（应用化学专业论文）小分子及其环糊精包合物与鲱鱼精DNA的相互作用.pdf

西南科技大学硕士研究生学位论文第1 页 摘要 d n a 在生物体的基因表达、转录、基因突变、致癌作用以及细胞凋亡方面扮 演着重要角色，一直受到人们的关注。 环糊精对药物分子的包合作用可以改善药物分子的物理和化学性质。因 此，借助于环糊精的模拟酶功能，将靶向分子包合筑构成超分子体系并用于 研究它们与生物大分子d n a 的作用，有助于从分子水平了解抗肿瘤、抗病毒 药物的作用机理，为设计临床上更为有效的药物提供理论指导，而且对开发 新型生物传感器有着重要的意义。 本文综合运用了紫外光谱法、荧光光谱法、电化学方法、粘度法、热力 学方法等，研究了不同小分子体系及其环糊精包合物与鲱鱼精d n a 之间的相 互作用，计算了二者相互作用机理的结合比、结合常数、热力学函数等参数。 实验结果表明，y 环糊精核黄素以1 ：1 摩尔比成包合物，包合常数厨 = 2 2 1 1 0 4l m o l ，该包合物能与d n a 的作用方式为混合方式，主要为沟 槽作用与静电作用。包合物与d n a 的结合比为力b c d - r f t r d n a = 5 ：1 ，结合常 数为c e 2 9 8 1 5k = 2 8 6 x 1 0 3m o l l ，热力学函数为，巩。= 1 4 4 x 1 0 5j m o l ， r 疏= 5 4 9 3 2j m o l 一1 k ，r g m e 2 9 8 1 5k = 一1 9 7 x 1 0 4j m o l ，该过程为熵驱 动。 丫c d 达旦黄与鲱鱼精d n a 之间是一种以沟槽作用和静电作用为主，嵌 插作用为辅的混合作用方式。 吖啶橙与d 环糊精之间以2 ：1 的包合比形成包合物，包合物表观摩尔吸 光系数为e = 6 4 3 x 1 0 4l m o l - 1 e m 。包合物与d n a 之间以混合方式发生作 用，即同时存在较强的静电作用和较弱沟槽作用。 维生素k 3 与y 环糊精以1 ：1 摩尔比成包合物，包合常数k f = 1 0 2 x 1 0 4 l t o o l ，包合物与d n a 的作用方式为混合方式，主要为嵌插作用和静电作 用。 关键词：环糊精鲱鱼精d n a 包合物作用方式 西南科技大学硕士研究生学位论文第1i 页 a b s t r a c t d n aa t t r a c t e dm u c hi n t e r e s td u et oi t sc r u c i a lr o l ei ng e n ee x p r e s s i o n ，g e n e t r a n s c r i p t i o n ，m u t a g e n e s i s ，c a r c i n o g e n e s i sa n dc e l ld e a t h ，e t c c y c l o d e x t r i ni n c l u s i o nc o m p l e xc a nh e l pt om e l i o r a t et h ep h y s i c sa n d c h e m i s t r yc h a r a c t e ro fm e d i c i n e s o ，i nv i r t u eo ft h ef u n c t i o no fs i m u l a t ee n z y m e ， c y c l o d e x t r i nc a nb eu t i l i z e dt oi n c l u d et h et a r g e tm o l e c u l ea n di n v e s t i g a t et h e i n t e r a c t i o no ft h ei n c l u s i o nc o m p l e xw i t hd n a i ti sh e l p f u lt ou n d e r s t a n ds o m e d i s e a s e sa n dt h em e c h a n i s m ，a n do f f e ra c a d e m i cg u i d a n c ei nd e s i g n i n ge f f e c t i v e d r u g ，a n di so fg r e a ts i g n i f i c a n c ei ne m p o l d e r i n gs e n s i t i v ec h e m i c a lp r o b e so f p o l y m e rs t r u c t u r e c o n s e q u e n t l y , t h es t u d yo ni n t e r a c t i o nb e t w e e na n t i c a n c e r m e d i c i n ea n dd n ai sm e a n f u la n ds h o u l db es t u d yi n d e p t h i nt h i s w o r k ，u l t r a v i o l e ts p e c t r o s c o p y ，f l u o r e s c e n c e s p e c t r o s c o p y ， e l e c t r o c h e m i c a lm e t h o d ，v i s c o s i t ym e t h o da n dt h e r m o d y n a m i cm e t h o dw e r eu s e d t os t u d yi n t e r a c t i o nm o d eb e t w e e nt h ed i f f e r e n ts y s t e m so fs m a l lm o l e c u l e sa n d i t si n c l u s i o nc o m p l e xa n dh e r r i n gs p e r md n a t h e i rc o m b i n er a t i o s ，c o m b i n e c o n s t a n t sa n dt h e r m o d y n a m i cf u n c t i o n sw e r ec a l c u l a t e d t h er e s u l t ss h o wt h a tr fa n d ? - c dt of o r ma1 ：1r a t i oo ft h ei n c l u s i o n c o m p l e x ，w i t hi n c l u s i o nc o n s t a n tk f = 2 2 1 x1 0 4 l m o l t h ei n t e r a c t i o nm o d e b e t w e e n7 一c d r fa n dh e r r i n g s p e r md n ai sam i x e db i n d i n g t h e p r i m a r y b i n g d i n gm o d e sa r ee l e c t r o s t a t i cb i n d i n ga n dg r o o v eb i n d i n g c o m b i n er a t i oo f 7 - c d - r fa n dd n ai s i ? - c d r f ：n d n a = 5 ：1 ，a n dc o m b i n ec o n s t a n ti s 妒= 2 8 6 x10 3 m o l l ，t h et h e r m o d y n a m i cf u n c t i o n sa r e 风e = 1 4 4 x 1 0 5j m o l 一，a r g m e 2 9 8 1 5k = 一1 9 7 10 4j - t o o l ，r e = 5 4 9 3 2j m o l 一1 k ，r e s p e c t i v e l y e n t r o p yi sad r i v e n f o t e e t h ei n t e r a c t i o nm o d eb e t w e e ny - c d t ya n dh e r r i n g s p e r md n ai sam i x e d b i n d i n g t h ep r i m a r yb i n g d i n gm o d e sa r ee l e c t r o s t a t i cb i n d i n ga n dg r o o v e b i n d i n g ，a n dt h em i n o rb i n g d i n gm o d ei si n t e r a c t i o nm o d e f ，- c oa n da oc o m ei n t ob e i n gai n c l u s i o nc o m p l e xw i t hr a t i o2 ：1 ，a n d e = 6 4 3 1 0 4l m o l 一1 c m t h ei n t e r a c t i o nm o d eb e t w e e n p 。c d a oa n d h e r r i n g s p e r md n a i sam i x e db i n d i n g ，w h i c hc o n t a i n e ds t r o n ge l e c t r o s t a t i c b i n d i n ga n dw e a kg r o o v eb i n d i n g 西南科技大学硕士研究生学位论文 第1ii 页 v i t a m i nk 3a n d 丫一c dt of o r ma1 ：lr a t i oo ft h ei n c l u s i o nc o m p l e x ，w i t h i n c l u s i o nc o n s t a n tk f = 1 0 2 x10 4l - m o l t h ei n t e r a c t i o nm o d eb e t w e e n ? - c d - k 3a n dd n ai s am i x t u r em o d e ，w h i c hi n c l u d ei n t e r c a l a t i o na n d e l e c t r o s t a t i cb i n d i n g k e yw o r d s ：c y c l o d e x t r i n ；h e r r i n g s p e r md n a ；i n c l u s i o nc o m p l e x ； i n t e r a c t i o nm o d e 独创性声+ 明 本人声明所呈交的论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得 的研究成果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中 不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得西南科技大 学或其它教育机构的学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对 本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示了谢意。 签名：丧丹 日期：加：6 弓 关于论文使用和授权的说明 本人完全了解西南科技大学有关保留、使用学位论文的规定，即：学 校有权保留学位论文的复印件，允许该论文被查阅和借阅；学校可以公布 该论文的全部或部分内容，可以采用影印、缩印或其他复制手段保存论文。 签名：镬寸 导师签名： 醐啡分彳多弓 西南科技大学硕士研究生学位论文第1 页 1 绪论 1 1引言 d n a ( 为英文d e o x y r i b o n u c l e i ca c i d 的缩写) ，又称脱氧核糖核酸，是染 色体的主要化学成分，同时也是基因组成的，有时被称为“遗传微粒”，是生 物体的重要组成物质，它主导着生物的生长、发育和繁殖等活动。d n a 是一 种分子，可组成遗传指令，以引导生物发育与生命机能运作。主要功能是长 期性的资讯储存，可比喻为“蓝图”或“食谱”。其中包含的指令，是建构细胞 内其他的化合物，如蛋白质与r n a 所需。带有遗传讯息的d n a 片段称为基 因，其他的d n a 序列，有些直接以自身构造发挥作用，有些则参与调控遗 传讯息的表现。 分子生物学研究表明，d n a 是体内抗癌药物作用的主要靶标，药物与 d n a 结合后干扰了d n a 的进一步合成，从而抑制了癌细胞的恶性生长n 1 ，。 1 9 6 9 年，顺铂首次被报道具有抗肿瘤活性，随之被应用于临床实验，开创了 小分子金属配合物药物作为抗癌药研究的新领域。小分子与d n a 的作用研 究一直是化学和生物学热门的研究领域。随着研究的深入，许多化合物都能 与d n a 发生作用，这些化合物包括小分子药物、金属络合物、酶抑制剂、 生物染色剂等。已经发现的一些看似简单但能够针对基因突变疾病的化学治 疗药物和某些小分子已成为一些癌症的临床治疗中的常用药物的事实正激发 着科学工作者寻求更多高效、低毒的治疗药物 7 - 1 0 ，。因此，抗癌药物分子与 d n a 相互作用的研究是一个很有意义且有待深入研究领域n ”。 1 9 7 8 年法国科学家j m l e h n n 引等超越主客体化学的研究范畴，首次提出 了“超分子化学”这一概念，他指出：“基于共价键存在着分子化学领域，基于 分子组装体和分子间键而存在着超分子化学”。环糊精作为重要的超分子主体 受到人们越来越多的重视。环糊精( c y c l o d e x t r i n ，简称c d ) ，早期叫沙丁格 糊精( s h a r d i n g e rd e x t r i n ) ，发现于1 8 9 1 年，2 0 年后第一个包合物问世。它 是一种重要的超分子主体，是由环糊精葡萄糖基转移酶( g c t ) 作用于淀粉所 产生的，由d ( + ) 2 葡萄糖单元通过糖苷键连接起来的环状寡糖。环糊精分子 中包含众多化学反应性相同的羟基，这些可修饰和可生成氢键的基团与邻近 的疏水空腔共存，可以包结各种有机、无机客体，给各种模型设计带来了机 会，这种包合作用能明显改善客体分子的状态、稳定性、溶解度等理化特性， 这使得它在医药、食品工业、环境保护和天然酶模拟等方面有着广泛的用途。 西南科技大学硕士研究生学位论文第2 页 因此，研究环糊精包合物与d n a 的相互作用，借助于环糊精的模拟酶 功能对药物包合，不仅有利于抗癌药物的改良和筛选，也对开发新型生物传 感器、超分子作用机理阐述及抗癌药物机理的深入研究等都具有重要意义。 1 2 环糊精化学 1 2 1超分子化学理论基础 超分子化学是基于分子间的非共价键相互作用而形成的分子聚集体的化 学，在与材料科学、生命科学、信息科学、纳米科学与技术等其它学科的交 叉融合中，超分子化学已发展成了超分子科学，被认为是2 l 世纪新概念和高 技术的重要源头之一n ”。超分子化学是一门新兴的学科，它是基于冠醚与穴 状等大环配体的发展以及分子自组装的研究和有机半导体、导体的研究进展 而迅速发展起来的。 超分子作用是一种具有分子识别能力的分子间相互作用，是空间效应影 响下的范德华力、静电引力、氢键力、兀相互作用与疏水相互作用等n n ”。分 子识别是类似“锁和钥匙“的分子间专一性结合，可以理解为底物与给定受体 间选择性键合，是形成超分子结构的基础”。超分子作用对于某些化学反应 过程如催化等具有重要的意义，特别是在生物体系，相当多的生物化学过程 离不开这种作用，如底物与蛋白质的作用、酶催化过程、遗传密码的复制、 翻译、转录等以及抗体与抗原的作用等。 超分子化合物是由主体分子和1 个或多个客体分子之间通过非价键作用 而形成的复杂而有组织的化学体系。主体通常是富电子的分子，可作为电子 给体( d ) ，如：碱、阴离子、亲核体等。而客体是缺电子的分子，可作为电 子受体( a ) ，如：酸、阳离子、亲电体等。超分子化学和配位化学同属于授 受体化学，超分子体系中主体和客体之间不是经典的配位键，而是分子间的 弱相互作用，大约为共价键的5 一1 0 。因此可认为，超分子化学是配位 化学概念的扩展。 超分子体系的微观单元是由若干乃至许许多多个不同化合物的分子或离 子或其他可单独存在的具有一定化学性质的微粒聚集而成。聚集数可确定或 不确定，这与一分子中原子个数严格确定具有本质区别。超分子形成不必输 入高能量，不必破坏原来分子结构及价健，主客体间无强化学键，这就要求 主客体之间应有高度的匹配性和适应性，不仅要求分子在空间几何构型和电 荷，甚至亲疏水性的互相适应，还要求在对称性和能量上匹配。这种高度的 西南科技大学硕士研究生学位论文第3 页 选择性导致了超分子形成的高度识别能力。如果客体分子有所缺陷，就无法 与主体形成超分子体系。由此可见，从简单分子的识别组装到复杂的生命超 分子体系，尽管超分子体系千差万别，功能各异，但形成基础是相同的，这 就是分子间作用力的协同和空间的互补。这些作用力的实质是永久多极矩、 瞬间多极矩、诱导多极矩三者之间的相互作用，相应的能量项可分别称为库 仑能、色散能和诱导能。这些弱相互作用还包括疏水亲脂作用力、氢键力、 作用的协同性、方向性和选择性决定着分子与位点的识别n ”。经过精心设计 的人工超分子体系也可具备分子识别、能量转换、选择催化及物质传输等功 能，其中分子识别功能是其他超分子功能的基础。 1 2 2 环糊精化学理论基础 1 2 2 1环糊精的性质与结构 环糊精作为重要的超分子主体受到人们越来越多的重视。环糊精是环糊 精聚糖转位酶作用于淀粉后经水解环合而成的产物为水溶性、非还原性的白 色结晶粉沫，常见的有a 、p 、丫三种，分别由6 、7 、g 个葡萄糖分子构成， 它的形状口宽底窄类似一个角锥，里面中空的体积。环糊精的内壁由指向空 腔内的c 3 和c 5 上的氢原子及糖苷键的氧原子构成，糖苷键的氧原子上的孤 对电子指向空腔内部，使环糊精空腔内产生较高的电子云密度，从而表现出 l e w i s 碱的特征。环糊精内腔是疏水性的，而环糊精的外腔却有很多轻基， 这使得环糊精有内疏水而外亲水的性质。环糊精结构和重要性质在图1 1 和 表1 1 中表示。 图1 - 1环糊精结构示意图n 盯 fig 1 1t h es t r u c t u r eo f c y ci o d e x t rin 西南科技大学硕士研究生学位论文第4 页 表1 - 1环糊精的一些重要参数 t a b i e 1 1 p a r a m e t e r so fc y ci o d e x t ri n 与客体分子形成包合物，是环糊精最主要的性质。环糊精包合物能否形 成受内在因素和外在条件的影响。内在因素是环糊精和客体的基本性质，外 在条件主要有：1 三维空间排列的相互匹配性；2 范德华力；3 色散力：4 偶 极一偶极相互作用；5 电荷转称作用；6 静电作用力；7 氧键；8 疏水作用m ，。 研究结果表明，多种弱相互作用的协同作用于环糊精的分子识别过程，主 客体间的尺寸匹配、几何互补等因素对主一客体配合物的稳定性有重要的贡献 乜”。近二十多年来，大量的化学修饰环糊精被合成出来，从而扩展了对客体 分子的识别能力和选择性。环糊精及其衍生物对有机和无机小分子的识别， 是环糊精超分子化学中研究得最多的一个领域，已经有综述报道了环糊精对 荧光客体分子的包合识别以及增敏效应、环糊精对药物分子的包合作用从而 改善药物分子的物理和化学性质、环糊精对手性分子的识别以用于分离检测 n “。近年利用环糊精的“外亲水，内疏水”特性与药物及多种有机化合物形成 包合物的研究备受关注。其原因是c d 空腔尺寸与大多数临床使用的药物分 子尺寸相适宜，形成的包合物稳定且无毒副作用，能增加脂溶性药物的溶解 度，输送药物到特定靶点，在某种程度上还能增加药物的治疗效果。环糊精 形成包合物过程示意见图1 2 ： 西南科技大学硕士研究生学位论文第5 页 图1 - 2环糊精形成包合物示意图心们 f i g 1 2 f o r mo fc y c l o d e x t ri ni n c i u s i o n0 0 m p ie x 1 2 2 2 环糊精的应用 利用环糊精的疏水空腔生成包络物的能力，可使食品工业上许多活性成 分与环糊精生成复合物，来达到稳定被包络物物化性质，减少氧化、钝化光 敏性及热敏性，降低挥发性的目的，因此环糊精可以用来保护芳香物质和保 持色素稳定。环糊精还可以脱除异味、去除有害成分，如去除蛋黄，稀奶油 等食品中的大部分胆固醇；它可以改善食品工艺和品质，如在茶叶饮料的加 工中，使用b 环糊精转溶法既能有效抑制茶汤低温浑浊物的形成，又不会破 坏茶多酚、氨基酸等赋型物质，对茶汤的色度、滋味影响最小。此外，环糊 精还可以用来乳化增泡，防潮保湿，使脱水蔬菜复原等。 环糊精能有效地增加一些水溶性不良的药物在水中的溶解度和溶解速 度，如前列腺素c d 包合物能增加主药的溶解度从而制成注射剂。它还能提 高药物( 如肠康颗粒挥发油的稳定性和生物利用度，减少药物( 如穿心莲) 的不良气味或苦味；降低药物( 如双氯芬酸钠) 的刺激和毒副作用，以及使 药物( 如盐酸小檗碱) 缓释和改善剂型。 环糊精是手性化合物，它对有机分子有进行识别和选择的能力，已成功 地应用于各种色谱与电泳方法中，以分离各种异构体和对映体。环糊精在电 化学分析中能改善体系的选择性。 环糊精与表面活性剂一起用到洗发剂及厨房清洗剂中可以减少表面活性 剂对皮肤的刺激，利用环糊精还可以去除织物上的油渍。在染色工艺中，使 用环糊精能够显著降低染料的初始上染速率，提高匀染性及纤维的着色量。 西南科技大学硕士研究生学位论文第6 页 环糊精在环保上的应用是基于其能与污染物形成稳定的包络物，从而减 少环境污染。其特有的分子结构可用于生物法处理工业废水。环拟除虫菊酯 是一类非常重要的杀虫剂，利用环糊精可以解决其不溶于水，需消耗大量的 有机溶剂的问题，是解决拟除虫菊酯污染环境的有效途径。含不饱和脂肪酸 的鱼饲料，用环糊精将脂肪酸包接，可防止其扩散入水。 1 2 2 3环糊精包合物研究进展 美国化学家b r e s l o w 在1 9 7 5 年最早发现环糊精作为主体分子能对过渡金 属配合物产生包合作用而形成第二配位圈化合物心”。1 9 9 8 年罗来斌、陈慧兰 等人确定了烷基钴肟与环糊精包合物的晶体结构扭“。1 9 9 9 年r d s i n i s t e r r a 等人发现水杨醛席夫碱铜配合物与环糊精的包合物可以有效地催化分解过氧 化氢和使超氧自由基歧化化”。最近十几年来，以结构简单的基元分子构建复 杂的功能性大分子化合物在超分子领域愈来愈引起人们的重视。w e n z 等人从 环糊精分子的包合特性出发，利用环糊精及其衍生物主体分子与过渡金属配 合物客体或有机分子客体的自发包合作用，成功地构建出了索烃( c a t e n a a n e ) 、 轮烃( p o i y r o t a x a n e ) 、聚轮烃( p o l y r o t a x a n e ) 和分子管道( t u b u i a rp o l y m e r ) 等等 超分子结构最近还报道了两个维生素b 1 、b 2 分子与q 环糊精形成的含有生 物大分子的轮烃d “。这些结构复杂的大分子化合物具有某些独特的物理化学 性质和活性行为。 多种实验方法如核磁共振、x 射线粉末衍射、红外光谱、紫外可见光谱、 荧光光谱、电化学学方法、热分析方法、各种色谱分析方法以及理论计算方 法等被用于环糊精的超分子作用机理和分子识别机理的研究。 c a r o f i g l i o 研究了在p h = 7 0 的磷酸盐缓冲溶液中七( 2 ，3 ，6 三氧甲基) p 环糊精( 简称t m p c d ) 与m e s o 四( 4 羧基苯基) 卟啉( 简称t c p p ) 及其锌络合 物的相互作用，生成包结常数很大的2 ：1 超分子，又利用核磁共振法研究了 它们的包结模式乜”。s a n y o 等用电子吸收光谱、荧光光谱及圆二色谱研究了 碱性溶液中t p p s 4 与a c d 、b c d 、t m p c d 和1 - c d 的包结作用，计算了 它们的包结比及包结常数，表明t p p s 4 与不同的c d 作用具有不同的包结模 式心”。v e n e m a 等合成了3 种桥连b 环糊精，用1 hn m r 研究了它们与t c p p 、 t p p s 4 的包结模式，同时用荧光光谱法测定了它们的包结常数幢”。m o s i n g e r 等用紫外可见光谱法、荧光光谱法比较了不同2 羟丙基环糊精( 简称h p c d ) 和t p p s 4 生成超分子包结物的能力，说明包结物的形成能大大阻止卟啉吡咯 环上氮的质子化【3 0 】。r e i n h o u d t 等合成了水溶性的杯芳烃环糊精荧光受体， 西南科技大学硕士研究生学位论文第7 页 环糊精单元和杯芳烃单元与阿托品、薄荷醇等客体分子的相互作用使得荧光 基团更加暴露于水中从而增加了荧光淬灭的几率，从而可以对它们进行检测 【3 i 】o 1 3小分子与d n a 的相互作用 1 3 1d n a 靶向药物抗癌原理 1 3 1 1d n a 的分子结构 随着科学和技术的发展，人们对d n a 的组成、结构及其相应的功能有 了清晰的了解。构成核酸的单体是核苷酸，核苷酸由核苷( 包括碱基，戊糖) 和磷酸组成，按戊糖是p d 核糖或p d 2 脱氧核糖，将核酸分为核糖核酸 ( i a ) 和脱氧核糖核酸( d n a ) 。前者的碱基是腺嘌呤( a ) 、鸟嘌呤( g ) 、 胞嘧啶( c ) 和尿嘧啶( u ) 四种：后者的碱基中，除了胸腺嘧啶( t ) 代替 尿嘧啶( u ) 外，其余三种与前者相同。碱基是d n a 的重要结构单元， 核 苷酸中的碱基均为含氮杂环化合物，它们分别属于嘌呤衍生物和嘧啶衍生物。 d n a 中的碱基都是与糖环相连的，连接部位分别为嘌呤的n 9 和嘧啶的n 1 。 研究小分子与碱基的相互作用要考虑碱基所处的生理环境。 d n a 的一级结构即是指四种核苷酸( d a m p 、d c m p 、d g m p 、d t m p ) 按照 一定的排列顺序，通过磷酸二酯键连接形成的多核苷酸，由于核苷酸之间的 差异仅仅是碱基的不同，故又可称为碱基顺序。 两条单链之间碱基由氢键联系起来，形成两种特定碱基配对：a t 和 g c 。相邻碱基对平面之间间隔于v a n d e rw a a l s 距离内，因此碱基平面上分 布的兀电子云系统之间的吸引力、碱基上永久性偶极间的作用力和诱导偶极 的相互作用等分子间作用力，使碱基之间存在堆积作用。堆积作用的大小表 现出嘌呤嘌呤 嘌呤嘧啶 嘧啶嘧啶的趋势，而且还受碱基排序的影响。 氢键和堆积作用使两条脱氧核苷酸单链组成一条双螺旋，就是d n a 的二级 结构。d n a 是一种柔性的生物大分子，这使得d n a 双螺旋可采用不同的构 象，如a 、b 、c 、d 、z 等形式。d n a 采用哪种构象，很大程度上取决于环 境条件，如盐的种类，相对湿度等。b 型是大多数天然d n a 的存在形式， 其结构特点是两条呈反平行的多核苷酸链围绕同一螺旋轴旋绕而成右手双螺 旋，每十个碱基对旋绕一圈形成一个螺旋结构，螺距3 4n m ，螺距直径2n m 。 z d n a 是d n a 几种构象中唯一的左手螺旋。z d n a 中两条由d g 和d c 交 替形成的寡聚核苷酸链反向平行排列，通过w a t s o n 。c r i c k 碱基配对把它们系 西南科技大学硕士研究生学位论文第8 页 在起并绕成一个左手螺旋。d n a 不同构象所具有的特征使得小分子药物来 识别d n a 二级结构成为可能。d n a 双螺旋结构模型如图1 4 所示： 鳓i n 1 1 垮m l a e o u a n i t a b 图1 - 4d n a 双螺旋结构模型怕2 1 f i g 1 4 d o u b i eh e ii xm o d e io fd n a 1 3 1 2d n a 靶向抗癌药物 d n a 和r n a 是细胞繁殖和遗传的物质基础，起着遗传信息贮存、自我 复制和控制蛋白质合成的重要作用。如果d n a 和r n a 的合成受到抑制或破 坏，必然会直接影响到细胞的增殖。自1 9 5 3 年w a t s o i l 和c r i c k 提出了d n a 的双螺旋结构模式，从分子水平上阐述了生命遗传信息通过d n a 半保留复 制机理，从此生物学进入了分子生物学的新的时代，分子生物学和分子药理 学的发展使人们能够从基因水平上理解某些疾病的发病机理，并通过分子设 计来寻找有效的治疗药物。新型抗癌药剂的开发和抗癌机理研究，一直是人 们争相研究的前沿课题。 2 0 世纪6 0 年代，意大利、法国、日本、美国等一些实验室开展了d n a 葸环抗生素道诺霉素复合物研究，发现葸环化合物通过带正电荷的残基与 d n a 之间的静电作用及葸环平面与d n a 的嵌入而形成复合物。分子生物学 和分子药理学的发展使人们能够从基因水平上理解某些疾病的发病机制，通 过分子设计寻找有效的治疗药物。d n a 靶向化合物成为很重要的药物选择对 融 西南科技大学硕士研究生学位论文第9 页 象，临床上使用的许多抗癌药物都以d n a 为作用靶点，通过与癌细胞d n a 发生相互作用破坏其结构，进而影响基因调控与表达的能力，表现抗癌活性 【3 3 1 o 靶向药物是指利用对某些病灶组织细胞具有特殊亲和力的分子作载体， 与药物偶联后将其定向输送到作用的靶器官病灶部位。靶向药物有提高病灶 部位的有效药物浓度，减少用药剂量，降低不良反应等优点。与药物作用的 3 种重要的生物大分子靶：酶、受体、及核酸。其中，以酶和受体为靶的药 物研究开始较早。相比之下，以核酸为靶的药物研究则起步较晚，主要是由 于核酸三维空间结构的复杂性及其与药物作用机制的多样性所决定的。 药物分子与d n a 的相互作用主要有以下3 种模式： ( 1 ) 通过转录因子和聚合酶控制药物与蛋白质的相互作用，从而和发生 相互作用。 ( 2 ) 通过与双链的作用形成核酸三螺旋结构或杂交( 特殊位点的键合) 与 单链 的键合形成杂交体影响转录酶的活性。 ( 3 ) 芳香族配合物分子与的双链结合，这种结合有3 个方面： 与带负电荷的核酸的磷酸骨架通过静电作用结合，这种结合是非特异 性的。 平面芳香环体系嵌入核酸碱基对之间。主要是芳香稠环的平面有机分 子以嵌入模式与作用，例如一些抗癌的抗生素药物( 道诺霉素，阿霉素，棘霉 素，博霉素等) 。 沟槽键合。药物与双链的两种( 大、小) 沟槽键合。与沟槽紧密接触的 小沟槽键合，常伴有氢键结合和与磷酸骨架静电结合，例如光神霉素、纺锤 霉等；与大沟槽键合可以引起与的氢键结合并形成三链结构，如诺福克等。 小分子化合物与核酸作用时，可以同时存在一种或几种基本作用方式。 一部分芳香族分子( 比如些有电化学活性的抗癌药物) 嵌入到双链的碱基对之 间，除了主要通过堆积作用与键合外，子周边的基团与碱基对边缘或磷酸骨 架表面的大或小沟槽，或双链的表面还可以有其他作用力在( 比如氢键或静电 吸引) 。通过比较可以发现，沟槽键合分子与作用明显大于嵌入剂与的用。下 面的章节中将对d n a 靶向药物与d n a 的作用机制做出详细介绍。 1 3 2d n a 靶向化合物作用机制 虽然d n a 靶向化合物的数量非常之大，但与d n a 的结合模式归纳起来 西南科技大学硕士研究生学位论文 第1o 页 大致可分为非共价结合、共价结合和剪切作用三类n “。 ( 1 ) 非共价结合 静电结合 即分子通过非特异性的相互作用结合于带负电荷的d n a 双螺旋外部。 一般认为，静电结合没有选择性，作用于磷酸骨架。有报道认为核酸分子表 面由静电力形成的水化层中的水分子的排列与碱基有关。通常认为这种作用 模式在药物的应用上价值不大，但也并非如此。例如t m p y p 金属朴啉带正 电荷的侧链与d n a 磷酸骨架间静电作用对它能嵌入结合在g c 碱基对之间 起了必不可少的稳定作用。 嵌插结合 即在碱基对之间嵌入平面的或近乎平面的芳环系统，嵌插结合的作用力 来自芳环的离域兀体系间的1 1 兀相互作用。这是药物分子与d n a 发生作用的 最重要形式之一。通常稠环芳环体系都趋向与结合在g c 富聚区，而对于一 些含有庞大取代基的分子，如毗啶取代环的朴啉分子在与d n a 作用时，吡 啶环取代基会尽量旋转，以保持与母体共平面，从而形成良好的堆积形状与 d n a 碱基嵌插。当d n a 靶向分子嵌入d n a 碱基之后，有的可以直接抑制 d n a 复制与转录；有的则在经过进一步活化后，使d n a 断裂受损而影响其 功能。近期研究表明，小分子与d n a 相互作用形式还有“半嵌插结合”不同 于经典结合。 沟区结合 即d n a 靶向分子于d n a 的大沟或小沟的碱基对边缘直接发生相互作 用。通常非稠环的芳香体系能够通过一定的旋转后结合在小沟的a t 富聚区， 并且在靶向分子的供体基团于小沟中的n 3 或t 的0 2 这些受体间常常有氢 键形成，纺锥菌素和h o e c h s t 两种经典的小沟。结合分子与d n a 切割剂连接 后，可以得到亲和性及对a t 序列选择性都有明显的人工核酸酶，近年来发 展起来的反义寡聚核苷酸，因其能够按照严格的碱基对互补原则。通过氢键 结合在双螺旋d n a 的大沟中而形成局部的三螺旋结构，因而可精确识别核 酸所携带信息的特异序列。因此一方面可通过将些具有特定功能的活性基 团缀结于寡聚核苷酸末端，而得到具有高度选择性的人工核酸酶或药物分子 原型g 另一方面如已知靶分子的核苷酸序列，有可能根据反义寡聚核苷酸的 碱基序列直接写下抑制物的化学结构，这一点十分有利于药物分子的合成。 研究表明，小分子与d n a 相互作用形式还有“半嵌插结合”，与特定碱 基对螺纹结合，由于超分子化学的发展，分子与核酸的作用还涉及长距组装， 西南科技大学硕士研究生学位论文第11 页 带有正电荷的分子对核酸有凝聚作用等。影响小分子与d n a 相互作用的应 素很多，小分子的结构、形状大小和柔性都很重要。 ( 2 ) 共价结合以及剪切作用 与非共价结合作用相比，d n a 靶向分子与d n a 共价结合的序列特异性 识别能力要强得多。例如d u o c a r m y c i n 及其衍生物，只能在d n a 小沟中对 a t 富集区识别，分子中活泼的环丙烷与小沟内特定碱基序列中a 的n 3 共价 结合后导致在该位点脱去嘌呤。晶衍射及其它一些方法也都证实了顺铂中的 p t 原子能够与d n a 小沟中同一条链上相邻鸟嘌呤 d ( g p g ) 】的n 7 共价结合形 成链内加成物，并使d n a 双链解旋及产生弯曲，以便于含有高淌度基因结 构的蛋白质的结合。 b l m 是一种典型的d n a 切割化合物，分子结构的特殊性使其能够别并 结合在d n a 中5 - g c 3 序列的鸟嘌呤上，然后经一系列化学反应最终导致 d n a 断链，这种双功能性对于设计人工核酸酶及发展有效的抗肿瘤药物都具 有非常重要的指导意义。事实上，已有大量研究根据这一原理把对d n a 具 有剪切功能的分子与能对d n a 序列进行特异性识别的分子连接起来，以合 成序列特异性更高的人工核酸酶或抗肿瘤药物。 1 3 3小分子与d n a 相互作用研究进展 近年来，由于医药学和生命科学的发展，研究小分子与d n a 相互作用 的机理，对现代药物动力学的认识和开发具有专一、高效性的新药都具有极 其重要的意义。研究药物分子与d n a 的作用有很多实际动机，临床上使用 的许多抗癌药物都是以d n a 作为作用的主要靶点，通过与癌细胞d n a 发生 相互作用破坏其结构，进而影响基因调控与表达的功能，表现出抗肿瘤活性。 一些抗病毒药物如治疗艾滋病药物也是以d n a 作为作用的靶向分子。目前， 许多报道集中于各种金属离子及金属配合物与d n a 作用机理的探讨，而环 糊精包合物与d n a 作用的研究较少。根据所查阅文献，d n a 与小分子相互 作用的研究主要分为两个方面： ( 1 ) 与金属物质的相互作用 一些金属离子，特别是一些过渡金属离子，它们能与发生缔合作用，使 某些的结构发生改变。能与d n a 发生相互作用的金属物质主要有以下两类： 金属离子和金属配合物。其中，金属配合物主要有：金属卟啉配合物，铂配 合物，其他过渡金属配合物。而金属离子又包括：碱金属离子、过渡金属离 子和稀土金属。 西南科技大学硕士研究生学位论文第12 页 1 9 6 9 年，顺铂首次被报道具有抗肿瘤活性，随之被应用于临床实验，开 创了小分子金属配合物药物作为抗癌药研究的新领域。金属配合物小分子与 d n a 的作用研究一直是化学和生物学热门的研究领域。一直是化学和生物学 热门的研究领域。以d n a 为靶分子的金属抗癌剂，其抗癌活性是由于金属 离子与d n a 的配位，即金属离子与d n a 的某些亲核基团( 如磷酸氧位点或 碱基氮、氧位点) 直接螯合，引起癌细胞的d n a 损伤，使d n a 在复制和转 录时受到障碍，从而阻止了癌细胞的生长和分裂，并导致其死亡。因此，了 解金属离子及其化合物与d n a 的作用机制，是揭示其抗癌机理、合成新的 抗癌药物的关键。 汪中明等通过电子光谱法研究了l a ( 1 - i i ) 与2 ，9 二甲基1 ，1 0 菲咯啉( l ) 的d l 丙氨酸衍生物的配合物与小牛胸腺d n a ( c t d n a ) 的相互作用n ”。用溴 化乙啶( e b ) 作为荧光探针研究了l a ( i i i ) l 配合物与c t d n a 相互作用的过程。 康敬万等用电化学方法和吸收光谱法研究了e u 芦丁配合物和小牛胸腺 d n a 的相互作用。发现e u ”芦丁配合物与d n a 通过静电吸引和沟槽键合方 式键合n “。 ( 2 ) 与非金属小分子的相互作用 非金属小分子物质，特别是一些药物分子与的相互作用，会影响到的生 理和物理化学性质，改变的转录和复制。在医药研究中，与靶向分子相互作 用的研究不仅可以阐述一些抗肿瘤、抗病毒药物及致癌物的作用机理，而且 对进一步指导人工核酸的合成、高级结构以及新型药物的设计合成的研究都 具有重要意义。 童晓青等尝试性地用电化学技术探讨硫堇被b 环糊精包合后与d n a 的 相互作用，并就作用模式、性质进行了总结n ”。发现b 环糊精硫堇包合物以 嵌入方式与d n a 形成一种非电活性超分子化合物，包合物与d n a 的结合比 是1g l ，结合常数为6 2 5 x 1 0 4 l m o l 。y w a n g 等采用荧光和紫外等光谱学方 法研究了临界浓度下d 环糊精亚甲基蓝包合物与d n a 的作用，发现了不同 包合物浓度下作用机理的变化n ”。 1 3 4 研究手段 1 3 4 1 环糊精包合物表征手段 ( 1 ) 紫外可见吸收光谱 紫外可见光谱用于表征主客体相互作用的基础是客体包合到c d 后，c d 空腔内的高电子密度诱导客体分子电子移动，吸收波长和吸收度发生不同程 西南科技大学硕士研究生学位论文第13 页 度的变化。紫外分光光度法通过两种方法测定包合物的组成比，一是连续变 异法( j o b 法) ，其基本原理是维持总摩尔数不变，改变c d 和客体分子的比 例，当2 种组分的摩尔分数之比等于包合物组成比时，包合物的浓度最高； 二是摩尔比法，即保持客体分子浓度不变，不断增加c d 浓度配制一系列包 合物溶液，测定吸光度，最大吸光度所对应的摩尔比即为包合物的组成比。 ( 2 ) 荧光光谱法 。 利用荧光光谱研究药物分子与c d 结合常数的方法较多，有双倒数法、 荧光偏振法、时间分辨荧光法、相分辨荧光法及荧光各相异性法，其中双倒 数法可以提示客体与c d 之间的多级包合，其表达式如下： 【g o 【c d z f = i ( k x a ) + c d a l 庐l ( k 口【g 】o ) i c d + i ( a o o ) 【g 】o 为客体的总浓度，为加入c d 后荧光强度较无c d 时的变化值( 实际 上是指包合物的荧光强度) ，a 为常数。实验中，以l f 对i c d 作图，从 所得直线的斜率和截距求得k ，方法简便。用b e n e s i h i l d e b r a n d 法的前提必 须是【c d 】远远大于 g 】o ，且假设溶液中只有1 ：1 包合物形成。 1 3 4 2 药物分子与d n a 作用的表征方法 ( 1 ) 电化学方法 电化学方法由于具有简单、方便、可靠和用量极少等优点，特别是对于 一些通过静电模式与d n a 作用的分子，用电化学方法能获得其它方法无法 得到的信息，因此，自从1 9 6 1 年m i l l e r 开始研究d n a 基本电化学行为以来， 用电化学方法来进行d n a 与识别分子的相互作用的研究越来越多n ”。m a r i n 用循环伏安和琼脂糖凝胶电泳等方法，研究了抗肿瘤药硫化三( 环氮丙基) 磷 和d n a 的相互作用机理，结果表明部分氮丙烷从硫化三( 环氮丙基) 磷中脱 出，与d n a 碱基中的氮呈共价键结合，从而可插入到d n a 碱基对中，从而 可以起到治疗癌症的效果h ”。李青山研究了二乙基邻菲咯啉二氯合锡 ( e t 2 s n c l 2 ( p h e n ) ) 在近生理条件下与d n a 的相互作用 4 1 o 认为e t 2 s n c l 2 ( p h e n ) 主要作用于d n a 的磷酸基因，使d n a 构象发生改变，同时e t 2 s n c l 2