（生物化学与分子生物学专业论文）白芥子挥发油抗肿瘤作用初步研究.pdf

， w a si n v e s t i g a t e d ，w h i c hm i g h tp r o v i d eb e t t e rt h o u g h t so fu s i n gt h ev o l a t i l eo i lf r o m s e m e ns i n a p i sa l b a e t h eo p t i m u me x t r a c t i o nc o n d i t i o nw a si n v e s t i g a t e db yt h eo r t h o g o n a ld e s i g n l 9 ( 3 4 ) ，a n dt h ec h e m i c a lc o m p o n e n t so ft h ev o l a t i l eo i lf r o ms e m e ns i n a p i sa l b a e w e r ea n a l y z e db yg c m s ；t h ei n b i b i t i o n a le f f e c to ft h ev o l a t i l eo i lf r o ms e m e n s i n a p i sa l b a et oh 2 2c e l l sw a sd e t e c t e db yt r y p a nb l u es t a i n i n ga n dm t ta s s a yi n v i t r o ；t h ei n f l u e n c eo fh 2 2c e l l s a p o p t o s i sa n dc e l lc y c l eb yt h ev o l a t i l eo i lw a s d e t e c t e db yd n aa g a r o s eg e le l e c t r o p h o r e s i sa n dp r o p i d i u mi o d i d e ( p i ) s t a i n i n g ； a s c i t e st u m o r m o d e la n ds o l i dt u m o r m o d e lw a su s e dt od e t e c tt h ei n b i b i t i o n a le f f e c t o ft h ev o l a t i l eo i lf r o ms e m e ns i n a p i sa l b a et oh 2 2 - b e a r i n gm i c ei nv i v o ，t h e m o r p h o l o g i cc h a n g e so ft h et u m o rc e l l sw a so b s e r v e db yh e m a t o x y l i n e o s i n ( h e ) s t a i n i n g ，s p l e e ni n d e xa n dt h y m u si n d e xw a sd e t e c t e dt oi n v e s t i g a t et h et o x i c i t ya n d s i d ee f f e c t so ft h ev o l a t i l eo i lf r o ms e m e ns i n a p i sa l b a e , a n dt h ea c r i d i n eo r a n g e ( a o ) s t a i n i n gw a su s e dt oo b s e r v et h em o r p h o l o g i cc h a n g e si n d u c e db ya p o p t o s i s ，t h e e x p r e s s i o n so ft h eg e n eb a xa n db c l 一2 i nt h et u m o rt i s s u ew a sd e t e r m i n e du s i n g i m m u n o h i s t o c h e m i s t r y t h er e s u l t ss h o wt h a tt h eo p t i m u me x t r a c t i o nc o n d i t i o n so ft h ev o l a t i l eo i lf r o m s e m e ns i n a p i sa l b a ei s ：h y d r o l y s i st e m p e r a t u r e5 0 c ，p hv a l u eo f b u f f e rs o l u t i o n5 0 ， c o n c e n t r a t i o no fa s c o r b i ca c i do 5 m m o l l t h ey i e l dr a t eo ft h ev o l a t i l eo i lo ft h i s p r o c e s s c a l lr e a c ho 16 4 ，t h em a i n c o m p o n e n t o ft h ev o l a t i l eo i li s a u y l i s o t h i o c y a n n t e ( 8 9 4 1 1 ) ；t h ev o l a t i l eo i lf r o ms e m e ns i n a p i sa l b a ec a ni n h i b i tt h e g r o w t ho fh 2 2t u m o rc e l l ss i g n i f i c a n t l yi nv i t r oa n di tm a yw o r kt h r o u g ha p o p t o s i s ； t h ev o l a t i l eo i lf r o ms e m e ns i n a p i sa l b a ea l s oc a ni n h i b i tt u m o rg r o w t hi nv i v oa n d e x t e n dt h el i f es p a no fh 2 2 一b e a r i n gm i c es i g n i f i c a n t l y , a n dt h er e s u l t sd e m o n s t r a t e da i i i胡 福建师范大学吴圣曦硕士论文 g o o dd o s e e f f e c tr e l a t i o n s h i p ，b u tt h eh i g h - d o s a g eg r o u po ft h ev o l a t i l eo i lh a s o b v i o u st o x i c i t ya n ds i d ee f f e c t so nt h em i c e ；t h ev o l a t i l eo i lf r o ms e m e ns i n a p i s a l b a em a yr a i s et h ee x p r e s s i o no fb a xa n ds u p p r e s st h ee x p r e s s i o no fb c l - 2 ，a sa r e s u l t ，r a i s et h eb a x b c l - 2r a t et op r o m o t ea p o p t o s i s k e y w o r d sv o l a t i l eo i lf r o ms e m e ns i n a p i sa l b a e ；e x t r a c t i o np r o c e s s ；h 2 2c e l l s ； a n t i t u m o r ；a p o p t o s i s i i i ，一毽露，p_1，1 i 中文文摘 中文文摘 i i iiii iii ii i iui ii ii 18 0 7 0 0 0 异硫氰酸盐i t c s 是存在于十字花科植物的一种具有防癌抗癌作用的有机硫 化合物，近年来受到营养学与预防医学界的高度重视。但是i t c s 种类繁多，抗 癌的活性都有一定的差异，且不同的i t c s 对不同的肿瘤的抗癌活性也并不相同， 甚至有一些i t c s 还有促进肿瘤细胞生长的作用，抗癌的机制也较为模糊。本文 对异硫氰酸盐i t c s 的研究概况给予综述，为异硫氰酸盐i t c s 的进一步开发应用 提供参考。 白芥子是十字花科植物白芥的种子，也是一味传统中药。白芥子的主要药效 成分有白芥子苷、白芥子碱、白芥子挥发油等。白芥子挥发油是自芥子苷经芥子 酶水解产生，为无色或淡黄色的油状物，容易挥发，有辛辣味。白芥子挥发油提 取工艺的探讨国内还未见报道，本实验应用l 。( 3 4 ) 正交设计试验，考察缓冲液 p h 值、抗坏血酸浓度以及水解温度对白芥子挥发油提取率的影响，并对其化学 成份进行鉴定。 白芥子挥发油富含异硫氰酸盐类物质，白芥子挥发油中的主要i t c s 是异硫 氰酸烯丙酯( a i t c ) ，目前对其抗肿瘤作用有不同的实验结果。一些研究发现 a i t c 能够对人结肠癌细胞系h t 2 9 有细胞增殖抑制和细胞毒作用；能够使人前 列腺癌细胞p c 3 的周期阻滞于g 2 m 期并引起细胞凋亡。但是美国国家毒理计 划进行的两年食品级a i t c 的研究表明a i t c 能引起f 3 4 4 n 大鼠膀胱移行上皮 细胞乳头状瘤；且a i t c 还可以抑制内毒素l p s 诱导的原代大鼠肝细胞的凋亡并 且其作用有可能导致肿瘤的发生。可见a i t c 到底是促进还是抑制肿瘤细胞的生 长目前尚不明确，a i t c 与人类生活紧密相关，因此，从不同途径进一步探讨a i t c 的抗肿瘤作用及其机制，对人类的食品安全，以及十字花科植物的开发应用有着 非常重大的现实意义。 本文通过白芥子挥发油对体内外培养的肝癌h 2 2 细胞的影响来探讨其抗肿 瘤作用。主要研究内容如下： 1 白芥子挥发油提取工艺优化及其化学成份鉴定 采用l 9 ( 3 4 ) 正交设计试验优化白芥子挥发油的提取工艺，并以g c m s 联用 法分析其化学成份。结果表明缓冲液p h 值、抗坏血酸浓度对白芥子挥发油得率 的影响达到了极显著水平，水解温度对得率的影响也达到了显著水平，影响程度 从大到小依次是缓冲液p h 值 抗坏血酸浓度 水解温度；g c 。m s 联用共分离出 1 0 个峰，鉴定出9 种成份，占挥发油总量的9 9 9 9 9 ，主要组成为异硫氰酸烯丙 福建师范大学吴圣曦硕士论文 酯( 8 9 4 1 1 ) 、异硫氰酸3 丁烯酯( 7 3 6 4 ) 、3 丁烯腈( 1 2 7 5 ) 。得出的结 论是最佳提取条件为：水解温度5 0 、缓冲液p h 值为5 0 、抗坏血酸浓度为 0 5 m m o l l ，挥发油提取率可达0 1 6 4 ，且此工艺稳定可行。所提取的白芥子挥 发油中大部分为异硫氰酸盐类，并含有少量醛类、醚类和腈类物质。 2 白芥子挥发油对小鼠肝癌h 2 2 的体外抑制作用研究 ，( 1 ) 细胞排染实验采用台盼蓝染色来计数在各浓度白芥子挥发油作用下的 h 2 2 细胞的存活率，结果表明各浓度白芥子挥发油对h 2 2 细胞都有显著的杀伤 作用，且杀伤作用呈现一定剂量效应关系。 ( 2 ) 采用m t t 法测定白芥子挥发油对小鼠肝癌h 2 2 细胞增殖的抑制作用， 结果表明白芥子挥发油对体外培养的h 2 2 细胞有显著的抑制作用，其中以4 0 0 ug m l 与2 0 01 1g m l 剂量组最为显著，抑制率分别达到8 9 0 2 4 - 1 5 与 8 6 5 9 4 - 3 4 。通过细胞抑制率算得白芥子挥发油对h 2 2 细胞半致死浓度i c 5 0 为 6 6 5 9 。通过比较2 4 h 、4 8 h 、7 2 h 各个剂量组白芥子挥发油细胞抑制率可得，白 芥子挥发油对h 2 2 的抑制作用随着时间的延长而增强。 ( 3 ) 通过肿瘤细胞d n a 的琼脂糖凝胶电泳分析可见：除空白组未形成d n a 梯外，其它各个剂量的给药组都有不同程度的d n a 梯的形成。由此可以推测促 进肿瘤细胞凋亡可能是白芥子挥发油抑制h 2 2 细胞增殖的作用机制之一。 ( 4 ) 通过p r o p i d i u mi o d i d e ( p i ) 单染经流式细胞仪检测可得各给药组存在 凋亡峰，且从结果分析推测白芥子挥发油诱导h 2 2 的细胞凋亡发生在0 2 x m 期。 3 白芥子挥发油对小鼠肝癌h 2 2 的体内抑制作用研究 ( 1 ) 通过腹水瘤模型以及实体瘤模型来验证白芥子挥发油的抗肿瘤作用， 结果表明白芥子挥发油各个剂量组( 2 0 m g k g 、4 0 m g k g 、8 0 m g k g ) 能够有效抑 制肝癌h 2 2 小鼠实体瘤肿瘤细胞的生长( 抑制率分别为1 6 1 3 、4 3 5 1 、 4 6 2 2 ) ，提高小鼠的生存时间( 生命延长率分别为1 5 4 5 、4 7 2 7 、5 9 0 9 ) ， 且呈良好的剂量一效应关系。在腹腔给药时，大、中剂量组白芥子挥发油给药组 存在明显毒副作用，体重及免疫指标( 脾指数和胸腺指数) 显著下降，当使用原位 给药法时，抑瘤率上升( 3 7 8 8 、4 6 5 7 、6 5 8 3 ) ，毒副作用显著降低，与 n s 组相比差异不显著。 ( 2 ) 肿瘤组织的石蜡切片经h e 染色的显微观察可见，白芥子各剂量组均 出现了不同程度的空泡，瘤组织的排列较n s 组疏松，表明肿瘤细胞存在不同程 度的死亡。采用吖啶橙( a o ) 荧光染色法可见白芥子各剂量组肿瘤细胞中细胞 v 矗ll爵瓢；1 k i 中文文摘 核固缩，形状不规则，且出现致密浓染的颗粒，有一些细胞核内还可见新月体荧 光，有部分细胞核且裂解成碎块，初步推测白芥子挥发油通过诱导肿瘤细胞凋亡 以抑制肿瘤细胞生长。 ( 3 ) 应用免疫组织化学法检测可得白芥子挥发油大、中、小剂量组与n s 组相比，各剂量组b a x 的表达都显著提高，而b c l - 2 的表达则受到一定程度的抑 制，且提高与抑制的作用都呈现剂量依赖关系，给药组b a x b c l 2 比率升高。因 此推测白芥子挥发油能够调节肝癌h 2 2 小鼠中b a x 与b c l 2 的表达而促进肿瘤 细胞凋亡，从而达到抑制肿瘤细胞增殖的效果。 ；童il鼍-i_ 目录 目录 摘要兽i a b s t r a c t i i 中文文摘。 目勇之 第一章绪论1 1 1 白芥子挥发油的化学成分1 1 2 i t c s 的研究概况一1 - 1 2 1i t c s 的来源1 - 1 2 2 芥子苷酶2 1 2 3i t c s 结构2 1 2 4i t c s 的化学性质3 1 2 5i t c s 的测定方法3 1 2 6i t c s 化学防癌作用的研究3 1 2 7i t c s 对肿瘤细胞抑制作用的研究7 一 1 2 8i t c s 化学防癌机制9 1 2 9i t c s 对肿瘤细胞的抑制机制1 0 1 2 1 0i t c s 的基因毒性1 2 1 2 1 1i t c s 的其它作用13 1 3 课题的研究内容与意义1 4 1 4 技术路线16 第二章白芥子挥发油提取工艺优化及其化学成分鉴定1 7 2 1 材料与方法17 2 1 1 材料17 - 2 1 1 1 实验材料17 2 1 1 2 药品1 7 2 1 1 3 仪器- 1 7 2 1 2 方法一17 2 1 2 1因素水平表的设计1 7 2 1 2 2 白芥子挥发油提取1 8 2 1 2 3 白芥子挥发油化学成份的分析1 8 2 2 结果1 8 2 2 1正交实验一18 2 2 2 验证实验一19 2 2 3 化学成份分析一2 0 一 2 3 讨论2 2 一 第三章白芥子挥发油对小鼠肝癌h 2 2 细胞的作用一2 3 3 1 白芥子挥发油对小鼠肝癌h 2 2 细胞的抑制作用2 3 - 3 1 1 材料。一2 3 3 1 1 1实验材料2 3 3 1 1 2 药品2 3 3 1 1 3 细胞株2 4 3 1 1 4 实验仪器2 4 - 福建师范大学吴圣曦硕十论文 3 1 2 实验方法2 4 3 1 2 1 细胞排染实验2 4 3 1 2 2m t t 法测定白芥子挥发油对h 2 2 细胞的抑制作用2 4 3 1 2 3 白芥子挥发油对h 2 2 细胞生长的抑制2 5 3 1 2 4数据处理2 5 3 1 3 实验结果2 5 3 1 3 1 细胞排染实验2 5 3 1 3 2 m t t 法测定白芥子挥发油对h 2 2 细胞的抑制作用2 7 3 1 3 3 白芥子挥发油对h 2 2 细胞生长的抑制j 2 8 3 1 4 讨论一2 9 3 2 白芥子挥发油对小鼠肝癌h 2 2 细胞抑制机制初探3 0 3 2 1 材料3 0 3 2 1 1 实验材料3 0 3 2 1 2 药品3 0 3 2 1 3 细胞株3 1 3 2 1 4 实验仪器3 1 - 3 2 2 实验方法3 卜 3 2 2 1 琼脂糖凝胶电泳31 3 2 2 2p i 单染检测细胞周期与细胞凋亡3 2 3 2 2 3 数据处理3 2 。 3 2 3实验结果3 2 3 2 3 1 d n a 琼脂糖凝胶电泳结果3 2 。 3 2 3 2 p i 单染结果3 3 3 2 4 讨论。3 4 第四章白芥子挥发油对小鼠移植性肿瘤h 2 2 的抑制作用及机制探讨3 7 4 1 白芥子挥发油对小鼠移植性肿瘤h 2 2 的抑制作用3 7 4 1 1 材料3 7 4 1 1 1 实验材料3 7 4 1 1 2 药品3 7 4 1 1 3 动物与细胞株3 7 4 1 1 4 实验仪器3 7 4 1 2 实验方法3 7 4 1 2 1 白芥子挥发油对h 2 2 腹水型小鼠生存寿命的影响3 7 4 1 2 2 白芥子挥发油对h 2 2 小鼠实体瘤生长的影响3 8 4 1 2 3 原位给药法检测白芥子挥发油对肝癌h 2 2 小鼠实体瘤生长 的影响。3 8 4 1 2 4 肿瘤组织细胞形态学观察3 8 4 1 2 5 统计学处理3 8 4 1 3 结果3 8 4 1 3 1 白芥子挥发油对h 2 2 腹水型小鼠生存寿命的影响3 8 。 4 1 3 2白芥子挥发油对肝癌h 2 2 小鼠实体瘤生长的影响4 0 4 1 ：3 3 原位给药法检测白芥子挥发油对肝癌h 2 2 小鼠实体瘤生长 的影响4 1 4 1 3 4 白芥子挥发油对h 2 2 小鼠瘤组织细胞形态学的影响4 2 釜ll匿，一-1 目录 4 1 4 讨论4 3 4 2 自芥子挥发油对肝癌h 2 2 小鼠细胞凋亡的影响4 4 4 2 1 材料。4 4 4 2 1 1 材料一4 4 4 2 1 2 药品4 5 4 2 1 3 动物和细胞株4 5 4 2 1 4 主要仪器4 5 4 2 2 方法。4 5 4 2 2 1 肿瘤细胞形态的吖啶橙( a o ) 荧光染色观察4 5 4 2 2 2 肿瘤凋亡相关基因b a x 、b c l 一2 表达的免疫组化分析4 5 4 2 2 3 统计学处理4 6 4 2 3 结果4 6 4 2 3 1 吖啶橙( a o ) 荧光染色结果4 6 4 2 3 2 小鼠肝癌h 2 2 实体瘤凋亡相关基因b a x 、b c l - 2 表达结果 一4 8 - 4 2 4 讨论。51 小结与展望5 3 一、结论5 3 二、本论文的特点5 4 三、展望5 4 参考文献5 7 攻读学位期间承担的科研任务与主要成果6 9 致谢7 1 个人简历7 3 j1_1 第一章绪论 第一章绪论 1 1 白芥子挥发油的化学成分 白芥子为十字花科植物白芥b r a s s i c aa l b a ( l o b o i s s 的成熟干燥种子，白芥子 豁痰利气，主治咳喘痰多，胸满肋痛，胃寒吐食，肢体麻木，寒湿痹痛，湿痰流 注，阴疽肿毒等，是一味本草纲目中早有记载的传统中药。 自芥子的主要化学成分有芥子苷、芥子碱、芥子挥发油等。芥子挥发油由白 芥子中的芥子硫苷通过芥子酶水解生成，通过水蒸气蒸馏法提取而得。其沸点为 1 4 8 1 5 4 。c ，密度为1 0 1 6 1 0 2 2 9 m l ，是无色至淡黄色的液体，有异常刺激的气 味，曝晒在日光下颜色会逐渐变为红棕色。 白芥子挥发油富含异硫氰酸盐类物质，其主成分为异硫氰酸烯丙酯( a i t c ) 。 陈密玉等通过g c m s 对白芥子挥发油的化学成份进行了分析，发现生白芥子提 取的挥发油中异硫氰酸烯丙酯( a i t c ) 含量为3 5 9 0 ，其他的化学成份基本为 异硫氰酸盐类( i t c s ) 1 1 2 。刘强等也测得生白芥子提取的挥发油中a i t c 含量 为8 1 6 6 【1 13 1 ，本文作者也对生白芥子挥发油的化学成份进行测定，测得a i t c 含量为8 9 4 1 ，其它成份也基本为i t c s 。由此以i t c s 的防癌抗癌作用为重点， 本文概述了i t c s 的研究情况。 1 2 i t c s 的研究概况 1 2 1i t c s 的来源 i t c s 通常由芥子油苷经由芥子苷酶水解而产生的，大量存在于各种十字花 科植物中，如萝b 、菜花、卷心菜、白芥、水田芥、甘蓝、辣根等。且芥子油苷 在各种十字花科植物干重所占的比例都达到1 以上 1 。芥子油苷在结构上基本 都是由1 个b - d 硫代葡萄糖基、1 个磺化肟基和一个侧链组成。芥子苷酶和芥子 油苷在十字花科植物中是储存于不同的细胞器当中，当植物体遇到降解或机械损 伤时，芥子苷酶与芥子油苷相遇，芥子苷酶就会切断1 3 一硫代葡萄糖苷键产生一 份子异硫氰酸盐从而发挥一系列的生理生化功能来抵御虫害，这就是所谓的“芥 子炸弹。在不同的十字花科植物中，芥子油苷的种类也不尽相同，根据调查， 在3 0 0 0 多种的十字花科植物中至少存在有1 2 0 多种的芥子油苷心1 ，可根据侧链r 的氨基酸来源不同，可以将芥子油苷分为脂肪族( r 来源于亮氨酸、异亮氨酸、 福建师范大学吴圣曦硕士论文 丙氨酸、缬氨酸以及蛋氨酸) 、芳香族( r 来源于酪氨酸、苯丙氨酸) 和吲哚族 ( r 来源于色氨酸) 口3 ，且r 基的不同导致了不同的芥子油苷可产生不同的异硫 氰酸盐，以下就是一部分十字花科植物中的油苷种类以及水解后产生的异硫氰酸 盐种类： 1 2 2 芥子苷酶 芥子苷酶除了存在于各种十字花科植物中外，也存在于哺乳动物组织、昆 虫、真菌、肠道细菌等当中“1 。且在不同的十字花科植物中，芥子苷酶还有着不 同的同功型，这些芥子苷酶的分子量( 1 3 0 - 1 4 5 k d a ) ，亚基数( 2 - 1 2 ) ，糖类含量 等各不相刚5 1 ，这就解释了在不同的十字花科植物中芥子苷酶要在不同的条件下 才能达到它的最高活力。影响芥子苷酶活性的因素主要有以下几点：温度、p h 、 l 一抗坏血酸浓度以及一些金属离子浓度。其中p h 在3 7 。c - 5 0 。c 之间，p h 在3 7 - 7 之间，l 一抗坏血酸浓度在0 2 8 - 5m m o l l 之间，可使不同十字花科植物中的芥子 苷酶达到最大的活力3 。 1 2 3i t c s 结构 异硫氰酸盐( i s o t h i o c y a n a t e s ) 是十字花科植物和芸苔属植物中天然存在 的一类化合物。现在发现的天然的或人工合成的i t c s 已经超过2 0 种，这些i t c s 有着或多或少的抗肿瘤活性口1 ，但是平时饮食中经常接触到并具有抗肿瘤活性的 i t c s 主要包括：异硫氰酸烯丙酯( a i t c ) 、异硫氰酸苯乙酯( p e i t c ) 、异硫氰酸 苄酯( b i t c ) 、莱菔硫烷( s f n ) 等1 ，都含有- n = c = s 结构。其结构式如下： a i t c ( 疆1 2 = c h - c h 2 1 i l 端g = s 第一章绪论 咒n b 1 1 妒舳s 矿班悯 胃 c 玛钒c 啦) n 驾 1 2 4i t c s 的化学性质 i t c s 的化学性质不太稳定，这是由于i t c s 分子中的- n = c = s 基团中的c 具有 高度的亲电性，能够与一些亲核试剂发生亲核加成反应，例如氨基、羧酸、羟基、 硫醇等。i t c s 的分解速度会随着温度的提高而上升，但是在温度低于一5 时， 分解会完全停止，且光线对其分解没有影响。室温下，i t c s 在中性有机溶剂如 丙酮中化学性质稳定，不易分解，但在中性或者碱性的水溶剂中，i t c s 会与水 分子中的o h _ 发生化学反应。 1 2 5i t c s 的测定方法 i t c s 的测定方法归结起来有5 种，即氧化还原法、重量法、紫外分光光度 法、比色法、气( 液) 相色谱法。常量分析中常用氧化还原法，微量分析及i t c s 的鉴定则常用液( 气) 相色谱法。近几年来，主要用到液( 气) 相色谱法、高速逆流 色谱法、超临界流体色谱法以及气质色谱联用、毛细管电泳以及毛细管电色谱来 定量分析i t c s 1 。姜子涛等提出许多测定i t c s 的方法，有哌嗪非水滴定法、二 硫代碳氨酸形成法、吗啉滴定法、氯胺一t 间接氧化法和有哌啶滴定法n 引。 s e k i y a m a 等报道了比色测定法，i t c s 在与n ，n 一二甲基对苯二胺反应后能够生 成红蓝色的复合物，且这种复合物在6 7 0 n m 和5 0 0 n m 处有最大吸收峰 i i o f a h e y n 2 1 等采用高速逆流色谱法分离纯化植物中的硫代葡萄糖苷。 1 2 6i t c s 化学防癌作用的研究 最近的一些研究表明，膳食中摄入i t c s 确实有降低癌症的风险n 3 1 制，其对 啮齿类动物肝癌、乳腺癌、肺癌、食道癌、前胃癌有明显的阻断作用n 5 。1 8 1 。 v e r h o e v e n 等从病例相互比较研究中得出十字花科植物可能预防胃癌、肺癌、结 肠和直肠癌的论断。i t c s 预防癌症的功能可能是通过抑制i 相酶的活性和诱导 i i 相酶的活性来实现的。w e y m a r n i n 们等比较了1 1 种i t c s 对p 4 5 02 a 6 和2 a 1 3 的作用，发现这些化合物对2 种酶均有不同程度的灭活作用，但当药物浓度为 1 0um o l l 时，仅b i t c 对p 4 5 02 a 1 3 具有显著抑制作用。对p 4 5 02 a 6 的灭活 福建师范大学吴圣曦硕士论文 则需要更高的浓度和更长的作用时间。 a i t c 在体内是i i 相解毒酶强有力的诱导物，在每天2 0 0i lm o l l 的剂量下， 老鼠的肝脏、肾、脾、肺、膀胱、胃、十二指肠、空肠、回肠、盲肠和结肠中 q r 或g s t 活性显著提高。其中膀胱的作用效果最明显，在每天喂养1 0 | lm o l l 的情况下，q r 和g s t 的活性都有明显提高。s f n 是各种诱导物中诱导i i 相酶能 力最强的化学预防物。有人用鼠做实验，每天每只喂养1 5 m m o l ls f n ，持续5 d ， 发现在肝脏、前胃、肺、小肠中q r 和g s t 含量有所增加乜引。 1 2 6 1i t c s 对肺癌的预防作用 w a t t e n b e r g 等发现b i t c 和p e i t c 可以抑制苯并芘及二甲基葸等致癌物质诱发 的肺肿瘤的发生。m a r k 将一种致癌物质4 一( 甲基亚硝氨基) 一3 一吡啶一卜丁酮( n n k ) 加入到一组大鼠的饲料中，剂量为每只每天8 8m g 。另外，一组在加入n n k 的同时 加入p e i t c 。结果发现单纯加入n n k 的大鼠肺肿瘤诱发率为8 0 ，而对照组为4 3 。这个实验结果进一步被h e c h t 所证实，h e c h t 将n n k 和苯并芘同时加入到大鼠 的饲料中，每8 周投用1 次，总量各为2 41 tm o l 。对照组在加入n n k 和苯并芘的同 时，加入b i t c 及p e i t c 。结果实验组的大鼠肺腺瘤为6 1 5 个只，而对照组为0 1 1 个只；在处死雄性f 3 3 4 大鼠f i j - 6 或2 4 d 时给动物一次剂量i t c s ，其肝、肺和鼻粘 膜微粒体的n n k 氧化作用降低。p e i t c 比b i t c 的作用更强。处死h 0 2 4 t j 、时一次给予 i t c s ，使小鼠肺微粒体n n k 氧化降1 氐4 0 - 8 5 瞳；j i a o 等心2 1 研究i t c s 对n n k 所致a j 鼠肺癌模型的抑癌作用，发现2 一己基异硫氰酸酯( 2 - h e x y li s o t h i o c y a n a t e ) 优于 卜己基异硫氰酸酯( 1 - h e x y li s o t h i o c y a n a t e ) ，l ，2 一二苯乙基异硫硫氰酸酯( 1 ， 2 - d i p h e n y l e t h y li s o t h i o c y a n a t e ) 优于2 ，2 一二苯乙基异硫氰酸酯( 2 ， 2 - d i p h e n y l e t h y li s o t h i o c y a n a t e ) 。 l o n d o n 等瞳3 1 在1 9 8 6 - 1 9 9 7 十年间调查了中国上海男性肺癌患病率、吸烟及尿 中i t c s d t c s 水平之间的关系( 在体内，i t c s 被代谢成二硫代氨基甲酸盐( d t c s ) 。 在调查的1 8 2 4 4 名男性中，有2 3 2 人患肺癌，其中8 9 7 是吸烟者，在与之配对的 7 1 0 例对照人群中，5 5 6 是吸烟者；尿中检淝u i t c d t c 的个体患肺癌的风险降 低( 相对危险度o 6 5 ) ，但i t c d t c 的浓度与肺癌发病并无剂量反应关系。i t c d t c 与肺癌患病风险的相关性在具有谷胱甘肽硫转移酶m 1 ( g s t m l ) 缺失的基因表型 的个体( 特别是同时存在g s t m i 矛h g s t t i 缺失的个体，肺癌患病危险度0 2 8 ) 中表现 的尤为明显。s p i t z 等采用回顾性流行病学方法研究了膳食i t c 摄入与肺癌发病之 间的关系。他们调查了5 0 3 例新诊断为肺癌的病例以及4 6 5 例正常对照人群。用食 第一章绪论 物频率调查问卷的半定量法估计正常人群和肺癌患者在一年前摄入i t c s 的情况。 结果发现，肺癌患者平均摄入i t c s 的水平( ( 0 4 7 o 5 1 m g 1 0 0 0 k c a l ) 明显低于对 照组人群( o 5 8 0 8 4 m g 10 0 0 k c a l ) 。 动物实验发现芳烃类i t c ( a r y l a l k y l - i t c ) ，能抑$ 1 j n n k 和n 一亚硝基甲基苄胺 ( n m b a ) 诱导的啮齿类动物肺癌和食管癌的发生乜钔。不过特定的i t c s 只特异抑制某 一种或某一类致癌物活化。例如，p e i t c 是n n k 一诱导a j d , 鼠肺癌发生的有效抑 制剂，对b ( a ) p 诱导的a j d , 鼠肺d n a 力n 合物的形成和肺癌发生则无作用嗌3 。 另通过实验研究发现丁基异硫氰酸酯和戊基异硫氰酸酯可以抑制苯并芘及 二甲基葸等致癌物质诱发的胃癌和肺肿瘤的发生。t a n i d a 等发现在老鼠的食物 中加入日本辣根粉能够预防由致癌物质甲基硝基胍引起的肠胃肿瘤。 据研究发现，对a j 小鼠给肺腺癌致癌剂2 0 周可使小鼠1 0 0 产生肺腺瘤，在 2 1 - 4 2 周在饲料中加入1 5 m m o l k g 的s f n ，可以发现实验对照组肺腺癌发生率为 4 2 ，而s f n 组仅为2 0 ，结果可推测s f n 对早期肺部损伤的吸烟者有一定程度 的预防作用晗7 1 。 1 2 6 2i t c s 对膀胱癌的预防作用 d o m i n i o u e 等在1 9 8 6 - 1 9 9 6 年对诊断为膀胱癌的2 5 2 名男性进行了跟踪调查， 调查结果表明，各种水果和蔬菜以及水果蔬菜的颜色以及水果蔬菜胡萝卜素的含 量与膀胱癌的患病危险性均无关系，只有十字花科植物的摄取量与患病危险性呈 现负相关。 罗斯韦尔帕克研究所调查，一个月吃3 次以上生的十字花类蔬菜，如花椰 菜、卷心菜和菜花，可以降1 氐4 0 患膀胱癌危险。日本与新加坡等一些国家居民 罹患膀胱癌的概率显著低于其它国家，可能与其大量进食辣根密不可分砼羽。研究 人员调查了2 7 5 名患有膀胱癌患者和8 2 5 名正常人的日常饮食习惯。主要包括这些 患者在诊断出膀胱癌以前摄入十字花蔬菜情况、吸烟习惯以及其他与癌症危险有 关的因素。研究者发现，在忠膀胱癌和摄入生十字花蔬菜之间有明显的负相关性。 与吸烟、每月摄入生蔬菜少于3 次的人相比，非吸烟、每月摄入3 次以上生蔬菜的 人膀胱癌发病率减少7 3 。 o g a w a 等发现p e i t c 和b i t c o 邑明显增加致癌物诱导的f 3 4 4 大鼠膀胱上皮的异 常增生和膀胱癌的发病几率；在不给致癌物的条件下，单单从饲料中掺人一定比 例的p e i t c 或b i t c ，连续3 2 周，p e i t c 或b i t c 所处理的动物都出现了膀胱上皮的异 常增生，并且其中一些动物还发展成为膀胱癌乜9 | 。o k a z a k i 等认为，在有致癌物 福建师范大学吴圣曦硕士论文 质诱导的情况下，p e i t c 能够抑制膀胱癌的发生；而不加入致癌物质，单独存在 较高浓度的p e i t c 的条件下，却引起了膀肤上皮的异常增生汹3 。 1 2 6 3i t c s 对乳腺癌的预防作用 有报道称西兰花中的i t c s 能明显降低乳腺癌的发生率。f o w k e 等b 在上海乳 腺癌研究中心收集了3 3 7 例患者在术前，禁食状况下的晨尿样本，按l ：1 配对法收 集对照人群的晨尿样本。经统计学处理发现，乳腺癌患者和对照人群尿中i t c d t c 的浓度有显著差别( 分别为1 7 1 和2 3 1i jm o l m g ) 。尿中i t c d t c 的水平与乳腺癌 发病呈负相关。 对雌性s d 大鼠的d m b a 诱癌实验中，饲料中加入b i t c o 0 6 m m o l g ，显著降低乳 腺肿瘤的发生率和肿瘤形成的数目，以及肾上腺坏死；在给d m b a 前2 4 小时给b i t c 或p e i t c ，可抑s u - 腺肿瘤的发生，但在给d m b a 2 4 d x 时后才给b i t c 或p e i t c 则无此 作用。b i t c 的作用最强；给d m b a 一周后喂大鼠含b i t c o 0 1 7 m m o l g 的饲料，抑制 d m b a 诱导乳腺肿瘤的发生2 33 | ；萝卜硫素( 一种自西兰花分离的i t c ) 可阻断乳 腺肿瘤的形成，在给d m b a 的同时给大鼠灌喂萝卜硫素5 天，肿瘤的发生率、数目 和重量都显著减少m 1 。 喂食雌性s d 大鼠含2 0 球芽甘蓝的饲料，具有预防乳腺癌的作用。在给d m b a 1 5 周后，对照组大鼠的肿瘤发生率为7 7 而实验组只有1 3 。一年后实验组的纤维 腺瘤发生率为6 7 开始时吃对照饲料，而在1 5 周后改喂球芽甘蓝饲料的大鼠的发 生率为9 0 口副。 1 2 6 4i t c s 对肝癌及结肠癌的预防作用 b a s t e n 等的研究从m r n a 水平和蛋白水平证实了s f n 可诱导人肝癌细胞 h e p g 2 ，人结直肠腺癌细胞