（微生物学专业论文）青霉发酵产α半乳糖苷酶的研究.pdf

摘要 和pz t 。7 本文对青霉n 3 固体发酵、液体深层发酵产d - 半乳糖苷酶的工艺及其 酶学特性进行了研究，得出如下研究结果： 1 研究了青霉n - 3 固体发酵的碳氮源比、氮源组成及发酵温度、含水量 和时间对青霉n - 3 产a 一半乳糖苷酶的影响。f 该菌在麸皮与豆粕的比例 为5 ：l ，添加4 的鱼粉、4 的硝酸铵、2 的磷酸二氢钾，2 8 ( 2 培养 7 2 小时，酶活可达5 6 8i u g ( 干曲) 。 7 2 以对硝基苯基a 半乳糖苷为底物时，青霉n 3 固体发酵产的a 半乳 糖苷酶的最适作用温度为6 5 ( 2 ，最适p h 为4 5 ，酶在保温2 小时，4 0 时对酶活无影响。( 6 5 r 时酶活保留6 7 ，7 0 c 1 小时基本无酶活。 酶的k m 值为k i n = 5 4 4 x1 0 r 4 厂y 3 通过对青霉n 3 液体发酵产n 半乳糖苷酶的发酵培养基组成( c 。n ， 无机盐) 及工艺条件( 起始p h ，装液量) 的摸索，并经正交试验，得到 较优培养基配方为：豆粕粉4 、硝酸铵2 9 6 、磷酸二氢钾0 2 、硫酸镁 0 2 、起始p h 为5 5 。在此条件下，发酵液酶活可达5 1 6i u l 。 4 以对硝基苯基a 半乳糖苷为底物时，青霉n 3 液体发酵产的a 半乳 糖苷酶的最适温度为5 5 ，最适p h 为4 5 ，酶在保温2 小时，4 0 c 时 对酶活无影响，5 5 时酶活保留7 0 ，6 5 c 时酶活保留8 6 ( 与在6 5 ，1 0m i n 相比) 。 关键词：n 一半乳糖苷酶：青霉：固体发酵：液体发酵 生理生化特性 塑婆盔堂亟主堂焦鲨塞 i 引言 1 1n 一半乳糖苷低聚糖和多聚糖 u d 半乳糖苷结构的糖类存在许多种植物之中，尤其多见于种子、 根、芽等组织内。这些碳水化合物作为植物的储存物质而存在于种子等组 织内，但也参与其它的生理渗透压调节。在豆类植物中，棉子糖家族的低 聚糖含有以o 1 , 6 键与蔗糖单元相连的d 吡喃半乳糖。半乳糖含量较多的 多聚物是半乳甘露聚糖，这种糖存在于纠尔豆树胶和刺槐豆树胶中。在纠 尔豆树胶中的a d 半乳糖含量达3 8 4 0 ，刺槐豆树胶中的a d 半乳糖为 2 2 2 4 。软木中的半纤维素主要是含半乳糖取代基的葡甘露聚糖。在大豆、 羽扇豆中除细胞壁含有结合的a d 半乳糖，还有游离的a 半乳糖苷低聚 物如棉子糖、水苏糖、毛蕊花糖等。 蜜二糖( m e l i b o s e ) 是6 一。一a d 一半乳糖基一b d 一吡喃葡萄 糖，这种二糖曾在很多植物的渗出物中发现，并且在小麦胚乳以及某些植 物的花蜜中鉴定其存在。棉子糖不完全水解可产生蜜二糖。 水苏糖( s t a c h y o s e ) 的结构为o a d 一半乳糖基一( 1 6 ) 一0 一a d 一半乳糖基一( 1 6 ) 一0 一a d 一吡喃葡萄糖基一( 1 2 ) 一 b d 一呋喃果糖苷。已经从许多植物中得到这种四糖。水苏属( s t a c h y s ) 的宝塔菜( s s i e b o l d i i ) 含量可以高达干重7 5 。大豆中也含有一定量的水 苏糖，此外，美国自蜡树( f r a x i n u sa m e r i c a n a ) 、西葫芦( c u c u r i t ap e p o ) 和毒鱼草( v e r b a s c u m t h a p s u s ) 都含有这种四糖。 毛蕊花糖( v e r b a s c o s e ) 是由三个分子d 一吡喃半乳糖与一个分子蔗糖， 通过a 一1 , 6 一键组成的寡糖，属于棉子糖族类型的结构从六十年代以来，相 继从美洲石蚕( t e u c r i u mc a n a d e n s e ) 的地下茎、可可豆和大豆中分离出这 种五糖。 筋骨草糖，是由四个分子d 半乳糖和一个分子蔗糖组成的六糖，六十 年代中期，从筋骨草属( a j u g an i p p o n n e n s 扫) 和草原鼠尾草( s a l v i a p r a t e n s i s ) 的根部，以及巢菜( i d c i a s a t i v a ) 的种子中已分离出来。 棉子糖( r a f f i n o s e ) 是。一a d 一毗喃半乳糖基一( 1 6 ) - a d 一 堑婆盔堂塑圭堂焦迨塞 吡喃葡萄糖基一b d 一呋哺果糖苷。棉子糖通常以低浓度存在于植物叶 片，在贮藏器官内，尤其是种子，只是在成熟期存在，而当萌发过程就消 失。据研究，寒冷季节和植物组织水分含量下降的条件下，棉子糖含量会 大大增高。植物抗寒性，会使贮存淀粉减少而蔗糖增高，这几乎是普遍现 象，可能与植物组织中棉子糖含量变化有直接关系。植物来源的a d 半乳 糖苷酶，有能力从低能量的供体转移d 半乳糖基给蔗糖，以生成棉子糖， 尽管糖苷酶类催化的平衡反应，通常倾向于水解，如果底物的浓度在增大 并不断转化利用其生成物，棉子糖的合成是可能通过这一途径来完成的。 棉子糖普遍存在于高等植物，但迄今没有在藻类发现。这种天然三糖， 是棉子糖族一系列同质寡糖的结构基础。1 8 7 6 年由l o i s e a u 第一次在甜菜 蜜中发现棉子糖后，p l a n t a 和s c h u l z e 在1 8 9 0 年发现四糖水苏糖， b o u r q u e l o t 和b r i d l e1 9 1 0 年发现五糖毛蕊花糖， m u r a k a m i1 9 4 1 年发现 六糖筋骨草糖， f r e n c h1 9 5 4 年发现更高级的九糖。这些棉子糖族成员， 在结构上共同之处，就是以蔗糖分子为基础，依次以a ( 1 6 ) 键合的吡 喃半乳糖残基，连接在蔗糖的葡萄糖部分，以形成四糖、五糖、六糖以至 九糖。 据j e r e m i a s 报导( 1 9 6 2 ) ，以上介绍的棉子糖，水苏糖，毛蕊花糖和筋 骨草糖，在结构上有明显的相关性。已经知道，筋骨草糖存在于3 个科的6 个种；毛蕊花糖存在于7 个科的2 4 个种；水苏糖存在于4 6 个科的1 6 5 个 种；棉子糖存在于5 5 个科的2 2 0 个种。这些棉子糖族的寡糖，聚积在种子、 块茎、地下茎、根等贮存器官，以及树皮、叶子和果实中。在绿色植物界， 除了蔗糖它们算是分布最广的寡糖。 含a 半乳糖的多聚糖中主要是半乳甘露聚糖。e f f r o n t 在1 8 9 7 年首次 报导刺槐豆( 1 0 c u s tb e a n ) 的粘胶性质。两年后b o u r q u e l o t 和h e r i s s e y 表明这种粘胶中d - 甘露糖：d 半乳糖为5 i ：1 ，这样结果与六十年代的检测 很为相近。迄今为止，测定过的7 0 多种植物半乳甘露聚糖中，两种单糖组 分的比例值差别很大。例如紫苜蓿( m e d i c a g os m 抑e ) 种子半乳甘露聚糖中， d 甘露糖：d 半乳糖为1 ：1 ；而在槐树( s o p h o r aj a p o n 缸a ) 种子中的相应 比值则为5 2 6 ：1 。这种比值悬殊更大的是棕榈科( p a l m a c e a e ) 种子半乳甘 2 浙江大学硕士学位论文 露聚糖，这里只含很少的d 半乳糖残基，而在象牙实( i v o r yn u t ) 中的甘 嚣蜜a ( m a n n a na ) 和甘露蜜b ( m a n n a nb ) ，其中d - 甘露糖：d - 半乳糖 分别为5 0 ：1 和9 0 ：1 。 植物的半乳甘露聚糖，主要存在于豆科种子。据e a n d e r s o n ( 1 9 4 9 ) 检测1 6 3 种豆科种子，有1 1 9 种含胚乳粘胶多糖，其中1 3 种已鉴定是半乳 甘露聚糖。迄今已证实7 0 种豆科种子的半乳甘露聚糖，除少数外都存在于 种子胚乳中( 例如大豆的半乳甘露聚糖存在于种子英里) 。按照1 9 5 9 年 a s p i n a l l 提出的定义，d 半乳糖含量在5 以上的甘露聚糖称为真正半乳甘 露聚糖( t r u eg a l a c t o m a n n a n s ) ，已经在番荔枝科( a n n o n a c e a e ) 、旋花科 ( c o n v o l v u l a c e a e ) 和棕榈科的成员中得到。 豆科种子的半乳甘露聚糖，一般是以多糖形式贮存，在种子萌发时， 豆科种子中的粘胶含量下降也说明这一点。虽然在种子成熟过程，半乳甘 露聚糖的水平稳定地提高，达到最大值再慢慢地下降，其单糖组分比例则 保持不变。据研究，在萌发的植物种子中，半乳甘露聚糖的降解，最少要 有三种酶系参与作用：一是n d 半乳糖苷酶，解除( 1 6 ) a d 半乳糖 侧链；二是b d 甘露聚糖酶，分裂( 1 4 ) 8 d 甘露聚糖骨架链成为寡糖； 三是1 3 - d 甘露糖苷酶，完全水解d 甘露寡糖成为d 甘露糖。 种子胚乳半乳甘露聚糖的基本结构样式，与作为半纤维素的细胞壁半 乳葡萄甘露聚糖有相似之处，后者由b - d ( 1 4 ) 键合的d 甘露糖基和 d - 葡萄糖基组成主链，在0 - 6 上有时被单个n d 半乳糖基取代。这里的d 甘露糖与d 葡萄糖之比常常也是3 ：i ，而所含的d 半乳糖残基少则难溶于 水，只溶于碱性水溶液，表明d 甘露聚糖骨架上取代d 半乳糖分支数，与 多糖水溶性间存在的关系。已知刺槐豆树胶中d 半乳糖侧链的含量，在冷 水可溶级分中很高，而在热水可溶级分中则很低，而在不溶性级分中所含 d - 半乳糖则非常少。这种溶解度与侧链含量间的关系，可以归结于相邻的 多糖链间存在很强的非共价键合相互作用。例如，刺槐豆树胶可以作为促 进剂使直链淀粉从溶液中沉淀，可能由于它的主链上d 半乳糖分支很稀少， 对多糖链间非共价键合相互作用防碍不大，而纠耳树胶含较多的d 半乳糖 侧链，就没有象刺槐豆那样的作用。 塑婆盔堂亟圭堂焦迨塞 1 2 微生物n 一半乳糖苷酶的研究进展 d 半乳糖苷酶( e c 3 2 1 2 2 ，q d g a l a c t o s i d a s e ) ，最初是由酵母底 面发酵液提制出来的，加水可以分解蜜二糖而称之为蜜二糖酶通过对各种碳 水化合物为基质的蜜二糖酶特性的研究，发现以具有n d 半乳糖苷结构的碳 水化合物为该酶的主要作用对象，因此蜜二糖酶被命名为a - 半乳糖苷酶。 c i 半乳糖苷酶能水解含半乳糖的低聚糖、半乳糖苷聚糖，半乳糖脂 等中的非还原性末端中的a d 半乳糖苷。它们广泛存在于微生物、植物、 动物中。不同来源的a d 半乳糖苷酶的纯化特性已有很多报道，它们的特 性相差明显。以植物( 咖啡、紫花苜蓿、车前草、蚕豆、西瓜) 取材的q - d 半乳糖苷酶研究的比较详细。在各种哺乳动物组织的匀浆中存在a d - 半 乳糖苷酶，猪肾的半乳糖苷酶是与颗粒部分相连接。人和鼠的甲状腺、肾 脏和脾脏的酶活性最高。由微生物生产a d 半乳糖苷酶，易得，而且产量 也极高。国外从6 0 年代即开始从微生物中筛选产a 半乳糖苷酶的菌种，并 对a 半乳糖苷酶进行纯化及性质的研究；我国于7 0 年代后期开始进行微生 物产a 半乳糖苷酶及酶性质的研究。现已筛选出不少产a - 半乳糖苷酶活性 高的微生物，并进行了广泛深入的研究，尤其在酶制剂的制备和食品工业 的应用方面，已取得很大进展。 n 半乳糖苷酶在食品、饲料及医药工业各方面都具有很重要的应用价 值。在甜菜制糖工业中，糖蜜中的棉子糖经a 一半乳糖苷酶分解，不仅能提 高产率，还能提高效率，此外a 半乳糖苷酶还应用于大豆及其他豆类的加 工，因棉子糖和水苏糖这类低聚糖的存在，阻碍了豆类蛋白的利用。在以 豆饼为日粮的饲料加入a 半乳糖苷酶和其它酶协同作用，可有效提高饲料 的利用率。除此外，在医疗上和多糖树胶的改性上有着广泛的作用。 铃木等从土壤中筛选出三株只产生n 半乳糖苷酶的放线菌和一株产n 一 半乳糖苷酶还产生少许转化酶的被孢霉。将后者制成含n 半乳糖苷酶的固定 化菌体，能连续使用多次，分解棉子糖的活力高，应用在甜菜制糖工业中， 可使甜菜废糖蜜中所含6 一1 0 的棉子糖水解7 6 - - 8 7 ，分解生成的蔗 糖和废糖蜜中原来所含的蔗糖均能提取出来，使蔗糖的产率提高3 - 4 。 因此，这种工艺称为“无废糖蜜制糖法”。 4 塑婆盔堂亟主堂焦迨塞 1 2 1 产一半乳糖苷酶的微生物 很多微生物能产n 半乳糖苷酶。很早就发现酵母菌、乳杆菌和曲霉的 一些种能产生a 半乳糖苷酶。以后又相继发现了较多的细菌，如假单孢杆 菌、产气气杆菌、大肠杆菌和梭状芽孢杆菌。 表1 1 产a 半乳糖苷酶的微生物 t a b l e1 - 1m i c r o b i a lw h i c hc a l l p r o d u c ed g a l a c t o s i d a s e 细菌 大肠杆菌 大肠杆菌亚种 乳酸芽孢杆菌 德氏乳酸芽孢杆菌 嗜热脂肪芽孢杆菌 腊状芽孢杆菌 拟杆菌 假单孢杆菌 梭状芽孢杆菌 牛链球菌 肺炎双球菌 真菌 透孢梨头霉 反射梨头霉变种 李克梨头霉 分枝梨头霉 灰色梨头霉变种 泡盛酒曲霉 烟曲霉 黑曲霉 黄曲霉 米曲霉 红曲霉 栖土曲霉 蝇绻霉 毛霉 青霉 葡酒色被孢霉 根霉 酵母 假丝酵母 毕赤氏酵母 卡尔斯伯酵母 啤酒酵母 意大利酵母 许旺氏酵母 八孢裂殖酵母等 放线菌 费氏链霉菌 橄榄色链霉菌 玫瑰多刺链霉菌 脆弱链霉菌 自葡酒色被孢霉的半乳糖苷酶制剂在甜菜制糖工业上应用，一般认 为：从真菌中分离筛选的菌株产n 半乳糖苷酶的活性较高，产量高而又有 效的微生物菌株是工业酶的基础。于是，7 0 年代中期以后，很多产a 半乳 糖苷酶活性很高而有效的新菌株不断被发现。如成田等从朝鲜酒曲分离筛 选出来的蝇卷霉，渡边等研究的蝇卷霉、聚多卷霉、中国卷霉、毛霉状卷 堑婆盔堂亟堂焦迨塞 霉、透孢梨头霉、反射梨头霉变种、李克梨头霉、分枝梨头霉、灰色梨头 霉变种等。与此同时，我国科研人员根据酒曲中霉菌的特性，将定性纸层 析分离筛选产a 半乳糖苷酶真菌的方法加以改进，也于我国酒曲分离筛选 出3 2 株产a 半乳糖苷酶的霉菌，其中产该酶活性最高的几株菌为分枝梨头 霉。表1 列出一些能产a 半乳糖苷酶的微生物。 1 2 2n 一半乳糖苷酶的生理生化特性 1 2 2 1 旷半乳糖苷酶的作用方式与基质特异性 一般的研究认为a 半乳糖苷酶的作用方式是断裂非还原性末端的a d 半乳糖苷键，产生一分子的a - d 半乳糖，但在9 0 年代以来的研究表明，有 些微生物a 半乳糖苷酶还能水解其侧连基团是a 半乳糖苷键连接的杂多 糖。同时还发现同一种微生物的几种a 半乳糖苷酶的作用方式不一样。 r e i j ik a n e k o 在研究a s p e r g i l l u sn i g e r5 - 1 6 的a - 半乳糖苷酶的作用基 质特异性时发现，粗酶液能分解对硝基苯基a 半乳糖( p n p g a l ) 、蜜二糖。 将粗酶液先用硫酸铵沉淀，然后经d e a e 一纤维素柱和s p s e p h a d e x c 5 0 柱和亲和色谱柱进行纯化得到一种n 半乳糖苷酶，它能水解p n p g a l ，但不 能水解蜜二糖。一方面说明此酶至少存在二种同工酶，另一方面说明不同的 a - 半乳糖苷酶具有不同的基质特异性。在以甘露半乳糖低聚糖作底物的酶解 研究中，在以甘露糖为骨架的低聚糖中还原性末端n 半乳糖能够被裂解下 来。如m - m * ( g a d ，还原性末端甘露糖- m * 上连接的半乳糖g a l 能够被裂 解下来。这与以前只认为水解非还原性末端的a 半乳糖键的看法有所不同。 啤酒酵母含有一种a d - 半乳糖苷酶( 蜜二糖酶) ，它有较宽的最适p h 范 围，对大多数底物来讲p h 4 5 为最理想，它以1 0 0 ：1 2 3 ：3 3 的比例水解蜜二糖、 苯基a d 半乳糖苷和甲基q 半乳糖苷。牛链球菌的a d 半乳糖苷酶很容 易催化二o a d 半乳糖基甘油和a d ( 1 6 ) 连接的半乳糖基低聚糖的水 解。 e l i n al u o n t e r i 在研究p e n i c i l l i u m s i m p l i c i s s i m u m 的a 半乳糖苷酶基 质特异性时发现，旦s i m p l i c i s s i m u m 能产生3 种a 乳糖苷酶：a g l i 、a g l i i 、a g l m 。这3 种酶的最佳底物是棉子糖。a g li 能将蜜二糖中的8 7 小 堑堑盔堂亟堂焦丝塞 半乳糖苷键断裂，能将棉子糖中的9 5 的o 半乳糖苷键断裂，对毛蕊花四 糖的降解，只能断裂3 5 的口半乳糖苷键；a g li i 酶它对蜜二糖、棉子糖、 毛蕊花四糖等棉子糖族家低聚糖中的n 半乳糖苷键的断裂达9 0 1 0 0 ； 对a g l g i 而言，它对蜜二糖、和棉子糖家族的低聚糖的a 半乳糖苷键的断裂 能力明显要弱。进一步研究表明，a g l i i 对棉子糖家族低聚糖的链的长度不敏 感。 1 2 2 2 q 一半乳糖苷酶的物理及化学结构 a 半乳糖苷酶与其它的糖苷酶一样都是糖蛋白。对葡酒色被孢霉的o 半 乳糖苷酶结晶的研究指出：在结晶酶中含中性糖1 0 8 、d 葡糖胺2 7 ， 系一种糖蛋白。将纯化的n 半乳糖苷酶用凝胶电泳显示的是均一带，用考马 斯亮蓝和s c h i f f 碱染色，证明了a 半乳糖苷酶是一种糖蛋白。同时用另一种 方法也证明了o 半乳糖苷酶是一种糖蛋白：将产a - 半乳糖苷酶的细胞放在 “c 的果糖溶液中培养，再将所产生的a - 半乳糖苷酶进行凝胶电泳。“c 标记 的酶显示出一个单一的放射性带，再将放射性的酶用一种p r o n a s e 的酶进行 充分水解，通过s e p h a d e xg - 2 5 柱分离，进一步证明d 半乳糖苷酶是由蛋白 质和糖两部分组成。从n 半乳糖苷酶这种糖肽分离下来的糖进一步分析，这 种连接于多肽上的糖基是由6 - 8 个单糖组成的。它们是甘露糖和乙酰葡萄糖 胺，并且甘露糖和乙酰葡萄糖胺的比例大约是2 8 ：1 。 在研究此低聚糖与蛋白质的连接方式时，通过弱碱和强碱在n a b h 。存 在的条件下进行水解等一系列后处理，发现a 半乳糖苷酶中的蛋白质和糖苷 的连接方式是通过低聚糖中的乙酰葡萄糖胺和蛋白质中的天冬氨酸残基相连 接的。不同种的微生物产生的同一种酶具有几种不同的催化特性，这主要是 和蛋白质的结构有关，而蛋白质的结构是由肽链的氨基酸序列决定的，在几 种微生物产生的n 半乳糖苷酶的n 末端氨基酸序列也证实了这一点。研究 表明卫s i m p l i c i s s i m u m 的a g l i i i 的n - 末端氨基酸序列与腻v i n a c e a 和 叩胁6 最曙z 明s 豇 的a 半乳糖苷酶n 末端氨基酸序列具有高度的相似性，而 a g li i 的n 末端氨基酸序列与其它几种q 半乳糖苷酶的n 。末端氨基酸序列相 似性很小。n 末端氨基酸序列高度相似的几种酶它们的作用底物的特异性相 同，而n 末端氨基酸序列相似性很小的几种酶其作用的底物的特异性相差很 堑堑盔堂塑堂焦迨塞 大。 1 2 2 3a 一半乳糖苷酶的最佳作用条件与酶的稳定性 n 半乳糖苷酶的活性可用蜜二糖及棉子糖，也可利用对硝基苯酚- n o - 半乳糖吡喃糖苷作为底物来测定。不同的微生物产生的a 一半乳糖昔酶的最适 p h 和温度的范围各不相同。一般细菌分泌的最适p h 范围在6 5 - - - 7 5 之间， 最适温度在3 7 , - - 4 0 ；丝状真菌及酵母分泌的a 半乳糖苷酶的最适温度范 围比细菌要高，一般在5 0 - , , 6 0 之间，p h 范围变化很大，在4 5 8 0 之间。 一般来说，同一种微生物产生的粗酶和将其纯化后的酶的作用最适温度几乎 相同，但其热稳定性有差异。，在对分枝犁头霉产生的n 半乳糖苷酶的性质 研究时表明，分枝犁头霉半乳糖苷酶在5 0 保温7 h ，纯酶活力保留5 0 ， 粗酶活力保留8 2 ，在6 0 保温2 h ，纯酶活力保留2 0 ，粗酶能保留5 0 。 同工酶之间的稳定性也有差异，m o r t i e r e l l av i n a c e a 产生两种同工酶q 半乳 糖苷酶：g a l i 、a g a l 。其中g a l 在p h 3 0 - 4 0 、温度在6 0 对 p n p - g a l 具有最大活性，而a g a li 在中偏碱性条件下稳定，在p h 7 0 、5 0 c 极其稳定。另一个有趣的问题是：同一种微生物在不同的培养基上生长时其 产的a 半乳糖苷酶的热稳定性和p h 稳定性也不一样。r i c h a r d 等人对黑曲 霉在不同培养基上生长产生的n 半乳糖苷酶的性质进行研究，发现黑曲霉在 麸皮和米糠上生长产生的a 半乳糖苷酶的最佳酶作用条件是：p h ：5 0 ，温 度5 0 ，在3 5 - 5 0 两种酶都稳定，在超过5 0 时，在米糠的培养基 上的a 半乳糖苷酶的稳定性要高些，6 0 时，麸皮为培养基的a 半乳糖苷 酶的活力损失5 5 ，而以米糠为培养基的a 半乳糖苷酶活力只损失1 4 这 很可能是因为在不同培养基上所产生的同工酶的热稳定性不同。 固定化n 半乳糖苷酶的p h 和温度适应范围比相应未固定化的酶要宽。 m a s a r um i t s u t o m i 等用胶态壳多糖固定朱红密孔菌( p y c n o p o r u s c i n n a b a r i n u ) d 半乳糖苷酶时发现，固定化半乳糖苷酶在p h4 5 , - 5 0 时 最高，与未固定化的酶相似，在p h l 如1 0 5 的各种缓冲溶液中于3 7 ( 2 预处 理2 h 后，固定化酶p h 3 9 之间稳定，并可恢复原来活性8 0 9 6 以上。未固定 化的酶在7 5 c 时酶活性最大，固定化后在8 0 c 时其酶活性最大。 堑坚盔堂亟主堂焦堡皇 1 2 3微生物合成n 一半乳糖苷酶的调控 1 2 3 1 微生物产d 一半乳糖苷酶的诱导与抑制 微生物合成的d 半乳糖苷酶为诱导酶，不同种类的微生物合成a 一半乳 糖苷酶需要不同的诱导物。一般的诱导物是酶作用的底物或底物类似物，有 时还可能是半乳糖苷的分解产物。大肠杆菌( e c o l lj 甜岫p c o m m u n o r i a m l 2 1 7 ) 在水苏糖或棉子糖诱导下能产生大量的胞内n 半乳糖苷酶。红曲 ( m o n a s c u s ，s p ) 能被半乳糖诱导。葡酒色被胞霉合成n 半乳糖苷酶除能被 蜜二糖、棉子糖诱导外，还能被它的底物类似物乳糖所诱导。r u b e nc r u z 等 人在研究米曲霉合成n 半乳糖苷酶时，比较了不同糖类物质的诱导作用。他 选择了淀粉、水苏糖、棉子糖、蔗糖、葡萄糖、麦芽糖、乳糖、蜜二糖、豆 粕碳水化合物，作液体深层发酵诱导物。结果发现只有水苏糖、棉予糖、豆 粕碳水化合物具有诱导作用。在以麸皮为基础物作固体发酵，添加不同量的 豆粕( 碳水化合物) 浸出液来作研究。克麸皮分别加1 0 、2 5 、5 0 r a l 豆 粕浸出液，再分别加4 0 、2 5 、o m l 水，进行固体发酵。结果发现，以p n p g a i 为底物进行酶活测定时，提取液酶活分别为o 9 3 、1 7 3 、2 5 8 u m i n m l ， 由于豆粕中含有水苏糖、棉子糖，随发酵培养基中的水苏糖、棉子糖含量的 提高，酶活也随之提高。 以葡萄糖为碳源，对微生物产n 半乳糖苷酶的诱导合成及诱导物的利用 均有影响。葡萄糖容易被微生物所利用，因此在微生物产n 半乳糖苷酶时也 存在“葡萄糖效应”，即只有培养基中无容易利用的碳源时，才能看到诱导作 用。对红曲n 半乳糖苷酶合成的动力学研究亦发现：红曲细胞生长环境中存 在葡萄糖和半乳糖( 诱导剂) 时，首先利用的是葡萄糖，细胞生长曲线是双 峰的。当葡萄糖的浓度超过2 2 5 1 0 4 9 m l 时，葡萄糖就抑制了半乳糖的利 用和n 半乳糖苷酶的合成。 1 2 3 2 微生物源n - 半乳糖苷酶的分子调节机理 微生物合成n 半乳糖苷酶时可能受到多个各自独立的基因控制，以致产 生同工酶的特性( 如底物特异性、对温度的稳定性等) 相差极大。e i i n a 报道 的黑曲霉( a s p e r g i l l u s _ n i g e r ) 所产生的三种d 半乳糖苷酶，其中a g li 、 a g l m 的活性能被其水解产物q 半乳糖所抑制，而a g li i 的活性不受影响。 9 塑坚盔堂亟主堂焦逾塞 i r m af d e nh e r d e r 在研究黑曲霉产生的一种分子量为8 2 k d 的d - 半 乳糖苷酶时发现，其蛋白质氨基酸顺序与其它微生物产生的a - 半乳糖苷酶的 n 末端氨基酸序列具有极高的相似性，根据n - 末端氨基酸序列，利用黑曲霉 的xe m b d 基因库的低聚核苷酸作探针来克隆相应的基因a g i a 。结果发现当 a g l a 基因缺失时，黑曲霉不产生分子量为8 2 k d 的d 一半乳糖苷酶，含多拷 贝a g l a 基因的菌株会超量生产分子量为8 2 k d 的d - 半乳糖苷酶。当在基本 培养基上生长时，a g l a 基因缺失的黑曲霉产a - 半乳糖苷酶的总活性受到的 影响不大，进一步研究表明含此多拷贝基因的黑曲霉产生的a - 半乳糖苷酶的 总活性也没有多大的变化。后来的研究才发现a g l a 所编码的分子量为8 2 k d 的a 半乳糖苷酶只占黑曲霉胞外n 半乳糖苷酶酶活性的一小部分。在黑曲 霉中由其它基因编码的a 半乳糖苷酶占酶活的主要部分。黑曲霉的n - 半乳 糖苷酶的合成受多个基因的调控。 在大肠杆菌中也存在两种与o 半乳糖苷酶合成有关的操纵子，即位于染 色体上的蜜二糖操纵子( m e l ) 和位于质粒的棉子糖操纵子( r a f ) 。r a f 操纵 子由位于结构基因上游的调节基因r 及一个由三个基因即a 、b 、d 组成的 多顺反子所构成。r a f 为编码n 半乳糖苷酶的结构基因，这种r a f 编码的a 半乳糖苷酶是一种诱导酶，在棉子糖操纵子的调控中诱导占主导地位。但此 棉子糖操纵子对诱导物具有很强的立体结构选择性。与染色体上的蜜二糖操 纵予不同，棉子糖操纵子编码的a 半乳糖苷酶不需n a d 作辅酶，从棉子糖 操纵子的序列分析表明，该操纵子并没有典型的“c a p b o x ”，但存在代谢降 解物阻遇和以c a m p c a p 复合体为媒介的调控。当存在0 4 的葡萄糖时， c a m p 含量降低而影响c a m p c a p 复合体的形成，半乳糖苷酶的表达下 降到原来的1 2 一l 3 。 1 3 n 一半乳糖苷酶的应用 1 3 1 在医疗方面的应用 n 半乳糖苷酶对医学界带来兴趣，主要是因为它在人体内的一些生化 过程中起着重要作用。现已查明人体如果缺乏半乳糖苷酶，就会引起所谓 的法布里氏病( f a b r y sd i s e a s e ) 。这种病是由于分子水平的变异引起的， 是一种糖代谢缺陷遗传病。所谓酶法治疗，就是以医疗为目的的应用半乳 1 0 堑逛盔堂堡主堂焦迨塞 糖瞢酶。n 半乳糖苷酶还是一种可结合于特异血型的酶，在人体血液中， 血液b 细胞是含有半乳糖苷，纯化的咖啡豆半乳糖苷酶能转化b 细胞为。 细胞表示了h 抗原性。半乳糖是这个反应中释放出的唯一糖，人细胞可 释放出大约3 1 0 6 分子半乳糖。通过此酶的作用不仅了解到b 细胞活性的 决定因子，而且也可估计抗原部位的数目。细菌及放线菌分泌的甜半乳糖 苷酶也有此作用，但丝状真菌分泌的酶则无此作用机能。 1 3 2 在多糖结构改善上的应用 半乳糖存在于多种杂多糖如纠尔豆胶、刺槐胶等中，最富含半乳糖的低 聚糖是半乳甘露聚糖，在纠尔豆胶中含3 8 4 0 甜半乳糖。在洋槐豆胶中 是2 2 2 4 。它们均是以半乳糖残基连接于甘露糖为主链的甘露聚糖上。 半乳甘露聚糖这种多糖具有重大的商品价值，它是一种优良的食品胶，广 泛应用于食品、化工等行业。半乳糖侧链的存在，它对半乳甘露聚糖的特 性影响很大。刺槐豆树胶、纠尔树胶这两中树胶都以b d 1 ，4 甘露聚糖为 骨架的杂多糖。a - d - 半乳糖基侧链的多少及位置，决定其在水中的溶解度和 凝胶能力。纠尔豆胶与刺槐胶相比，其胶凝能力不如刺槐胶，如用晓半乳糖 苷酶来进行适当处理，进行改性除去适量侧链的半乳糖残基而不使甘露聚 糖主链断裂，可极大地提高纠尔豆胶的胶凝能力，提高其商品性。 1 3 3 在饲料工业中的应用 早在1 9 5 7 年，就有在饲料中添加酶制剂来改善其营养价值。最近的研 究表明，含豆类饼粕的饲料中，含a 半乳糖苷的低聚糖和多聚糖是一种抗 营养子。其中低聚糖主要是游离的水苏糖、棉子糖等。多聚糖主要是n 半 乳糖和果胶类似物组成大豆、羽扇豆等细胞壁的组成部分，它们形成个 坚硬的网状结构，将营养物质包裹其中，这也是导致豆粕的利用率不高的 原因。在单胃动物的肠道内较高浓度的此类游离的水容性低聚糖糖可能引 起食糜滞留，意味着降低家禽粮豆饼的能量利用效果，对营养物的吸收和 消化产生不利影响，因为它们的肠道内缺乏q 半乳糖苷酶。在单独使用d 半乳糖苷酶时，能否有效地改营养效果，迄今为止的研究结果尚不统一。 b r e n e s ( 1 9 9 3 ) 添加酶制剂对含有羽扇豆7 0 的日粮对肉鸡生产性能的影 响研究表明，添加n 半乳糖苷酶对生长和饲料利用率有所改善，但差异不 塑堑盔堂亟主堂焦鲨皇 显著，添加纤维素酶制剂无效。在添加果胶酶、n 半乳糖苷酶、蛋白酶时， 其效应明显，增重可提高1 8 ，饲料转化率改善1 0 ，被认为n 一半乳糖苷 酶可与其它酶共同作用产生协同效应，而改善羽扇豆的营养价值。 1 3 4d d - 半乳糖苷酶在制糖工业上的应用 棉子糖是一分子蔗糖以a 1 ，6 糖苷键与半乳糖相连组成的三糖，在c t 半乳糖苷酶的作用下，棉子糖分解为蔗糖和n 半乳糖，在甜菜制糖工业中， 甜菜中含有0 1 一0 1 5 的棉子糖，虽然量不多，但在制糖中却增加了糖 蜜的粘度，阻碍蔗糖结晶析出，以致产生大量的废糖蜜。棉子糖本身不能 被人利用，因而棉子糖是甜菜制糖工业中的一种有害物质，既降低甜菜的 产糖率，又降低糖的质量。应用n 半乳糖苷酶处理废糖能将阻碍蔗糖结晶 的棉子糖清除，在分解一分子棉子糖的同时，还产生一分子的蔗糖。一般 用n 半乳糖苷酶处理甜菜汁或糖蜜，将糖蜜置于糖蜜稀释罐中稀释到3 0 锤度，然后转入棉子糖分解槽中，用硫酸调p h ，采用n 半乳糖苷酶固相酶 反应，棉子糖的降解率达8 5 ，处理后得糖蜜再用斯蒂芬法提取蔗糖用戊二 醛固定的反射犁头霉而成的固相酶，可反复使用1 0 0 多次，这样分解生成 的蔗糖和废糖蜜中的原来所含有的蔗糖都能提取出来。这种工艺称为“无 废糖蜜制糖法”。甜菜上半部因含棉子糖过多，往往不能利用而废弃，采用 酶法制糖后，则能充分利用。酶法制糖可使蔗糖粒状结晶的均匀性、色泽 和纯度改进。由于酶法制糖产糖率提高，糖蜜含量降低因而煮糖率亦就提 高，使单位蔗糖产量的耗煤量降低约1 0 。酶法制糖与斯蒂芬法制糖相结 合，因糖蜜中含蔗糖量减少，石灰石的消耗也减少约1 0 。且因煮糖率的 提高及蔗糖结晶时间的缩短，使甜菜加工能力和设备周转率有很大提高。 现在许多国家均采用此法生产。 1 3 5 在豆类制品加工上的应用 大豆中含有一定量的a 。半乳糖苷低聚糖，如水苏糖( 4 ) ，棉子糖( 1 ) 和毛蕊花糖( 0 6 ) ，这些糖都是游离的。在利用大豆生产豆浆或用大豆 生产代乳粉时，这类低聚糖不易被消化吸收，且无营养易引起肠道胀气等 肠道不适的不良反应。如采用含蔗糖酶的n 半乳糖酶处理，这些n 半乳糖 苷低聚糖水解成半乳糖、葡萄糖、果糖等，就可以有效地处理这一问题，减轻 1 2 塑婆盔堂亟主堂焦鲨塞 这些低聚糖在大肠发酵而因起的肠道不适。利用真菌的a - 半乳糖苷酶处理 豆乳中的低聚糖已取得成功。 在非洲的尼日利亚的农村和城镇由于动物蛋白的短缺及价格很贵，在许 多家庭中豇豆( 嘲棚u n g u i c u l a t a ) 作为唯一的最重要的膳食蛋白来源， 如同大豆一样，豇豆中含有棉子糖家族低聚糖，高时含量达5 - 6 ，它的难消 化性，易诱导肠道胀气，这种缺陷很长时间以来就认识到高含量的这种低聚糖 妨碍了它的可按受性，采用发芽、去壳、温水浸泡和蒸煮可减少它的含量， 但不能显著减轻胀气和肠胃不适完整的豇豆用3 0 的水浸泡1 6 h r 水苏糖 减少2 6 3 ，棉子糖减少2 8 ，而长时间的浸泡会产生令人不适的异昧。5 0 分钟的蒸煮能使水苏糖减少2 8 6 ，棉子糖减少4 4 尽管浸泡和蒸煮能减 少低聚糖的含量，但这样处理过的豇豆磨成粉，其颜色、质地、香味、商品性 能都将受到负面的影响，而且还不能显著减轻胀气和肠胃不适。缸豆粉在 利用真菌n 半乳糖苷酶制剂在5 0 1 2 条件下处理2 小时，可将其中8 2 3 的 水苏糖、9 3 3 棉子糖除去。且酶处理的豇豆粉，由于酶的底物专一性，它 不影响其中的非a - 半乳糖苷键结合的化合物，这些化合物的功能性将不受 到影响。试验结果表明豇豆经过酶法这一工艺处理，能有效控制肠道胀气 引起的不适的发生。 1 4 研究的内容及设想 由于a 半乳糖苷酶在食品、饲料、医药工业上的应用前景，因此，研 究、开发a 半乳糖苷酶具有广阔的市场前景。选择了这个研究课题，是希 望通过这个研究，能够为微生物发酵产a 半乳糖苷酶的产业化提供一些理 论基础。 目前酶制剂的生产主要有两种方法，其一，固体发酵生产法。用固体 发酵的方式来生产酶制剂也叫表层发酵。与液体深层发酵相比，其生产投 资规模小、生产成本低、不会产生环境污染。其发酵的酶活力高，酶系全。 但缺点是：不能自动化，生产工人劳动强度较大，生产条件不易精确控制， 较为粗放，产量不易扩大。目前国内生产的饲用酶制剂，采用固体发酵发 占绝对优势。因为在饲料中成分复杂，多种酶的效果比单酶效果好。其二， 液体发酵生产法。液体发酵生产酶制剂主要优点是；操作劳动强度小，可 堑望盔堂堡堂焦迨塞 自动化，产量可大规模生产。主要缺点是：生产投资规模大，生产技术要 求高，产生的废水易污染环境。食品、医用级酶制剂是采用液体发酵法生 产。 本文将同时研究青霉n - 3 固体发酵和液体发酵来生产a 半乳糖苷酶。 及其酶的生理生化特性。影响青霉n - 3 固体发酵产生o - 半乳糖苷酶的因素 很多，主要有碳源、氮源以及无机盐、温度、湿度和时间。影响青霉n 一3 液体发酵产生a 半乳糖苷酶的因素主要是碳源( 包括诱导物) 、氮源、无机 盐、p h 、通风量、时间等等。主要研究内容如下： 1 4 1 d 一半乳糖苷酶固体发酵的生产工艺 影响青霉n 3 固体发酵产生a 半乳糖苷酶的因素很多，主要有碳源、 氮源以及无机盐、温度、湿度和时间。研究这些因素对产酶的影响。 1 4 2 固体发酵产生的a 一半乳糖苷酶的生理生化特性。 确定固体发酵产生的a 半乳糖苷酶的生理生化特性，主要是酶的最佳 作用温度 最佳作用p h ；酶的热稳定性；酶的p h 稳定性；酶分解底物的 进程曲线；底物浓度对酶反应速度的影响及酶的k m 值。 1 4 3 a 一半乳糖苷酶液体发酵的产生工艺 为了确定青霉n - 3 液体发酵产生a 半乳糖苷酶较为理想的工艺，本文 先对各个单因子单独进行试验，这些因素主要：碳源( 包括诱导物) 、氮源、 无机盐、p h 、通风量、发酵时间等，然后采用正交试验设计方法对培养基 进行优化，确定一最佳发酵产酶培养基。 1 4 4 液体发酵产生的a 一半乳糖苷酶的生理生化特性。 确定液体发酵产生的q 半乳糖苷酶的生理生化特性，主要是酶的最佳 作用温度；最佳作用p h ；酶的热稳定性。 1 4 塑堑盔堂亟圭堂焦监童 材料与方法 2 1 材料 2 1 1 菌种： 青霉( p e n i c i l l i u m s p ) n - - 3 2 1 2 主要试存j 豆粕 麸皮 玉米粉 蛋白胨 酵母粉 鱼粉 蔗糖 葡萄糖 乳糖 麦芽糖 绵子糖 硫酸铵 硝酸铵 氯化铵 硝酸钠 磷酸二氢钾 硫酸镁 硫酸铁 二氯化钙 磷酸氢二钠 柠檬酸 碳酸钠 氢氧化钠 盐酸 对硝基苯酚 由本实验室保存。 国产市售 杭州面粉厂 国产市售 日本药品株式会社 浙江省富春江酵母厂 进口( 秘鲁产) 国产( a r ) 国产( a r ) 国产( a r ) 国产( a r ) 国产( a r ) 国产( a r ) 国产( a r ) 国产( a r ) 国产( a r ) 国产( a 凡) 国产( a r ) 国产( a r ) 国产( a r ) 国产( a r ) 国产( a r ) 国产( a r ) 国产( a 凡) 国产( a r ) 美国s i g m a 公司 堑堑盔堂亟主堂焦迨塞 对硝基苯d 洳半乳糖苷美国s i g m a 公司 2 1 3 主要仪器 1 隔水式电热恒温箱p y x d h s 型上海市跃进农场医疗器械厂 2 电热烘干箱1 0 1 2 型上海实验仪器厂 3 分光光度计7 5 1 g w 型惠普上海分析仪器有限公司 4 数显恒温水浴锅h h 2 型常州国华电器有限公司 5 酸度计z d 一2 型上海第二分析仪器厂 6 离心机l x j - 型上海医用分析仪器厂 7 摇床h z 9 3 1 0 k 型太仓市科教仪器厂 2 2 试验方法 2 2 1 培养基 2 2 1 1 斜面种子培养基 马铃薯葡萄糖培养基( p d a ) 2 2 1 2 液体种子培养基 玉米粉3 豆饼粉2 k h 。p o4o 2 2 2 1 3 固体发酵培养基 麸皮7 5 豆饼粉1 5 n h 4 n o3 4 鱼粉4 k h ：p o42 2 2 1 4 液体基础发酵培养基 豆饼粉6 k h 2 p o 0 1 m g s o 0 1 2 2 1 5 液体发酵培养基 豆饼粉4 n h 4 n o3 2 k h 2 p o to 2 m g s 0 4 o 2 2 2 2 培养方法 2 2 2 1 斜面种子的活化 从原始菌种中用接种针按种到p d a 斜面上2 8 下培养5 - 6 天，备用。 2 2 2 2 液体种子培养 5 0 0m l 的三角烧瓶中装入1 0 0m l 种子培养基，1 2 1 ( 2 ，3 0m i n 灭菌。 接种后置于摇床中2 8 ，1 8 0r m i n 的条件下发酵培养4 0 小时左右，当三角烧 瓶中出现许多细小的菌球时，此时的菌液即可作为液体菌种。 1 6 塑婆盔堂亟主堂丝迨塞 2 2 2 3 固体发酵培养 5 0 0m i 的三角烧瓶中装入2 0g 固体发酵培养基，加入适量的水，然后 灭菌。接种后置于培养箱中2 8 静止发酵培养。 2 2 2 4 液体发酵培养 5 0 0m l 的三角烧瓶中装入1 0 0m l 液体发酵培养基，1 2 1 ，3 0m i n 灭菌。 接种量3 ( v v ) ，然后置于摇床中 2 8 ，1 8 0r m i n 的条件下发酵培养3 - 4 天。 2 2 3 酶活分析方法 2 2 3 1 固体发酵粗酶液的制备 将发酵好的青霉发酵物于4 0 下烘干，粉碎后取适量，加入5 0 倍体积 ( v w ) 的水，4 0 水浴条件下浸泡4 0m i n ，然后过滤，滤液即粗酶液。 2 2 3 2 液体发酵租酶液的制备 发酵液在3 0 0 0r m i n 条件下离心2 0m i n ，取上清液即为粗酶液 2 2 3 3 酶活测定方法 以对- 硝基苯一d - 伍一半乳糖苷( p n p g ) 为底物，取经适当稀释的粗酶液0 5 ， 加入p h5 0 的缓冲液1 0 m l ，2 m m o l l 的底物0 5 ，于4 0 水浴条件下， 反应1 0 m i n ，然后加入2 0m l 的1 0m o l l 的n a 2 c 0 3 溶液终止反应，在4 0 0 n m 下测分光光度值。 2 2 3 4 酶活力单位定义 在ph 5 0 ，温度为4 0 c 的条件下，每分钟生成l p m o l 对硝基苯酚所需 的酶量为一个酶活力单位。 2 2 4 固体发酵试验方法 2 2 4 1 碳源、氯源比对c i 一半乳糖苷酶合成的影响试验 以麸皮为发酵基质，同时作为碳源，加入一定量豆粕粉作为氮源，比较不 同麸皮豆粕粉比例对产酶的影响 2 2 4 2 无机氮对。一半乳糖苷酶合成的影响试验 先择氯化铵、硫酸铵、硝酸钠、硝酸铵为无机氮源，在麸皮与豆饼按以 上最适比例配制的条件下，加入不同的无机氮源，使发酵培养基中外加入 无机盐的n 含量均相同的情况下( n 含量均为0 7 5 ) ，比较不同的含氮无 机盐对产酶的影响。同时确定最佳无机氮源的需要量。 塑坚盔堂亟主堂垡迨塞 2 2 4 3 添加有机氟对a 一半乳糖苷酶合成的影响试验 添加不同量的酵母粉及鱼粉，比较添加不同的有机氮及其不同的含量对 产酶的影响。 2 2 4 4 水份对。一半乳糖苷酶合成的影响试验 在培养基中以干物质的量为基准，加入不同比例的水，比较