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用于羊毛细化的酸性蛋白酶产生菌选育和发酵研究 摘要 羊毛细化处理中，蛋白酶的应用已经被证明是有效的方法，而且具 有设备简单、操作方便和环保的优点。但是在众多研究中表现出了蛋白 酶对羊毛活性不高的问题。羊毛复杂结构和酶的特异性是单一蛋白酶在 羊毛细化处理中酶活性不高的可能原因。从菌种角度出发选育能够生产 对羊毛高活性的蛋白酶产生菌是个可行的方法。 本文从产生酸性蛋白酶的野生黑曲霉菌株出发，采用亚硝基胍诱变 选育出一株能够产生对于羊毛水解性能较好的酸性蛋白酶菌株。设计一 种用羊毛作为底物的蛋白酶活力测定的新方法。按照活力测定的新方法 研究了诱变菌株的液态和固态发酵过程。 以羊毛为底物的蛋白酶酶活力测定方法是依照氨基酸和茚三酮反 应显色原理。采用羊毛的全降解氨基酸溶液中所对应的羊毛的质量为x 轴，茚三酮反应显色的吸光度作为y 轴，作标准曲线。消除了单一氨 基酸的茚三酮显色产生的偏差。对应标准曲线，可以找到相对应的羊毛 的质量。定义l m l 酶液在1 h 水解i g g 羊毛作为一个酶活力单位u m l 。 在亚硝基胍终浓度为0 6 m g m l ，诱变时间为6 m i n 的条件下。经过 以羊毛部分水解物为主要氮源的筛选培养基初筛，摇瓶复筛后得到菌 株，命名为d h c 4 0 。 研究了诱变菌株d h c 4 0 的液态发酵和固态发酵的培养基组成和 发酵条件。对于液态发酵，单因素试验确定培养基主要营养物质。正交 试验优化和培养基的组成。培养条件采用单因素法确定。在7 5 l 发酵 罐中分批发酵研究了菌体生长和酸性蛋白酶产生的动力学特征，根据发 酵的数据非线性拟和得到了菌体生长和产酶的动力学模型。 固态发酵中，应用单因素优化法确定培养基成分和发酵条件。经过 优化后，诱变菌株的固态发酵酶活力为1 4 3 2 5 6 7 u g 干曲。可见，该 菌株在固态发酵中可以得到较高的酶活力。 比较自制酸性蛋白酶和普通市售的酸性蛋白酶对经过氧化预处理羊 毛细化处理的效果。处理时间为1 小时，羊毛的减量率使用自制酸性蛋 白酶处理为7 3 5 ，而市售酸性蛋白酶处理为5 4 3 ：羊毛的细度使用 自制酸性蛋白酶处理为2 0 3 6 u r n ，而市售酸性蛋白酶处理为2 2 3 5u m 。 从处理效果来看，自制酸性蛋白酶对羊毛的水解效果要优于市售的酸性 蛋白酶。 关键词：羊毛细化，酸性蛋白酶，诱变，液态发酵，动力学模型，固 态发酵，酶的性质 s t u d i e so ns c r e e n i n ga n df e r m e n t i n go fs t r a i n sp r o d u c e s h i g ha c t i v i t ya c i dp r o t e a s ef o rw o o l a b s t r a c t p r o t e a s eh a se f f i c i e n tt ot h i nw 0 0 1 i th a v es o m em e r i t ss u c ha ss i m p l e e q u i p m e n t ，f a c i l i t ym a n i p u l a t ea n de n v i r o n m e n tp r o t e c t i o n b u ts o m ep r o b l e m s w e r ef o u n di ns t u d yo fw o o ls l e n d e r t h em a i np r o b l e mw a st h el o wa c t i v i t yo f p r o t e a s et ow 0 0 1 t h e r ea r em a n yr e a s o n sf o rl o wa c t i v i t yp r o t e a s et ow o o l ， c o m p l e xs t r u c t u r eo fw o o la n ds p e c i a lc h a r a c t e ro fp r o t e a s em i g h tb et h em a i n r e a s o n i tw o u l dh a v ee f f i c i e n ti fah i g ha c t i v i t yp r o t e a s et ow o o lc a nb ef o u n d t o s c r e e nam u t a n tw h i c hb ea b l et op r o d u c e p r o t e a s ew i t hh i 【g ha c t i v i t yt ow 0 0 1 t h i s w a yi sf e a s i b l e i nt h i sp a p e r ，am u t a n tw h i c hw a sa b l et op r o d u c eh i g ha c t i v i t ya c i dp r o t e a s e t ow o o lh a db e e ns c r e e n e db a s e do na s pn i g e r a c c o r d i n gt ot h et h e o r yt h a t n i n h y d r i nr e a c tt oa m i n oa c i dc o u l dc h a n g ec o l o r ，an e wm e a s u r ef o rp r o t e a s e s a c t i v i t yw a sd e s i g n e d a d o p t e dc o m p l e t ed e c o m p o s e dw o o ls o l u t i o nr e a c tw i t h n i n h y d r i n ，as t a n d a r dc u r v eh a db e e ng o t u s i n gc o m p l e t ed e c o m p o s e dw o o l s o l u t i o n ，t h ec o l o rd i f f e r e n c ew h i c hc a u s ef r o md i f f e ra m i n oa c i dr e a c tw i t h n i r d a y d r i nw a se l i m i n a t e d n t gw a ss e l e c t e da st r e a t i n gr e a g e n t am u t a n tw h i c h n a m e dd h - c 4 0w a sp r i m i t i v es c r e e n e db yf i l t e rc u l t u r em e d i u ma n dr e s c r e e n e d b yf l a s kb o r i c t h ef i l t e rc u l t u r em e d i u mw a sd e s i g n e dw i t ht h ep a r td e c o m p o s e d w o o ls o l u t i o na sm a i nn i r o g e ns o u r c e t h el i q u i ds t a t ef e r m e n ta n ds o l i ds t a t ef e r m e n to fm u t a n td h - c 4 0w e r e s t u d i e d i nt h es t u d yo fl i q u i ds t a t ef e r m e n t ，s i n g l ef a c t o ro p t i m i z et e s t sw e r e a p p l i e dt od e t e r m i n et i es o r to fi n g r e d i e n t si n c u l t u r em e d i u ma n di n t d a c t i o nt e s t s w e r ea p p l i e dt od e t e r m i n ed e t a i lp r e s c r i p t i o n c u l t u r ec o n d i t i o n sw e r ed e t e r m i n e d t h r o u g hs i n g l ef a c t o rt e s t s s o m ed a t u mw a ss u r v e y e db yb a t c hf e r m e n ti n7 5 l f e r m e n t o r s o m ek i n e t i cc h a r a c t e r i s t i cf o rg r o w t ho fs t r a i na n dp r o d u c eo f p r o t e a s ew e r es t u d i e d n o n - l i n e a rc u r v ea n a l y s i sm e t h o d sw e r ea p p l i e dt of i tt h e p a r a m e t e r so fk i n e t i c sm o d e l s i nt h es t u d yo fs o l i ds t a t ef e r m e n t ，s i n g l ef a c t o ro p t i m i z ew a yw a su s e dt o d e t e r m i n et h ei n g r e d i e n to fc u l t u r em e d i u ma n dc o n d i t i o n s c h a n g e ds t r a i n d h c 4 0w a sf e r m e n t e di no p t i m i z e dc u l t u r em e d i u ma n dc o n d i t i o n s t h ea c t i v i t y o fp r o t e a s er e a c h e dt o1 4 3 2 5 6 7 u g c o m p a r e dw i t har e g u l a ra c i dp r o t e a s ew h i c hb o u g h tf r o mm a r k e t ，t h e s e l f - p r o d u c e da c i dp r o t e a s ec o u l dh a v eab e t t e re f f e c ti nw e i g h tl o s sa n ds l e n d e rt o w 0 0 1 a f t e ro n eh o u r st r e a t m e n tt i m e ，t h ew e i g h tl o s sc a nr e a c ht o7 3 5 u s i n g b ys e l f - p r o d u c e da c i dp r o t e a s ew h i l et h er e g u l a ra c i dp r o t e a s eo n l yh a s5 4 3 d u r i n gt h ed i f f e r e n tp r o t e a s et r e a t m e n t ，t h ew o o l st h i nc h a n g ef r o m2 4 1a mt o 2 0 3 6 u r na n d2 2 3 5a m t h ef o r m e rp r o t e a s ew a ss e l f - p r o d u c e da n dt h el a t t e rw a s t h er e g u l a r z h a n g t o n g l i a n g ( a p p l i e dc h e m i s t r y ) s u p e r v i s e db ya s s o c i a t ep r o f c h e nd e z h a o k e yw o r d s ：s l e n d e rt h i n n e r , a c i dp r o t e a s e ，p r o t e a s ea c t i v i t y ，a b e r r a n c e ，l i q u i d s t a t ef e r m e n t ，k i n e t i c sr r o d e l s ，s o l i ds t a t ef e r m e n tc h a r a c t e r i s t i c 硕士擘雠丈 附件一： 东华大学学位论文原创性声明 本人郑重声明：我恪守学术道德，崇尚严谨学风。所呈交的学位论文，是本人在导 师的指导下，独立进行研究工作所取得的成果。除文中已明确注明和引用的内容外，本 论文不包含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的作品及成果的内容。论文为本人亲 自撰写，我对所写的内容负责，并完全意识到本声明的法律结果由本人承担。 学位论文作者签名：张习毛 日期：扣叮年，月t o 日 硕士学位论文 附件二： 东华大学学位论文版权使用授权书 学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定，同意学校保留并向国 家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被查阅或借阅。本人授权东华 大学可以将本学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩 印或扫描等复制手段保存和汇编本学位论文。 保密日，在2 二年解密后适用本版权书。 本学位论文属于 不保密口。 学位论文作者签名：磁阁乞 指导教师签名： 日期：泖佯月，口日 2 日期：加叮年 叭 中vm 日卜泪 倜 硕士学位论文 前言 1 1 羊毛细化的概述 第一章前言 羊绒是动物纤维中最优秀的一种，它取之于一种绒山羊身上紧贴皮 肤表面即毛的根部。羊绒纤维比羊毛细很多，外层鳞片也比羊毛细密、 光滑，因此，重量轻、柔软、韧性好。羊绒的光泽好，手感柔滑，这也 是细羊毛所不具有的特点。由于山羊绒在纤维结构上没有毛髓，其保暖 性就比羊毛好。其织造的产品各项性能都是消费者所熟知的纯羊毛产品 及其它纤维产品所望尘莫及的。另外，羊绒由于产量很少。一只山羊一 年仅能产5 0 8 0 克无毛绒，也就是说五只山羊一年所产的羊绒仅可制作 一件普通羊绒衫，被誉为”纤维宝石”、”软黄金”。 羊绒的这些优良的特性和很小的产量必然造成羊绒纤维的价格昂 贵，在2 0 0 4 年的春天，羊绒纤维的原料无毛绒价格将在每吨5 5 万6 0 万元之间。羊毛的价格在2 0 0 4 年国际市场看涨的情况下，被誉为品质 最好的澳毛的最高价格为每公斤8 2 7 澳分，按照最新的汇率计算，折 合人民币为4 7 8 万吨，可以看出羊绒的价格为羊毛的价格的十几倍之 多。在成分上，羊毛纤维和羊绒纤维是基本上一致的，如果能够将羊毛 纤维细化处理，除去羊毛的一部分鳞片层，使其细度达到或接近羊绒的 细度，处理后的羊毛的一些性质将发生部分的改变，具有羊绒的一些性 质。细化后的羊毛和羊绒混纺，替代一部分羊绒，其产品手感好，成本 低，可纺性强，质量好。资源得到了合理的配置。可以降低羊绒制品的 价格。将具有很好的市场前景和巨大的经济效益。 1 2 羊毛细化工艺中的酶法处理 1 2 1 羊毛的酶法处理 化学法对于羊毛的处理取得了比较好的效果。羊毛的防毡缩处理 硕士学位论文前言 的“机可洗 性能和细化的羊毛已经在市场上出现，其中在市场上的羊 绒制品中就含有部分的化学处理的细化羊毛。但是由于化学处理中产生 的有机氯对环境具有严重的污染而逐渐得到了淘汰。酶法处理由于其对 环境的清洁性和本身的高效性，逐渐受到了人们的重视。 羊毛在本质上属于蛋白质，蛋白酶无疑是一种很好的选择。蛋白 酶是水解肽键的一类酶。蛋白质在蛋白酶的作用下，能够迅速水解为胨、 肽等，最后成为氨基酸。蛋白酶按照其水解的肽键的位置不同分为内切 酶( 内肽酶) 和外切酶( 羧肽酶和氨肽酶) 。其中内肽酶是从蛋白质分子 内部水解肽键的蛋白酶：羧肽酶和氨肽酶则分别从蛋白质或多肽的羧基 的末端和氨基末端进行肽键水解，并游离出氨基酸的蛋白酶，又称为外 切酶。按照作用的最适p h 值分为酸性蛋白酶( p h 2 一- 5 ) 、中型蛋白酶( p h 6 8 ) 和碱性蛋白酶( p h9 1 1 ) 。 羊毛是由鳞片细胞、皮质细胞和细胞膜复合物( c m c ) 组成。每 一部分又有极其复杂的微细结构。从形态和结构上看，羊毛纤维主要由 鳞片层和皮质层组成，两者通过细胞间质( c m c ) 粘联在一起；鳞片 层仅占羊毛总量的1 0 左右，由表层，外层和内层构成，鳞片表层和 外层含角质蛋白，难以降解。由于鳞片层的特殊结构，使其在羊毛的性 质中扮演非常重要的角色。鳞片表层对化学作用非常稳定。 图1 - 1 羊毛鳞片形态结构1 2 i 由于羊毛鳞片层中二硫键的网状结构，一般的蛋白酶很难能够将 羊毛的鳞片层降解，所以现在的羊毛防毡缩、细化工艺多集中在首先使 用氧化剂或是还原剂将鳞片层部分剥离，然后使用蛋白酶来处理鳞片层 内部的蛋白质，达到细化的目的。 专一性是酶区别与其他催化剂的重要特性之一。一种蛋白酶只能 硕士学位论文前言 催化水解一种固定氨基酸连接的肽键。羊毛的蛋白质中的氨基酸种类众 多，而且其氨基酸的连接方式也较为复杂。这就为羊毛处理中酶的使用 和选择造成了个较大的难题。羊毛经过处理后细度一般只减少1 1 5 “m ，这和人们所设想的羊毛细化仿羊绒的理想( 从2 2 - - 2 4 1 x m 减少 到15 17 i _ t m ) 还相差很远。所以有些人认为羊毛的蛋白酶细化处理不 是一个好的办法。但是近年来，随着生物技术的飞速发展，蛋白酶产生 菌的选育方法也取得了很大的进步。酶的种类也增加的很快。羊毛蛋白 质复杂的组成和特殊的鳞片层结构决定了所使用的酶不应该是一种纯 的酶，而应该是多种酶的复合物。将多种的纯化的酶制剂和化学助剂进 行复配可以达到一个很好的效果【3 4 】。可是考虑到成本，这种方法是一 种很不经济的方法。如果能够选育出一次培养可以生产多种酶的微生物 菌种，而且这些酶的复合物对于羊毛的处理能够体现出较好的效果。那 将会产生很好的经济效益和在科学研究取得进步。 1 2 2 羊毛酶法细化国内外发展现状 早在1 9 4 1 年m i d d l eb r o o k 和p h i l l i p s 就首先报道了用蛋白酶进行 羊毛防缩处理的研究成果最初的实验发现单独使用酶对羊毛进行处理 其作用很小随后在5 0 年代就有了两种在一定范围内得到商业化应用的 蛋白酶防毡缩技术，即过氧化物酶( p e r z y m e ) 和氯化酶( e h l o r z y m e ) i 艺。 受当时生物技术水平的限制这两种酶处理技术未能得到进一步的推广 应用和发展。现在，由于迄今为止最为成熟、应用最为广泛的氯化树脂 法技术存在环境污染问题，产生a o x 5 1 ，即可吸收的有机氯化物。因 此用蛋白酶进行羊毛改性处理又重新受到重视。虽然目前其工业化程度 还不高，但关于这一方面的报道越来越多，且已从单纯的防缩加工转移 到了改善产品风格手感和光泽提高穿着舒适性以及仿珍贵动物毛( 如山 羊绒、马海毛) 效果在现有的酶处理工艺中只有极少数是单独的酶处理 大多数仍是预处理和酶处理的两步法联合工艺。如在1 9 9 7 1 9 9 8 年间 有关羊毛织物( 机织物针织物) 和纯毛纱线的防缩处理报道大多数采用 了双氧水作为预氧化剂进行预处理而后用酶处理酶如( 13 9 8 6 1 、h a p 、 硕士学位论文 前言 m a x w z 、m a x a c a l l 7 】) 等进行后处理。 目前的羊毛用蛋白酶整理剂主要是以改善羊毛的手感、抗起毛起 球、低温染色等为主要目的，还未见有商品化的羊毛防毡缩酶制剂和细 化产品。可见对于羊毛防毡缩整理和细化仿羊绒处理中还有很多的问题 需要研究。 1 2 3 羊毛酶法细化的前景 羊毛的细化是提高羊毛的品质和经济效益的一个很重要的研究内 容。在市场上已经出现了部分的细化羊毛替代羊绒的产品，可见，细化 的羊毛具有较好的市场前景。化学法由于其对环境的污染性已经淘汰。 酶法细化成为替代化学细化的重要的手段。 蛋白酶的种类很多，不同的蛋白酶水解的肽键不同。胰蛋白酶专 一水解赖氨酸和精氨酸的羧基形成的肽键。糜蛋白酶专一水解疏水性氨 基酸，主要是酪氨酸、苯丙氨酸和色氨酸的羧基形成的肽键，胃蛋白酶 水解的肽键要求两侧的氨基酸都是疏水性的氨基酸。谷氨酸蛋白酶专一 水解谷氨酸和天冬氨酸的羧基形成的肽键，精氨酸蛋白酶水解精氨酸的 羧基形成的肽键【8 】。在羊毛细化处理工艺中碱性蛋白酶对于羊毛的处理 容易造成羊毛纤维的内部受损，严重影响处理后羊毛的强度。酸性蛋白 酶对于羊毛作用温和。机械性能损伤小i 引。酸性蛋白酶在羊毛细化工艺 中的应用值得重视。 羊毛防毡缩和细化的研究中，研究者多集中于染整科技工作者。研 究的重心多放在羊毛的处理工艺的研究上。对于酶种类的研究集中于现 有的酶的品种选择和复配。现在还没有市售的对于羊毛的专用的蛋白酶 制剂。可以看出只是采用现有的资源来进行这方面的研究具有很大的局 限性。开发新的酶制剂势必成为下一阶段羊毛处理的研究中一f i , 。同属蛋 白酶，由于降解的对象不一，来源不一，性能相差较大，因此特别能体 现酶的化学专一性。这也为选育生产羊毛处理专用酶的菌种提供了理论 依据。 生物酶来源于菌种的发酵代谢过程，新的菌种成为了新的酶制剂 硕士学位论文前言 的保障。一些研究生物的科研工作者注意到了这些情况，在这个方面做 了一些工作。李永泉采用激光对宇佐美曲霉棕色突变株w 2 5 进行诱变 处理选育到一株产酸性蛋白酶、纤维素c m c 酶的复合酶生产菌 l 8 6 f 1 0 i 。这个菌株能够同时生产出酸性蛋白酶和纤维素c m c 酶，两种 酶同时作用，蛋白酶渗入鳞片内层进行酶解而纤维素酶通过降解间质层 c m c 协助蛋白酶剥除羊毛鳞片。中科院沈阳生态研究所的曹军【ll j 等从 土壤中分离出1 株可有效降解角蛋白的栖土曲霉，固态发酵后得到的 蛋白酶具丝氨酸蛋白酶的特性。角蛋白酶可以特异性地作用角蛋白使其 二硫键裂解进而降解为多肽、寡肽和游离氨基酸。姚淑敏【l2 j 在从长期 堆积废羽毛的土壤中分离筛选出一株对羽毛有降解能力的细菌，为一芽 孢杆菌。发酵生产的蛋白酶对羽毛具有较强的降解能力。 从以上这些人的研究来看，新的菌种的选育，培养这些新的菌种 产生对于羊毛特异性作用的生物酶，是具有理论和实验支持的。 1 3本文研究的目的和主要内容 生物酶制剂在羊毛的处理中具有良好的应用前景。但是现在所面 临的问题是酶种类的选择局限性和多种酶复配的成本问题。从微生物菌 种选育角度出发，筛选菌种，发酵后能够生产对于羊毛降解具有较好效 果的酶制剂产品。这样可以达到节约成本、提高产品质量的目的。微生 物菌种经过诱变处理，基因受到一定程度的损伤，在基因结构上会发生 一些变化。在培养基中加入一些需要降解的物质作为微生物生长的营养 物质，微生物在受到诱变剂的作用后，那些能够在该种营养物质上生长 的微生物菌种有可能具有分泌分解该种物质的酶的能力。 鉴别培养基是菌种选育方法中很重要的一个部分。本课题中要求 筛选出的菌株能够生产对于羊毛水解具有高效的酸性蛋白酶。根据菌株 诱变过程中具有的不确定性。在筛选培养基中加入羊毛的成分作为主要 的营养，这样诱变后的菌株如果能够利用羊毛作为生长的营养，那么可 以分泌分解羊毛能力的酶系，这种酶系是我们所需要的。在鉴别培养基 中加入羊毛的成分可以提高筛选的效率。 硕士学位论文 前言 底物不同，测定酶活力得到的结果也不相同。得到对羊毛具有高效 水解活性的酸性蛋白酶是我们的目的，那么直接用羊毛作为酶活力测定 的底物，更能够体现酶活力的水平。设计用羊毛这种特殊蛋白质的蛋白 酶活力测定方法也成为研究内容。 在实验中菌种的发酵研究都使用的是摇瓶培养。体积小，菌体生长 批次间平行性不好，对于以后的工业生产指导意义不高。小型发酵罐的 培养条件接近工业生产的发酵罐，用小型发酵罐来研究菌体生长的特征 和产酶的特征对于以后的生产具有一定的指导意义。通过发酵罐的实验 来得到菌体生长和酶产生的特征，建立动力学模型。对于以后的生产的 控制具有一定的帮助。 基于以上目的，本文在以下四个方面进行了的研究和探讨： 1 、适用于羊毛细化酸性蛋白酶产生菌的选育 通过亚硝基胍对野生黑曲霉产生菌的诱变。利用菌株经过诱变后碱基变 化的不确定性，使用羊毛的部分水解物作为诱导物，筛选那些能够以羊 毛部分水解物作为营养物质，代谢出的酶能够水解羊毛的菌株。设计一 个含有羊毛部分水解物的筛选培养基。使用摇瓶复筛来确定高产的菌 种。 2 、设计以羊毛作为底物表征蛋白酶活力的方法 以标准的澳毛作为酶活力的测定的底物，酶水解羊毛后的水解液 中所含有的氨基酸用茚三酮显色。将羊毛在酸液中完全分解得到的氨基 酸溶液作为基准，测定酶活力。 3 、适用于羊毛细化蛋白酶发酵培养基和培养条件的优化 通过单因子优化和正交优化方法相结合，研究液态深层发酵和固 态发酵过程的条件和培养基的组成。用小型发酵罐液态发酵研究建立蛋 白酶发酵过程的动力学模型。 4 、新菌种所生产的酸性蛋白酶的性质和在羊毛上的应用 测定自制酸性蛋白酶的一些性质，外界环境对酶活力的影响。对 比市售的蛋白酶，测试在自制酶对羊毛的水解效果。 硕士学位论文 理论部分 第二章理论部分 2 1蛋白酶对羊毛的作用 2 1 1 羊毛的结构 羊毛纤维不同于合成纤维，就其化学组成来看，本质是一类复杂的 蛋白质化合物。从分子上来看，羊毛纤维中包括了所有的十八种氨基酸， 其中含量较高的有胱氨酸、谷氨酸、精氨酸、亮氨酸、苏氨酸和酪氨酸； 而最主要的还要算胱氨酸。胱氨酸含有双硫键，对坚固鳞片层的形成起 着重要作用。 图2 - 1 羊毛纤维结构1 3 j 从形态和结构上看，羊毛纤维主要由鳞片层和皮质层组成，两者通 过细胞间质( c m c ) 粘联在一起。鳞片层仅占羊毛总量的1 0 左右， 由表层，外层和内层构成，鳞片表层和外层含角质蛋白，难以降解。由 于鳞片层的特殊结构，使其在羊毛的性质中扮演非常重要的角色。 2 1 2 蛋白酶对羊毛作用的机理 在酶与羊毛的反应体系中，酶是肽键遇水分解的催化剂。酶在适宜 的条件下发挥其活性，从羊毛纤维表面鳞片层的亲水部分进入纤维内部 促使羊毛中的肽键水解达到使部分蛋白质溶解的目的。 硕士学位论文 理论部分 一0 卅占r j l l 0ii 蚪丑n 一 c h n 一占j 上一n 一占j l n ih hh h + h 2 n 一吉r 2 j l o 一 酶催化水解肽键 其催化过程可简述如下【1 4 】： 1 酶分子在溶液中向羊毛纤维表面扩散； 2 酶分子在溶液中向纤维表面的吸附 3 酶分子向羊毛纤维内部扩散 4 酶催化水解反应 5 反应产物从羊毛内部向外部扩散 6 产物向溶液中扩散 图2 - - 2羊毛酶催化水解过程1 1 5 l 2 2 蛋白酶活力测定 2 2 1 福林法1 1 6 i 手 蛋白酶在一定的温度与p h 值条件下，水解酪蛋白底物，产生含有 酚基的氨基酸如：酪氨酸、色氨酸；在碱性条件下，将福林试剂还原， 生成钨蓝和钼蓝，用分光光度法测定吸光度，计算蛋白酶的活力 1g 固体酶粉( 或l m l 液体酶) ，在一定温度和p h 值条件下，l m i n ， 一一且 硕士学位论文理论部分 水解酪蛋白产生l l x g 酪氨酸为一个酶活力单位，以i t g ( i x m 1 ) 表示。 2 2 2 蛋白酶活力测定的一些新方法 2 2 2 1 d n a 溴乙锭荧光分析法1 1 7 i 原理：溴乙锭插入双链d n a 的碱基对之间时，可使d n a 的荧光增 加2 5 倍。接近饱和的溴乙锭( 0 5 1 上g m 1 ) 与d n a 混合时，其荧光增加量与 d n a 的浓度呈正比。当蛋白质( 如组蛋白) 与d n a 结合时，阻止了溴乙锭 的插入，结果，荧光消失。组蛋白与d n a 有非常高的亲和力，组蛋白加入 双链d n a 溶液时，全部结合到d n a 双链上，溶液中没有游离的组蛋白存 在，直到所有结合部位都饱和。溶液荧光的下降量与组蛋白的加入量呈 正比。在d n a 组蛋白溴乙锭溶液中加入蛋白酶时，蛋白酶水解结合在 d n a 链上的组蛋白，使d n a 结合部位暴露出来，溴乙锭重新插入d n a 双链中，荧光增加量与蛋白酶活性呈正比。据此，通过测定d n a 溶液的 荧光增量来计算蛋白酶的活性。 测定方法：在1 7 x 7 5 m m 的硼酶玻璃管中，加入含有o 5 9 9 m l 溴乙锭 的p h 8 0 的t r i s 缓冲液1 2 m l 和1 0 t l d n a - 组蛋白复合物( 其中含o 5 1 x g 牛胸腺d n a 和1 5 1 x g 完整组蛋白) ，于3 7 0 c 平衡5 分钟后，加入约1 0 1 x l 蛋白酶，在一定的间隔时间内，测定荧光增量。激发波长为5 2 5 n m ，发射波 长为6 0 0 n m 。 2 2 2 2 x 光胶片法1 1 8 l 取适当大小的x 光胶片，将一定量的明胶液均匀地涂于x 光胶片 上。将待测酶液5 0 1 且1 滴加于胶片上，然后将胶片放入4 2 0 c 恒温箱中( 箱 内温度根据待测酶的最适温度而定) 保温4 0 分钟左右。取出胶片用自来 水冲洗1 0 - - l5 分钟。测量胶片上透明圈的直径，并算出透明圈的面积， 再以此计算酶的活性。 2 2 3 蛋白酶活力测定的自定义方法 羊毛的蛋白质结构比较复杂，蛋白质中的氨基酸序列的排布是多种 多样的。采用国家测量标准中的酪氨酸作为蛋白酶的作用底物，很难反 硕士学位论文理论部分 映出新筛选到菌种产生的蛋白酶对羊毛的作用。考虑到菌种选育的目的 是筛选出能够代谢对于羊毛降解有力蛋白酶的菌株，直接以羊毛作为测 定基准，可以很直观的反映出蛋白酶对羊毛的作用能力。 在p h5 7 和8 0 1 0 0 c 条件下，大多数氨基酸和茚三酮乙醇溶液 反应形成兰紫色的化合物旧】。不同的氨基酸和茚三酮反应显色过程中， 显示的颜色也不完全一样。对于蛋白酶降解羊毛后的水解液中，所含有 的氨基酸和多肽片段种类繁多，如果使用单一的氨基酸作为比色的标准 的话，水解液中众多的氨基酸显色反应中会出现颜色的偏差。考虑到这 个问题，采用羊毛的完全水解液作为茚三酮显色的标准，绘制一条标准 曲线。蛋白酶对羊毛的水解程度就可以通过茚三酮显色后和标准曲线的 比对来定量的得知。 2 3微生物的菌种选育 菌种选育包括根据菌种自然变异而进行的自然选育，以及根据遗传 学基础理论和方法，人为引起的菌种遗传变异或基因重组，如诱变育种、 杂交育种、原生质融合和基因工程等技术。 当前发酵工业中使用的高产菌种，几乎都是通过诱变育种而大大提 高了生产性能的菌株。诱变育种除能提高产量外，还可达到改善产品质 量、扩大品种和简化生产工艺等目的。诱变育种具有方法简单、快速和 收效显著等特点。目前仍是广泛使用的主要育种方法之一。考虑到本研 究的思路是对原有能够产生酸性蛋白酶的野生黑曲霉菌株进行改造，促 使其能够生产出对于降解羊毛具有较好功效的酶系。生产出的酶可能是 一组蛋白酶的混合酶，也可能是一组蛋白酶和其他种类酶的混合，所以 采用诱变剂对菌种进行诱变育种的方法。 2 3 1 菌种诱变的生物学原理 d n a 作为遗传物质有三个功能：一是通过复制将遗传信息由亲 代传递到子代；而是通过转录是遗传信息在子代得以表达；三是通过变 异在自然选择过程中获得新的遗传信息【2 0 1 。变异是d n a 的核苷酸序列 硕士学位论文 理论部分 改变的结果，它包括由于d n a 损伤和错配得不到修复引起的突变，以 及由于不同d n a 分子之间的减缓而引起的遗传重组。 在自然条件下发生的突变称为自发突变。自发突变的突变率非常 低，在1 0 1 0 左右。能够提高突变率的物理或化学因子称为诱变剂。物 理的诱变剂包括紫外线、电离辐射和激光等物理因素。紫外线的高能量 可以使相邻嘧啶之间双键打开形成二聚体，使d n a 产生弯曲和扭结。 o 。审呲 o o 胸腺嘧啶( t )胸腺嘧啶二聚体( t t ) 1 2 1 i 电离辐射的作用比较复杂，除射线直接效应外还可以通过水在电离 时所形成的自由基起作用。大剂量照射时，还会出现碱基的破坏。某些 化学诱变剂通过对d n a 碱基的修饰作用而改变其配对性质。亚硝酸能 脱去碱基上的氨基。烷化剂能够使d n a 碱基上的氮原子烷基化引起分 子电荷分布的变化而改变碱基配对的性质。亚硝基胍在适宜条件下可使 每一个细胞发生一个以上的突变，典型的变化是在d n a 复制叉部位出 现多个紧相靠近的一簇突变。一次控制加入亚硝基胍的时间和剂量可选 择性地使细胞d n a 特殊片段发生突变。 9 2 - c - - 甲n h - - 3c c 7 h 2 h c 2 - - i d n a 链 i d n a 链 两个鸟嘌呤的交联作用 2 1 l 2 3 2 诱变育种的原则 n h 2 诱发突变是指通过人为方法，利用物理、化学或生物因素显著提高 基因自发突变频率的手段。诱变育种需遵循以下几个原则【2 2 】： ( 1 ) 选择简便有效的诱变剂：在选用理化因素作诱变剂时，在同样效果 下，应选用最简便的因素：而在同样简便的条件下，则应选用最高效的 因素。实践证明，在物理诱变剂中，尤以紫外线为最简便；而在化学诱 硕士学位论文 理论部分 变剂中，一般可选用公认效果较显著的“超诱变剂”，如n 一甲基一n 一 硝基一n 一亚硝基胍( n t g ) 。 ( 2 ) 挑选优良的出发菌株：出发菌株是用于育种的原始菌株，选用合适 的出发菌株有利于提高育种效率。如选用具有有利于进一步研究或应用 性状的菌株：选用已发生过其他突变的菌株。 ( 3 ) 处理单细胞或单孢子悬液：为使每个细胞均匀接触诱变剂并防止长 出不纯菌落，就要求作诱变的菌株必须以均匀而分散的单细胞悬液状态 存在。用于诱变育种的细胞应尽量选用单核细胞，如霉菌或放线菌的分 生孢子或细菌的芽胞等。 ( 4 ) 选用最适的诱变剂量：各类诱变剂剂量的表达方式不同，如紫外线 的剂量指强度与作用时间之乘积；而化学诱变剂剂量则以在一定外界条 件下，诱变剂的浓度与处理时间来表示。根据以往诱变结果，可发现正 变较多地出现在偏低的剂量中，而负变则较多地出现在偏高的剂量中。 因此，目前在产量诱变工作中，大多倾向于采用较低剂量。 ( 5 ) 充分利用复合处理的协同效应：诱变剂的复合处理常常表现出明显 的协同效应，因而对育种有利。 ( 6 ) 利用和创造形态、生理与产量间的相关指标：利用鉴别性培养基或 其他途径，可有效地把原先肉眼无法观察的生理性状或产量性状转化为 可见的“形态”性状。如可在琼脂平板培养基上，通过观察和测定某突变 菌落周围蛋白酶对干酪素水解圈的大小，来估计此突变株的产蛋白酶能 力。 ( 7 ) 设计高效筛选方案：通过诱变处理，在微生物群体中会出现各种突 变型个体，但从产量变异的角度讲，其中绝大多数都是负变株。要从中 把极个别的、产量显著提高的正变株筛选到手，必须设计简便、高效的 科学筛选方案。 2 3 3菌种诱变的诱变方法及诱变剂 在人工的物理化学诱变因素作用下，菌株的突变率得以大大提 高，有利性状的突变株被筛选到的可能性大大增强。 硕士学位论文理论部分 物理诱变主要是采用辐射。如紫外线、x 射线、丫射线、激光和快 中子等都是常用的诱变剂。化学诱变剂的种类很多。根据其作用方式的 不同分为三类：一是可以与核酸碱基发生化学反应的诱变剂，此类主要 有烷化剂、亚硝酸和羟胺等。二是一些碱基类似物。它们与碱基的结构 类似，在d n a 复制时，它们可以被错误的掺入d n a ，引起诱变效应。 三是具有移码突变能力的突变剂。移码突变是指由一种诱变剂引起 d n a 分子中的一个或少数几个核苷酸的插入或缺失。从而使该部分后 面的全部遗传密码发生转录和翻译错误的一类突变。亚啶类化合物属于 这一类的诱变剂。 ( 1 ) 紫外线辐射【2 3 1 紫外线辐射是物理诱变因子中较有效，较普遍方法之一。紫外线的波 长在2 0 0 - 3 8 0 n m 之间，但是对诱变最有效的波长仅仅是2 5 3 2 6 5 n m ， 一般紫外线杀菌灯所发射的紫外线大约有8 0 是2 5 4 n m 。紫外线照射 后造成的d n a 损伤，一般在可见光照射下，由于光激活酶的作用，可 将嘧啶二聚体解开，使其恢复正常，这称为光复活作用。为了避免光复 活，经紫外线照射后的样品必须用黑纸或者黑布包裹。 ( 2 ) 亚硝基胍( n t g ) 诱变2 1 】 亚硝基胍的化学名称为1 甲基3 硝基1 亚硝基胍，简称n t g 。为 黄色结晶状物质。性质不稳定，遇光易分解，放出n 0 2 。n t g 有超诱 变剂之称，能使细胞发生一次或多次突变，还能使多基因并发突变，在 复制叉附近一个基因突变能诱发邻近位置的基因陆续连锁突变。依靠 n t g 诱发的突变主要是g c a t 转换，另外还有小范围切除、移码突变 及g c 对的缺失。在自然条件下n t g 容易分解，而在酸性( p h5 5 ) 条件 下会产生h n 0 2 。虽然h n 0 2 本身就是诱变剂，但在n t g 有活性时 ( p h 6 9 ) ，它却无诱变效果。在碱性条件下，n t g 会形成重氮甲烷 ( c h 2 n 2 ) ，它是引起致死和突变的主要原因。它的效应很可能是c h 2 n 2 对d n a 的烷化作用引起的【2 2 1 。 亚硝基胍的诱变过程一般采用磷酸盐的缓冲液作用反应体系，微 生物孢子或菌丝体在亚硝基胍溶液中反应一定的时间。用稀释的方法来 硕士学位论文理论部分 终止反应。平皿涂布。在一定特殊设计的培养基中生长，经过筛选可以 得到需要得微生物菌种。 2 3 4 诱变育种的基本过程1 2 4 i 区亟回日区巫圆日圈嚼 1 出发菌株的选择 用来育种处理的起始菌株称为出发菌株。合适的出发菌株就 是通过育种能有效地提高目标产物常量的菌株。首先应考率出发菌株是 否具有特定生产性状的能力或潜力。 本课题的要求是诱变生产能够对羊毛降解具有特别效果的酶系的 产生菌。其中其作用的应该不是一种单一的酶。那么就要求诱变的出发 菌株具有的酶系比较完整。考察后认为黑曲霉具有生产酸性蛋白酶的能 力，也有一些黑曲霉具有生产纤维素酶的能力。野生的黑曲霉菌株在被 诱变后，可能会筛选得到产生多种蛋白酶或是同时产生蛋白酶和纤维素 酶的菌株。这样的菌株的发酵产物中的酶应该对羊毛具有一些特殊的效 果。经过以上分析后，选择了野生型的黑曲霉作为了诱变育种的出发菌 株。 2 制备菌悬液 在微生物的诱变操作中，菌体的均一性可保证诱变剂和每个细胞 充分的接触，提高诱变的可能性。为了避免细胞团的出现，可以用玻璃 珠振荡打散细胞团，再用脱脂棉花或滤纸过滤的，得到分散的菌体。对 于产生孢子或孢芽的微生物最好采用孢子或孢芽。本课题中采用的是黑 曲霉菌作为诱变的出发菌株，黑曲霉菌是一种产生孢子的菌体。在诱变 过程中，选择新鲜的孢子，玻璃珠振荡，过滤，得到单孢子的悬浮液。 3 诱变处理 诱变剂的使用种类在很大程度上还是依靠经验来选择。不同的诱 硕士学位论文理论部分 变剂诱变的机理和作用的效果不同。衡量诱变剂的作用效果的指标应该 是一个综合的指标。单单以诱变剂的剂量或是浓度、作用时间作为诱变 的指标，会产生偏差，不利于重复的操作。另外，不同种类和不同生长 阶段的微生物对于诱变剂的敏感程度不同。在诱变处理前，应该预先做 诱变剂用量对菌体致死数量的致死曲线。选择合适的操作方法和诱变剂 的剂量。就一般的微生物而言，突变率随剂量的增加而增高，但是达到 一定剂量后，再加大突变剂的剂量反而会使突变率下降。人们对于诱变 剂的具体用量有不同的看法。有人认为高剂量的是适合的，就是造成菌 体致死率在9 0 一9 9 9 时的剂量。在这个剂量下，能够获得较高的正 突变率。有人认为在低致死率( 7 0 一8 0 ) 能够提高正突变率，而负 突变率出现在高的剂量中。对于这些不同的说法，应该用实验的方法来 验证，不同的微生物诱变的效果不同。n t g 具有使得细胞发生多次诱 变的能力，且操作简单，设备要求不高。选择了n t g 作为诱变剂。 2 3 5 菌种筛选1 2 5 i 筛选的方法要求快速、简便，具有一个明显的特征来区分变异株。 按照这种要求的建立的筛选方法有菌体形态方法、平皿快速检验法。平 皿快速检验法是将肉眼看不到的微生物的性状转变为可见的“形态”变 化。包括显色法、变色圈法、透明圈法、生长圈法和抑制圈法等。这些 方法一般只能定性或半定量用，常用于初筛。用于复筛的比较精确的方 法一般采用摇瓶培养法，摇瓶的培养条件和与发酵罐的条件较为接近， 能够反映实际情况。以上这些方法存在的一个显著的问题就是工作量 大，效率低下。经过几百次的实验后也不一定能够得到需要的菌株。寻 找特殊的筛选方法是极其重要的。后来发展定向筛选常用来筛选抗性突 变株和营养缺陷型突变株，其筛选效率很高。抗性突变包括抗代谢产物、 抗代谢类似物、抗噬菌体、抗前体及其类似物、抗重金属离子或抗特定 的有毒物质。抗培养基中的某些成分，代谢产物等的积累往往对其自身 的合成具有反馈调节作用。筛选的抗性突变株，可以消除这些不利因素 的抑制或阻遏作用，达到积累目的。营养缺陷型的本质是一种减低或消 硕士学位论文 理论部分 除末端产物以解除反馈抑制，使代谢途径中的中间产物或分枝合成途径 中的末端产物得以积累【2 6 1 。 筛选方法的选择是育种研究中的难点，就不同的育种目的而选择 和设计自己的筛选方法和筛选培养基，不能一概而论。微生物生长过程 中，对于外界营养的利用是靠自身酶的分泌