（光学工程专业论文）多参量血液分析生物传感器的研究.pdf

中文摘要 随着我国人口年龄结构的变化和人们对健康水平改善提高的要求，临床 医学上需要实现对疾病的早期发现，以便早期诊疗和早期治疗。如果对一些疾 病的先期预兆，如血糖，胆固醇等能够进行快速、简便、有效测定，就能实现 疾病的早期发现，同时便于病人的自我监护。 本文将生物芯片技术应用于血液分析检测，耳的是研制出一种多参量血 液分析生物传感器，利用一滴血同时进行血糖、总胆固醇、酮体、乳酸浓度的 快速、精确测定，为病人特别是糖尿病伴发高血脂症等病人的l | 缶床监护和高龄 者的自我监护提供了帮助，也为疾病的先期预兆提供很好的检测手段。 本论文主要完成了以下工作： 由于在生物芯片中测量微量液体的反应，电极需要微型化，反应电流也 很微小，本文成功地把i d a 微电极应用于传感器中，提高了电流响应幅度和测 量灵敏度。通过光刻、薄膜沉积等微加工技术制作出i d a 微电极，并且同时采 用了基于剥离和基于腐蚀两种工艺流程。 研究生物酶与血液中待测目标之间在不同反应条件下的反应电流大小， 针对不同的待测物配比酶溶液，在不同区域的微电极上分别固定酶。 设计制作了血液分配机构，用于快速均匀的分配血液和分隔反应区。 设计并开发了多通道微电流测试仪，通过检测反应电流，根据电流一浓 度关系从而确定待测物浓度。 完成生物传感器整体特性的测试与鉴定。 关键词：生物传感器，i d a 微电极，微加工，酶电极，血液检测 a b st r a c t w i mt h ec h a n c e so f t h ep o p u l a t i o na g es t r u c t u r ea n dt h er e q u i r e m e n to f i m p r o v e m e n ti ni t sh e a l t hl e v e l s o m ee n h a n c e m e n t st ot h ec l i n i cm e d i c a la r e e x p e c t e d s p e c i a l i s tp o i n to u tt h ec u r em e d i c a lw i l lb er e p l a c e db yp r e v e n t i v e m e d i c a li nt h ef u t u r e t h e r e f o r e ，e f f e c t i v e 。s i m p l ea n dc o n v e n i e n td e t e r m i n a t i o no f d i s e a s eo m e ni na d v a n c e ，s u c ha st h ec h a n g eo f b l o o dg l u c o s e ，t o t a lc h o l e s t e r o la n d o t h e rb i o c h e m i c a lc h a r a c t e r s ，h a sa t t r a c t e dag r e a td e a lo f i n t e r e s ti nt h er e s e a r c h f i e l do f m e d i c a l ， b i o c h i pt e c h n i q u ei sa p # i e d t ob l o o da n a l y s i sa n dm e a s u r e m e n ti nt h i st h e s i s a m u l t i - p a r a m e t e r sb i o s e n s o ru s e df o rb l o o da n a l y s i si nm e d i c i n eh a sb e e n r e s e a r c h e da n df a b r i c a t e d ，b yw h i c ht h ec o n c e n t r a t i o nt e s t so f b l o o ds u g a r ，t o t a l c h o l e s t e r o l ，a c e t o n eb o d ya n dl a c t i ca c i di no n l yo n ed r o po f b l o o da r em a d e s i m u l t a n e o l l s t h em a i nr e s e a r c hw o r ki si n t r o d u c e db r i e f l y , a sf o l l o w s ： s i n c em i c r o d o s a g eo f l i q u i di st e s t e do nb i o c h i p s ，e l e c t r o d e sn e e dt ob e m i n i a t u r i z e da n dt h er e a c t i o nc u r r e n ti sv e r ys m a l l t h e r e f o r ei d am i e r o e l e c t r o d e s a r ea p p l i e dt ot h i sb i o s e n s o r , b e c a u s et h e i rp a r t i c u l a rs t r u c t u r ei sv e r ye f f e c t i v ei n e n h a n c i n gt h er e s p o n s ec u r r e n ta n dm e a s u r e m e n ts e n s i t i v i t y 1 1 l ei d a m i c r o e l e c t r o d e sa r ef a b r i c a t e db yp h o t o g r a p h y ，f i l md e p o s i t i o na n do t h e r m i c r o f a b r i c a t i o nt e c h n i q u e s ，a n dt w o p r o c e s sf l o w sb a s e d0 1 1l i t - o f fa n de t c h i n ga l e c a r r i e do u t t h ec u r r e n to f c h e m i c a lr e a c t i o nb e t w e e ne n z y m e sa n db l o o dc o n t e n t sd e p e n d s o nc o n d i t i o n s f o rd i f f e r e n tb l o o dp a r a m e t e r , 翻i z y m es o l u t i o n sw i t hr a t a b l e s u b s t a n c ea r ef o r m e da n de n z y m em i x t u r e sa r em o d i f l e do nt h es u r f a c eo f d i f f e r e n t m i c r o e l e c t r o d e s b l o o dd i s t r i b u t i o ns t r u c t u r ei sd e s i g n e da n df a b r i c a t e d ，t od i s t r i b u t eb l o o da n d i s o l a t er e a c t i o na r e a s am u l t i c h a n n e l i n s t r u m e n tf o rc u r r e n tm e a s u r e m e n ti sd e s i g n e da n dd e v e l o p e d t ot e s tr e a c t i o nc u r r e n t t h es y s t e mc h a r a e t e r i s t i c so f t h eb i o s e n s o ra r et e s t e da n di t sq u a l i f i c a t i o nt e s ti s c a r r i e do u t k e y w o r d s ：b i o s e n s o r , i d am i c r o e l e c t r o d e ，m i c r o f a b r i c a t i o n ，e l l z y m ee l e c t r o d e ， b l o o da n a l y s i s 独创性声明 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作和取得 的研究成果，除了文中特别加以标注和致谢之处外，论文中不包含其他人已经 发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得苤垄盘壁或其他教育机构的学 位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均己 在论文中作了明确的说明并表示了谢意。 学位论文作者签名：黝签字日期：耐年，2 月，。日 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解墨盗盘茔有关保留、使用学位论文的规定。 特授权鑫盗盘茔可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检 索，并采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编以供查阅和借阅。同意学 校向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘。 ( 保密的学位论文在解密后适用本授权说明) 学位论文作者签名：雾学毒 导师签名：隋才聿一 签字日期：函艿年肛月一日 签字日期：2 。陴。z 月扣日 第一章绪论 1 1 研究背景和实际意义 第一章绪论 人口进入老龄化社会，高龄者的健康问题日益引起全世界范围内的研究 人员的关注。专家指出，今后医疗手段的发展方向，将有现在的治疗医疗向将来 的预防医疗转变，因此，对一些疾病的先期预兆，如血糖、尿素、胆固醇、乳 酸等生化指标的变化，进行有效、简便、快速、准确的测定，愈发引起医疗界 的关注。 糖尿病和高血脂症成为人类健康的两大杀手，并且糖尿病人常伴发高血 腊症，糖尿病患者全球约1 5 亿( 中国3 0 0 0 万) 、高血脂患者约2 亿( 中国 4 0 0 0 万) ，糖尿病人伴发高血脂症约4 0 0 0 万人( 中国约1 0 0 0 万) 。糖尿病 和高血脂症人口的成长速度约为一般人口成长速度的两倍，以l0 至12 乡6 的比例增加。如果能够实现血糖、血脂等参数的同时、快速测量，必将给人类 健康带来福音，并将实现巨大的市场回报。 目前市场上利用酶法检测血液产品主要是针对单一生化参数的检测，较 为常见的如血糖仪。多参量血液生化检测仪为数不多，主要有美国雅培公司推 出的“血糖血酮仪”，德国罗氏推出的“爱康全”血糖、胆固醇、甘油三脂 三参数检测仪( 光学检测) 。本文给出一种多参量血液分析生物传感器，以生 物酶作为敏感基元，通过微加工制作出微电极和微反应腔。利用一滴血，在同 一生物芯片上通过测量微电极上生化反应所产生的微电流分别测试血液中血 糖，总胆固醇，酮体和乳酸浓度四个参量。具有反应速度快、灵敏度高、携带 方便等特点，具有广阔的应用前景。同时本研究也将为实现血液检测仪器的功 能多元化、仪器体积微型化奠定坚实的技术基础。 1 2 生物芯片和p t a s 1 2 1 生物芯片 生物芯片( b i o c h i p ) 的概念来自于计算机芯片，发展至今不过十几年左 右，但进展迅速。由于最初的生物芯片的主要目标是用于d n a 序列的测定，基 第一章绪论 因表达谱鉴定和基因突变体的检测和分析，所以有时生物芯片又被称为基因芯 片( g e n e c h i p ) 或d n a 芯片。目前这一技术已扩展至很多领域。 芯片分析的实质是在面积不大的基片表面上有序地点阵排列了一系列固定 于一定位置的可寻址的敏感物质，结合或反应在相同条件下进行。反应结果用 各种物理或化学手段进行转换成电信号，通过计算机进行分析处理，综合成可 读的数据信剧“。 芯片分析实际上就是传感器阵列分析。芯片点阵中每个单元都是一个微型 传感器测头。所以传感器技术的最新进展往往都被应用于芯片的发展。阵列检 测可以大大提高检测效率，减少工作量，增加可比性。所以芯片分析技术实际 上就是传感技术的发展和提高。 芯片型实验室( l a bo r lac h i p ) 是9 0 年代后出现的一个新的研究领域。顾 名思义，它是以芯片分析为基础，其功能已从单一分析测定发展为集各种分析 化学所需的实验室基本操作于一体的“微型实验室”。所以，可以这样认为， 芯片分析的最终目的是实现“芯片型实验室”。将传统的分析化学所需的仪器 设备在微型芯片上实现。本文所述及的血液分析的生物传感器就是为实现这一 目的而进行的。 “芯片实验室”是一个理想化的新概念，而f f f a s ( m i n i a t u r i z e dt o t a l a n a l y s i ss y s t e m ) 系统则是一个具体的科学新概念。 1 2 2g t a s 概念的提出 在过去的4 0 年里，随着科学技术的发展，分析化学经历了一个动态发展 和连续提高的阶段。2 0 年前，分析化学达到了一个“艺术的顶峰”：检测极限 达到百万分之一( p p b ) ，检测时间缩短到一个小时以内，同时，分析仪器己经 露出t 4 , 型化的曙光1 2 。但是，另一方面，对于不同检测内容，需要由不同的 检测手段和检测仪器来进行。通常，任何一项检测内容，都需要有一台专门的 仪器甚至个专门的实验室来进行。而在化学工业生产中，为实现过程控制和 产品质量控制，需要对多个参量进行快速高效在线( o n l i n e ) 检测。这对于传 统的分析化学检测手段，无疑是一个极大的挑战。所以，对于从事工业分析化 学的研究人员来说，如果能够有一种实时( r e a l t i m e ) 多参量分析检测系统，以 实现能有足够的时间对分析检测的结果中预示的某种潜在问题进行处理。这对 于产品质量控制，无疑是一种技术上的飞跃。同时，这一要求，也引起了从事 环境科学和医学领域的研究人员的重视。为了实现这个目的，需要在一个分析 检测系统中集成各种分析化学所必需的环节和步骤，以实现对多个不同参量进 第一章绪论 行检测。这种测试系统被命名为t a s ( t o t a lc h e m i c a la n a l y s i ss y s t e m ) 测 试系统。t a s 系统具有自动采样、传送、信号变换、信号处理和结果分析等功 能。它实现了自动地将需要连续检测的化学信号转换成测量结果，极大地提高 了分析检测效率，从而实现了对被测内容的连续检测。 图1 1p t a s 系统结构示意图 尽管，t a s 系统极大地提高了系统的分析检测效率，但由于t a s 系统需要 将大量试样消耗在预处理阶段，所以明显增大了化学试剂消耗，同时也延长了 分析检测所需的时间。另外由于体积庞大，也极大地限制了它的应用范卧”。 为解决t a s 测试系统的体积庞大，试剂消耗量大等问题，一个新的分析测 试概念酊a s ( m i n i a t u r i z e dt o t a la n a l y s i ss y s t e m ) 被提出。 l t a s 这个 概念的是以t a s 为基础提出的，“t a s 实际上可以认为是一个微型化t a s 系 统。a m a n z 于1 9 9 0 年首次提出p t a s 这个概念如果能够可以极大地减小 t a s 系统的体积，使其所有功能，如采样环节等，与检测部分集成在一起的 话，我们则可以称其为肛t a s 4 。p t a s 系统结构如图l 一1 所示。从流体力学理 论和扩散理论我们可知，口a s 系统相对于t a s 系统，在如色谱分离，电泳分 离能力和试样传递时间等方面，必将具有更为快速高效的特点。同时，化学试 剂的消耗，也将惊人地减少。 第一章绪论 1 2 3u 1 a s 的设计原理和特点 由于微加工和微电子技术的引入，使蚵a s 系统的体积大大减小。我们知 道如果仪器的几何尺寸为d ，如流路的内径，则体积为d 3 ；如果d 减小为原来 的1 1 0 ，则体积减小为原来的i 1 0 0 0 。同时，由于d 的减小，分析检测所需 的时间也将大大减小，效率将大大提高。 灯a s 系统随着系统的小型化，微型化，与传统的化学分析测试仪器相比， 具有以下特点【5 】： 1 体积小，重量轻，便于携带，适于现场使用的特点； 2 试剂的消耗少，极大减小化学废液对环境的污染； 3 检测效率高，适于实时在线检测； 4 体积小，重量轻，便于携带，适于现场使用的特点； 5 自动化程度高，操作简单； 6 极大地降低了生产和使用费用； 7 为一些不能应用常规检测仪器进行宏观检测的研究提供了微量检测的 解决办法。 1 3 生物传感器和酶电极 1 3 i 生物传感器的概念和分类 在现代分析生物化学众多新兴测定技术中，生物传感器以其专一的识别 功能，可在复杂的有机、生化样品中进行快速分析检测，甚至生物活体测定的 独到优势，在近2 0 年的时间里得到迅速发展，引起人们的普遍关注。 生物传感器于1 9 6 7 年首次问世，到8 0 年代，这一概念便己在国际上得到 公认。1 9 9 1 年，国际学术权威机构i u p a c ( 国际纯粹和应用化学联合会) 发表了 化学、生物传感器的名称、术语的文件，这标志着生物传感器的研究和开发进 入了新的阶段。目前，由于众多学科诸如材料科学、生命科学、电子技术、生 物技术等的参与研究开发，使生物传感器成为分析生物技术领域中活跃的分 支。 所谓生物传感器，是由固定化的生物材料包括酶、抗体、微生物等生物活 性物质与适当的换能器件密切配合而构成的分析工具或系统，可将生化信号转 换成可定量的电或光信号，从而实现对特定底物的快速检测。由于生物活性物 质具有专一的识别功能，使得生物传感器具有较高的选择性，能直接应用于复 第一章绪论 杂样品的测定。敏感基元指的是对目标物进行选择性作用的生物活性单元，根 据敏感基元的工作原理的不同，生物传感器可以被分为两类：即催化型生物传 感器和亲和型生物传感器。前者利用了如酶等生物敏感基元的专一性和催化 性，它检测的是整个反应动力学过程的总效应：后者利用了分子问特异的亲和 性，如免疫传感器等，它检测的是热力学平衡的结果( 1 l 。 目前，生物传感器中主要的生物敏感基元有4 种： ( 1 ) 酶 酶是生化反应的高效催化剂，对目标物具有高度的专一性。在反应过程 中，利用氧化还原酶的电子转移，或利用反应前后目标物或产物的浓度变化进 行检测。基于酶的生物传感器目前应用较为广泛。 ( 2 ) 抗原和抗体 抗原是能被动物组织作为一种外源性物质进行特异性识别的物质分子，相 伴随产生的防护性机制称之为免疫反应。通过抗原和抗体在换能器表面的结 合，利用质量检测的方法或s p r 方法进行检测。 ( 3 ) 受体 利用受体与特定目标物的结合，通过q c m 或s p r 技术进行检测。目前，作 为识别元件用于生物传感器研究实验，大部分只限于烟酞胺乙酞胆碱受体( n a c h r ) ，这主要是由于其他受体在生物体中只存在很小量，不易分离而大量获 得。 ( 4 ) 核酸 核酸具有最高的生物选择性，利用核酸分子杂交的原理对目标物进行检测 的核酸生物传感器从理论上讲具有极其美好的发展前景，因而成为目前生物传 感器研究领域最前沿的研究课题。 换能器指的是能捕捉敏感基元与目标物之间的作用过程，并将其表达为物 理信号的元件。最早应用的换能器就是前面所提到的电化学传感器。这类换能 器既可以是电位型的也可以是电流型的，所不同的是前者测定零电流下电极表 面的电荷密度：后者测定衡电压下工作电极在反应过程中的电流变化。随着研 究的深入，各种物理手段不断地被引入了生物传感器。按最终表达物理信号对 生物传感器分类，生物传感器有：( a ) 质量检测，如质量，频率等；( b ) 电特性 检测，如电量，电阻等；( c ) 光检测，如折射角，光强等；( d ) s q r ；( e ) 光谱 检测：( f ) m a c h - z e h n d e r 干涉检测1 6 】。 第一章绪论 1 3 2 酶电极 生物传感器中研究最多是酶电化学传感器，它由固定化的酶和电化学器件 构成，酶作为敏感基元，作为电化学器件使用的是各种电极。 最早研究的c l a r k 7 1 型生物传感器，其基本原理是借助于溶液中溶解的氧 实现酶与电极间的电子传递。底物的测定是通过检测产物过氧化氢浓度的变化 或氧的消耗量来进行的。七十年代便实现产业化，广泛用于发酵和食品工业。 但这种方法具有如下局限性：1 ) 响应信号与氧分压或溶氧关系较大，氧分压的 变化对以氧电极为基础电极的酶电极有明显干扰：2 ) 氧分子也是氧化酶的底 物，当溶解氧浓度很低时，难以保证被测物的氧化，从而造成测定的线性范围 过于狭窄；3 ) 酶促反应产生的过氧化氢的积累可使酶去活化；4 ) 一些生理电活 性物质如抗坏血酸和尿素等也会被电极氧化，产生干扰信号。这些缺点限制了 生物传感器的进一步推广和应用。 媒质酶电极( m e d i a t e de n z y m ee l e c t r o d e s ) 是一类以化学媒质代替 0 2 h 2 0 2 在酶与电极之间进行电子传递的酶传感器【8 l 。1 9 8 4 年c a s s 0 等首先报 道了一种以二茂铁衍生物作为电子媒质的葡萄耱传感器，由此开创了酶媒 质生物反应以及媒质生物传感器的研究领域。媒质是一类小的电活性有机物 质，主要有二茂铁及其衍生物、四硫富瓦烯( t t f ) 、四氰醌二烷( t c n q ) 、苯醌 和铁氰化钾等。它们一般具有比较低的氧还电位，能在较低的工作电压下在酶 氧还中心与电极之间进彳亍电子传递。因此避免了其它许多电极活性物质的干 扰。此外，媒质的应用可使电极响应的线性范围拓宽，过电位降低，噪音、背 景电流及干扰信号均减小【g l 。与氧电极和h 2 0 2 电极为代表的第一代生物传感 器相比，媒质酶电极具有明显的优越性。因此，媒质酶电极的出现被视为生物 电子学和生物传感器领域里最令人瞩目的成就之一。媒质酶电极基本原理如图 1 2 。氧化态的酶( e o x ) 在其将底物氧化为产物的过程中得到电子而被还原 ( e r e d ) 。还原态的媒质( m r e d ) 在电极表面被氧化激活( m o x ) 后，接受酶活性中 心的电子又重新被还原( f a e d ) 。还原态的媒质( m r e d ) 重新被电极氧化而失去电 子产生电流，从而使电子从酶传递给电极。媒质重新被氧化产生的电流信号即 可反映被测基质中的底物浓度。经与丝网印刷技术结合，构成能大批量生产 的、性能优良的一次性( d i s p o s a b l e ) 酶电极。其主导产品便携式血糖酶电极己 经拥有大约5 0 世界市场份额，是迄今开发最为成功的生物传感器。其原始论 文被s c i 源论文引用7 0 0 余次，主要作者c a s s 和h i l l 在他们的合作论文发表 十年后( 1 9 9 4 ) 共同获得英国皇家学会m u l l a r 奖。 第一章绪论 m i e d m o x e f e d e o x 图1 2 媒质酶电极氧化还原反应原理 1 3 3 酶电极的一些新技术 s u b s t r a t e p r o d u c t 1 高分子导电聚合物酶电极技术 从1 9 9 0 年开始，人们开始利用高分子导电聚合物膜修饰电极来固定化 酶，用于血液、尿液及发酵液中葡萄糖的检测，其中葡萄糖氧化酶电极是最常 用的。在检测过程中，由于实际样品组成复杂，除葡萄糖外还含有其他成分， 而且某些组份的相对含量往往不固定，因此会对葡萄糖的检测造成干扰。9 0 年代以来导电聚合物膜如聚毗咯、聚苯酚、聚邻二氨基苯等用于构造葡萄糖氧 化酶电极的研究越来越多，这是由于电聚合物膜制备方法简单，得到的膜厚度 均匀，可以用于任何形状和大小的电极，可以先在电极表面聚合一层聚合物膜 作为固定酶的基质，利用膜表面含有的一n i - i s 、- - o h 等活性基团实现酶的固 定化【1 0 1 ，很多研究者在电聚合成膜的同时通过物理包埋或静电作用将酶固 定，电聚合膜还可以起到阻止测试液中的杂质扩散到电极表面并抑制干扰物质 响应的作用。酶通过导电高分子聚合物固定在金属电极上，大大提高了酶在电 极表面的附着能力和传感器的抗干扰能力，延长酶电极的使用时间，同时可以 精确控制酶膜的厚度和酶在电极上的量，因此这类传感器具有非常好的复现 性。由于酶分子被牢固地固定在高分子膜中，在检测时不容易从酶膜中脱落， 具有较好的重复使用性，很适宜在在线检测中使用。 2 流动注射式酶电极系统 流动注射系统在最近几年得到了飞速的发展，特别是在电化学领域，由于 电极和样品腔可以通过微细加工技术制作得非常微小，所以整个系统也能够设 计的很小，这样就可以在很小的空间内设计出很复杂、完整的检测系统，国外 称为微型实验室。在酶电极检测领域，这种技术也在不断发展中。本文描述的 酶电极就是一种流动注射式酶电极。 眄一ect等de，o11r8 第一章绪论 3 纳米粒子葡萄糖酶电极 由于纳米粒子具有优异的电特性和吸附性，正在被越来越多地应用到酶的 固定化和酶催化反应过程中，充当固定剂和催化剂。目前在酶电极检测领域 中，最受关注的是纳米金和纳米碳管两种纳米粒子，通过实验，科研人员发现 了一些有趣的现象，虽然尚无一套公认的理论来解释有关结果，但纳米粒子对 酶电极传感器响应的促进与优化作用却是确实存在的。 在纳米金方面，由于纳米金比表面积大、表面反应活性高、表面活性中心 多、吸附能力强，可增加酶的吸附量和稳定性，已有研究证吲”j 在酶电极中 添加纳米金可使电极的响应得到有效提高。孟宪伟等【1 2 】发现修饰了超细憎水 纳米金的葡萄糖氧化酶电极的响应大大增强，他们认为纳米金充当了氧化还原 反应中的电子受体，加快了电子转移的速度。 在纳米碳管方面，多壁和单壁的纳米碳管多被用于修饰电极，被修饰后的 电极对氧化还原物质的氧化还原能力提高，原因可能是碳管的导电性优于其他 电极，导致氧化还原过程中产生的电子能够很快从溶液中到达电极表面，另外 还有人认为碳管本身参与到了氧化还原过程的反应中，自身也有电子得失。但 在酶电极中，纳米碳管与酶之间的作用机理还非常模糊，需要在做大量的微观 研究来确认。 1 4 论文主要研究内容 生物传感技术是近年来迅速发展的技术，被越来越多的用于国民经济的各 个领域。本课题是天津市科技攻关培育项目，主要研究对于糖尿病人的血液中 与糖尿病相关的四个参数( 血糖、总胆固醇、酮体和乳酸) 进行监测的微集成系 统。 传感器以生物酶作为敏感基元，利用生化反应的专一性，高选择性地分析 血液各组分。该生物酶电极基于ut a s ( m i c r ot o t a la n a l y s i ss y s t e m ，微 全分析系统) 技术，采用微加工方法在同一片玻璃基底上制备出四组叉指阵列 ( i n t e r d i g i t a la r r a y ：i d a ) 微电极，分别固定不同的生物酶构成四个功能 区，同时测量血糖、总胆固醇、酮体和乳酸浓度四个参数。在酶电极表面通过 贴膜构成微反应腔，作为血液分配机构。在同一基底上制作四组电极，测量微 量样品的化学反应电流，电极需要小型化，这样就会导致电流响应幅度降低。 而i d a 微电极的特点是形成氧化还原反应循环，能有效提高响应电流，从而提 高测量的灵敏度。由微电流测量仪器检测出反应电流大小，计算并显示出目标 反应物的浓度。如图1 3 所示。 第一章绪论 觚样 仁：= = 冷 各参量浓度 = = = = = = = 3 数据输出 圈 鑫胆 图1 3 传感器系统原理示意图 论文研究的主要内容包括： 1 ) i d a 微电极的设计、制作； 2 ) 微电极上各种酶的固定； 3 ) 设计血液分配结构； 4 ) 研制了多路微电流测量仪； 5 ) 测试血样浓度。 第二章酶电极中的电化学检测研究 第二章酶电极中的电化学检测研究 本章对基于酶催化的生物化学检测原理进行了探讨，对影响测量结果的各 项因素，如电极材料、电极结构、电子交换媒质等问题进行了认真分析，并且 详细地分析了i d a 电极的工作原理。 2 1 酶电极的工作机理 在本文所述的血液分析生物传感器中，我们采用基于生物酶催化的生物电 化学检测原理，进行血液参数的测试。酶生物电极的工作原理就是利用酶对生 化反应催化的单一性对目标物质进行检测。在绝大多数的情况下，生物酶会保 持极高的选择性，因而酶生物传感器在医疗，环境，及食品等行业应用极为普 遍。 通常在生物酶的催化下发生的生化反应如式( 2 1 ) 表示： s l + s 2 丝丝与鼻+ ( 2 1 ) 式中s l 为目标物，当目标物的浓度不能被直接检测时，我们可以通过检测 s 2 的减少量( 或减少速度) 或生成物p l ，p 2 的生成量( 或生成速度) 来获得目标 物的浓度。 自1 9 6 2 年，c l a r k 首次通过检测在葡萄糖氧化酶( g l u c o s eo x i d a s eg o d ) 的催化下，葡萄糖氧化成葡萄糖酸时，电极附近氧的消耗量来获得溶液中葡萄 糖的浓度川。基于各种检测原理的葡萄糖生物传感器成为酶生化传感器研究领 域的一个研究热点。表2 1 给出目前出现的比较有代表性的基于葡萄糖氧化酶 的几种生化电极。 表2 1 葡萄糖氧化酶生物传感器 检测原理系统构成实验室 0 2 的消耗0 2 电极 s j u p d i k e 1 4 】 h 2 0 2 的生成量h 2 0 2 电极 d r t h e y e n o t 【1 5 】 h 2 0 2 相关反应 一i 敏感电极 g n a g y 1 6 】 葡萄糖酸的生成量p h 电极 b l a m u e l 使用其他媒质溶液中加入f e r r o c e n e d l w i l l i a m s 1 7 】 第二章酶电极中的电化学检测研究 基于生物酶催化的生物化学电极在生物酶与化学电极之间进行电子传递的 工作原理如图2 - 1 所示。生物酶与电极之间的电子传递是利用小分子量的电子 交换媒质在生物酶与电极之间进行的。这种媒质辅助型的电子交换的特点是： 媒质作为第二目标物参与酶催化反应：在电极表面发生的电极与媒质之间 的电子交换是可逆的。在媒质辅助型酶催化反应中，媒质作为第二目标物和第 一目标物( 分析物) 一起参加反应。作为催化反应的媒质物质的生成物，在与电 极表面进行电子交换后，得以再生。( 这个反应不需要酶的催化，因而可以被 认为是一个单独进行的反应。) i i “匕i 臣标物 ( s u b s t m t e ) 产物 ( p r o d u c t ) 图2 1 酶与电极之间电子传递示意图1 1 3 j 电子交换媒质直接参与电极表面的电子交换，媒质的选择对测量结果的影 响极大。在基于生物酶的葡萄糖传感器出现的初期，人们一般是利用溶液自身 存在的0 2 作为电子交换媒质来实现生物酶与电极之间的电子交换，具体反应 方程式如式( 2 2 ) ，( 2 3 ) 所示： g l uc o se + d + 日，d 旦竺竺专g l u c o n i ca c i d + h ，d ， ( 2 2 ) ，a 叫a + 以d + e( 2 - 3 ) 但由于溶液中氧的浓度将对测量结果产生影响，为获得稳定、准确的测量结 果，需要将被测试样按一定比例进行稀释，以保证溶液中含有足够的氧的含量 0 8 。但这样极大地限制了这种检测方法的应用范围，因为在有些情况下，如 人体血糖的连续在体检测，是不可能对被测试样进行稀释的。 为解决试样中氧含量的波动对测量结果的影响，许多研究人员进行了多 种改进，如传感器结构，外界媒质的引入等【1 7 ，1 9 1 。实验结果表明，外界媒质的 引入是一个行之有效的方法。 理想的电子交换媒质应具有以下特性 2 0 1 在酶的催化下，反应速度快； 在电极表面，能够表现出良好的电化学特性； 不论在氧化态，还是还原态，都应具有良好的化学稳定性； 第二章酶电极中的电化学检测研究 为减少外界对测量结果的干扰，媒质的氧化峰位应与溶液的p h 值 无关； 同时，媒质的废弃处理应简单易行，且无毒。 可应用的媒质有很多种，如：铁氰化物和醌，二茂铁极其衍生物。例如在 葡萄糖的测量中引入电子交换媒质，在电极上发生的反应如下： 葡萄糖+ g o x t f m ) 争d 葡糖酸+ g o x ( r m m ) ( 2 4 ) g o x f f a d m ) + m ( o x 时g o x t v a d ) + m 0 e a ) ( 2 - 5 ) m t r e a ) 一e 争m ( o x ) ( 2 6 ) 其中g o x 0 ) 和g o x ( f a d m ) 分别是葡萄糖氧化酶的氧化态和还原态， m ( o x ) 和m ( 删分别是电子传递媒质的氧化态和还原态。在制作传感器时，葡萄 糖氧化酶与及固定剂被溶解在适当p h 的缓冲液中，最后通过固定剂固定到电 极表面。检测时，葡萄糖样品溶液中的葡萄糖首先与固定在电极上的葡萄糖氧 化酶反应，葡萄糖被氧化为葡糖酸，葡萄糖氧化酶由g o x t r a d ) 变成 g o x ( f a d m ，还原态的葡萄糖氧化酶又与m ( o x ) 发生氧化还原反应，最后还原 态的葡萄糖氧化酶失去电子回复到氧化态，继续催化葡萄糖反应，而m ( o x ) 则被还原为m ( 。m ( 在阳极表面失去电子，回复到m ( o x ) ，继续参加下一 轮的反应。整个过程不断循环，直到反应结束。 2 2 电极上的电化学分析 电化学分析方法按最终检测方法，主要可以分为电流型( 最终检测内容为 电流变化) 、电位型( 检测电位变化) 和电导型( 检测电阻变化) 三种类型。在本 文所述的生物电化学检测中，基体电极主要是应用电流型电化学分析方法，对 发生在电极表面的电极反应的响应电流进行测试。这主要是因为电流型电化学 分析方法相对其他方法具有高选择性，高灵敏度和结构简单等特点。 这里将深入讨论与测量结果直接相关的各项因素，如电极材料、电极结构 等，为血液分析生物芯片的设计提供理论依据。 2 2 1 酶电极上的动力学分析 电流检测是电化学的一个分支，参与反应的原子或分子通过得失电子在电 极上产生电流。一般来说，任何原子或分子在足够的能量支持下都能够得( 被 还原) 失( 被氧化) 电子，如果分子或原予比较容易得失电子，那么我们称它具 第二章酶电极中的电化学检测研究 有电活性。物质在氧化还原过程中所需要的能量可以作为物质特性的表征参 量，一般被称为氧化还原电位。 当在工作电极和参考电极问加一定的电压后，物质发生氧化或还原反应会 在工作电极上产生f a r a d a i c 电流，电流值与被分析物的浓度成比例关系。电 荷在电化学检测单元中的传递可以用下式表达： d + n e = r 其中n 表示物质在氧化还原过程中所产生的总电子数，这个方程描述了一个简 单的、可逆的电荷传递过程，电荷传递发生在电极和包含被测物质的电解质的 界面上，电极充当电子供体或电子受体的角色。 在反应中产生的电流值代表在电极上发生的电化学反应的速率，可以表示 为： i = n f a j ( 2 - 7 ) 其中j 表示电流密度，a 表示电极面积，f 是法拉第常数( 9 6 ，4 8 5ct o o l 4 ) 。 由于在电极上发生的反应的种类不同，反应响应电流主要与电子在电极界 面上的传递速度和被分析物质从溶液中转移到电极表面的速度有关。在电化学 测量中，被分析物质从溶液中转移到电极表面的行为重要包括扩散和对流行 为。 在反应开始前，氧化性物质0 的浓度在整个溶液中都是相同的，当反应 开始时，电极表面的o 的浓度迅速下降，o 被还原为r 。由于在静止的溶液中 扩散是物质转移的唯一方式，因此在时间t 、距电极x 远的o 的摩尔流动量与 浓度梯度成比例关系。氧化还原所产生的电流密度遵循菲克第一定律： ，( 刈) ：d 0 掣( 2 - 8 ) 咣 c o 为0 在溶液中的浓度，d o 为o 在溶液中的扩散系数，x 表示0 与电极表面 的距离，j 为电流密度，t 表示较短的时间间隔。这个公式表示：与时间相关的 电流密度可以表示为距离初始位置( x = 0 ，即电极表面) 某个距离的被测物浓度 的变化速度与一个常数的乘积。这时电极表面( x = o ) 上的响应电流表示为： i 。：删d 0 l 掣i ( 2 - 9 ) 第二章酶电极中的电化学检测研究 被测物质在电极反应单元中的浓度与其到电极表面的距离可以用图2 - 2 表 示。图中，包括两个区域：溶液区和电极反应区。反应溶液经过充分混合，在 溶液区中被测物质的浓度与其距离电极的远近无关：是保持不变的，为 c = c o 。在电极与溶液区之间存在一个非常薄( l ) 的区域电极反应区 ( n e r n s t 扩散层) ，在这个区域中被测物质的浓度与距电极的距离相关，浓度 生 x = ox = l 刊电权的距离 _ - _ _ _ _ _ _ 。- - _ _ _ _ _ - _ _ _ _ _ _ _ _ _ 图2 - 2 酶电极表面的扩散区 从溶液区与电极反应区的界面的c = c o 一直下降到电极界面上的c = o 。 n e r n s t 扩散层的厚度与反应溶液的状态有关，在反应溶液充分搅拌混合的状 态下，n e r n s t 扩散层的厚度一般约0 o l m 到0 0 0 1m m 。在扩散层中，扩散 行为控制着被测物质从溶液转移到电极表面的速度，被测物质的浓度变化与到 电极的距离呈线性下降关系。在扩散层中，被测物质的浓度可以用下式表示： 一d c ( c o - c e ) ( 2 1 0 ) 办， 由于被测物质的浓度在电极表面为0 ，该公式可以写成： 妾：阜( 2 - 1 1 ) “l 将公式( 2 9 ) 与( 2 1 1 ) 联合，可以得到如下公式： i l ：n f a ：d o c o ( 2 - 1 2 ) 其中i l 表示在充分搅拌的反应溶液中的限制电流。从式中可以看出，在充分 搅拌的情况下，被分析物在电极上反应所产生的限制电流与被分析物的浓度和 扩散系数成正比，并且与n e r n s t 扩散层的厚度成反比。 以上所讨论的电极响应是建立在反应溶液在整个反应过程中都被充分搅 拌，同时反应溶液的浓度不会发生变化的基础上的，在这种情况下，n e r n s t 第二章酶电极中的电化学检测研究 扩散层的厚度不会发生改变，在扩散层中被测物质的浓度梯度也不会随时间发 生改变，这是一种均衡系统下的反应。但是，我们所面对的传感器是非搅拌体 系，同时被测物质的量非常小，n e r n s t 扩散层的厚度就会随时间而改变，即 随时间的增加，n e r n s t 扩散层逐渐加厚，同时其中的浓度梯度也发生变化， 这是一种非均衡系统中的反应。这时，被测物质在n e r n s t 扩散层中的扩散行 为可以用菲克第二定律描述。 丝：d d 一0 2 e ( 2 1 3 ) 研西f 它描述了在非稳态扩散过程中，扩散粒子浓度c 随距电极表面的距离x 和 时间t 变化的基本关系式。 2 2 2 电极材料 由于电极表面反应有很大程度取决于电极材料的物理和化学特性，因而电 极材料的选择对能否获得稳定可靠的测量结果至关重要。不同材料的电极必将 导致不同的工作窗口( 能够获得较低的背景电流的一定电压范围，以避免响应 信号被背景淹没) 的选择。目前常用的电极材料有碳，铂，金和汞。 碳是目前在电流检测方法中应用较多的一种电极材料，常见的有玻璃碳， 石墨等形式。玻璃碳除具有极其良好的机械稳定性及导电性外，同时具有良好 的化学稳定性和较大的工作窗口。而玻璃碳电极由于背景电流较大，所以不适 合进行微弱信号检测。 汞电极虽然具有易获得清洁表面和在负电压范围内有较大的工作窗口等优 点。但在正电压范围内却极易被氧化，同时，由于在室温范围内，汞为液态， 因而不易被加工成具有固定几何形状的检测电极，因而汞电极的应用存在较大 难度。 贵金属( 如铂、金) 是目前应用较多的一种电极材料，它们具有稳定的化学 特性；易于提纯；加工特性好，可以被加工为各种几何形状、尺度的检测电 极：背景电流低，适于微弱信号的高精度测量。同时，对贵金属电极进行表面 生物化学修饰的手段成熟且易于实现，能够满足目前对生物化学检测日新月异 的要求。随着薄膜技术和微加工技术的应用，基于贵金属的薄膜微型电极为贵 金属电极的应用范围的扩展奠定了更加坚实的基础。但相对与碳电极，贵金属 电极存在价格昂贵，工作窗口较小等缺点。 第二章酶电极中的电化学检测研究 鉴于上述分析，我们采用金作为我们生物芯片中的基体电极的电极材料， 这主要是考虑到进行微型电极加工及电极表面酶修饰方面的要求。同时，金电 极的背景电流低的特性，也是进行微弱信号测量所必需的。 2 3i d a 微电极工作原理 由式( 2 7 ) 可知，在其他条件保持不变的前提下，响应电流随着电极面 积的减小而减小。在生物芯片中，为在微小体积内实现多参量的同时检测，基 体电极的小型化，微型化势在必行。但基体电极的微型化必将导致响应电流的 幅度减小，这将使对后续的信号处理电路的要求将变得极为苛刻，甚至难以实 现。因而如何在有限面积的工作电极上获得令人满意的响应电流成为一个十分 重要的问题。 2 3 1i d a 微电极的特点 近年来，随着微加工技术的发展与成熟，复杂结构的微型电极加工己经成 为可能【2 1 捌。目前，基于微a n t 技术的微型电极成为目前电化学分析中的一个 研究热点。当电极阵列利用微加工技术被加工在一个极其微小的空间内，发生 在其中一个单元