（应用化学专业论文）硅胶表面D苯丙氨酸分子印迹聚合物的制备及吸附性能研究.pdf

哈尔滨_ t 程人学硕+ 学位论文 摘要 分子印j 姒, ( m o l e o a l a ri m p r i n t i n gt e c h n i q u e ，i v l n 3 是种制备对特定分子具有 专识别性能的聚合物伽o 】锨l l a ri m p r i n t i n gp o l y m e r ，m 哟的技术。它是将功能单 体在模板分子( 又称印迹分子) 的存在下，交联聚合，然后洗脱除去模板分子，这 样制得的聚合物，在立体空穴和功能基排布上与目标分子具有互补的结构。分子印 迹聚合物对模板分子的识别具有预定性、专性和实用性等优点而在分离、提纯、 免疫测定、生物模拟以及痕量分析等领域显示出广阔的应用前景。 本文以n 苯丙氨酸( d p h e n y l a l a n i n ) 为模板分子，甲基丙烯酸( m a a ) 和二 乙烯基吡啶( 2 - v _ p ) 为功能单体，以乙二醇二甲基丙烯酸酯( e d m a ) 为交联剂， 乙腈为溶剂，采用硅胶表面接枝的方法制备d 苯丙氨酸分子印迹聚合物，并对分子 印迹聚合物的吸附性能进行了初步研究。 以n 苯丙氨酸为模板，e d m a 为交联剂，m a a 和2 - v p 为功能单体，乙腈为 溶剂，采用硅胶表面接枝分子印迹技术，合成了不同比例的n 苯丙氨酸分子印迹聚 合物。考察了功能单体、交联剂、溶剂配比，温度，反应时间等各种因素的影响。 分别通过红外光谱和扫描电镜等对印迹聚合物的组成、含量和外貌进行了分析， 结果说明分子印迹聚合物成功地接枝到了硅胶表面。 紫外分光光度法研究表明，n 苯丙氨酸分子印迹聚合物在有机溶剂中有很好吸 附的能力，聚合物对d 苯丙氨酸的最大吸附量为2 2 0m 拒。 根据吸附热力学和吸附动力学表明，此聚合物对模板分子的吸附较好的符合 l a n g m u i r 单分子层吸附模型，对模板分子的吸附具有较高的分配系数。 关键词：分子印迹；硅胶表面接枝；n 苯丙氨酸；吸附；机理研究 哈尔滨r t 程大学硕士学位论文 m o l e c u l a ri m p r i n t i n gt e c h n i q u e i sb e c o m i n gi n c r e a s i n g l yr e c o g n i z e da sa p o w e r f u lt e c h n i q u eo fp r e p a r i n gs y n t h e t i cp o l y m e r st h a tc o n t a i nt a i l o rm a d er e c o g n i t i o n s i d e sf o rc e r t a i nm o l e c u l e s t h ep r o c e s so ft h ep r e p a r a t i o nc o n s i s t so f ：( 1 ) m i x i n gt h e t e m p l a t em o l e c u l e sw i t ha n t hm o n o m e r sw i t ha p p r o p r i a t ef u n c t i o n a lg r o u p s , ( 2 ) l o w t e m p e r a t u r ep h o t op o l y m e r i z a t i o n , ( 3 ) e x t r a c t i n gt h et e m p l a t em o l e c u l e sf r o mp o l y m e r , w h i c hl e a v e sc a v i t i e s i n s i d et h e p o l y m e r s t h a ta r ec o m p l e m e n t a r yi nt e r m so f s i z e , s h a p e , a n df u n c t i o n a lg r o u po r i e n t a t i o nt ot h o s eo ft h et e m p l a t em o l e c u l e s i th a s a l l e x t e n s i v ea p p h c a t i o ni np u r i f i c a t i o n , i m m 啪缀y , e n r i c h m e n t , b i o m i m i c sa n do t h e r r e l e v a n tf i e l d sf o ri t s p r e d e t e r m i n a t i o n , s p e c i f i c i t y a n d p r a c t i c a b i l i t y o fm o l e c t d e r e g n i t i o n am o l e c u l a r l yi m p r i n t e dp o l y m e r ( m i p ) w a ss y n t h e s i z e ds u c o e s s f u l l yt h r o u g h g r a f t i n go fm o l e c u l a r l yi m p r i n t e dp o l y m e ro ns i l i c as u p p o r t sb yu s i n gd - p h e n y l a l a n i na s t e m p l a t e s , m e t h a c r y l i ca c i da n d2 - e t h e n y lp y r i d i n ea sa f u n c t i o n a lm o n o m e ra n de t h y l e n e g l y c o ld i m e t h a c r y l a t ea sc r o s s l i n k e r t h em o l e c u l a r l yi m p r i n t e dp o l y m e r ( m i p ) b a s e d o r t h es u r f a c eo fs i l i c aw a sc h a r a c t e r i z e db yi ra n ds c a n n i n ge l e c t r o nm i c r o s c o p y ( s e m ) t h e a d s o r p t i o nb e h a v i o ro fd - p h e - m i pw a sp r e l i m i n a r i l yi n v e s t i g a t e da n d t h em a xa d s o r p t i o n i s2 2 0 r a g g , t h er e s u l ta l s os h o w st h a tt h i sm o l e c u l a r l yi m p r i n t e ds i l i c am i c r o s p h e r e sp r e p a r e di n t h i st h e s i sa d s o r bt h et e m p l a t ei nt h ew a yo fl a n g m u i r a n dt h e r ei sad e c r e a s eo fe n t h a l p y d u r i n gt h ea d s o r p t i o np r o c e s s w h a t sm o r e , t h e s em i c r o s p h e r e sa l s oh a v eh i g hp a r t i t i o n c o e f f i c i e n tt ot e m p l a t em o l e c u l e m o l e c u l a ri m p r i n t i n g ；s i l i c ag r a f t i n g ；d - p h e n y l a l a n i n a b s o r p t i o n ； m e c h a n i s mr e s e a r c h 哈尔滨工程大学 学位论文原创性声明 本人郑重声明：本论文的所有工作，是在导师的指导下，由 作者本人独立完成的。有关观点、方法、数据和文献的引用己在 文中指出，并与参考文献相对应。除文中已注明引用的内容外， 本论文不包含任何其他个人或集体己经公开发表的作品成果。对 本文的研究做出重要贡献的个人和集体，均已在文中以明确方式 标明。本人完全意识到本声明的法律结果由本人承担。 作者( 签字) ：藕鲁九黎 日期： 娜7 年6 月j 孑日 哈尔滨工程大学 学位论文授权使用声明 本人完全了解学校保护知识产权的有关规定，即研究生在校 攻读学位期间论文工作的知识产权属于哈尔滨工程大学。哈尔滨 工程大学有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件。 本人允许哈尔滨工程大学将论文的部分或全部内容编入有关数据 库进行检索，可采用影印、缩印或扫描等复制手段保存和汇编本 学位论文，可以公布论文的全部内容。同时本人保证毕业后结合 学位论文研究课题再撰写的论文一律注明作者第一署名单位为哈 尔滨工程大学。涉密学位论文待解密后适用本声明。 本论文( 囹在授予学位后即可口在授予学位1 2 个月后口 解密后) 由哈尔滨工程大学送交有关部门进行保存、汇编等。 作者( 签字) ：蒋狄黎 日期：2 卯了年6 月f 8 日 导师( 签字) ：孝缸髟 2 p 口7 年6 月j 8 日 哈尔滨t 程大学硕十学位论文 1 1 前言 第1 章绪论 近几年来，随着生命科学研究的进展，利用生物亲和作用分离蛋白质等 生物大分子的亲和纯化技术得到迅速发展，亲和分离方法如亲和色谱、亲和 膜分离、亲和沉淀等日渐成为生物工程下游技术中最有效的分离子段之一。 亲和作用就是以生物分子间特异、专一和可逆的亲和作用为基础，生物 分子间特异、专一和可逆的亲和作用是整个生物学普遍存在和特有的现象 【1 5 】，广泛存在于不同的生物大分子之间，例如抗原与抗体之间，蛋白酶与蛋 白质底物之间等。这种专一性就意味着在分离生物活性物质时、必须制备出 专用的吸附剂，在大多数情况下很少有可以相互套用的亲和吸附剂，并且， 自然界存在的亲和作用毕竟是有限的，难以满足种类繁多的尘物产品分离和 纯化的要求，亲和配基的筛选和制备也是相当困难的，另外，还存在配基的 偶联和载体的活化问题，操作过程中还要注意条件温和以不破坏配基的空间 构形及活性，否则都将影响分离效果。 科学工作者们积极探索其他的途径来发挥该技术选择性高的优势。除了 自然配基外，利用化学合成的方法来构建亲和配基，这一技术的发展使亲和 分离突破了自然界亲和力的局限，例如：利用冠醚、环糊精等分子的特殊结 构对手性物质构建出特异亲和位点，进行识别和分离。但这需要在分子构形 和合成方而付出巨大的努力，并且产品成本太高。 9 0 年代发展起来的一种亲和技术分子印迹( m o l e c u l a ri m p r i n t i n g ) 技 术提供了另一种制备分离介质的方法，良好的综合性能使这种技术的发展极 具潜力。 分子印迹技术( m o l e c u l a ri m p r i n t i n gt e c h n i q u e ，也称模板印迹技术) 是从 仿生角度，采用人工方法制备对特定分子( 模板分子) 具有专一性结合作用聚 合物的技术【甜0 1 。这二种聚合物被称为分子印迹聚合物( m i p s ) 。已在分离提纯 哈尔滨t 程大学硕十学位论文 1 1 - 1 4 】、免疫分析【1 5 】、酶模拟1 1 6 】以及生物模拟传感器【1 7 】等方面显示出广泛的应 用前景，成为新世纪最具潜力的新材科之一【1 8 】，m i p s 也因此被誉为“万能的 分子识别材料”。 分子印迹技术的思想起源【1 9 刎可以追溯至l j f i s c h e r 的“锁和钥匙 、p a u l i g n 的“抗原一抗体以及d i c k e y 的“专一性吸附”的概念。然而，很长一段时 间内没有引起人们的重视。到了二十世纪七十年代，随着w u l 卿m o s b a c h 等 人开创性的工作，使得分子印迹技术得到了突飞猛进的发展，并在世界范围 内掀起了研究热潮。目前，全世界有十几个国家上百个学术和研究机构正在 从事分子印迹聚合物的研究及开发工作，发表的论文和申请的专利数目也与 日剧增。2 0 0 1 年，在各种国际科技期刊上发表的有关m 坤的论文超过三百篇。 m i p s 之所以发展如此迅速，主要是因为它有三大特点【2 1 , 2 2 l ：预定性 ( p r e d e t e r m i n a t i o n ) 、识别性( r e c o g n i t i o n ) 和实用性( p r a c t i c a b i l i t y ) 。预定性决定 了人们可以根据不同的目的制备不同的m i p s ，以满足各种不同的需要；识别 性是因为m i p s 是按照模板分子( t e m p l a t em o l e c u l e ) 定做的，它具有特殊的分 子结构和官能团，能选择性地识别模板分子；其实用性表现在它与天然的生 物分子识别系统如酶与底物、抗原与抗体、受体与激素相比，具有抗恶劣环 境的能力，表现出高度的稳定性和长的使用寿命，且制备过程较简单。 1 2 分子印迹作用过程 分子印迹技术是制备具有分子识别能力聚合物的技术。具体制备过程如 图1 1 所示。将具有特定形状和大小的需要进行识别的分子作为模板分子，同 具有官能团的功能单体相互作用，在交联剂的作用下形成高度交联的具有大 孔、网状的聚合物，其内部包埋与功能单体相互作用的模板分子，然后利用 物理或化学方法将模板分子洗脱，这样聚合物母体上就形成了与模板分子空 间匹配的具有多重作用点的空穴。这样的空穴便可以与待分离混合物中的模 板分子进行特异性的亲和作用，从而达到分离、纯化的目的。如果模板分子 可以反复洗脱和吸附，则该分子印迹聚合物可以多次使用。 2 哈尔滨下程大学硕士学何论文 c r o s s l i l x k e r 。p 。o 。l 。y 。t 。n 。e 。r 。i 。z 。a 。1 t 。i 。o 。n c o l n p l e x 篇f ：嚣嚣： s e l f - a 辎蛐l b l yla p p r o a d i o 朗 l t l | o l l o l n e f t a r g e tm o l e c u l e 臼 图1 1 分子模板聚合物制备过程示意图 分子印迹聚合物的制各一般需要三种物质。一是待分离、识别物质的纯 品，否则就不能得到具有特异亲和性的聚合物。如果这种物质较为难得或价 格昂贵，那么这一点就成为该技术的一个潜在的缺点。一般每克聚合物干体 需5 0 5 0 0 比m o l 的模板分子，在洗脱过程中可回收再利用。二是带有官能团的 聚合物单体。比较常用的是丙烯酸、丙烯酞胺和苯乙烯类，对某些金属鳌合 反应还常常是制备具有分子识别功能的高分子聚合物，但天然聚合物如蛋白 质也可作为单体对其他分子进行印迹。三是交联剂。为了得到高度交联的聚 合物，目前最有效的交联剂是二甲基丙烯酸乙二醇酯和三甲基丙烯酸丙三甲 醇酯等带有二醇或三醇结构的丙烯酸酯类。对于苯乙烯类聚合物单体而言， 二乙烯苯的同分异构体则是经常使用的交联剂。 这三种物质在一定的条件下进行溶液聚合或悬浮聚合得到的聚合物经洗 脱后便是带有分子印迹的聚合物。这种聚合物应具有如下特点才能得到较好 的亲和分离效果：( 1 ) 具有一定的刚性，以确保分子印迹聚合物在应用过程中 保持模板分子的空间构型和互补官能团的位置，从而具有高度的选择性；( 2 ) 具有一定的柔韧性以确保亲和动力学尽快达到平衡；( 3 ) 亲和位点的可接近 性；( 4 ) 机械稳定性以使分子印迹聚合物能在高压下应用；( 5 ) 热稳定性使分子 印迹聚合物能够承受高温并有利于亲和动力掣矧。 3 哈尔滨丁程大学硕士学位论文 1 3 分子印迹聚合物的制备方法 近年来，m i p s 的制备有了很大发展，己经有无定型粉末、整体柱、球形 和膜等多种形态。 1 3 1 分子印迹制备技术的分类 根据模板分子同聚合物单体官能团之间作用形式的不同，分子印迹技术 可以分为共价键法和非共价键法。 1 3 1 1 共价键法 共价键法又称预组装法( p r e o r g 锄i z a t i o n ) ，是由德国的w u l f ：f 【7 】及其同事在 2 0 世纪7 0 年代初创立的。在此方法中，模板分子同聚合物单体以可逆的共价 键相互联接。聚合后再通过化学途径将共价键断裂除去模板分子，从而得到 分子印迹聚合物。共价键作用的优点是聚合中能获得在空间精确固定排列的 结合基团。在分子印迹聚合物的应用过程中，依实验条件的变化使共价键形 成和断裂，从而实现对模板分子的吸附与解附。很显然，由于这种形式中经 历共价键的形成和断裂，而共价键作用力一般较强，所以需要能量比较高， 在印迹分子自组装或识别过程中结合和解离速度慢，难以达到热力学平衡， 不适于快速识别。在水解过程中需要加入催化剂，操作条件比较苛刻，适用 的范围比较狭窄，而且识别能力和生物识别差别很大，因此这种方法发展缓 慢。 1 3 1 2 非共价键法 非共价键法又称自组装法( s e l f - a s s e m b l i n g ) ，由瑞典的m o s b a c h 及其同事 在2 0 世纪8 0 年代后期创立。在此方法中，模板分子与功能单体之间自组织排 列，以非共价键自发形成具有多重作用位点的单体模板分子复合物，经过交 联聚合后这种作用保存下来。常用的非共价键作用有：金属鳌合作用、电荷 转移以及范德华力等，以氢键、静电引力、疏水力、偶极力应用最多。总之， 非共价键作用的种类较多，在制备分子印迹聚合物及其后续过程中，使用一 种作用相互结合制得的分子印迹聚合物的选择性较低，而使用多种作用相互 4 哈尔滨t 程大学硕士学何论文 结合制得的分子印迹聚合物则具有较高的选择性和分离能力。一般通过酸性 聚合物单体的羧酸官能团或磺酸官能团与模板分子的氨基、酰基等形成静电 力和氢键。由于这种方式普遍、简单的特点而成为分子印迹技术中较重要的 一种形式。 除了上述两其本类型外，另外还有一种技术综合了两者，即聚合时单体 与印迹分子问作用力是共价键，而在对印迹分子的识别过程中，二者的作用 是非共价的【2 4 , 2 5 】。印迹分子胆固醇与单体4 乙烯基苯碳酸酯共价结合后，通 过水解使共价结合部断裂形成酚羟基，在分子识别中通过氢键结合胆固醇。 1 3 2 分子印迹制备方法 分子印迹聚合物的制备方法包括本体聚合、分散聚合、沉淀聚合、悬浮 聚合、表面印迹法、原位聚合等技术。 1 3 2 1 传统方法( 本体聚合) 分子印迹聚合物研究的早期几乎均采用本体聚合的方法。即将印迹分子、 功能单体、交联剂和引发剂按一定比例溶解在惰性溶剂( 通常是氯仿可甲苯) 中，然后移入一玻璃安培瓶中，采用超声脱气，通氮气除氧，在真空下密封 安培瓶，经热引发( 6 0 0 c ) 或紫外光照射( 在室温下波长通常为3 6 6 姗) 引发聚合 2 4 h 得到块状聚合物，再经粉碎、研磨和筛分，得到适当大小的粒子，洗脱除 去印迹分子，经真空干燥后即成。此方法制备的m i p s 具有满意的“记忆功能 对印迹分子有良好的选择性和识别特性，而且合成操作条件易于控制，实验 装置简单，便于普及。其缺点：( 1 ) 后处理过程繁杂，研磨过程中会不可避免 地产生一些不规则粒子和相当大量的过细粒子，这些过细粒子需经过沉降除 去，因而费时费力，使产量大大降低，通常小于5 0 。( 2 ) 不规则粒子的柱效 率较低。( 3 ) 大规模生产有困难。( 4 ) 由于交联度很高，模板的除去很困难，报 道的最高值为9 0 ，但通常低于此值，这对于以贵重药品为印迹分子的体系 来说价格过高。( 5 ) 印迹点在合成过程中被包埋在聚合物内部，使得其利用率 低，表现为低的吸附量。 1 3 2 2 分散聚合 5 哈尔滨t 程大学硕十学位论文 此法是将模板分子、功能单体、交联剂溶于有机溶剂中，然后将溶液移 入水中，搅拌，乳化，最后加入引发剂交联、聚合，可直接制备粒径较均一 的球形分子印迹介质。该法制备的聚合物是一类新的、有用的载体粒子，粒 子为纳米级( 5 0 5 0 0 n m ) ，这类材料的显著特点是表面积大，遗憾的是，纳米 材料对色谱来说很难直接使用。因此，既有大的表面积又适合色谱应用的材 料非常引人注目。 m o s b a c h 等首先利用分散聚合法制得微球形分子印迹聚合物，他们制备 了一系列全氟代高聚合物表面活性剂( p f p s ) ，收到了很好的效果。该方法的 特点是可以得到形状规则的微球，并可通过调节乳化剂的用量控制粒径在 1 2 5 # m 。整个制备过程都是在非极性体系中进行的，因此产物较适合应用于 非极性环境中，其制备的关键是分散剂和惰性分散体系的选择【2 6 】。 1 3 2 3 沉淀聚合 虽分散聚合法的效果好，但其制备过程非常复杂，且所需的分散剂和惰 性分散体系非常昂贵，所以无法推广。后来y e 2 7 1 等在原有的技术上，采用一 种制备简便、成本低、高产率和印迹效果也很好的沉淀聚合法，制各了平均 粒径分别为0 3 z m 和0 2 # m 的m i p s ，并印迹了茶碱和雌二醇。 1 3 2 4 悬浮聚合 m a y e s i 冽等提出了悬浮聚合法的方法，它是制备聚合物微球最简便最常 用的方法之一，用与一般有机溶剂皆不互溶的全氟烃为分散介质，加入特制 的聚合物表面活性剂使印迹混合物形成乳液，聚合后得到粒度范围分布窄， 形态规则的m i p s 颗粒。通常使用的单体是疏水性的，所以连续相常用水或高 极性的有机溶剂。但对于分子印迹聚合物的合成而言，这些溶剂是不适宜的。 因为高极性溶剂会极大地降低功能单体与印迹分子间相互作用的数量与强 度，从而影响聚合物对印迹分子的识别能力；另一方面酸性单体在水中的溶 解度过高，使单体与交联剂间的无规则共聚很难进行，并且水溶性印迹分子 会在水相中损失，所以很难用水相悬浮聚合制备分子印迹聚合物。采用全氟 化碳液体作为悬浮介质，代替传统的有机溶剂水悬浮介质，从而根除了非共 6 哈尔滨工程大学硕十学位论文 价印迹中存在的不稳定的预组织合成物。乳液( 悬浮) 聚合方法主要优点有：( 1 ) 解决了硅胶表面修饰分子印迹制备对象单一的缺点；( 2 ) j 匿过对初始聚合阶段 工艺条件的控制，可得到尺寸均一，有良好机械性能的聚合物颗粒，无需粉 碎和筛分，能保证得到的印迹聚合物的物理和化学性能。但该法由于聚合体 系中有水的介入，所以目前还只能局限于共价键型m i p 合成。2 0 0 1 年，y e 等 【冽系统总结了乳液( 悬浮) 聚合制备分子印迹各种方法的优缺点。 1 3 2 5 表面印迹 表面印迹，先将模板分子与功能单体在有机溶剂中反应形成加合物，然 后将此加合物与表面活化后的硅胶、硅烷偶联剂、粒子和玻璃介质反应嫁接， 这样获得的分子印迹聚合物解决了传统方法中对模板分子包埋过深或过紧而 无法洗脱下来的问题。w u l f f 等【3 3 】应用表面印迹法制得了分子印迹材料。通过 对粒子表面进行修饰制备分子印迹聚合物材料是一个较好的方法。这种方法 最大的优点是可以利用粒子的机械稳定性，通过对粒子本身性能的调节来适 应应用的需要。由于载体具有较高的孔度和表面积，因而选择表面印迹方法， 可以使底物较易接近活性点，这是表面印迹法优于其它聚合方法的一个方面。 除此之外，这种方法还可以单独改变载体树脂的交联度或对孔结构进行调整， 通过合成可以容易地得到小粒径及窄分布的载体。近几年，很多学者都把更 多精力致力于开发新的合成方法和工艺，总的来说都可以归结为表面分子印 迹技术，它主要涉及2 个重要领域：( 1 ) 基于硅胶表面修饰的分子印迹技术；( 2 ) 基于乳液( 悬浮) 聚合物为载体的分子印迹技术。硅胶表面修饰技术的优点主 要有：( 1 ) 聚合过程中，硅胶表面的修饰基团通过价键距离控制，只有对应底 物才有强烈识别作用，可极大降低非特异吸附对选择性的影响；( 2 ) 采用线性 无机聚合物为载体，在应用时可极大暴露印迹作用的表面积，减少“包埋 现象。 s u l i t z k y 等 3 4 】最近报道了一种新的基于硅胶表面修饰的m 口制备方法，利 用硅胶颗粒表面含有活泼自由基团进行m 坤的薄膜表面接枝技术。利用这项 技术制备了形状规整，厚度均一的l 苯基丙氨酰替苯胺的m i p ，这种m i p 能显 7 哈尔滨t 程大学硕七学位论文 著改善动力学性质、提高柱容量以及传感器响应能力。h p l c 实验表明，这种 m i p 多孔颗粒，柱效取决于接枝聚合物的数量。他们制备的硅胶接枝聚合物 薄膜( 薄膜平均厚度0 8 n m ) 平均孔径1 0 m m ，在分离印迹对映体苯基丙氨酰替 苯胺时显示了极高的柱效和当量塔板数( n = 7 0 0 m ，n = 2 4 0 0 0 m d ) 。同时还表 明，平均孔径1 0 0 r i m ，薄层厚度3 1 8 r i mm i p 的饱和吸附量远远大于用传统方 法制备的块状m i p 的吸附量。 1 3 2 6 原位聚合 m a t u s u i 等首先将原位聚合用于分子印迹技术中，他们直接在h p l c 柱内 制备连续棒型聚合物，并用于对应异构体的分离，收到了很好的效果。 s c h w e i t z 等采用原位聚合法在毛细管中制备得到了电泳色谱用的连续单分散 均m i p ，该产物可用于对应体( r ，s ) 一心得安( ( r ，s ) - p r o p r a n o l 0 1 ) 的分离。这种方 法是在色谱柱内直接合成的，避免了封管聚合的研筛过程，实验过程大简化， 且一旦聚合反应条件适当，制备色谱柱的成功率非常高。但是其聚合反应程 度却难以控制，若反应时间太长，合成聚合物太致密则会使色谱柱的流动力 学性质差，柱压高，流速慢，而若聚合时间过短，则合成的聚合物中选择性 结合位点太少又会使色谱柱的柱效低。 1 4 分子印迹聚合物原材料 制备m 口至少需要以下这几种原材料：模板分子、交联剂、适当的溶剂， 多数情况下还需要功能单体。 1 4 1 模板分子 根据所要识别的化合物的结构和性质，模板分子可以是低分子化合物、 低聚物、金属离子或金属络合物，也可是分子聚集体，习惯上统称它们为模 板分子。应用较多的有糖类及其衍生物，氨基酸及其衍生物、蛋白质、核酸、 激素、杀虫剂、酶或辅酶、药物、染料和多肤等 1 4 2 交联剂 8 哈尔滨工程大学硕十学位论文 交联剂的聚合物( 聚合物母体) 的结构对制备分子印迹聚合物起着非常重 要的作用。因为模板孔穴的识别性能是由模板分子和聚合物链的固定排列共 同决定的，因此聚合物结构的优化极为重要。聚合物母体应具备如下性能： 1 ) 有足够的硬度，以便模板除去后孔穴能保持形状而不变形。 劲有较高的柔顺性，以使它们能与嵌入的底物迅速达到平衡。 3 ) 可制成特定的形态，要求既有尽可能高的交联度，又有良好的底物可 近性。 钔有良好的热稳定性，以便于在对动力学有利的高温条件下使用。 5 1 有良好的机械稳定性，以便于高压或搅拌环境下使用。 1 4 2 1 有机聚合物 目前，聚合物母体基本上都采用多孔的有机聚合物。有机聚合物母体可 以是缩聚物，也可以是加成聚合物，在实际中应用较多的是交联剂的烯类聚 合物，这些聚合物一般是无规则网络结构，内部有模板印迹，在这种模板印 迹孔穴内有固定排列的结合位点。 交联烯类聚合物母体主要有凝胶型和大孔型网络结构两种。在溶剂作用 下，凝胶型聚合物母体会变软、变脆，而且随着硬度的增加，在良性溶剂中 的溶胀度会随着交联度的增加而迅速降低，这很不利于传质。因此，这类聚 合物不宜用作模板聚合物。 具有大孔型网络结构的聚合物在实际中应用较多。因为多孔体系对于溶 剂、模板和模板类似物进入网络内部较为容易。这种材料的孔径可达 1 0 6 0 r i m ，这足可使一般模板分子在孔穴内自由扩散。 图1 2 所示为一些常用的交联剂的分子结构式。实际中应用最多的是烯类 交联剂二甲基丙烯酸乙二醇酯( e d m a ) 和三羟甲基丙烷三丙烯酸酯( t r i m ) ， 这些交联剂的聚合物一般具有大孔型网络结构，交联度高，稳定性好，且网 络内部传质过程较为容易。 9 哈尔滨丁程大学硕十学位论文 c o o h 榭心 o v v v 叶 v 舳 o o 0 ( 一c 一伽一洲2了一c 一佣一佣2 一c h 。一 岛一。一童一重兰c h 。h 一睇一 c h 一2g 。一。一0 9 一g c h ： 一洲2 一i 一岛_ 一。一c c 2 洲2 明一h 2 c 一i r o 一芒一已2 c h 2 c h 2 。一i 一伽一洲2 。一i j 一曲一c h 2 。 图1 2 几种常用交联单体的结构式 1 4 2 2 无机载体表面及内部孔穴 在固体材料( 如硅胶) 表面进行修饰是获得母体材料的一种行之有效的 方法。这类母体材料的选择性取决于孔穴的形状和孔穴内功能基团的排列， 而与母体本身关系不大。通常用自组装体系进行无机固体表面的修饰，即首 先在硅胶或载体玻璃上吸附一层硅烷和修饰过的模板混合物，并用化学方法 结合成硅氧烷，然后用溶剂溶解除去模板。这样在硅烷分子的网络内留下了 印迹孔穴。这样的材料优先吸附模板分子，但对模板分子的类似物也有较强 的吸附作用。无机载体也可以是金、二氧化锡、二氧化锆【3 9 】等。 1 4 2 3 生物高分子 1 0 j = 。 哈尔滨下程大学硕十学位论文 蛋白质和糖等生物高分子也可作为分子印迹聚合物母体材料。将部分变 性的蛋白质经模板修饰后可制得带有新型酶活性中心的产物，或在亚甲基兰 存在下用腈脲酰氯交联水溶性的淀粉，除去亚甲基兰后得到的不溶产物均可 作为母体。在大量外加的功能底物存在下，把溶解在水中的蛋白质冷冻干燥， 然后再用有机溶液除去模板分子或用直链淀粉与有机络合剂制备了直链淀粉 的包络化合物，用腈脲氯进行分子内和分子间的交联，可得不溶的络合物， 所得的这些产物对模板分子都有较高的选择性。 1 4 3 功能单体 功能单体的一端能和交联剂间体共聚，而另一端则能和模板分子结合， 它是制备m i p 的关键。一般要求功能单体与交联剂必须具有很好的共聚性能， 因为交联剂的自聚体由于不具有识别基团而没有分子识别作用，而功能单体 的自聚体由于其交联度太低也无法形成真正有效的印迹孔穴，因此只有两者 的共聚体才是聚合物中的有效部分。另一方面，功能单体与模板的结合力要 适中，因为结合力过大则模板分子难以洗脱，而过d , m u 孑l 穴对模板分子的选 择效率不高。图1 3 所示为几种常用的功能单体，其中应用最广泛的是甲基丙 烯酸( m a a ) ，它分子内除具有一个碳碳双键外，还有一个羟基，可以以离子 键与氨基发生作用，也可和酰胺、氨基甲酸酯和羧基化合物产生氢键作用。 因而，当模板分子中含有氨基、脂肪醇、脂肪氨等基团时，心是极为适合 的功能单体。带有双键的胺类和吡啶类也是性能优异的功能单体，如丙烯酰 胺、乙烯基吡啶等。这些化合物可以和交联剂发生共聚使n 原子“挂在”聚 合物链上，这此n 便可以和带有c o o h 或o h 的模板分子以氢键或离子键结 合。近来，以双丙烯酰胺为功能单体的分子印迹聚合物亦有报道。其特点是 在极性溶剂中也有较强的氢键作用，这是甲基丙烯酸等所不具备的。 功能单体可以用一种也可以用多种，例如p i l e t s k y 等【删等把二甲基丙磺酸 酰胺和环糊精作为双功能单体，印迹了苯基丙氨酸；t a k e u c h i 等【4 1 j 以甲基丙 烯和2 ( 三氯甲基丙烯酸) 作为双功能单体制备了分子印迹聚合物。采用多个功 哈尔滨丁程大学硕+ 学位论文 能单体的优点是聚合物与模板分子的作用力较强，选择专一性较好。 h o 丙烯酸 a c r y l i ca c i d 4 乙基苯乙烯 4 - e t h y ls t y r e n e 1 乙烯基咪唑 1 - e t h y l e n ei m i d a z o l e n h 2 o 丙烯酰胺 a c r y l a mi n e 1 4 4 溶剂或分散剂 0 h o 甲基丙烯酸 m e t h a c r y l i ca c i d n h o 4 乙烯基苯甲酸 h 0 m e 0 甲基丙烯酸甲酯 m e t h y lm e t h a c r y l a t e 乌头二酸 h 4 一e t h y l e n eb e n z o i ca c i dm e t h y l e n eu t a n ed i o i ca c i d 4 乙烯基吡啶 4 - v i n y lp y r i d i n e n h 2 , 6 二丙烯酰胺基吡啶 2 , 6 - b i s a c r y l a m i d ep y r i d i n e 图1 3 常用的功能单体结构式 2 乙烯基吡啶 2 - v i n y lp y r i d i n y f 3 c h o 三氟甲基丙烯酸 t r i f l u o r i n ec t h a c r y l i ca c i d 聚合过程中所用的溶剂或分散剂对聚合过程、后续处理以及实际应用都 有一定的影响【1 5 l 。选取溶剂时应尽可能减小它对模板分子与聚合物的键合作 哈尔滨工程大学硕士学位论文 用的不利影响。使后续处理( 如抽提) 尽可能地简单易行。目前，常把聚合 环境分为水相和非水相两大类。 非水相中，常用的溶剂主要有二氯甲烷、氯仿、丙酮、甲苯等。 一般情况下若以氢键作为主要结合作用，则溶剂应尽量采用非极性的。 因为极性溶剂( 尤其是水) 会大大削弱模板分子与聚合物的相互作用，从而 使聚合物的选择性大大降低，甚至消失。因此迄今为止，大部分的印迹过程 都是在有机溶剂中完成的。在非水相中结合得到的m i p 在用于非水环境中时 较为有利，但用于水性环境中分子识别却存在诸多缺点。首先，在制备m 口 时，由于受聚合环境的影响，亲水性基团在聚合物表面的分布较少，当功能 单体为亲水性时就会大大降低功能单体的结合作用。其次，由于聚合物表面 上带有大量的亲油性基团，当分离的底物为亲水性时，底物与m i p 的结合以 及向m 口内部传质都会受到阻碍，这也会严重影响m i p 的使用性能。所以用于 水相环境中的分子印迹聚合物最好是在水性体系下印迹得到的。 1 5 分子印迹聚合物识别性能的表征 分子印迹聚合物性能的表征到目前还没有一个统一的理论描述，主要原 因是分子印迹聚合物的应用范围非常广泛，在不同的应用领域中，可以有不 同的表征方法，例如在色谱固定相、手性分离和固相萃取应用中，一般用分 离系数a 【4 2 】、分离度r s 4 3 1 、保留时间t r 、结合常数k d t 删、离解常数k a 4 5 】和富 集系数【拍】等来表征m i p 的选择性的好坏。采用的仪器方法有高效液相色谱 ( h p l c ) 、质谱( m s ) 、核磁共振波谱( n m r ) 、傅立叶变换红外光谱( f t i r ) 和紫 外光谱( u v ) 等；而在化学传感器的应用中，则需要借用各种电化学参数如电 流、电容、电导、电压以及各种光学参数和质量参数如光强度和质量等来表 征。在催化应用领域中则以催化效率、反应速度、结合量等参数来描述分子 印迹聚合物的催化活性。 1 5 1 高效液相色谱法 高效液相色谱法( h p l c ) 是应用最广泛的测试m i p 分子识别性能的方法。 】3 哈尔滨| t 程大学硕十学位论文 该方法的操作过程是，将处理好的m p 作为固定相装入色谱柱内，用洗提液 洗提，然后将含有模板分子的溶液或混合物注入色谱柱内，从扫描仪所记录 的图像来分析聚合物对模板分子选择性的大小。目前，气相色谱法和毛细电 泳色谱法( c e c ) 也有所应用，c e c 在一定程度上改善了液相色谱中吸收峰峰宽 较大、强度较弱以及拖尾现象严重等缺点i 弘4 9 1 。 利用高效液相色谱分析的前提条件是被测物要有确定的紫外吸收，若该 物质没有确定的紫外吸收便不能用高效液相色谱进行分析。 1 5 2 电势测定法 这种方法f l 了m o s b a c h 等【5 0 】提出，其原理是当液体沿固体表面流动时会产 生流动电位，液体浓度的变化将影响流动电位的大小。因此，根据所测定流 动电位的大小即可得知液相浓度的大小，在特定条件下，就可以确定液相内 溶质和固定相之间的亲和作用的大小。其操作过程是，将模板聚合物装入流 通池，用含有模板分子的溶液或混合物进行洗涤，由电位计读出流通池两端 的电压，再推算聚合物的识别性能。 与色谱法相比，电势测定法具有更宽广的适用范围，它能测定某些色谱 法所无法测定的物质。 1 5 3 傅立叶变换红外光谱和核磁共振法 利用傅立叶变换红外光谱和核磁共振法可以确定在洗脱了模板分子之 后，印迹孔穴内留有的与模板分子相互作用的结构单元。但是这两种方法不 能用于确定m i p 对模板分子的识别选择性。因此，近来该法的应用不多。 1 6 分子印迹聚合物的应用 m i p 具有制作简单、成本低廉且坚固耐用、适用范围广等优点，而被誉 为“万能的分子识别材料 。这些优点使之能够替代天然的或通过其它方法 获取的具有分子识别性能的材料，如抗体等。在过去的一段时间里分子印迹 聚合物的应用研究主要集中在以下几个方面： 1 4 哈尔滨t 程大学硕十学位论文 ( 1 ) 在色谱分析中的应用；( 2 ) 生物传感器；( 3 ) 用于手性拆分；( 4 ) 抗体和 受体模拟物；( 5 ) n 相萃取：( 6 ) 催化方面。 1 6 1 色谱分析中的应用 分子印迹技术在高效液相色谱中的应用是目前研究最多的一个领域。用 于色谱分析主要有以下两方面的工作：样品前处理( 分离、提纯、浓缩) 和手 性物质的分离【2 3 1 。 分子印迹聚合物作为吸附剂，真正用于试样的前处理是s e l l e r 野e n 【4 6 1 于 1 9 9 4 年首先报道的以他合成的五咪( p e n t a m i d i n ，一种抗原虫菌药) 为印迹的印 迹聚合物，该聚合物作为吸附剂完成了对生物液体试样尿中五咪的提取、纯 化和浓缩，使之达到能够直接检出的浓度。最近z a n d e r 等【5 1 】人报道了他们的 最新工作，他们以尼古丁作为印迹制备的分子印迹聚合物，在分析口香糖中 所含的尼古丁及尼古丁氧化物时得到了非常高的回收率和良好的重现性。他 们制备的聚合物在选择性上明显优于传统的g 1 8 吸附剂和没有印迹反应的同 种聚合物。迄今为止，分子印迹技术结合固定相色谱对分析样品进行前处理 的研究已作了很多工作。许多研究表明分子印迹聚合物可以从有机溶剂和水 中选择吸附底物。但是，对于不同物质，不同的溶剂( 极性、非极性) 其吸附 条件和洗脱条件都是十分不同的。尚没有发现一个普适规律。 1 6 2 生物传感器敏感材料 化学或生物传感器，都是由识别元件和与其紧密接触的转换器组成的， 它将对分析物产生的应答信号转变成输出信号。关于环境检测、生物医疗、 食品分析等的传感器都是将生物分子( 如酶、抗体) 作为其特异识别元件。 由于生物分子物理化学稳定性差，这导致了人造受体得到了广泛重视。分子 印迹聚合物用作传感器的敏感材料是分子印迹技术的一个重要研究方向。分 子印迹聚合物敏感材料与近年来研究较热的生物敏感材料相比，具有耐高温、 高压、酸、碱和有机溶剂，不易被生物降解破坏，可多次重复使用，易于保 存等优点。而且，较生物材料易得，可以用标准的化学方法合成出来。因此： 1 s 哈尔滨工程大学硕士学能论文 分子印迹聚合物有希望成为取代生物材料的理想替代品【5 2 5 4 1 。 1 6 3 手性拆分 近来，分子印迹手性拆分工作发展迅速【5 ”9 1 。目前市场上大约有5 0 0 多种 旋光性药品，而9 0 被作为外消旋混合物管理，而手性混合物是一种旋光性 药品，往往具有毒副作用。正是基于这一事实，这些年来，一些国家食品和 药物管理局对新的手性药品提出了要求，对映体必须被分离和分别管理，并 进行各自的毒理和药理实验。这就要求提高分离技术，大量研究表明，分子 印迹能满足这一技术要求。k e m p e 等以( s ) 萘普生为印迹分子制备分子印迹聚 合物用于萘普生消旋混合物的拆分，得到了很好的效果，分离度为0 8 3 。另 外该种聚物还很好地区分了与萘普生结构相似的布洛芬和酮洛芬。m i p s 也用 于某些几何异构体的分离。其拆分方法已不仅限于i - i p l c 。所研究的拆分对象 包括药物、氨基酸及其衍生物、肽及有机酸。能将手性混合物拆分，并易于 实现商业化、规模化。总之，目前虽有不少问题有待解决，但分子印迹聚合 物用于手性拆分的前景是不容否定的。 1 6 4 抗体和受体模拟物 印迹聚合物被研究的另一个应用领域是它作为抗体和受体模拟物的适用 性。研究发现，m i p s 具有类似于抗体或受体的高度特异识别性，因此可被用 来代替抗体而用于免疫测定中。许多分子印迹聚合物的吸附实验都是基于竞 争性放射配体结合这一原理的。如以茶碱和镇静剂为印迹的印迹聚合物显示 了惊人的专一性识别能力【删。当这些印迹聚合物被用于竞争性实验时，对于 结构相近的物质的结合能力或者完全没有，或者远低于与印迹分子的结合能 力抗茶碱印迹聚合物完全能够区分印迹分子和结构上非常相似的咖啡因，而 茶碱和咖啡因化学结构上只有一个甲基的区别，用一般的方法是很难把两者 区分开的。更惊人的是这些分子印迹聚合物与这些药物的单克隆抗体的交叉 反应几乎是相同的。抗茶碱分子印迹聚合物用于检测病人血浆样品中茶碱的 含量是完全符合医学检测要求的。这证明印迹聚合物抗体和受体完全可以作 1 6 哈尔滨t 程大学硕十学位论文