（应用化学专业论文）联用色谱在中药和生物样本中活性成分的分析方法及其应用研究.pdf

摘要 现代分析仪器提供了大量而又丰富的量测信息，特别是气相 色谱与质谱，高效液相色谱与二极管阵列，高效液相色谱与质谱 等联用仪的发展，它们将色谱的分离能力与光谱的表征能力相结 合，借助新的分析理论和技术，为生物学、生命科学、药物学、 环境科学等学科分析问题的解决提供了强有力的工具和手段。高 维数据解析方法的发展使人们对复杂化学体系分析能力有了很 大的提高，使得传统分析化学难以处理的“黑色”体系的分析成为 可能。本论文从当前化学学科发展现状出发，从色谱和质谱联用 仪器入手，目的是通过有效利用色谱和质谱提供的联合信息，建 立中药和生物体液中活性成分的分析方法，从而实现对中药和生 物体液等复杂体系的定性和定量分析。论文主要涉及三个方面： 联用色谱在中药实际体系的分析，高效液相色谱与二极管阵列和 质谱联用法用于中药活性成分的分析方法及其应用研究和高效 液相色谱与二极管阵列和质谱联用法用于生物体液中活性成分 的分析及其应用研究。 一联用色谱在中药实际体系的分析( 第二章一第三章) ：用 化学计量学多元分辨方法和相关化学计量学方法，对中草药活性 成分进行定性和定量分析；利用联用色谱提供的色谱和光谱( 质 谱) 信息，以建立色谱指纹图谱。第二章用气相色谱一质谱联用 法( g c - m s ) 分离和检测当归根挥发油，用子窗口因子分析法( s f a ) i 和相关化学计量学方法，对当归根的g c m s 二维数据进行分辨， 从而定性和定量分析了当归根中挥发油成分；同时用光谱相关色 谱( s c c l ，定性比较分析了当归两个不同部位( 当归须和当归根) 的挥发油成分。第三章用h p l c d a d 和l c e s i m s 法研究了中 药黄芪黄酮类化合物的色谱指纹图谱。 二用h p l c - d a d 和l c m s 联用仪定性和定量分析中药的 活性成分。从天然产物中寻找可能发展为新药先导化合物的研究 有重要实际意义，由于用传统的分离方法从药用植物及海洋生物 中分离纯化有效成分非常耗时，因此建立高效、快速、灵敏度高 和选择性好的方法，以对有生物活性的天然产物中有效成分进行 分析在药用植物研究中有重要意义。第四章建立了h p l c d a d 和l c e s i m s 法分离、鉴定与定量分析冬虫夏草及蚕蛹虫草中 的活性成分核苷类化合物的方法。冬虫夏草和其替代物中有多 种核苷类化合物，但其主要活性成分为腺嘌呤、次黄嘌呤、腺苷 和虫草素，本章也建立了一个灵敏、快速和选择性好的定性和定 量分析冬虫夏草和其替代物蚕蛹虫草中主要活性成分腺瞟呤、 次黄嘌呤、腺苷和虫草素的等度l c e s i m s 法。 三用h p l c d a d 和l c m s 联用仪定性和定量分析生物样 品中的活性成分及其应用研究( 第五章一第七章) ：生命科学发 展到今天越来越离不开现代分析技术的支持，这给生命科学家和 分析化学工作者提出了新的课题。目前，许多基础与临床医学研 究课题由于没有合适的分析方法而无法进行。故建立先进、可靠、 w 灵敏、准确、快速的分析方法，以对生物样品中的活性成分进行 定性定量分析和低药物浓度测定及其药代动力学、生物等效性的 研究，有重要的实际意义。第五章采用选择性离子检测( s i m ) 并h 大气压化学电离离子化( a p c i ) ，建立了简单、灵敏、快速分离和 测定人体尿液及血浆中l 一精氨酸( a r g ) 、不对称二甲基精氨酸 ( a d m a ) 和对称二甲基精氨酸( s d m a ) 的等度高效液相色谱 质谱联用方法。第六章采用高效液相色谱一电喷雾液质联用技 术，建立了测定人体血浆中非那雄胺含量的方法，并用于非那雄 胺的人体药代动力学研究，结果令人满意。第七章采用高效液相 色谱，用电喷雾离子化，以2 一氯腺苷为内标，以正离子选择性 离子检测为检测方式，提出了简单、灵敏、快速分离测定人体滑 液中腺苷的等度高效液相色谱一质谱联用方法，方法快、重现性 和选择性好，结果准确度高。 关键字： 化学计量学，质谱，色谱，中药，生物样品 i i i a b s t r a c t t h em o d e r na n a l y t i c a l i n s t r u m e n t s ，e s p e c i a l l yt h ed e v e l o p m e n to fg a s c h r o m a t o g r a p h - m a s s s p e c t r o m e t e r ( g c - m s ) ，h i g hp e r f o r m a n c el i q u i d c h r o m a t o g r a p h - d i o d ea r r a yd e t e c t i o n ( h p l c d a d ) ，h i g hp e r f o r m a n c el i q u i d c h r o m a t o g r a p h - m a s ss p e c t r o m e t e r ( h p l c - m s ) ，p r o v i d eu s m u c hu s e f u l i n f o r m a t i o n w i t ht h eh e l po fn e wa n a l y t i c a l t h e o r y a n dt e c h n i q u e ，t h e c o m b i n a t i o no fc h r o m a t o g r a p h i cs e p a r a t i o na n ds p e c t r a lo rm a s ss p e c t r u m c h a r a c t e r i z a t i o np r o v i d e su sp o w e r f u lt o o lf o rt h er e s o l u t i o no fa n a l y t i c a l p r o b l e m so nb i o l o g y , b i o c h e m i s t r y , p h a r m a c o l o g ya n de n v i r o n m e n t a ls c i e n c e t h er e c e n t d e v e l o p m e n t s o fh i i g h d i m e n s i o n a lc h e m o m e t r i c sr e s o l u t i o n m e t h o d sp r o v i d eap o w e r f u lt o o lf o ru st od e a lw i t ht h ed i f f i c u l t b l a c k s y s t e m ”t h e r e f o r e ，t h ea i mo ft h et h e s i si st od e v e l o pn e wa n a l y t i c a lm e t h o d s f o rt h ea n a l y s i so fa c t i v ec o m p o n e n t si nt h ec o m p l e xs y s t e m s ，s u c ha sh e r b a l m e d i c i n ea n db i o l o g i c a l s a m p l e s ，w i t hg c m sa n dl c m sh y p h e n a t e d c h r o m a t o g r a p h yi nm a s ss p e c t r ad a t am i n i n ga n dh y p h e n a t e dc h r o m a t o g r a p h y 1 a p p l i c a t i o no fh y p h e n a t e dc h r o m a t o g r a p h i cr e s o l u t i o nm e t h o d st o h e r b a lm e d i c i n e s y s t e m s ( c h a p t e r2t oc h a p t e r3 、w i t hc h e m o m e t r i c s r e s o l u t i o nm e t h o d sa n dr e l a t i v ec h e m o m e t r i c sm e t h o d s ，t h ea c t i v ec o m p o n e n t s i nh e r b a lm e d i c i n ec a nb ei d e n t i f i e da n d q u a n t i f i e d b y u s eo f c h r o m a t o g r a p h i ca n ds p e c t r a lo rm a s ss p e c t r u mi n f o r m a t i o n ，f i n g e r p r i n to f h e r b a lm e d i c i n ec a nb eo b t a i n e d i nc h a p t e r2 ，c o n s t i t u e n t so fe s s e n t i a lo i li n m a i nr o o to fa n g e l i c as i n e n s i sw e r ei d e n t i f i e da n dq u a n t i f i e d b yg a s c h r o m a t o g r a p h y - m a s ss p e c t r o m e t r y ( g c - m s ) c o m b i n e dw i t h s u b w i n d o w f a c t o ra n a l y s i s ( s f a ) a n dt h er e l a t e dc h e m o m e t r i cm e t h o d s c o n s t i t u e n t so f e s s e n t i a lo i li nt w od i f f e r e n tp a r t so fa n g e l i c as i n e n s i s ，m a i nr o o ta n dr o o t f i b r e ，w e r ea l s oc o m p a r e dw i t hs p e c t r u m - o r i e n t e dc o r r e l a t i v ec h r o m a t o g r a p h y ( s c c ) a n dr e l a t e dc h e m o m e t r i cm e t h o d s i nc h a p t e r3 ，h p l cf l a v o n o i d f i n g e r p r i n t s o fm e t h a n o le x t r a c to fa s t r a g a l ir a d i xf r o mf o u rd i f f e r e n t r e s o u r c e sw e r es t u d i e dw i t hh p l c d a da n dl c e s i m s 2 q u a l i t a t i v ea n a l y s i sa n dq u a n t i t a t i v ea n a l y s i so fa c t i v ec o m p o n e n t si n h e r b a lm e d i c i n ew i t h h y p h e n a t e dh p l c - d a da n dl c e s i m sm e t h o d s ( c h a p t e r4 ) t h er e s e a r c h ，w i t c hl o o k sf o rg u i d i n gc o m p o u n d sf o rt h ep o s s i b l e n e wm e d i c i n e s ，i sv e r yi m p o r t a n t b e c a u s et h es e p a r a t i o np r o c e s sf o ra c t i v e c o m p o n e n t sf r o mp h a r m a c e u t i c a lp l a n t sa n ds e ai sv e r yt i m e c o n s u m i n gw i t h t h et r a d i t i o n a lm e t h o d s ，i ti sv e r yi m p o r t a n tt od e v e l o ph i 曲e f f e c t i v e ，f a s t , s e n s i t i v ea n ds e l e c t i v em e t h o d sf o rt h ea n a l y s i so fa c t i v ec o m p o n e n t si n n a t u r a lp l a n t s i nc h a p t e r4 ，am e t h o df o ri d e n t i f i c a t i o na n dd e t e r m i n a t i o no f n u c l e o s i d e si nc o r d y c e p ss i n e n s i sa n di t ss u b s t i t u t e sb yh i g hp e r f o r m a n c e l i q u i dc h r o m a t o g r a p h y w i t h p h o t o d i o d ea r r a y d e t e c t i o na n dm a s s s p e c t r o m e t r i cd e t e c t i o nw a sd e v e l o p e d a d e n i n e ，h y p o x a n t h i n e ，a d e n o s i n ea n d e o r d y c e p i na r et h em a i nn u c l e o s i d ec o m p o n e n t si nc o r d y c e p ss i n e n s i sa n di t s s u b s t i t u t e s ，s oi ti sn e c e s s a r yt od e v e l o pau s e f u lm e t h o df o ra n a l y s i so fa b o v e c o m p o n e n t s as i m p l ea n dr a p i di s o c r a t i cl c m sc o u p l e d 、i t i le l e c t r o s p r a y i o n i z a l i o n ( e s i ) m e t h o df o rs i m u l t a n e o u ss e p a r a t i o na n dd e t e r m i n a t i o no f v a d e n i n e ，h y p o x a n t h i n e ，a d e n o s i n ea n dc o r d y c e p i ni nc o r d y c e p ss i n e n s i s ( c s ) a n di t ss u b s t i t u t e sw a sa l s od e v e l o p e d 3 q u a l i t a t i v ea n a l y s i sa n dq u a n t i t a t i v ea n a l y s i so fa c t i v ec o m p o n e n t si n b i o l o g i c a ls a m p l e sw i t hh y p h e n a t e dh p l c - - d a da n dl c - m s m e t h o d s ( c h a p t e r5t oc h a p t e r7 、t h ed e v e l o p m e n to fb i o t i cs c i e n c ec a r l tb ea c h i e v e d w i t h o u tt h eh e l po fm o d e ma n a l y t i c a lt e c h n i q u e t h u s ，n e wp r o b l e m sa r e a r o u s e df o rb i o t i cs c i e n t i s ta n da n a l y s t b e c a u s et h e r ea r en op r o p e rm e t h o d s ， m u c hw o r ko nf o u n d a t i o n a la n dc l i n i cr e s e a r c hc a n tb ed o n e i ti si m p e r a t i v e t h a tt h ea d v a n c e d ，r e l i a b l e ，s e n s i t i v e ，a c c u r a t e ，f a s ta n a l y t i c a lm e t h o d sf o rt h e d e t e r m i n a t i o no fa c t i v ec o m p o n e n t si nb i o l o g i c a ls a m p l e sb ed e v e l o p e d t h e s e m e t h o d sc a nb eu s e df o rq u a l i t a t i v ea n a l y s i sa n dq u a n t i t a t i v ea n a l y s i so fl o w c o n c e n t r a t i o no fd r u ga n di t s s t u d yo np h a r m a c o k i n e t i c sa n db i o e q u i v a l e n t c h a r a c t e r i nc h a p t e r5 ，as i m p l e ，s e n s i t i v ea n df a s ti s o c r a t i ch i g h - p e r f o r m a n c e l i q u i dc h r o m a t o g r a p h y m a s ss p e c t r o m e t r ym e t h o d c o u p l i n g w i t ha n a t m o s p h e r i cp r e s s u r e c h e m i c a l i o n i z a t i o n ( a p c i ) w a sd e v e l o p e d f o r s i m u l t a n e o u ss e p a r a t i o na n dd e t e r m i n a t i o no fl a r g i n i n e0 a r g ) ，n g n 6 d i m e t h y l a r g i n i n e ( a d m a ) a n d 萨n 一d i m e t h y l a r g i n i n e ( s d m a ) i n b i o l o g i c a ls a m p l e s t h em e t h o dw a ss u c c e s s f u l l yu s e df o rt h ed e t e r m i n a t i o no f a r ga d m aa n ds d m ai nh u m a nu r i n ea n dp l a s m aw i t hs a t i s f a c t o r yr e s u l t i n c h a p t e r6 ，as e n s i t i v e ，f a s t ，a c c u r a t ea n d s e l e c t i v e l i q u i d c h r o m a t o g r a p h i c - e l e c t r o s p r a y i o n i z a t i o nm a s s s p e c t r o m e t r i cm e t h o dw a s d e v e l o p e da n dv a l i d a t e df o rt h ed e t e r m i n a t i o no ff i n a s t e r i d ei nh u m a np l a s m a 、r | t h em e t h o dw a su s e dt oe s t i m a t et h ep h a r m a c o k i n e f i c so ff i n a s t e r i d ea f t e ro r a l a d m i n i s t r a t i o no fa5 m gt a b l e to ff m a s t e r i d et o2 4h e a l t h yv o l u n t e e r s i n c h a p t e r7 ，as i m p l e ，s e n s i t i v ea n df a s tr e v e r s e d - p h a s eh i 曲一p e r f o r m a n c el i q u i d c h r o m a t o g r a p h y m a s ss p e c t r o m e t r yc o u p l i n gw i t ha ne l e c t r o s p r a yi o n i z a t i o n ( e s i ) i n t e r f a c em e t h o dw a sd e s c r i b e df o rt h eq u a n t i t a t i v ed e t e r m i n a t i o n o f a d e n o s i n ei nh u m a ns y n o v i a lf l u i d t h em e t h o dw a sa p p l i e dt od e t e r m i n a t i o n o fa d e n o s i n ei ns o m es y n o v i a lf l u i d so fp a t i e n t sa f f e c t e db yr h e u m a t o i d a r t h r i t i sa n df o rs t u d yo nc o r r e l a t i o nb e t w e e na d e n o s i n ea n dp a t i e n t sa f f e c t e d b yr h e u m a t o i da r t h r i t i s k e yw o r d s ： c h e m o m e t r i c s ，c h r o m a t o g r a p h y , m a s ss p e c t r a ，h e r b a l m e d i c i n e ，b i o l o g i c a ls a m p l e 原创性声明 本人声明，所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究 工作及取得的研究成果。尽我所知，除了论文中特别加以标注和致谢 的地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不 包含为获得中南大学或其他单位的学位或证书而使用过的材料。与我 共同工作的同志对本研究所作的贡献均已在论文中作了明确的说明。 作者签名：蕞! 焉 日期：生! ! 生年j l 月2 日 关于学位论文使用授权说明 本人了解中南大学有关保留、使用学位论文的规定，即：学校 有权保留学位论文，允许学位论文被查阅和借阅；学校可以公布学位 论文的全部或部分内容，可以采用复印、缩印或其它手段保存学位论 文：学校可根据国家或湖南省有关部门规定送交学位论文。 储魏羔盟聊箍! 銎塑嗍巡年旦月旦日 博士学位论文 第一章引言 第一章引言 分析化学作为一门对物质进行定性、定量及获取结构信息的科学，长期以来在科 学和生产实践中发挥着重要的作用。而色谱是分析复杂混合物的传统工具，在许多学 科领域都有着广泛的应用【l 】。近年来，随着物理学及计算机技术的发展，色谱与其它 各种分析技术相结合，形成诸多联用仪器，如气相色谱与质谱联用仪( g a s c h r o m a t o g r a p h m a s ss p e c t r o m e t e r , g c m s ) ，高效液相色谱与二极管阵列联用仪( h i g h p e r f o r m a n c el i q u i dc h r o m a t o g r a p h d i o d ea r r a yd e t e c t i o n , h p l c d a d ) ，毛细管电泳与 二极管阵列联用仪( c a p i l l a r ye l e c t r o p h o r e s i s d i o d ea r r a yd e t e c t i o n ，c e d a d ) ，高效液 相色谱与质谱联用仪( h i 出p e r f o r m a n c el i q u i dc h r o m a t o g r a p h m a s ss p e c t r o m e t e r , h p l c m s ) 等。这些联用色谱将色谱的分离能力与光谱的表征能力相结合，借助新的 分析理论和技术，为生物学、生命科学、药物学、环境科学等学科有关分析问题的解 决提供了强有力的工具和手段【2 。 现代医学和药学的发腿为人类的医疗保健和生存繁衍做出了溆婴的贡献，假也俩 l 黼髓米越多问题【3 棚。其一，人类的疾病鼓由：；尊囊的传染性疾病为主转变为现代身心痰 瘸为熏，而且现代隽心疾瘸对人类更其威胁；篡二，化学药物对多数此类疾病光熊为 力，冀懑澍 蕈廷窝藏魏壤攀繁难戳克黢 茭三，夔藿人类辩璧i 愈壤蘩夔舞毫器l 键藤长 辫的满黧目益强烈，单纯依簇化学药物难激满足人们的这些追求。阂此博大精深的传 统暇麴越来越受到重视，“回归自然”、崇尚天然药物正在成为一种世界性潮流，发 鼹传绞医药已经成为世界上器国政府、众渡发鼹众的共识。中黼传统医药，也就怒中 攀药的疆论最完整、医疗窳筏最丰富、疗效最确切。同时我国遥摊蠢丰富的中药奉耋资 源，瓣薅，我国藓建瓷漾泛1 3 0 0 0 秘f l ，。& 羧楚4 0 0 0 多穆，聚翊药7 0 0 0 多耪，缀慧 中药糖1 2 0 0 多释，常髑秘辛才6 0 0 多静，裁璐2 0 0 多静，野生蓊裙l | 芟购4 0 0 多种。掰 材避熄，都预示着历经几干年实践检验的中牮药一定会拥有广阔的市场前景。 经济全球化和我隧加入世界贸易组2 擞( w t o ) 给我国的中麓产娥带来了新的挑战。 加入w t o 后，有许多露捌因素，例如w 激键避中药行业受好地与瞬际接孰，鸯戮予 弓l 避毙滋鲍技术鞠设繇，激发企韭参与翻瓣窝擎瓣意识，鸯利予粕强对中药妇謦 产投 煞保护簿等。不稳戮豢纛不少，镄魏穗饕笑税瓣降低，进嚣蓊麓占全霞药晶市场瀚魄 例迸公进一步增加，众舭究争压力加大；同时会照加重视药晶知识产权的保护，将严 格爨行药品专利和行政保护，我国中药产她溪发展就必须依靠现代科学技术，开发舆 露爨烹知识产权的耨中药，藩进荦亍传统中翡的二次开发等。 对予传统药物磷究，瓴摄我国的中癸，藏如攫器卫生缝缓的方法籀南中指出鲶鄂 榉，“冬管在一二卡譬疼，俦绫蓼奁缀多黧豢又褥爨了穗姿广滋豹液麓，毽楚它键逐 博士学位论文 第一章引言 未在大多数国家得到官方认可。有关传统药定性定量的安全性和有效性数据还远远达 不到可使之成为国际通用药物的标准。此类研究数据的缺乏，还不仅是由于世界卫生 政策规定的原因，更为重要的是，现今还缺乏适当、可接受的有关传统药评价的研究 方法! ” 由上可见，对我国中草药行列，机遇与挑战并存。大力发展我国中药产业是符合 时代潮流豹。目前制约我国中药产业发展的关键问题是科学技术水平韵落后。亟待解 决中草药种植( 中药材质量管理规范，g o o da g l i c e t l 髓p r a c a i c e ，g a p ) ，生产( 药品生 产质量管理规范，g o o d m a n u f a c t u r e p r a c t i c e ，g m p ) 和供应( 药品经营质量管理规范， g o o d s e p p l yp r a c t i c e ，o s p ) 等韵标准化。这也是中草药现代化、国际化的必然途径。 相应的，g a p ，( 眦p 和g s p 等也对中草药的分析科学带来一系列新的课题。中药现 代化研究是一项庞大的系统研究工程。对中草药进行全面化学成分分析和建立可用于 不同中草药分类、识别和质量控制的中药色谱指纹图谱是其中重要的任务之一睁b 】。 中药化学物质基础和色谱指纹图谱的建立，实际上是处于中药理论科学化和中药现代 化研究的核心基础地位，确实是一项“牵发面动全身”的研究工作，所以美国f d a 和欧洲药典都对对此十分重视，国外不少药物公司和学术机构都在此领域作出了不少 工作f 1 们。 本论文研究的主体之是联用色谱用于中草药活性成分的定性定量分析和色谱 指纹图谱的建立。 然而，实现中草药的标准化、现代化和国际化势必要求对中草药原料药材、中药 饮片、中成药及其复方制剂尽可能地进行多组分定性定量。利用现代联用技术，结合 化学计量学手段使得这类没有或者较少验前检测信息的中草药试样分析成为可能。 中草药作为黑色分析体系【2 2 】，其化学成分十分复杂且大多数未知，构成任何一味 中药的化学成分一般都有几十或上百种，且有些成分含量较低，故而对中草药化学成 分的全面定性定量分析对分析仪器和手段提出了新的拂战。此外，由中草药原料药材 炮制而成的中药铍片、经过一定豹生产工艺而生产出来韵中成药和其复方制剂，因在 原料处理过程中发生了许多物理与化学变化，而使姆题更加复杂化。同时g a p ，g m p 和g s p 也要求对中成药的生产，从原辫到最终产品的全过程进行质量监控。这些新的 挑战和质量监控要求促使我们使用新豹仪器，发展新的中医药分折技术及检测手段， 深入研究中药药效的物质基础、药理作用机理以及有效成分与药理作用的关系。这都 给现代分析化学学科提出了新的更高的要求f 船t 。 色谱联用仪器可产生同时包含光谱和色谱信息的高维数据。这种数据具有以下六 个化学特征1 2 2 1 ，这些化学特征对分析化学特别有用，即： 1 二维色谱数据同时包含了光谱与色谱信息。一般说来光谱( 如质谱、红外光谱、紫 外可见光谱等) 能提供化学物质大量的定性信息，而色谱则能提供定量信息，同时 2 博士学位论文 第一章引言 化学物质的保留时间对定性也是很有帮助，这说明二维数据与通常的一维数据相比 可提供更多信息，可以同时在光谱或色谱空间来研究样本。 2 色谱具有很强的分离能力，它可将一个很复杂的分析体系分解成为多个相对简单的 子体系。因此能将复杂体系变为简单体系，只需直接处理这些相对简单的体系或子 矩阵，而毋需直接用数学方法来解析复杂的多组份分析化学体系。 3 纯化学物质的色谱峰有且只有一个最大峰。这一化学数据的特点，可为我们在进行 数据处理和分析时带来有用信息。 4 在色谱流出时，不同的化学物质是依照某种化学规律依次流入和依次流出的。这一 特点，为我们确定某一物质的色谱保留时间区间带来很大方便。 5 在二维色谱数据中，经常很容易找到所谓的零组份区，即在一段保留时间区域内没 有任何化学物质流出，正是这样的零组份区域，为我们直接提供了在这一样本运行 条件下的仪器噪声或仪器背景方面的有用信息，这一信息将为我们确定体系的化学 组份数，分离和区别分析信号与噪声，提供重要信息。此外，如果体系存在某种背 景，零组份区域的信息，也将直接为我们提供有用的仪器背景信息。 6 一般二维色谱数据都是非负实数。这为我们提供很有用的数学上的非负约束条件， 从而大大缩小了搜索空间。 对具有以上化学特征的二维数据，近年来发展了大量化学计量学多元分辨方法， 它利用这些二维数据结构所具有的某些特殊约束，从而获得有物理意义的唯一解。如 有m a e d e r 提出的渐近因子分析法( e v o l v i n g f a c t o ra n a l y s i s ，e f a ) 2 4 砸l ，梁逸曾等提出 的直观推导式演进特征投影算法( h e u r i s t i ce v o l v i n gl a t e n tp r o j e c t i o n s ，h e l p ) 2 7 , 2 8 ， m a l i n o w s k i 提出的窗口因子分析法( w i n d o w f a c t o r a n a l y s i s ，w f a ) 口9 】，m a n n e 提出的子 窗口因子分析法( s u b w i n d o w f a c t o r a n a l y s i s ，s f a ) 3 0 , 3 1 1 等。这些分辨方法不断应用于新 的领域【3 2 - 3 4 】，特别是对于没有先验信息的复杂分析任务，即所谓黑色分析体系口2 1 ，如 中草药这样的分析体系，化学计量学多元分辨方法尤为人们所关注- 4 3 1 。 利用化学计量学分辨方法对中草药的成分进行定性定量分析是本论文的研究内 容之一。第二章分析了当归挥发油中化学成分 4 4 1 。对由气相色谱质谱联用分析仪所 获得的二维数据，由化学计量学分辩方法分辨实验数据以获取各组分的纯色谱和质 谱，从而对挥发油成分进行定性和定量分析，结果较为满意。 国家药品监督管理局于2 0 0 0 年确定，在2 0 0 4 年全面启动中药色谱指纹图谱对我 国中药注射液进行质量控制，如何既准确而又不丢失特征信息地表征和评价中药色谱 指纹谱图，是目前分析化学，特别是中药分析化学面临的一个新问题。目前，指纹图 谱己成为国际公认的控制草药或天然药物质量的最有效的手段f 6 1 “。中药指纹图谱质 控技术不仅是指纹图谱质控技术的应用，而且也是整个中药事业、中药产业现代化的 要求。 中药指纹图谱是借鉴法医学“指纹”的概念，对某种( 或某产地) 中药材或中成 博士学位论文 第一章引苦 药经适当处理后，采用一定豹分析手段，得到能够标示该中药材或中成药特牲的色谱 或光谱图谱。中药大部分为生物样品，其有效成分大部分为次生代谢产物。由于受气 候、土壤、生态环境等影晌，厨一中药的不同基源，其化学成分有甥显韵区剐，即使 同一品种的中药，不同产地、采收季节或加工方法，其化学成分也有一定韵区别。光 谱相关色谱( s p e c t r u m - o d c m o d c o r r e l a t i v ec i w o m a t o g r a p h y ，s c c ) m l 利用联用色谱豹 光谱信息与色谱信息和化学计量学方法，实现复杂中药色谱指纹图谱中的组分相关性 判断，客观表征和评价不问实验条件下鹅中药色谱指纹图谱，或同一品种中药的不问 部位，以及不同产地、采收季节或加工方法在最一实验条件下的中药色谱指纹图谱， 为特征指纹图谱的整体模糊综合分柝提供了实焉、方便、可靠、有力豹手段。第二章 的一部分用气相色谱矮谱联用犯c m s ) 结合光谱橱关色谱( s c c ) ，定性比较分析了当 归两个不罚部位( 当疆须和当妇搬) 的挥发滴。第三章利用h p l c d a d e s i m s 研 究了黄芪中黄蘼类化合锈豹高效液相色谱指纹图谱。 近年来从天然产物中寻找可能发展为新药先导化合物的研究又被重视，由于用传 统的分离方法从药用植物及海洋生物中分离纯化非常耗时，因此对有生物活性的天然 产物有效成分进行分桥在药用植物研究中有重要意义h 5 ，舶j 。大气压电离( a p i ) 韵出 现，成功地解决了滚裙色谱秘质谱联用的接日阿题，馒液辐色谱一质谱联用( l c - m s ) 逐渐发展成为成熟的技术。大气压电离包括太气压化学电离( a p c i ) 和电喷雾电离 ( e s i ) 两种。a p c l 主要应甩于环境分析和医药研究领域，在分析中、低极性韵相对 小分子化合物时，靛用a r c l 嚣常有效。e s j 剐是一种缀温和的离子化技术，多用于极 性、不挥发性、质量数较大、热不稳定韵纯合榜，尤其适甩于生物分子的分折。利用 l c - m s 分析混合样品，和其他方法相比有高效、快速、灵敏度高和选择性好等特点， 它只需对样品进行简单预处理或衍生化，尤其适用于含量少、不易分离得到或在分离 过程中易丢失的组分因此在药用植物研究中具有重要意义。该方法已广泛豹用于中 草药活性成分韵定性秘定量分祈 妊蚓。第羁章用h i l c d a d e s i - m s 法建立了一种能 分离、识羽与定量分析冬虫蔓草及蚕螭虫草中豹活性成分核瞽类化合物的方法。冬虫 夏草和其替代铹中有多种核替类化合钫。但其主要活性成分为稼嘌玲、次黄嘌 玲、腺苷和虫草紊，第四章鹣另一部分采甩选择性离子检测( s t m ) 和电赜雾 离子化( e s l ) ，建立了一灵敏、抉逮辆选释性好豹定性和定量分祈冬虫夏 草秘其替代耪一蚕螭虫革中主要活牲浅分豫磲呤、次黄噤岭、豫营和虫荜素 豹等度l c e s i m s 法 “。 中药色谱指纹图谱的化学钫质基础研究工作实际上是处于中药理论科学化和中药 现代化研究朐核心基鞠地位，两中药现代他研究的另一重要任务是中药药理和药代动 力学的研究。 采用一定模型。构建人体瓣魅组织、培养细腿、转基因细魄系，全面系统地对基 于化学指纹凰谱的巾药利剂遴行人体中药暖收和人体中药体内转运与代谢研究，定量 博士学位论文第一章引言 解释中药的君臣佐使、协同作用的药理机制，建立全新的基于中药色谱指纹图谱的中 药药效及药代动力学方法是中药现代化研究非常重要的任务。本研究中心获得的由国 家自然科学基金资助的重点课题“中药药效组份的指纹图谱的分析方法研究 ( 2 0 2 3 5 0 2 0 ) ”就是要做这一方面的工作，以提出中药的最佳给药方式及其代谢过程 和主要活性成分的代谢产物变化规律。并希望采用多变量统计分析方法，建立一整套 中药谱效学研究的技术平台，开创出具有我国特有知识产权的又能与国际接轨的中药 谱效学。 基于以上原因，本文在生物体液中活性成分的定性定量分析和低药物浓度测定及 其药代动力学、生物等效性的研究方面作了一些工作，以获得好的分析方法和经验， 为建立中药色谱指纹图谱的中药药效及药代动力学方法打下一定的基础。 生命科学发展到今天越来越离不开现代分析技术的支持，这不仅对生命科学家是 一种挑战，而且给分析化学工作者也提出了新的课题。目前，许多基础与临床医学研 究课题由于没有合适的分析方法而无法进行。因此，建立先进、可靠、灵敏、准确、 快速的分析方法，是完成课题研究和i 临床诊断最基本的前提。液相色谱质谱联用 法( l c m s ) 法因具有检测限低、灵敏度高、选择性好和分析时间短等特 点，同时它只需对样品进行简单预处理，因此在生化分析和临床医学研究中具有重要 意义，故该方法在生化分析和l 临床医学研究中有广泛的应用 s s - 6 6 】。利用液相色谱一 质谱联用法( l c m s ) 对生物样品中的活性成分进行定性定量分析和低药物浓度 测定及其药代动力学、生物等效性的研究，也是本论文的研究主题之一。 生物样品中精氨酸或二甲基精氨酸与高血压、冠心病、糖尿病、心血管疾病、肾 脏疾病、妊高征等多种疾病有关【6 。m 9 1 ，故建立人体血浆、尿液和组织中的l 一精氨酸 和二甲基精氨酸含量的测定方法在临床上具有重要的意义1 7 0 8 0 】。第五章采用选择性 离子检测( s i m ) 和大气压化学电离离子化( a p c i ) ，建立了简单、灵敏、快速分离 和测定人体尿液及血浆中l - 精氨酸( a r g ) 、不对称二甲基精氨酸( a d m a ) 和对称 二甲基精氨酸( s d m a ) 的等度高效液相色谱一质谱联用方法 8 1 , 8 2 。 非那雄胺( f i n a s t e r i d e ) 是一种四氮杂甾体化合物，能竞争性地、选择性地、剂 量相关性地抑制5 a 一还原酶活性，从而抑制睾酮转化成二氢睾酮( d h t ) ，临床上用于 治疗良性前列腺增生症( b p h ) 【8 8 8 l ，故建立人体血浆中的非那雄胺含量的测定方法 及其药代动力学、生物等效性的研究具有重要的临床意义 8 4 , 8 9 - 9 2 1 。第六章采用高效 液相色谱一电喷雾液质联用技术，建立了测定人血浆中非那雄胺的方法，并用于非那 雄胺的人体药代动力学研究，结果令人满意。 腺苷是三磷酸腺苷的代谢产物，当腺苷在细胞外环境存在与特殊细胞表面受体作 用时对包括免疫细胞在内的许多细胞具有广泛的生理活性。特别是对淋巴细胞、嗜中 性白细胞、单核细胞和