h e p l a 。m i d p m d l 8 t 越“b y 瑚疵d 击睁咖n md n a m r i k 日1p m d l 8 - t - a i d 4