（工业催化专业论文）磷脂酶D制备及催化反应的初步研究.pdf

摘要 磷脂广泛应用于食品、医药等领域，但是，很多情况下天然磷脂难于满足制 品性能方面的要求。磷脂酶d ( p l d ) 是成功制备各种半合成工艺磷脂的关键技 术，因而该酶制剂及应用技术得到重视和发展。本文对放线菌发酵产磷脂酶d 的性质和转磷脂酰反应应用进行了实验探索研究 应用硫酸铵沉淀法、乙醇沉淀法、聚乙二醇沉淀法对微生物发酵生产磷脂酶 d 进行了初步纯化。其中，硫酸铵盐析法在6 0 饱和度时提纯了8 0 1 倍，回收 率为5 0 9 ；乙醇沉淀法在用量体积分数1 0 ：1 时提纯了8 吣倍，回收率为6 0 ； 聚乙二醇沉淀法在0 4 9 m l 时提纯了1 1 2 倍，回收率为5 0 9 。 采用分光光度法检测不同条件下的磷脂酶d 水解活力，发现磷脂酶d 在p h 为6 ，温度为5 0 c 时活力最高；在p h 值为4 - 8 时，酶活性较稳定；温度低于4 0 时酶活力较稳定。磷脂酶d 的保存稳定性较好，在4 1 2 下保存3 0 天尚有踟以 上的酶活力。 以硅藻土、高岭土、硅胶g 为载体，对磷脂酶d 进行吸附固定化，比较三 种载体的固定化效果，硅藻土为较为理想的载体。 以谷氨酸、月桂醇、葡萄糖酸内酯为原料，合成了一种非离子型表面活性剂 谷氨酸二月桂酰基酯核糖醇，用该表面活性剂对酶进行包覆固定化当表面活性 剂质量与磷脂酶d 的蛋白含量比为2 ：1 时，包覆率达到最大，为4 0 。 以p c ( 磷脂酰胆碱) 为底物，对磷脂酶d 在有机介质中的催化反应作了初 步研究，研究表明：以磷脂酶d 催化的转磷脂酰反应和水解反应，当受体醇浓 度远远大于p c 浓度时，其动力学方程符合米氏方程在水有机相系统中，分 别以游离酶、固定化酶、包覆酶催化p c 的转磷脂酰反应，结果表明：包覆酶比 游离酶的转磷脂酰活力提高了大约2 0 倍。 本研究对以磷脂酶d 和天然磷脂为原料，合成稀有及半合成磷脂具有重要 的借鉴意义 关键词：磷脂酶d 表面活性剂转磷脂酰反应固定化分离纯化 p r e l i m i n a r ys t u d i e so i lp r e p a r a t i o n a n dc a t a l y t i cr e a c t i o no f p h o s p h o l i p a s e d a b s l r ac i - p h o s p h o l i p i di sw i d e l yu s e di nf o o d , p h a r m a c e u t i c a li n d u s t r i e sa n do t h e rf i e l d s ， u n d e rm o s tc i r c u m s t a n c e s , n a t u r a lp h o s p h o l i p i d sc a nn o tm e e tt h er e q u i r e m e n t so ft h e p r e f o r m a n c e p h o s p h o f i p a s ed i st h ek e yt e c h n o l o g yu s e ds u c c e s s f u l l yi np r e p a r i n g s e m i - s y n t h e t i cp h o s p h o l i p i d s , s ot h ee n z y m et e c h n o l o g yw a sc o n c e r n e da n d d e v e l o p e d i nt h i st e x t , t h ec h a r a c t e r i z a t i o n o fp h o s p h o l i p a s eds e c r e t e d b y a c t i n o m y c e s a n da p p l i c a t i o no f t r a n s p h o s p h a t i d y l a t i o nw a sp r e t i m i 埘ys t u d i e d p h o s p h o l i p a s e ds e c r e t e d b ya c t i n o m y c e s w a sp r e l i m i n a r y p u r i f i e db y 州h 4 泌o p r e c i p i t a t i o n , e t h a n o lp r e c i p i t a t i o n , p e gp r e c i p i t a t i o nr e s p e c t i v e l y b y m e a n so fa l i ) 2 s qp r e c i p i t a t i o n ( i n 6 0 s a t u r a t i o n ) , t h ep h o s p h o l i p a s edw a s p u r i f i e d8 0 1t i m e s , a n dt h er e c o v e r yr a t i ow a s5 0 9 ：b ym e a l k qo fe t h a n o l p r e c i p i t a t i o n ( i nt h ev o l u m er a t i o1 o ：1b e t w e e ne t h a n o la n dr a g te n z y m e ) , i tw a s8 0 8 t i m e sa n dt h er e c o v e r yr a t i ow a s b ym e a n so fp e gp r e c i p i t a t i o n 血0 4 9 m l c o n c e n t r a t i o n ) , t h ep h o s p h o f i p a s ed w a sp u r i f i e d1 1 2t i m e s , a n dt h er e c o v e r yr a t i o w a s5 0 9 t h e h y d r o l y s i sa c t i v i t y o f p h o s p h o l i p a s e dw a sd e t e r m i n e d b y a s p e c t r o p h o t o m e t r i ca s s a yu n d e r d i f f e r e n tc o n d i t i o n s t h er c s l i l ts h o w e dt h e p h o s p h o l i p a s ed h a sm a x i m a lh y d r o l y s i sa c t i v i t ya tp h6 。5 0 ；p h o s p h o f i p a s ed w a sa c t i v ea n dh i g h l ys t a b l ei ns o l u t i o nf r o mp h4t o8 ；i t sa c t i v i t yw a ss t e a d yw h e n t h et e m p e r a t u r eb e h o w e d4 0 c p h o s p h o t i p a s edh a dab e t t e rs t a b i l i t yi np r e s e r v a t i o n , t h ee n z y m ea c t i v i t yw o u l dk e e pa b o v e8 0 b e l o w4 cf o r3 0d a y s t h ei m m o b i l i z a t i o no ft h ep h o s p h o l i p a s edw i t hd i a t o m i t e , k a o l i n , s i l i c ag e la s t h ec 卸f f i e rw a ss t u d i e d b yc o m p a 幽no fi n , m o b i l i z a t i o nr e s u l t so ft h r e ec a r t i e r , i t w a sf o u n dt h a td i a t o m i t ei st h eo p t i m a l r i e l - an e wn o n - i o n i cs u f f a c t a n tc a l l e dg i n t a m i ca c i dd i d o d e c y le s t e rn b i t o la m i d e w a ss y n t h e s i z e df r o ml - g l u t a m i ca c i d , l a u r y la l c o h o lg l u c o n e 6 - l a c i o n e a n dw a s u s e dt oc o a t e dp h o s p h o l i p a s ed w h e nt h er a t i ob e t w e e nt h es u f f a o a n tm a s sa n d p f o t e i nm a s so ft h ep h o s p h o l i p a s ed w a s 2 ：1 ，w ec o u l dg e tt h em a x i m a lc o a t e dr a t eo f 4 0 t h ep r e l i m i n a r yr e s e a r c hw a sm a d e0 1 1t h er e a c t i o no fp h o s p h a t i d y l c h o l i n e ( p c ) c a t a l y z e db yp l d i nm g a n i cs o l v e n t ，a n dt h er e s u l t ss h o w e dw h e nt h ec o n c e n t r a t i o n o fa l c o h o lr e c e p t o rf a re x c e e d i n gp c , t h er f a c t i o no ft t a n s p h o s p h a t i d y l a t i o na n d h y d r o l y s i sc a t a l y z e db yp h o s p h o h p a s cd w o u l dc o i n c i d e n tw i t hm i c h a c l i s m e n t e n k i n e t i ce q u a t i o n t h er e s u l to ft r a n s p h o s p h a t i d y l a t i o no fp cc a t a l y z e db yt h en a t i v e p l d , i m m o b i l i z e dp l d , l i p i d - c o a t e dp l ds h o w e dt h a tt h et r a n s p h o s p h a t i d y l a t i o n a c t i v i t yo f al i p i d - c o a t e dp l d w a s2 0t i m e st h a nt h en a t i v ep l d t h er e s e a r c hh a d i m p o r t a n t u s cf o rr e f e r e n c e0 1 1 s y n t h e s i z i n g a n d s e m i - s y n t h e s i z i n gp h o s p h o l i p i df r o mp h o s p h o l i p a s ed a n dn a t u r a lp h o s p h o l i p i d s k e yw o r d s ：p h o p h o l i p a s ed ；s u r f a c t a n t ；t r a n s p h o s p h a t i d y l a t i o n ；i n u n o b f l i z a t i o n ； s e p a r a t ea n dp u r i f i c a t i o n 西北大学学位论文知识产权声明书 本人完全了解学校有关保护知识产权的规定，即：研究生在校攻 读学位期间论文工作的知识产权单位属于西北大学。学校有权保留并 向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版。本人允许论文被 查阅和借阅。学校可以将本学位论文的全部或部分内容编入有关数据 库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存和汇编本学 位论文。同时，本人保证，毕业后结合学位论文研究课题再撰写的文 章一律注明作者单位为西北大学。 保密论文待解密后适用本声明。 学位论文作者签名：压盛指导教师签名：乏鱼= 兰 圳7 年月日d 7 年月0 日 西北大学学位论文独创性声明 本人声明：所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工 作及取得的研究成果。据我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地 方外，本论文不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含 为获得西北大学或其它教育机构的学位或证书而使用过的材料。与我 一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的 说明并表示谢意。 学位论文作者签名：师良静 年月 日 西北大学硕士学位论文 第一章前言 1 1 研究问题的提出 磷脂的研究始于3 0 年代的德国，主要集中在大豆和蛋黄两种物质上，现在 国内外市售的卵磷脂主要是以大豆磷脂为主磷脂是良好的乳化剂，广泛应用于 食品、医药、化妆品、皮革、涂料等领域。但是，很多情况下天然磷脂难于满足 制品性能方面的要求。尤其是上世纪八十年代开始研究的脂质体靶向给药技术， 对合成及半合成磷脂提出了强烈要求。 解决此难题的方法之一就是对磷脂进行改性，提高磷脂的亲水性。改性方法 包括物理改性、化学改性和酶法改性【。鉴于前两种方法存在着一些安全性等方 面的缺陷。已逐渐被淘汰。磷脂的生理活性与其脂肪酸的组成和极性末端的组成 密切相关，某些稀有和有特定结构的磷脂有很高的药用价值。这些特殊结构的磷 脂在自然界中含量极少，难以用化学方法合成，但容易用酶改性法获得；酶改性 生成的磷脂保持天然构型，除非生产高纯度的磷腻一般不需要分离步骤1 2 】。酶 改性法具有反应条件温和，速度快，进行完全，副产物少等特点，所以磷脂的酶 法改性作为一种绿色、环保的方法有着广泛的发展前景和重要的经济和社会价 值。 1 2 文献综述 1 2 1 磷脂简介 1 2 1 1 磷脂的结构及来源 磷脂最早由u a u q u l i a 于1 8 1 2 年发现，1 8 4 4 年法国g l o b l y 首次从蛋黄中 分离出来，俗称卵磷脂( l 鲥t h i n ) f 3 1 。 卵磷脂从广义上讲是含磷脂酰胆碱( p h o s p h a t i d y l c h o l i n e ，简称p c ) ，脑磷脂 ( 磷脂酰乙醇胺，p h o s p h a f i d y l e t h a n o l a m i n ，简称p e ) 、肌醇磷脂( 磷脂酰肌醇， p h o s p h a t i d y l i n o s i t o l ，简称p 1 ) 、丝氨酸磷脂( 磷脂酰丝氨酸，p h o s p h a f i d y l s e r i n e 简称p s ) 和神经鞘磷脂( s p r i n g m y c l m ，简称s m ) 等的复合磷脂；狭义的卵磷 脂就是磷脂酰胆碱p c ，是甘油、胆碱、磷酸、饱和及不饱和脂肪酸组成的一种 含磷脂类物质。几种主要磷脂的结构见图1 1 。 西北大学硕士学位论文 0 ir 硒 一0 + 一嘞孵脂 0 l 产 一显一。一龋) l z 等c o - r c ni 飘醇瓣膳( h ) 0 9 卜o c il 妣p 喜。七。了酊州嘲 图1 4 几种主要磷脂的结构图 2 神经赫礴庸( s m ) 西北大学硕士学位论文 1 2 1 2 理化性质 卵磷脂和脑磷脂等纯品均为白色蜡状固体，在低温下可结晶。由于磷脂分子 中含有大量不饱和脂肪酸，易被空气中的氧所氧化，在空气中放置一段时间后， 形成过氧化物的聚合物，磷脂颜色由白色变为黄褐色，久而久之会变成棕黑色。 因此，需在低温干燥下保存，不能放置在阳光直射、潮湿、高温处，以免吸潮、 氧化、分解变质 4 1 。 卵磷脂溶于脂肪烃和芳香烃溶剂，部分溶于乙醇，不溶于丙酮和水当与水 混合时，磷脂由于发生水合作用而形成胶束，这种胶束可用水无限稀释，如果丙 酮加入量不足以沉淀磷脂，丙酮会溶于磷脂并形成一种稀的、均匀的溶液。磷脂 能溶于矿物油与脂肪酸，不溶于冷的动植物油，能分散于热油中。由磷脂的结构 可见，磷脂分子具有亲水和疏水双重性，疏水部分是脂肪酸的烃基，而亲水部分 是磷酸、胆碱。由于这种两性表面活性剂特征，磷脂被广泛用作乳化剂、稀释剂 等。磷脂中各组分含量的多少对其乳化性能有一定影响，例如p c 含量高，有利 于形成o w 型乳化体系，而p i 含量高有利于形成w o 型乳化体系。磷脂与酸、 碱、酶作用可发生水解，得到各自不同的水解产物。如卵磷脂水解得到脂肪酸磷 脂甘油和胆碱，磷脂甘油在生物体内通过磷酸脂酶水解，释放出胆碱，产生磷脂 酸。磷脂为带电分子，因此它对离子环境具有敏感性，当盐浓度超过2 ，p h 值 低于4 时磷脂的功能性明显降低 1 2 1 3 ，目磷脂的应用 磷脂分子中既含疏水基团又含有亲水基团，因此是一种很好的表面活性剂， 具有良好的乳化性能。大豆磷脂作为一种天然乳化剂，已在糖果、巧克力、乳品、 焙烤食品等领域中得到广泛应用。作为乳化剂用在食品中的磷脂其添加量一般不 超过1 ，但这样少的添加量尚无法保证磷脂作为一种活性成分发挥其特有的生 理功能。 作为功能性食品基料，磷脂的配合添加量达到3 0 以上由于磷脂的组成脂 肪酸多以不饱和脂肪酸为主，虽然营养价值高但易被氧化酸败，故需配合些维生 素e 或小麦胚芽油。这样，既可防止磷脂不饱和脂肪酸的氧化，又给富含磷脂的 功能性食品添加了维生素e 的生理活性。配合磷脂和维生素e 可调制成各种不 同形式、不同品种的功能性食品 5 1 。 3 西北大学硕士学位论文 1 2 2 磷脂的改性 我国是世界大豆生产的大国，有着丰富的磷脂资源。据统计，每年有近1 l 万吨的水化油脚或5 万多吨的浓缩磷脂副产物产生，然而，磷脂的资源利用率却 很低。仅为1 0 左右主要用于食品、饲料添加剂，少量用于医药保健和其他行 业，而绝大部分作为废料生产低级肥皂或作为饲料处理。同时也因夏季发酵和腐 败，给环境带来了很大的污染。为拓宽磷脂应用领域，充分利用磷脂这一宝贵资 源，磷脂改性研究显得极为重要磷脂的改性概括起来有以下3 种：物理改性、 化学改性和酶改性1 1 1 1 2 2 1 物理改性 物理改性就是利用某些分离溶剂和分离技术将混合磷脂中的某些具有特定 功能的部分纯化、富集的过程。在此过程中磷脂本身组分的化学结构并未发生变 化，不影响磷脂应用的安全性，但同时存在人为无法改变磷脂功能性质的缺点。 目前，常用于或正在研究的磷脂物理改性的方法有以下几种： 低级醇分离法在磷脂组分中，磷脂酰胆碱( p c ) 在酵中的溶解度比磷脂 酰乙醇胺( p e ) 及磷脂酸肌醇( p i ) 高，故根据溶解性能的不同使之分离。前者 形成醇溶性p c 富集部分，有很好的乳化性，适宜作o w 体系乳化剂。后者形 成醇不溶性p e 富集部分，适宜作w o 体系的乳化剂。进一步可通过a 1 2 0 3 等处 理获得高含量的磷脂酰胆碱嘲。通常使用的分离溶剂是c 1 c 4 的低级醇类，如乙 醇、甲醇、异丙醇、丙二醇等。用9 0 的乙醇对p c p e = i 2 的天然磷脂进行萃取， 可得到p c p e = 8 的高p c 产品为了得到更高浓度的产品，还可采用吸附剂分 馏法或色谱分离法阴。用丙二醇提取，加入柠檬酸可制得食用固体磷脂。用异丙 醇分离效果好，但溶剂用量大 吸附分离法该法是根据分离柱对磷脂中不同组分的吸附能力不同而加以 分离。如将粗磷脂溶于乙醇，用乙醇洗涤氧化铝填充的层析柱时，卵磷脂被优先 冲洗下来，其他成分不会被冲洗掉，由此可获得含丙酮不溶物9 5 的卵磷脂。用 硅胶做填充材料，用氯仿溶解磷脂，然后用3 ：2 的氯仿一甲醇( v v ) 混合溶液 冲洗，可获得丙酮不溶物8 3 的卵磷脂，此法常用于制备静脉注射用磷脂嗍。 膜分离法膜分离法是将磷脂用乙烷、正丙醇等有机溶剂溶解，形成磷脂胶 囊，通过一定孔径的半透膜，根据磷脂不同组分分子量大小的不同加以分离。该 4 西北大学硕士学位论文 技术正在用于高纯度产品的制取工艺中，如使溶于乙烷一异丙醇混合液的磷脂溶 液通过聚丙烯半透膜，可使卵磷脂浓度由2 5 提高到5 1 。因现有的功能膜尚 不能完全分离分子量相近的组分，故还需开发特定功能膜才能应用于工业化生产 中嗍 超临界萃取法超临界萃取是利用流体( 溶剂) 在临界点附近与植物油中的 磷脂油异常相平衡行为和传递性能，其随压力和温度的改变而使磷脂的溶解能力 在很大范围内变动，进而达到分离磷脂的一种新型分离技术。国内也有人尝试用 超临界进行分提，但限于该法萃取装置昂贵，生产成本偏高，且得率尚不如溶剂 法高，故仍处于试验阶段。 1 2 2 2 化学改性 磷脂的化学改性是利用一些化学试剂与磷脂中的官能团进行反应，使磷脂分 子发生化学变化国内目前完成工业化生产研究的品种有乙酰化、羟基化、酰羟 化、水解改性磷脂产品。现将己经产业化的和正在科学研究的磷脂化学改性方法 介绍如下： 乙酰化乙酰化首先发生在磷脂中酰基乙醇胺的氨基，可以用乙酸酐处理脑 磷脂得到低浓度的乙酰化卵磷脂。乙酰化时，磷脂酰基乙醇胺的氨基在磷脂酰氯 两性离子的正电部分引入一个取代基，把它变成1 个带负电的卵磷脂，这样的方 法可以改善溶解性和油包水的巍化性斛堋。 羟基化羟基化是在乳酸或其它酸的作用下，磷脂与过氧化氢反应，使脂肪 酸的不饱和键接上羟基的改性方法。羟基化磷脂提高了磷脂的亲水性，流动性好、 颜色浅。羟化改性方法是在夹层加热罐内以8 0r m i n 搅拌浓缩磷脂并加热到 5 0 - 7 0 1 2 ，加入2 3 的乳酸或乙酸，然后滴加磷脂原料质量百分含量为5 1 5 的3 0 过氧化氢溶液，反应1 - 3h 。用1 0 氢氧化钠溶液中和，真空脱水至1 5 以下，碘价6 0 - 7 0 ，迅速冷却至5 0 以下，包装储存。 酰羟化酰羟化可以先将磷脂酰基化，再羟基化或后续水解，再中和的改性 方法。这种方法都极大地改进了磷脂的分散性和水溶性，因此扩大了它在那些需 要合成辅助乳化剂系统中的应用1 1 1 l 。 羟氯化向溶于己烷的大豆磷脂溶液中，加入磷脂总量2 2 5 的次氯酸钠， 用乙酸调节溶液的p h ，保持温度为5 0 1 2 ，在不断搅拌下反应1 h ，即可制得羟氯 5 西北大学硕士学位论文 化大豆磷脂。仝其根等【1 2 1 研制出经氯化改性的磷脂，其乳化稳定性、分散性和润 湿性都比未改性的磷脂有较大的提高。 氢化在镍或铜一镍等催化剂的作用下，使磷脂分子发生氢化反应，可制得 色浅、味淡、稳定的部分饱和氢化磷脂。经纯化后，氢化磷脂一般为白色粉末状， 由于不饱和双键的减少，是一种稳定性很好的脂质体【b1 4 1 金希江【1 5 】采用p d c 为催化剂，二氯甲烷为溶剂，进行催化加氢，获得了淡黄色、碘价低于3 0 的氢 化大豆磷脂。何凤英i l q 选用把催化剂，二氯甲烷或二氯甲烷一乙醇混合物为溶剂， 分离反应生成物，获得碘价为2 0 - 3 0 ，色淡黄，无难闻气味，收率为8 0 的氢化 大豆磷脂。 磺化在醛、酮或酸存在下，用二氧化硫使磷脂磺化，醛、酮等亦参加反应， 产物在水中能形成透明的溶液，具有抗酸碱的沉淀作用1 1 刀。 水解在强酸或强碱存在条件下，脂肪酸被氢基所取代，亲水性增强，分子 的反应活性提高，可为其它改性方法准备条件。但水解反应条件难以控制，若水 解时间过长，易导致生成脂肪酸、甘油磷脂和肌醇磷酸或它们的盐、氨基酸和糖 类混合物，甚至于进一步水解成甘油、磷酸和肌醇。正因酸碱水解条件难以控制， 水解产物的颜色很深，现基本己被淘汰【1 8 1 。 1 2 2 3 冀法改性 酶改性具有反应物不需纯化，反应条件温和，速度快，进行完全，副产物少， 酶制剂作用部位准确，来源方便等特点1 1 9 1 ，近年来酶改性成为学者研究的热点， 用于磷脂改性的酶有专一性较宽的酯酶和磷酸酯酶，但最有意义的是专一性较强 的磷脂酶，包括磷脂酶a 1 ，a 2 ，c ，d 等。磷脂酶能催化磷脂的各种水解反应， 并在一定酰基受体和供体存在下催化酯化反应和酯交换反应，磷脂的结构进行各 种改变或修饰，得到不同结构和用途的磷脂。目前工业上应用的磷脂酶主要有磷 脂酶a 2 和磷脂酶d ，其它酶的应用尚处于试验阶段。 磷脂酶a 1 磷脂酶a 1 ( e a 1 1 3 2 ) 是一类能够在磷脂甘油部分的磷脂s n 1 位点选择性断裂酯键的酶，生成l - 6 溶血磷脂和脂肪酸。该酶作用底物广泛，底 物专一性不强。一些微生物来源的1 ，3 特异性脂肪酶( e c3 1 1 3 ) 也显示出 磷脂酶a 1 活性1 2 0 l ，在磷脂改性方面，可以替代磷脂酶a 1 磷脂酶a 2 磷脂酶a 2 ( e c 3 1 1 4 ) 是一类能够在磷脂甘油部分的s n 2 位点 6 西北大学硕士学位论文 选择性断裂酯键的酶，在生物界中分布广泛。它是水溶性酶，其水解聚集态的底 物( 单层脂，双层脂，微胶团) 的活力远比其单体状态高磷脂酶a 2 水解单层 脂的活力很低，当底物形成聚合态时，活力会上升t e s h i m a 认为，在团粒底物 表面存在许多相同的酶结合位点，和酶的结合常数是单层脂的4 0 倍；动力学和n 端化学修饰表明，磷脂酶a 2 活力的发挥，必须和脂水界面结合，只有微胶团的 脂水界面才能激活酶的活性【2 1 1 。该酶不仅能催化水解反应，在醇溶液中催化醇解 反应，生成溶血磷脂和酯：在酸中催化酸解进行酯化和酯交换反应。用磷脂酶 a 2 可以对磷脂的酰基进行放射性和荧光标记阎，从而研究生物膜的流动性和功 能以及酶学、脂代谢和生物膜结构。采用磷脂酶a 2 水解卵磷脂的方法生产溶血 卵磷脂，增强了亲水性能，h l b 值可达到1 0 1 2 。与卵磷脂相比，溶血卵磷脂的 亲水性、乳化能力和稳定性都显著改善，在高温、低温和低p h 条件下都能保持 良好的乳化性，且不受盐浓度的影响由于溶血磷脂在经过磷脂酶a 2 处理后， 除去了c 2 位上的不饱和脂肪酸，因此还具有抗氧化性。 磷脂酶c 作用于磷脂酰胆碱，生成甘油二酯和磷酸胆碱，由于磷脂酶c 的 水解作用是对磷脂结构的破坏，酶解产物己不属于磷脂，故应用研究的较少。 磷脂酶d 磷脂酶d ( e c 3 144 ，简称p u ) ) 即磷脂酰胆碱磷脂水解酶 ( e 144 ) ，属催化磷酸二脂酯键水解和碱基交换反应的一类酶的总称。p l d 发现于上世纪七十年代，大量生物化学研究表明，其主要生理功能是参与细胞脂 质代谢、信号转导及生物膜形成等因此，p i d 是一类分布较广的酶，从细菌 到高等动植物的许多生物类群中均发现p l d 存在瞄i 。 磷脂酶d 是一类特殊的酯键水解酶，它能催化水解磷脂分子中的磷酸和有 机碱( 如胆碱、乙醇胺等) 羟基成酯的键，即4 倍酯键，水解产物为磷脂酸和有 机碱。除水解作用外，在特定条件下，还能催化各种含羟基的化合物结合到磷脂 的碱基上，形成新的磷脂，这一特性称为磷脂酶d 的磷脂酰转移特性，通常也 称作碱基交换反应。利用这特性可对磷脂进行改性，制备高纯度的单一磷脂和稀 有磷脂【卅。 磷脂酶d 的另一重要特征是它只能在异相系统，即在脂( 油) 水界面上作 用，对均匀分散或水溶性底物无作用，即使有作用也极为缓慢。由于磷脂酶d 作用于处在脂( 油) 水界面的磷脂分子，因此，任何能增加底物水界面的条件 7 西北大学硕士学位论文 及有利于酶吸附在底物水界面上的因素都能加快磷脂酶d 的催化反应速度，提 高酶活力 磷脂酶d 具有宽广的底物特异性，能广泛作用于许多磷脂及磷脂衍生物 它对构成酯的碱基部分并没有绝对的特异性要求影响磷脂酶d 活力的因素很 多，包括p h 、温度、盐类、溶剂以及底物的聚合形式等【2 5 1 不同来源的酶其最 适p h 和温度不一样，植物中磷脂酶d 的最适p h 范围较窄，一般在5 6 之问， 而微生物磷脂酶d 的最适p h 在4 8 之间。大多数磷脂酶d 的最适作用温度为 2 5 - 3 7 ，但也有一些酶在5 5 6 0 1 2 时活力最高。除了p h 和温度之外，盐对磷脂 酶d 的作用也有影响。磷脂酶d 在医药和食品工业都有广泛的应用另外，磷 脂酶d 在生物体内的作用机制尚不清楚，有待进一步研列2 6 l 。 1 2 3 有机相中的酶催化反应 酶催化是目前生物技术中一个颇具基础性和应用性的研究领域。传统的观点 认为酶只能在水溶液发挥作用，酶显示活性时必须要有水。从理论上讲，若用有 机溶剂取代酶分子周围的水，酶分子的天然结构就会被破坏导致酶失活。这就限 制了酶在有机相中的应用【2 7 l 。直到二十世纪八十年代初z a k s 和k h b a n o v 等嗍报道 了脂肪酶在有机介质中仍具有较高的热稳定性和活力，日本的稻田佑二【剀等用聚 乙二醇对脂肪酶进行了修饰，使其溶于苯等有机溶剂中，并成功的催化了酯化反 应，从此有机介质中的酶催化反应就有了突破性的进展 1 2 3 1 酶粉直接扩散 k h b a n o v 等例首先报道了酶粉直接扩散法在有机溶剂中的催化活性，并指 出，在有机溶剂介质中，酶的热稳定性和底物选择性都有显著的提高。他们以三 丁酸甘油酸与庚醇在己烷中的酯交换为模型反应，用猪胰蛋白酶( p o r c i n e p a n c r e - a t i cl i p a s e ) 催化反应，通过动力学研究得出，反应遵从乒乓b i b i 机制。z a k s 等【3 1 】 发现枯草杆菌蛋白( s u b t i l i s i n ) 和a 胰凝乳蛋蛋白酶( a - c h y m o t r y p s i n ) ，在不同 的干有机溶剂( 指其中的水含量( 0 0 2 ，v ) ) 中催化酯交换反应，动力学符 合经典的米氏( m i c h a c l i s m e n t e n ) 方程。酶粉在不同的溶剂中的活性表现出相 当大的差别，这主要是由于亲水性强的有机溶剂夺取酶分子表面的必须水的能力 强。酶粉直接扩散法的优点是操作简单，并且酶与产物容易分离；缺点是非均相 反应效率低，酶分子直接暴露在有机溶剂中容易造成蛋白质变性和失活。 8 西北大学硕士学位论文 1 2 3 2 酶的修饰 酶的修饰可分为化学修饰和选择性修饰两类。 1 酶的化学修饰【3 州3 q 酶的化学修饰是将具有某些特性的配基( 修饰剂) 通过化学方法连接到酶分 子表面，赋予酶一些新的性质。主要分为以下几种： 功能基团的修饰酶分子上可离解的基团如氨基，羧基，羟基。巯基，咪唑 基等都可用来修饰。脱氨基作用可改善酶的稳定性，消除酶分子表面的氨基酸的 电荷，酰化反应可改变侧链羟基性质。这些修馋反应，可稳定酶分子有利的催化 活性现象，提高抗变性的能力。 酶分子内和分子间的交联双功能试剂如= 异硫氰酸脂、戊二醛可与酶分子 中或分子闻肽链的两个游离氨基分别发生反应使它们交联起来，增加酶的稳定性 和活性回收率。 酶与高分子化合物结合高分子化合物可以是双亲聚合物，如多糖、氨基葡 萄糖聚合物、聚氧乙烯、聚n - 乙烯吡咯烷酮、聚乙二酵( p e g ) 等，也可以是琉 水聚合物，如聚苯乙烯，聚甲基异丁烯酸等。它们可与酶结合，增加酶的稳定性。 2 酶的选择性返传修饰 这是在了解酶的一级结构和空间结构的基础上，设计出选择性修饰位点。通 过基因突变技术，把酶分子存贮在d n a 中，经过基因克隆和表达，就可以通过 生物合成方法不断获得具有新的特性和功能的酶。 1 2 3 3 固定化酶 酶的固定化是指通过物理化学方法将酶固定于可溶性或不溶性高分子支持 物( 或载体) 上而作成的一种酶制剂形式，它还可以叫做水不溶性酶、固相酶等。 利用固定化酶，我们可以改变“游离酶”在应用上的一些不利因素，例如，由于嘴 离酶”不溶于有机溶剂，在反应过程中很容易结块。酶固定化技术显示出很多优 点：( 1 ) 酶的稳定性增强；( 2 ) 酶能够反复使用；( 3 ) 可实现连续化酶反应；( 4 ) 可根据需要制成不同性质及形状的固定化酶；( 5 ) 可缩小反应体积；( 6 ) 减化下 游分离处理，可提高反应产物的纯度和产率；( 7 ) 具有充分利用资源、节省能源、 环境保护方面的优点1 3 5 l 。一般说来，酶的固定化方法有吸附法、共价结合法、交 联法、包埋法等几种 9 西北大学硕士学位论文 ( 1 ) 吸附法包括物理吸附和离子交换吸附，优点是操作简便，条件温和， 吸附剂可再生反复使用；缺点是酶和载体的吸附力比较弱，容易在不适宜的p h 、 高盐浓度、高底物浓度和高温下解析脱落嗣 ( 2 ) 共价结合法是酶蛋白分子上功能团和固相支持物表面上的反应基团之 间形成化学共价键连接，从而固定酶的方法由于酶与载体连接牢固，不易发生 酶脱落，有良好的稳定性及重复使用性，成为目前研究最为活跃的一类酶固定化 方法。其常用载体包括天然高分子( 纤维素、琼脂糖、胶原及衍生物等) ，合成 高聚物( 尼龙、多聚氨基酸、乙烯顺丁烯二酸酐共聚物等) 和无机支持物( 多 孔玻璃、金属氧化物等) 它的缺点是较激烈的共价反应使酶活损失较大闭。 ( 3 ) 交联法p 硼是利用双功能或多功能试剂在酶分子问或酶分子与载体问 或酶分子与惰性蛋白间进行交联反应的方法。交联反应可以发生在酶分子间，也 可以发生在分子内，一般情况下，在酶浓度低时，主要形成分子内交联，交联后 酶通常仍保持溶解状态。在高浓度状态下，分子问的交联比例上升，形成的固定 化酶变成不溶态。 仅通过分子间交联形成的固定化酶，颗粒一般很小，而且机械强度差，可以 先将酶吸附在载体上或包埋在胶内或微囊内，然后再用双功能或多功能试剂进行 交联。这种固定化酶空间位阻效应小 ( 4 ) 包埋法是一种不需要化学修饰酶蛋白的氨基酸残基，反应条件温和， 很少改变酶结构的固定化方法，其基本原理是先把单体和酶溶液混合，再借助引 发剂进行聚合反应，将酶固定于载体材料的网格中。固定化时保护剂和稳定剂的 存在不影响酶的包埋产率这种酶包埋在高聚物内的方法对大多数酶、粗酶制剂 甚至完整的微生物细胞都是适用的。 四种酶固定化方法各有所长，其中包埋法是相对较好的一种方法，但几种方 法联用，往往效果更好。无论采用何种方法，固定化酶的稳定性是首要考虑的因 素。酶、载体及试剂的费用、操作难易等与工业化有关的因素也必须考虑。 1 2 3 4 反胶团中的酶反应 反胶团是两亲分子溶于有机溶剂中时自组织形成的球形聚集体。与通常的胶 团相反，它极性头向内形成一个极性核，疏水性尾部向外伸展到有机溶剂中，故 名反胶团。反胶团是表面活性剂的烃链组成的外壳，疏水链指向有机溶剂，亲水 西北大学硕士学位论文 头指向水相形成的极性腔，形成纳米尺寸的“小水池”由于反胶束团体系能更好 地模拟酶天然环境，因而大多数酶在反胶团中能够保持良好的催化活性和稳定性 嗍成功应用反胶团进行的酶促反应有，氨基酸的旋光拆分、肽的合成、酯合成、 水解、酯交换、聚合物的合成以及污染物的酶促降解等 1 2 3 5 酶的表面活性剂包覆固定化 早在1 9 8 8 年日本学者o k a h a t a 等人嗍就提出了表面活性剂包覆固定化酶的概 念，制备工艺如下：将含有5 0 0 m g 脂肪酶2 s 0 m l g l 酸盐( o 0 5 m o l l , p h 6 8 ) 缓冲 溶液和含有5 0 0 m g 表面活性剂的2 5 0 m l 水溶液在超声波净化器混合2 0 r a i n ，然后 在冰箱( 4 ) 中置2 4 h ，通过离心分离和冷冻干燥得到白色粉末，收率为2 0 。 他还提出了包覆固定化酶的结构示意图( 图1 2 ) ) _ 1 坪“ 畸掣幸嚣 图1 - 2 表面活性剂包覆酶示意图 f g g 1 - 2 s c h e m a t i ci l l u s t r a t i o no f as u r f a c t a n t - c o a t e de n z y m e 我们可以看出，表面活性剂包覆固定化酶巧妙地利用了表面活性剂分子的两 亲性质，表面活性剂分子的亲水基团通过氢键与酶分子表面的氨基酸残基相结 合，疏水的长尾则伸展到有机溶剂中，使包覆后的酶分子易溶解在有机相中，酶 催化反应可以均相地在有机溶剂中进行，显著地提高了反应活性和稳定性，同时 酶分子受到表面活性剂分子保护不直接与有机溶剂接触从而有效地避免了酶的 变性与失活。 用表面活性剂包覆固定化的水解酶已成功的用于有机介质含水的有机介 质，两相体系中的反应。例如：被脂肪酶催化的具有专一的对映选择的酯化反应、 由磷脂酶d 催化的不溶于水的磷脂的转磷脂酰反应，用抗体催化的亲脂性底物 的水解反应和8 d 半乳糖酶的转糖苷反应中，已成功地用了包覆固定化酶。包覆 的水解酶能成功地增加亲水性底物的溶解性。同时，包覆的脂肪酶能有效地催化 1 1 g 埘 西北大学硕士学位论文 有机溶剂中的酯的合成，并且不改变酶的对映体的选择性，包覆固定化酶不同于 其它酶系统，它在有机溶剂中是可溶的、稳定的【切。s 1 c h i k a w a 对脂肪酶包覆的 不同链长、饱和程度、基团取代等的脂质进行比较后，发现硬脂酸最适合修饰脂 肪酶，蛋白质回收率达到1 5 2 ，水解活性达到0 5 8 p m o l ( m gp r o t e i n s ) 。用双十 二烷基一n - d - 谷- 氨酸对p f t a g i 的脂肪酶修饰后，该酶拆分消旋体限，s ) - t - 苯乙醇 的旋光选择活性大大提高，对( r ) - 对映体的活性可以达到5 0 5 即m o l i ( m g p r o t e i n s ) 与上述方法相比，表面活性剂包覆固定化酶具有制备容易、酶活损失 小、有机溶剂选择范围广、酶表面含水量低、酶的活性和稳定性高等优点，因此 它具有广泛的应用前景 1 3 本文研究的内容 1 采用盐析法、有机溶剂沉淀法、聚乙二醇沉淀法、超滤法对磷脂酶d 进行了 提纯，比较这四种方法的优缺点，找出一种最适合工业化生产的方法 2 对磷脂酶d 的性质作了初步的研究，确定了磷脂酶d 的最佳水解温度、p h 值，及对磷脂d 的稳定性进行了考察。 3 对磷脂酶d 的吸附固定化进行初步探讨，考察不同载体对酶水解活力及转磷 脂酰反应的影响。 4 合成一种非离子表面表面活性剂对磷脂酶d 进行包覆固定化，考察包覆固定 化酶催化的转磷脂酰反应效果 5 对磷脂酶d 在有机溶剂中的催化反应作了初步研究，初步探讨了磷脂酶d 的催化反应动力学模型。 西北大学硕士学位论文 第二章磷脂酶d 的分离提纯方法的研究 磷脂酶d ( p h o s p h o l i p a s ed ，简称p l d ) 即磷脂酰胆碱酶( e c 3 1 4 4 ) ，属催 化磷酸二酯酯键水解和碱基交换反应的一类酶的总称。它广泛存在于各种生物， 包括哺乳动物、植物、酵母和细菌d p 4 1 1 至今已报道的产磷脂酶d 的微生物主要 有链霉菌、棒状杆菌、大肠杆菌、沙门氏杆菌，以及假单孢菌等1 4 2 - 4 5 】尤其以放 线菌中链霉菌产酶报道最多，酶活较高与动植物来源的磷脂酶d 相比，微生物 磷脂酶具有较强的底物耐受性，较宽广的底物专一性和较高的碱基交换反应催化 活性，因而备受人们的关注渊。国内外已有许多人报道了磷脂酶d 的纯化方法， 例如，在1 9 9 4 年，g i a c o m oc a r r e a 等人报道了来自于两种链霉菌株( p m f j f i p m 4 3 ) 的磷脂酶d 的纯化与性质 4 6 1 。在1 9 9 8 年，c h i a k io g i n a o 等人报道了来自于放线菌 的磷脂酶d 的纯化与特性m 以上作者进行的提纯工作大多数是通过硫酸铵盐析 法、纤维素和葡聚糖凝胶拄层析和其它柱层析方法进行，且是在实验室小规模 制备本章着眼于大规模工业化酶生产，采用盐析法( 选用硫酸铵作中性盐) ，有 机溶剂沉淀法，水溶性非离子型聚合物沉淀法( 选用聚乙二醇作沉淀剂) 来提纯浓 缩发酵产磷脂酶d ，以获得有工业应用前景的磷脂酶d 制剂和应用技术。 。 2 1 实验材料与仪器设备 2 1 1 实验仪器及试剂 表2 - 1 实验仪器设备 t a b 2 - 1e x p e f i m e n t a le q u i p m e n t 西北大学硕士学位论文 表2 - 2 实验试剂 t a b 2 - 2e x p e r i m e n t a lr e a g e n t s 2 1 2 实验所需材科 截留蛋白质分子量为3 0 k d a 和1 0 0 k d a 的超滤膜华美生物工程有限公司； 截留分子量为8 0 0 0 的透析袋华美生物工程有限公司 2 1 3 试剂的配制 1 考马斯亮蓝试