（应用化学专业论文）面包酵母催化不对称还原2羰基4苯基丁酸乙酯的研究.pdf

摘要 摘要 群至基酯易被转化为其它功能基团而被作为天然产物及手性药物合成中重要的“手 性砌块”，( r ) - 2 - 羟基_ 4 苯基丁酸乙酯( ( 哟屯卸p b ) 是其中一种重要的手性物质，被广泛应 用于普利系列血管紧张肽转化酶( a c e ，全称a n g i o t e n s i nc o n v e r t i n ge n z y m e ) 抑制剂的合 成工业。生物法合成( r ) - - e h p b 因其自身的优点而备受关注，本论文利用廉价易得的面 包酵母作为生物催化剂，直接催化2 一氧代4 一苯基丁酸乙酯( e o p b ) 不对称还原合成 ( r ) - e h p b 。目前，此过程中仍存在如产物立体选择性不高，明显的底物及产物抑制作用， 化学添加剂的毒性，缺少能源供体( 糖类等难溶于有机溶剂) 难以实现辅酶的原位再生等 诸多问题。 水相中面包酵母催化还原e o p b ，产物以( s ) - e h p b 为主，e e ( d 为7 0 - 8 0 。通过 研究反应进程，分析了副产物苯丙醇的生成机理，并提出了可行的抑制副反应的方法。 有机溶剂中面包酵母催化不对称还原e o p b 反应的研究表明，选择合适的有机溶剂作为 反应介质，有利于提高酵母催化e o p b 合成( r ) - - e h p b 的反应立体选择性。经筛选，市 售桃花牌酵母在乙醚单相体系中催化e o p b 的反应效果最佳。最适酵母浓度、初始加水 量和反应温度分别为5 0gl 1 ，3 0gl - 1 和3 0o c 。向反应体系中直接添加氯代苯乙酮 ( a - p c ) ，可有效地提高酵母催化e o p b ( 5m m o ll - 1 ) 合h - 戋( r ) - - e i - i p b 的反应立体选择性，但 a - p c 长时间与酵母接触也存在毒性影响，降低酵母催化活性，减小e h p b 产率。为此 设计了4 种a - p c 添加策略，发现策略4 ( s t r a t e g y 们中，经a - p c 预处理操作后的面包酵 母既提高立体选择性，又改善了催化活性。面包酵母经a - p c ( 8gl - 1 ) 预处理仅4h 后， 催化还原e o p b 转化率、e h p b 产率及e e ( r ) - e h p b 分别由8 6 8 ，6 0 8 和6 2 7 ( 未 使用a - p c ) 提高至9 5 9 ，9 0 2 和9 2 o ( s t r a t e g y 哟。使用结构如a - p c 分子中含被羰 基活化的卤甲基的化学添加剂预处理酵母后，反应的立体选择性均有所提高，说明起作 用的关键官能团可能是a - p c 分子中的活泼氯甲基。利用紫外及荧光光谱观察酵母预处 理过程中a - p c 对酵母醇脱氢酶的影响，经a - p c 处理之后的面包酵母样品的醇脱氢酶吸 收峰的峰位和强度均发生变化，但经苯乙酮预处理的酵母样品的紫外吸收光谱曲线较空 白样品未发生变化。激发波长在2 9 5l l l n 时的荧光光谱也得出相似结果。这些实验结果 表明，a - p c 的活泼氯甲基确实与酵母醇脱氢酶发生了某种不可逆相互作用，较大地改 变了酵母的催化行为。 利用液液双相体系作为反应介质，克服了单相体系中的底物及产物抑制、底物浓度 偏低、有机溶剂的毒性及无法实现辅酶原位再生等不利影响。在水苯双相体系中面包酵 母( 经过预处理) 表现出较好的催化活性及立体选择性，底物浓度较有机单相体系提高 了近四倍( 2 0m m o ll - 1 ) ，在合适的反应条件下，即吲= 2 0 ：4 0 ，磷酸盐缓冲液p h8 o ， 3 0o c ，添加乙醇( 1 5 ，v v ) 辅底物等，e o p b 转化率、e h p b 产率及e e ( r ) - - e h p b 分别 达到9 5 4 、8 3 2 和9 7 0 。在 b m i m p f 6 t j ( ( 1 0 ：1 ，v v ) 双相体系中，面包酵母催化 e o p b 反应产物立体选择性由微水离子液体 b m i m p f 6 单相体系中的s 构型转变为r 摘要 构型。添加辅底物乙醇1 ( v v ) ，e e ( r ) - - e h p b 由6 4 2 提高至8 2 5 。使用3 2 2 节 s t r a t e g y4 中的经a - p c 预处理的面包酵母催化还原e o p b ，反应立体选择性达到8 9 4 ( e e ( 尺) ) ，且e h p b 产率增至5 6 4 。尽管 b m i m p f 6 粘度大，极性较高，但面包酵母 在离子液体 b m i m p f 6 水( 1 0 ：1 ，v v ) 双相体系中仍具有较好的催化立体选择性，说明 【b m i m p f 6 1 水双相体系中的酵母催化反应具有进一步研究价值。 首次设计并主要合成了两类结构如下所示的离子液体。 ?、 一i 札。训c 。h 5 0 s o 。a一i ! ：外o p f ： o i o 【 i j 测定了不同乙氧基链长的上述离子液体在有机溶剂中的溶剂性能，找到了具有“室 温均相，高温分相”的温控离子液体有机溶剂液液双相体系。在由含乙氧基链的季胺盐 型离子液体如、乙二醇二甲醚组成的温控离子液体双相体系中，可以进行酵母不对称 催化还原e o p b 反应，在合适的反应温度下反应于均相体系中进行，反应结束后，适当 升温，离子液体析出体系呈两相，含生物催化剂的离子液体相与含产物的有机溶剂相简 单相分离后可循环使用。实验结果表明，该体系中酵母催化e o p b 反应的立体选择性较 单独使用乙二醇二甲醚提高了2 5 - 3 0 ，通过简单分离后，酵母仍具有催化活性。 关键词：2 氧代1 4 - 苯基丁酸乙酯；不对称还原；面包酵母；催化；僻) - 2 掘基4 - 苯 基丁酸乙酯；双相体系；温控离子液体 a b s t r a c t a b s t r a c t e t h y l ( r ) - 2 - h y d r o x y - 4 - p h e n y l b u t y r a t e ( ( r ) - e h p b ) i sav e r s a t i l ek e yi n t e r m e d i a t ef o rt h e s y n t h e s i so fav a r i e t yo fa n g i o t e n s i nc o n v e r t i n ge n z y m e s ( a c e ) i n h i b i t o r ss u c ha sc i l a z a p r i l ， b e n a z e p r i l ，a n de n a l a p r i le t c s p e c i a la t t e n t i o nh a sb e e np a i dt ot h ep r o d u c t i o no f ( r ) - e h p b b yt h eb i o s y n t h e s i sm e t h o d i nt h i ss t u d y , w es y s t e m a t i c a l l ys t u d i e dm i c r o b i a la s y m m e t r i c r e d u c t i o no fe o p bt oo p t i c a l l ya c t i v e ( r ) - e h p bc a t a l y z e db yb a k e r sy e a s t ( s a c c h a r o m y c e s c e r e v i s i a e ) h o w e v e r , t h e r ea r es t i l ls o m ed i s a d v a n t a g e sa sf o l l o wi nt h i sp r o c e s s ：ar e l a t i v e l y l o we n a n t i o m e r i ce x c e s sv a l u eo f ( r ) - - e h p ba n dh i i g hb i o m a s s ：s u b s t r a t er a t i o ；t h es e v e r e s u b s t r a t ea n dp r o d u c ti n h i b i t i o nt ot h ee n z y m e sa c t i v i t y ；t h et o x i c i t yo fa l p h a - p h e n a c y l c h l o r i d e ( a - p c ) a n do r g a n i cs o l v e n t st ot h ey e a s t ；t h er e p r o d u c t i o no ft h ec o e n z y m eh a r d l y a c h i e v e di na no r g a n i cs o l v e n t ，e ta 1 t h ea s y m m e t r i cr e d u c t i o no fe o p bc a t a l y z e db yb a k e r s y e a s ti na q u e o u sp h a s et o s y n t h e s i z ee h p bw a si n v e s t i g a t e di nd e t a i l t h ee n a n t i o m e r i ce x c e s sv a l u e ( e e ) o fp r o d u c t ( s ) 4 p b er e a c h e du pt o8 0 t h er e a c t i o np r o c e s sa n dt h em e c h a n i s mo ft h ep r o d u c t i o no f t h eb y p r o d u c tp p nw e r ea l s oe x p l o r e di no r d e rt oi n h i b i tt h es i d er e a c t i o na n di m p r o v et h e e n a n t i o s e l e c t i v i t yo ft h er e d u c t i o n i no r d e rt oi m p r o v et h ee n a n t i o s e l e c t i v i t yo ft h ea s y m m e t r i cr e d u c t i o no fe o p bt o p r o d u c e ( r ) - - e h p b ，d i f f e r e n to r g a n i cs o l v e n t sw e r ee m p l o y e da sr e a c t i o nm e d i ai np l a c eo f w a t e r t h ee n a n t i o s e l e c t i v i t yo ft h i sr e d u c t i o nc o u l db er e v e r s e db yu s i n gd i f f e r e n to r g a n i c s o l v e n t s t h ee n a n t i o s e l e c t i v i t yo ft h ea s y m m e t r i cr e d u c t i o no fe o p bt o s y n t h e s i z e ( r ) - e h p bc a t a l y z e dw i t hb a k e r sy e a s ti nd i e t h y le t h e rc a n b ei m p r o v e db yt h ei n t r o d u c t i o no f a - p c w ed e s i g n e dd i f f e r e n ts t r a t e g i e so fa - p ca d d i t i o ni no r d e rt oo v e r c o m et h et o x i c i t yo f a - - p ct ot h ey e a s t t h ec a t a l y t i ca c t i v i t yo fy e a s ta n dt h ee n a n t i o s e l e c t i v i t yo ft h er e d u c t i o n w e r ei m p r o v e dw i t hs p e c i a lp r e t r e a t r n e n tp r o c e s so fy e a s t ( s t r a t e g y 铆t h ee f f e c to fa - p co n s e l e c t i v ei n h i b i t i o no fs - e n z y m e sw i t h i ny e a s tc e l l sw a si n v e s t i g a t e d a - p ca sag o o d a l k y l a t i n ga g e n tc a l le a s i l yr e a c tw i t ht h o s er e s i d u e sb e l o n gt ot h ea c t i v es i t eo ft h ee n z y m e i n y e a s tc e l l sb e c a u s eo fi t sr e a c t i v ec h i o r o m e t h y lg r o u pb i n d i n gt oi t sc a r b o n y lg r o u p ，w h i c h m i g h tb et h em a j o rr e a s o no ft h ee n h a n c e de n a n t i o s e l e c t i v i t yo fe n z y m a t i cr e a c t i o n t h e c h a n g eo fc a t a l y t i cb e h a v i o ro fb a k e r sy e a s ta f t e rt h ec h e m i c a lp r e t r e a t m e n t ，w h i c hm i g h tb e c a u s e db ya ni n t e r a c t i o nb e t w e e nt h ey e a s ta n da - p ci ne t h y le t h e r , w a ss t u d i e dv i as p e c t r u m a n a l y s i s ( o va n df s ) i na d d i t i o n ，u n d e rt h eo p t i m u mp r e t r e a t m e n tc o n d i t i o n s ，t h ec o n v e r s i o n o fe o p b ，t h ey i e l do fe h p ba n dt h ee e o f ( r ) - e h p br e a c h e d9 6 、9 0 a n d9 2 f r o m 6 8 ，6 0 8 a n d6 2 7 ，r e s p e c t i v e l y t h ew a t e r o r g a n i cb i p h a s i cs y s t e mw a sa d o p t e dt oo v e r c o m et h ei n h i b i t i o no fah i g h s u b s t r a t e p r o d u c tc o n c e n t r a t i o n t h eb a k e r sy e a s ts h o w e dt h eb e s tc a t a l y t i ca c t i v i t ya n d e n a n t i o s e l e c t i v i t yi nt h ew a t e r b e n z e n eb i p h a s i cs y s t e m w h e ne o p bc o n c e n t r a t i o nw a s2 0 m m o ll - l ，9 5 4 o fe o p bc o n v e r s i o n ，8 3 2 o fe h p by i e l da n d9 7 o o fe e ( 励- - e h p b w a so b t a i n e db yu s i n gt h ec h e m i c a l - - p r e t r e a t e dy e a s t ，r e s p e c t i v e l y , u n d e rt h ef o l l o w i n g a p p r o p r i a t er e a c t i o nc o n d i t i o n s ：3 0o c ，吲；2 0 ：4 0 ，p h8 0p h o s p h a t eb u f f e r , 1 5 ( v v ) a b s t r a c t o fe t h a n o la st h ec o - s u b s t r a t e i ni o n i cl i q u i d - - w a t e r ( 1 0 ：1 ，v v ) b i p h a s i c s y s t e m ，t h e e n a n t i o s e l e c t i v i t yo f t h er e d u c t i o nw a ss h i f t e dt o w a r d s ( 固- s i d ef r o mt h e ( 印- s i d ei n 【b m i m i p f 6 】( 2 7 7 ，e e ( 印) ，a n de e ( r ) - - e h p bw a si n c r e a s e df r o m6 6 t o8 2 5 w i t h t h ea d d i t i o no fe t h a n o l ( 1 ，v v ) a sac o - s u b s t r a t e t h ee f f e c to ft h eu s eo f 【b m i m p f 6 a sa n a d d i t i v ei nr e l a t i v e l ys m a l la m o u n t so nt h er e d u c t i o nw a sa l s os t u d i e d w ef i n dt h a tt h e r ei sa d e c l i n ei nt h ee n a n t i o s e l e c t i v i t yo ft h er e d u c t i o ni nb e n z e n e t h a ti sl i t t l ea f f e c t e di no r g a n i c s o l v e n t - w a t e rb i p h a s i cs y s t e m s i na d d i t i o n ，ad e c r e a s ei nt h ec o n v e r s i o no fe o p ba n dt h e y i e l do fe h p bw i t hi n c r e a s i n g 【b m i m p f 6 】c o n c e n t r a t i o n so c c u r s i ne i t h e ro r g a n i c s o l v e n t - - w a t e rb i p h a s i cs y s t e m so rb e n z e n e t h eq u a r t e r n a r ya m m o n i u ms a l t si o n i cl i q u i d sm o d i f i e dw i t hp o l y - ( e t h y l e n eg l y c 0 1 ) c h a i n w a ss y n t h e s i z e df o rt h ef i r s tt i m e t h es o l u b i l i t yo ft h e s ei o n i cl i q u i d si nd i f f e r e n to r g a n i c s o n e m sw a si n v e s t i g a t e du n d e rt h ed i f f e r e n tt e m p e r a t u r e i tw a sf o u n dt h a tt h e s ei o n i cl i q u i d s p o s s e s st h et h e r m o r e g u l a t e df u n c t i o no f “m o n o - p h a s eu n d e rl o wt e m p e r a t u r e ，b i p h a s eu n d e r h i g ht e m p e r a t u r e ”an o v e lc o n c e p to ft h e r m o r e g u l a t e di o n i cl i q u i db i p h a s i cb i o c a t a l y s i s ( t i l b b ) b a s e do nt h et h e r m o r e g u l a t e df u n c t i o no fi o n i cl i q u i d sf o rs e p a r a t i n gt h ec a t a l y s t f r o mt h er e a c t i o nm i x u r ew a sp r o p o s e d t h ea s y m m e t r i cr e d u c t i o no fe o p bc a t a l y z e db y b a k e r sy e a s tw a si n v e s t i g a t e di nt h e r m o r e g u l a t e di o n i cl i q u i db i p h a s i cs y s t e mc o m p o s e do f 1 1 2a n de t h y l e n eg l y c o l d i m e t h y le t h e r t h ee n a n t i o s e l e c t i v i t yo ft h er e d u c t i o ni ni n t h e r m o r e g u l a t e di o n i cl i q u i db i p h a s i cs y s t e mw a si n c r e a s e db y2 5 0 0 c o m p a r e dw i t ht h a t i ne t h y l e n eg l y c o ld i m e t h y le t h e r t h ey e a s ts e p a r a t e df r o mt h ei o n i cl i q u i dc a nb er e c y c l e d k e y w o r d s ：e t h y l2 - o x o - 4 - p h e n y l b u t y r a t e ；a s y m m e t r i cr e d u c t i o n ；b a k e r sy e a s t ；e t h y l ( r ) - 2 - h y d r o x y - 4 - p h e n y l b u t y r a t e ；c a t a l y s i s ；b i p h a s i cs y s t e m ；t h e r m o r e g u l a t e di o n i cl i q u i d 符号、变量、缩略词等本论文专用术语的注释表 e o p b e h p b ( r ) - e h p b ( d 毛h p b o p b h p b 种c a c p c p e p p n b y y a d h e e 几s b m i m e m i m d m f d m s o 符号、变量、缩略词等本论文专用术语的注释表 e t h y l2 - o x o - 4 - p h e n y l b u t y r a t e e t h y l2 - h y d r o x y - 4 - p h e n y l b u t y r a t e e t h y l ( r ) - 2 - h y d r o x y - 4 - p h e n y l b u t y r a t e e t h y l ( 回- 2 - h y d r o x y - 4 - p h e n y l b u t y r a t e 2 - o x o - 4 - p h e n y l b u t y r i ca c i d 2 - h y d r o x y - 4 - p h e n y l b u t y r i ca c i d a l p h a - p h e n a c y lc h l o r i d e a c e t o p h e n o n e 2 - c h l o r o 一1 - p h e n y l e t h a n o l p h e n y l p r o p a n o l b a k e r sy e a s t y e a s ta l c o h o l d e h y d r o g e n a s e e n a n t i o m e r i ce x c e s s i o n i cl i q u i d s 1 - b u t y l - 3 - m e t h y l i m i d a z o l i u m 1 - e t h y l - 3 - m e t h y l i m i d a z o l i u m d i m e t h y l f o r m a m i d e d i m e t h y ls u l f o x i d e v 2 羰基4 - 苯基丁酸乙酯 2 龌基4 _ 苯基丁酸乙酯 ( r ) - 2 4 圣基4 _ 苯基丁酸乙酯 ( s ) - 2 4 圣基一4 - 苯基丁酸乙酯 2 羰基4 苯基丁酸 2 羟基_ 4 - 苯基丁酸 萨氯代苯乙酮 苯乙酮 弘氯代苯乙醇 3 - 苯丙醇 面包酵母 酵母醇脱氢酶 对映体过量值 离子液体 1 丁基- 3 一甲基咪唑 卜乙基- 3 一甲基咪唑 n - - - 甲基甲酰胺 二甲基亚砜 独创性声明 本人声明所呈交的学位论文是本z d f 导师指导下进行的研究工作及取 得的研究成果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文 中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含本人为获得江南 大学或其它教育机构的学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志 对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示谢意。 签名： 关于论文使用授权的说明 本学位论文作者完全了解江南大学有关保留、使用学位论文的规定： 江南大学有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允 许论文被查阅和借阅，- - j - 以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库 进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文， 并且本人电子文档的内容和纸质论文的内容相一致 保密的学位论文在解密后也遵守此规定 签名：丕兰：竺导师挑磁 日 期： p 盟o 眵 第一章绪论 第一章绪论 1 1 ( r ) - 2 4 暨基1 4 苯基丁酸乙酯的作用及其合成方法 ( r ) - 2 - - 羟基_ 4 - 苯基丁酸乙酯( ( r ) - - e h p b ) 是合成众多血管紧张素转化酶抑制剂( a c e i ) 类治疗高血压和充血性心力衰竭药物的的关键手性中间体【1 1 ( s c h e m e1 - 1 ) 。 n 沁u 洲 珊誓 9 v 村 i n d o l a l 喇l 图示l - 1 ( r ) - e h p b 和部分a c e i 的结构式 s c h e m e1 - 1s t r u c t u r e so f ( r ) - e h p ba n dp a r t i a la c e i 由于( r ) - e h p b 在该类药物合成中的重要性，吸引了许多科技工作者对其制备方法进 行了广泛研究。归纳起来，可分为拆分法与合成法，在这两种方法中交叉使用了化学方 法与生物方法。 1 1 1 拆分法 化学拆分法是拆分与e h p b 相应的酸的消旋体2 掘基_ 4 - 苯基丁酸( i - w b ) ，所用拆分剂 为手性有机胺类，如1 苯乙胺衍生物【2 】，2 - 苯乙胺衍生物【3 1 和氯霉素中间体1 4 。其中，光 学纯的苯乙胺衍生物价格昂贵，作拆分剂应用价值不大；而氯霉素中间体则非常便宜， 具有工业化应用前景。 生物拆分法制备( r ) - h p b 及( r ) - e h p b 的报道较多。如：b a l d r o 等【5 】利用a m a n op 选择 性水解e i - i p b 中的( s ) - - e h p b ，由e 玎) b 消旋体制得( r ) - e h p b ( y i e l d6 8 ，e e 4 3 ) 。而 c o f f e n 等【6 】用a m a n op - 3 0 n 旨肪酶拆分( p h = 7 ，室温下2 4h ) ，收率和对应体过量值提高了 1 0 1 5 。i n a d a 等【7 】用微生物( p s e u d o m o n a ss p k p y - 3 0 0 - 0 1 ) 直接作用于e h p b 消旋体( 3 0 o c ，3d ) 也可得至i j ( r ) - e h p b ( y i e l d4 2 ，e e 9 5 ) 。m i y a t a 等【8 】用微生物( c g l u t a m i c u m a t c c1 3 0 3 2 ) 直接作用于h p b 消旋体得至i j ( r ) - h p b 。b a c k v a l l 等【9 】联合使用脂肪酶和过渡金 鬯 一 0 江南大学博士学位论文 属催化剂经动力学拆分2 掘基- 4 - 苯基丁酸甲酯消旋体( m h p b ) ，该法在酶法拆分的同时， 使用过渡金属催化羟基酸的消旋化反应，使无效异构体能在拆分的同时转化为有效异构 体，从而极大地提高了羟基酸酯的拆分收率。该法对h p b 的拆分效果好，但对m h p b 的 拆分效果较差，e e 值只有3 0 。 目前采用生物方法拆分h p b 及其酯类的瓶颈问题是反应周期长，选择性不够高，效 率低等，有待进一步改进和完善，特别是规模化生产尚有许多问题需要解决。 1 1 2 合成法 由手性助剂诱导不对称合成( r ) - e h p b 主要有以下三种方法：( 1 ) 由苯丁酮酸孟 酯经不对称诱导还原得到( 两- 2 习径基4 - 苯基丁酸+ - ) 孟酯，经水解得( r ) - 2 习弪基_ 4 苯基丁 酸( ( r ) - - h p b ) 。( r ) - h p b 在硫酸催化下与乙醇作用得至l j ( r ) - e i - i p b ，但该法存在催化氢化 收率太低( 2 9 ) 及孟醇回收等问题【l o 】。( 2 ) 由手性的嗯唑烷或异噫唑烷经氰化钠开环和水 解得到化合物( r ) - h p b 1 1 以2 1 ，如手性的碘化- 甲基嗯唑烷经氰化纳的选择性开环和水解 立体专一地制得( r ) - h p b 。该法手性助剂昂贵，且回收仍是一个问题。( 3 ) 由l 捕氨酸修 饰的硼氢化钠立体选择性还原2 氧代4 - 苯基丁酸( o p b ) 得( r ) - h p b 乃】。该法原料易得， 操作简单。 由手性源的不对称合成及其构型转化获得手性h p b 及其衍生物的途径主要有：( 1 ) 以d 卑果酸为手性源【1 4 1 ，如6 【一乙酰d 埠果酸酐与苯发生f r i e d e l - c r a f t s 反应，得( 固咆一乙 酰氧基4 氧代4 _ 苯基丁酸，再经钯碳氢解即得( r ) - h p b ( e e 1 0 0 ) 。由于d 埠果酸酐原 料昂贵，因此该法无实用价值。( 2 ) 以l 丝氨酸为手性源在溴化钾存在下，经亚硝酸钠 重氮化得到相应的构型保持的溴代酸，然后在氢氧化钠的作用下脱去溴化氢即得一个r 构型的环氧丙酸，再进一步与有机金属试剂在低温下开环得到( r ) - h p b ”】( 图1 1 ) 。该法 要求在无水低温下进行，反应条件较苛刻。( 3 ) d 苯基丁氨酸除可用化学方法【1 6 】转化为 ( r ) - - h p b 夕b ，还可以用微生物c b u t y r i c u m 进行转化【l 丌。由于d 苯基丁氨酸本身不易制得， 所以不论是化学方法还是生物方法都存在原料来源问题。( 4 ) 另一种研究得较多的方法 是以e o p b 为潜手性原料经均相 1 8 , 1 9 】或非均相【冽立体选择性催化氢化制得( r ) - e h p b 。 乎 n a n 0 2 甲p h c h 2 m g b r 肿v 人c 鲴_ k b r , h + , o h q 陟川“唧百磊 ( y i e l d ：9 7 ) o h ( y i e l d ：8 5 ) 图1 - - 1 ( r ) - - e h p b 的制备( 采用手性源) f i g 1 - 1p r e p a r a t i o no f ( r ) - - e h p bw i t hc h i r a l p o o l h 利用生物方法合成( r ) - e h p b 主要集中在用酶或整胞微生物对e o p b - 寺体专一性还 原。如o d a 等【2 1 1 报道e o p b 经微生物ch o l m i i 还原可专一性得到( r ) - e h p b 。o p b 经= 酶，如 乳酸脱氢酶 2 2 , 2 3 ，d a u c u sc a r o t a 2 4 ，l e u c o n o s t o cm e j e 咒把r d f 如s 【2 5 1 ，h u m i c o l aa t c c 3 6 9 9 2 2 6 1 等还原可得到( r ) 抑b 。c h a d h a 等f 刎利用砒“c 螂c n 厂。缸催化还原e o p b 合成 ( r ) - e h p b ( y i e l d9 0 ，e e ( r ) 9 9 ) ，但该法反应周期过长( 1 0d ) ，且生物催化剂用量不经 2 第一章绪论 济( c e l l s ：s u b s t r a t e = 1 0 0 ：1 ) 。k a l u z n a 等【2 7 】选用生物工程菌g s f y p 订p 催化还原e o p b ，虽 然e e 值为8 7 ，但产物产率却仅有4 6 。o d a 等人【2 l 】选择r h o d o t o r u l am i n u 纪和 c a n d i d ah o l m i i 为催化剂，在界面生物反应中催化还原e o p b 合成( r ) - e i - w b ( y i e l d5 8 ， e e 限) 9 5 ) ，产率仍然偏低。最近，一些研究者发现从不同的植物中获得的微生物可在 水相中催化还原e o p b ，虽然产物构象为尺，但产率( 3 5 - 8 1 ) 较低 2 8 , 2 9 ，且这些生物催 化剂并不如面包酵母般被化学家们所熟悉，限制了它们的广泛应用。t s e n g 等【3 0 】使用脂肪 酶选择性水解消旋的羟基氰得( r ) - - h p b 。h a s h i m o t o 等1 3 1 , 3 2 从土壤分离出微生物g o r a d o n a t e r r a e ，用于苯甲醛的不对称氰基化反应可直接制得手性的羟基氰，经水解也可制得 ( r ) q - i p b 。p a u l o 等【2 8 j 筛选出几种不同微生物并用于不对称催化还原e o p b 反应，结果如表 卜1 所示。 表l - 1 微生物催化还原e o p b t a b 1 - 1m i c r o b i a lr e d u c t i o no fe o p b 88 0 d e c o m p o s i t i o no c c u r r e d d a o 课题组【3 3 】使用经济易得的面包酵母在乙醚中催化还原e o p b 合成( r ) - - e h p b 取得 了成功。但是底物浓度始终不能高于5 8m m o ll 1 ，且反应结束时e i - i p b 最终浓度仅为 4 6m m o ll 1 ，反应亦存在明显的底物及产物抑制作用。该报道称在反应前将面包酵母用 氯代苯乙酮( a - p c ) 预诱导( p r e i n c u b a t e ) 段时间，反应产物的立体选择性e e 僻) 与e o p b 转化率分别达到8 1 和9 6 ，多数研究者认为这是因为a - p c 抑制了酵母中催化合成s 构型产物的醇脱氢酶的活性，因此使得反应立体选择性提高。但是这一结果是在高比酵 母物料( 1gy e a s t 1 2m ge o p b ) 前提下获得的，怀疑因为a - p c 自身的毒性使酵母催化活 性大幅度降低。另外在纯有机溶剂中进行的该反应，由于糖类等难溶于有机溶剂，无法 提供能源供体使得难以实现辅酶的原位再生。 总体而言，生物合成所得产品的光学纯度较生物拆分的高，但生物合成也有其自身 难以避免的不足，如底物浓度不高，周期长，效率低，难以实现高反应立体选择性的同 时获得满意的产物产率等，尚有待进一步改进和完善。 1 1 3 瓶颈问题 综上所述，( r ) - e h p b 是一种重要的手性药物合成中间体，但由于其结构的特殊性， 使得其大规模生物合成比较困难。尽管文献对( r ) - e h p b 制备方法报道了很多，但是真正 3 江南人学博士学位论文 规模化生产，无论化学方法还是生物方法都仍需进一步开发。本课题选择相对而言比较 有工业放大前景的面包酵母催化不对称还原潜手性底物e o p b 合成( r ) 毛h p b 的体系为 研究对象，从化学与化学工程的角度尝试采取一些特殊手段削弱该反应的底物和产物抑 制作用，提高该反应的化学选择性和立体选择性，并尝试对该过程实施反应玢离耦合， 提高效率。 有机溶剂水双相体系最初被应用于酶催化，后来人们发现有些细菌也能在有机溶剂 存在下生长，这为有机介质中的微生物整细胞催化展示了良好前景 3 4 , 3 5 l ，而且水相同时 存在对于需要添加辅酶或者辅酶再生的氧化还原反应、需要复杂的多酶体系参与的转化 过程等都体现出优势。l o u 等【3 5 】用红酵母( r h o d o t o r u l as p ) a s 2 2 2 4 1 的固定化细胞催化 不对称还原乙酰三甲基硅烷生成( - ) 一1 - - - - 甲基硅乙醇，在水相中的产率和e e 值分别为 8 9 和6 3 1 ，而在水正己烷双相体系中产率和e e 值分别达到了9 1 4 和7 2 7 。研究 者认为双相体系中有机相从水相中原位萃取了产物，消除了产物抑制并且使反应平衡向 合成醇的方向移动，从而使得产率提高；同时有机溶剂可能使细胞中的一些还原酶的同 工酶失活，而这些同工酶具有不同立体选择性，故使得还原反应中目标手性产物的立体 专一性增强，因而产物的e e 值增大。面包酵母在水相中催化e o p b 的反应产物主要为 不期望的( s ) - e h p b 州，若选择合适的有机溶剂作为反应介质，反应立体选择性将发生逆 转向期望的方向进行【3 7 】。有机溶剂相中的生物催化具有很多明显的优势：如可以提高水 不溶化合物的溶解度；能改变反应热力学平衡，提高转化效率；简化产物和催化剂的分 离和回收步骤等 3 8 , 3 9 1 。但是，有机单相中酵母催化不对称还原仅羟基酯存在明显的底物 及产物抑制现剩3 3 】。本研究尝试利用液液双相体系解决上述问题。 随着人们环保意识的不断增强以及生物催化领域溶剂工程的进展，新型溶剂的开发 与应用一直广受人们关注。离子液体这类新型溶剂在各领域的应用正在不断深入开展， 同时也为解决常规有机溶剂对生物催化剂的毒性影响提供一条有效途径。h o w a n t h 等【删 首次用固定化酵母细胞在疏水性离子液体 b m i m i p f 6 】中催化