（生物化学与分子生物学专业论文）纳米技术固定化纤维素酶的研究.pdf

湖南大学硕士毕业论文 摘要 纤维素酶是一组具有纤维素降解能力酶的总称，它们协同作用分解纤维素。游离纤 维素酶生产成本高，酶活力相对较低，并且容易失活。固定化纤维素酶稳定性高，方便 回收利用，可以有效降低应用成本。微乳化方法是制备纳米颗粒的有效手段，通过选取 合适油水相和表面活性剂，可以形成油包水型微乳液，水相液滴作为固定化酶纳米颗粒 生长的反应室，通过控制微乳液的液滴粒径从而制备出合适大小的固定化酶纳米颗粒。 本文探索了两种微乳法固定纤维素酶的方法，其中微乳冻融法以p v a 1 , f e 2 0 3 体系 为固定化酶颗粒的骨架，加入纤维素酶后形成的混合溶液作为水相，以硅油为油相，用 油包水微乳化方法，通过微乳分散形成的固定化反应室，进而通过反复冻融的方法对纤 维素酶进行固定。实验证明不同比例的p v a 和 t - f e 2 0 3 会影响固定化颗粒中的粒径大小 和表面电荷。当p v a 和t - f e 2 0 3 的质量比为5 0 时，固定化酶颗粒的粒径最小采用表 面活性剂s p a n 8 0 、物理冻融一次的体系可以获得较佳效果，其酶活力残留率达到8 3 9 。 制备的固定化酶颗粒性良好、粒形完整、粒径在3 0 0 r i m 左右。与游离纤维素酶相比，微 乳冻融法获得的固定化酶对于机械剪切作用有很强的耐受能力，并具有良好的协同作 用。 在微乳冻融法的基础上，本实验进一步探索微乳戊二醛交联法对固定化酶的影响。 同样以1 , - f e 2 0 3 p v a 纤维素酶混合液作为水相，以硅油为油相，用戊二醛作为p v a 的 交联剂，采用油酸油酸钠复合表面活性剂，油包水微乳化方法制备固定化酶颗粒。制 备出的固定化酶的酶活力残留率有4 6 3 。颗粒粒径在3 0 0 n m 左右，粒形完整，结构紧 密。实验数据显示此种固定化酶的p h 稳定性有了很大的提高，球磨机实验结果显示微 乳戊二醛交联法制备出的固定化酶对机械剪切力有很强的耐受性。 实验证明采用两种方法制备出的纤维素酶固定化颗粒，粒径在3 0 0 n m 左右，分散 性良好，酶活残留率在5 0 左右或更高，在球磨机试验中表现出良好的协同性和机械力 稳定性。由于骨架中含有1 - f e 2 0 3 纳米颗粒，可以在每次应用后用外加磁场方便的回收 有很好的工业应用前景。 关键词：纤维素酶；固定化；微乳液；交联 i i 湖南大学硕士毕业论文 a b s t r a c t c e l l u l a s ei sas e to fe n z y m e sw h i c ha r ea b l et od e g r e g a t et h ec e l l u l o s et o g e t h e r l y 。t h e f r e ec e l l u l a s eh a sh i 。9 1 1c o s to fp r o d u c t i o n ，l o we n z y m ea c t i v i t y , a n dl i a b l et oi n a c t i v a t e t h e i m m o b i l i z e dc e u u l a s ei sf i r ma n de a s yt or e e y c l e m i c r o e m u l s i o ni sag o o dw a yt op r e p a r a t e i m m o b i l i z e dn a n o - p a r t i c l e s t h ew om i c r o e m u l s i o nc a l lb ef o r m e db yc h o o s i n gp r o p e ro i l p h a s e ，w a t e rp h a s ea n ds u r f a c t a n t t h ew a t e rp h a s ed r o p l e ti sj u s t t h er o o mw h e r et h e i m m o b i l i z e dn a n o - p a r t i c l e sa r eg r o wu p t h u st h e s i z eo fn a n op a r t i c l ec a nb ec o n t r o l l e d t h r o u g hd o m i n a t i n gt h es i z eo ft h em i c r oe m u l s i o n sd r o p l e t i nt h i sp a p e rt w om e t h o d so ft h ei m m o b i l i z a t i o no fc e l l u l a s eb ym i c r o e m u l s i o na r e e x p l o r e d f i r s tt h em i c r o e m u l s i f i e da n df r e e z e - t h a w i n gm e t h o d ，s y s t e r mp v a 吖- f e 2 0 3i st h e f r a m e w o r k , t h a nt h em i x t u r eo fp v a - ? - f e 2 0 3a n dc e l l u l a s ea c ta sw a t e rp h a s e ，s i l i c o n eo i la c t a so i lp h a s e ，a l lo ft h e md i s p e r s et of o r mm i e r o e m u l s i o n ，o fw h i c ht h es t r u c t u r ec a nb ef i x e d b yf r e e z e t h a w i n g t h ep r o p o r t i o no fp v aa n d - f e 2 0 3c a l li n f l u e n c et h es i z ea n dc h a r g eo f t h ei m m o b i l i z e dc e l l u l a s e w h e nt h em a s sr a t i oi s5 0 ，t h es i z ei sm i n i m u m t h er e s i d u a lr a t e o fe n z y m ea c t i v i t yc a na c h i e v et o8 3 9 w h e nw eu s es u r f a c t a n ts p a n s 0a n df r e e z e - t h a w i n g o n e t i m e t h eg r a i ns i z eo ft h en a n op a r t i c a li sa b o u t3 0 0 n m ，m f c e l l u l a s eh a sg r e a ta b i l i t yt o t o l e r a n tt h em e c h a n i c a ls h e a rs t r e s s o nt h eb a s eo fm f - c e l l u l a s e ，t h em e t h o do fm i c r o e m u l s i f i e da n dg l u t a r a l d e h y d e c r o s s l i n k e dc e l l u l a s ew a sf u r t h e re x p l o r e d t h em i x t u r eo fp 、後吖一f e 2 0 3a n dc e l l u l a s ea c ta s w a t e rp h a s e ，s i l i c o n eo i la c ta so i lp h a s e , g l u t a r a lp e n t a n e d i a la c ta sc r o s s l i n ka g e n t , o l e i c a c i d s o d i u mo l e a t ea c ta ss u r f a c t a n t ，a l lo ft h e md i s p e r s et of o r mm i c r o e m u l s i o n t h er e s i d u a l r a t eo fe n z y m ea c t i v i t yc a l la c h i e v et o4 6 3 ，t h eg r a i ns i z eo ft h en a n op a r t i c a li sa b o u t 3 0 0 n mw h i c hh a sn o r m a ls h a p ea n dc l o s ei n s t r u c t i o n t h em g c e l l u l a s eh a sg r e a tp h s t a b i l i t ya n dh i g ht o l e r a n c e t ot h em e c h a n i c a ls h e a rs t r e s s t w om e t h o d sa r eu s et op r e p a r a t ei m m o b i l i z e dc e l l u l a s e t h eg r a i ns i z eo ft h en a n o p a r t i c a l i sa b o u t3 0 0 n m t h er e s i d u a lr a t eo fe n z y m ea c t i v i t yc a na c h i e v et oa b o u t 5 0 ，o r m o r e t h ep a r t i c a lo fi m m o b i l i z e dc e l l u l a s ep o s s e s sh i 曲t o l e r a n c et ot h em e c h a n i c a ls h e a r s t r e s s t h ep a r t i c a lc a nb er e c y c l e de a s i l yt h o u g hm a g n e t i cf i e l d ，a si tc o n t a i n s 丫- f e 2 0 3 k e yw o r d s ：c e l l u l a s e ；i m m o b i l i z a t i o n ；m i e r o e m u l s i o n ；c r o s s l i n k i i l 湖南人学硕_ i ：毕业论文 1 1 课题背景 1 1 1 生物燃料 第一章绪论 随着石化燃料由短缺变枯竭，寻找新的能量来源关系到经济的可持续发展乃至人类 的生存问题，利用可再生资源生产液体燃料以代替石油是世界上许多国家优先发展的目 标发展的推动力在于获得一种安全和可持续的能源供应以及希望减少温室效应。在未 来的2 0 年里欧盟计划把生物乙醇作为一种主要的可再生性生物燃料，欧盟颁布了一项 政策鼓励生物燃料的使用，目标是以能量计算，生物燃料对汽油和柴油的替代量在2 0 0 5 年达到2 ，到2 0 1 0 年增加到5 7 5 。 目前几乎所有的生物乙醇都是采用所谓的第一代生产技术即由糖或淀粉类农作物 生产的在过去的3 0 年里用玉米淀粉和甘蔗生产乙醇作为经济上可行的汽油添加物 已经发展了起来在美国生物乙醇生产的原料是玉米，大约1 3 的玉米被用来生产乙醇 仅次于畜禽饲料用玉米和玉米出口在过去的5 年里，美国的乙醇产量已经从每年1 7 5 亿加仑增加到去年的约4 5 亿加仑，而且依然以每年高于2 5 的速度增长。尽管这种乙 醇的生产成本也具有竞争力但是原材料的供给却不能满足对燃料乙醇日益增长的要 求，预计在不久的将来，使用糖和淀粉作为生物燃料的原料与直接利用他们作为食物和 动物饲料之间的竞争将会加剧目前在美国淀粉乙醇的最大产量将会达到每年1 2 0 亿至 1 5 0 亿加仑，。而美国每年消耗大约1 4 0 0 亿加仑石油，迫切需要其他可发酵糖资源用以生 产乙醇此外，使用糖基和淀粉基乙醇所减少的温室气体的量也没有达到预期的目标。 解决这一难题最可取的方法是采用第二代技术，即利用木质纤维素原料，如农业废 弃物( 麦草，甘蔗渣，玉米秸秆) 和林业废弃物( 木屑，疏伐剩余物) 等来生产生物乙 醇。这些原料资源丰富，而且生产的温室气体排放量很低，减轻了对环境的影响。木质 纤维素具有将来成为主要的可发酵糖资源的潜力。估计仅仅在美国每年就可以获得十亿 吨以上的农作物及森林残余物，这些生物质可以代替高达3 0 的美国全部汽油消耗量。 纤维素乙醇生产中关键的一步是将半纤维素和纤维素水解为单糖，利用纤维素酶将 纤维素水解为葡萄糖是最有发展前景的方法之一。图1 1 给出了酶法水解木质纤维素原 料生产乙醇的简化流程图。木质纤维素原料生产乙醇主要包括以下几个步骤：纤维素、 半纤维素的水解，发酵，木质素残余物的分离，乙醇的回收和浓缩，废水的处理。其中 两个转化步骤是关键：纤维素、半纤维素水解为糖以及所有糖的发酵i l j 。 湖南人学硕 ：毕业论文 1 1 2 纤维素的结构 图1 1 生物质生产乙醇的简略流程m t l l f i g1 1t h ef l o w c h a to f e t h a lp r o d u c e df r o mb i o m a s s 【1 i 纤维素是当今世界最丰富的可再生高聚物。据估计，通过光合作用每年合成的纤维 素达到1 0 l l 一1 0 1 2 t ，有些纤维素的纯度很高，比如棉花纤维，但大多数木本植物细胞壁 中的纤维素与木质素和其他多糖( 也称半纤维素) 结合的。 纤维素是一种多分散的线性均聚物，由葡萄糖通过1 3 1 , 4 糖苷键串联而成的线状长 链分子( 见图1 2 ) ，分子的聚合度变化很大，一般为3 0 0 0 1 0 0 0 0 个葡萄糖残基。天然纤 维素中葡萄糖分子内部和分子之间都彼此形成氢键，使得很多纤维素分子共同组成结晶 结构，进而组成复杂的基元纤维、微纤维、结晶区和无定性区等纤维聚合物的超分子结 构。一个纤维素中的大分子排列次序，就其整个结构而言并非均一的，其中有排列次序 较低的区域( 即不定形区) ，以及高度晶体化的区域( 结晶区) 。结晶结构赋予纤维素聚 合物刚性和高度水不溶性，不易被稀酸或碱水解【2 】。通过广角x 射线衍射( w i d e a n g l e x r a ys c a t t e r i n g ，w a x s ) ，或嵋cc p m a s n m r 光谱分析，通常可以估算高度有序区域内 多聚物的相对含量。纤维素结晶度( 通常4 0 至6 0 ) 的范围很广，这与样品的来源和 前处理有关。 2 湖南大学硕上毕业论文 图1 2 以1 3 1 ，4 糖苷键连接而成的纤维素分子1 2 1 f i g1 2t h ec e l l u l o s ef o r m e db yp 1 , 4 g l y c o s i d i cb o n d i 2 1 纤维素化学的典型大分子问题，就是链的降解。纤维素在化学或物理因素下发生功 能基转化，聚合度下降并引起葡萄糖基中碳碳键、碳氧键断裂，直至完全裂解转化， 生成各种小分子化合物。纤维素降解方式有水解( 酸解、酶法降解) 、氧化降解( 高碘 酸盐、二氧化氮、次氯酸钠、过氧化氢) 、机械降解( 球磨、超声波搅拌) 、热降解、 光化学降解( u v 、高能辐射) 等。 i 1 3 纤维素酶的分类及作用方式 纤维素酶的主要来源是微生物，自然界中大量而广泛地存在着能降解纤维素的微生 物，它们种类繁多，包括细菌、真菌和放线菌等。目前，用于生物质处理的商业化酶制 剂都来源于真菌，因为这类微生物能以高生产率产生具有高催化效率的复杂的酶混合 物，适应低成本酶供应的需要。其中酶活力较强的菌种为木霉属( t r i c h o d e r m a ) 、曲霉 属( a s p e r g i u u s ) 和青霉属( p e n i c i l l i u m ) ，特别是绿色木霉( t d c h o d e r m a v i r d e ) 及其近 缘菌株等较为典型，是目前公认的较好的纤维素酶生产菌1 3 j 。 在三级结构的研究中，人们发现纤酶分子是由球状的催化结构域通过一个富含p r o 和，或羟基氨基酸( s e r ，t h r ) 的连接桥( 1 i n k e r ) 和纤维素结合结构域这三部分组成。如 图1 3 所示整个酶分子呈楔形，球状核区表示了包含催化位点和底物结合位点的c a t a l i t i c d o m a i n 区，b 区代表了高度糖基化的连结桥( 1 i n k e r ) ，a 代表纤维素结合结构域1 4 1 。 i 矗 图1 3 纤维素酶三级结构示意图1 4 l f i 9 1 3t h et e r t i a r ys t r u c t u r eo f c e l l u l a s e l 4 i 湖南大学硕士毕业论文 、目前最广泛使用的用于生物质水解的商品化酶制剂由腐生嗜温真菌瑞氏木酶 ( t r i c h o d e r m ar e e s e i ) 深层发酵生产【5 1 。tr e e s e i 纤维素酶系的核心成员有3 类酶组成： 主要由两种纤维二糖水解酶( c e l l o b i o h y r o l a s e ，c b h ，也称c l 酶或微晶纤维素酶) 组成 的外切葡聚糖酶，多种内切葡聚糖酶( e n d o g l u c a n a s e ，e g ，也称c x 酶，c m c 酶) ， 以及p 一葡萄糖苷酶( d g l u c o s i d a s e ，b g ) ( 图1 4 ) 。两种纤维二糖水解酶c b hi 和c b h i i 约占分泌蛋白混合物的6 0 和2 0 ，是高效水解纤维素的关键垆j 。c b hi 和c b h l l 分 别从纤维素链的还原端和非还原端持续水解，释放葡萄糖的二聚体纤维二塘。内切 葡聚糖酶( e gi 至i v ) 约占分泌蛋白的1 5 ，水解纤维素链内部的p 1 ，4 键，产生的 新的还原性和非还原性末端随后被c b h 攻击。p 葡萄糖苷酶( b gi 和b g i i ) 约占分 泌蛋白混合物的0 5 ，可将纤维二塘和其他短链纤维糊精水解为葡萄糖。这三种组分 虽各有专一性，但相互之间又具有协同作用，具有结晶结构的纤维素就是在它们三者的 协同作用下被降解的1 7 1 。 n r 图1 4 e - f 维素水解主要酶示意刚 f i 9 1 4t h ee n z y m e - h y d r o l y s i n go fc e l l u l o s e 【7 】 纤维素用黑色圆点组成的叠层的链表示，r 表示还原端，n r 表示非还原端。两个主要的纤维素 酶c b hij f n c b hi i 持续从链的还原端和非还原端攻击纤维素链，释放纤维二塘。另外3 种主要内切葡萄 糖酐酶e gi 、i i 幂n l i i 随机攻击纤维素链，两种1 3 一葡萄糖苷酶( b g ) 把c 洲水解释放的纤维二糖水解 为葡萄糖。三角形代表酶的纤维素结合结构域，箭头表示其他假定的蛋白组分，它们通过破坏纤维 素晶体结构辅助纤维素酶对纤维素的降解作用u 1 。 在一个典型的糖化过程中，水解速率初始很快，但随后会迅速降低，从而导致葡萄 糖的的率低，水解时间长。大多数情况下，还会造成由于原料不完全水解而生成的抗性 4 湖南大学硕上毕业论文 残留物的积累。这与酶和底物两方面的因素有关。与水解有关的原料因素有：木质素和 半纤维素组分的存在阻碍了酶的作用：纤维素的结晶度、聚合度：可反应的纤维素表面 积的大小。已经研究的与酶相关的因素有：在混合和高温过程中由剪切力和温度导致的 失活：由于原料的物理性质使得酶组分发生分离作用而引起的酶损失；反应体系中纤维 二塘和葡萄糖的积累导致的产物抑制。 由于游离纤维素酶存在成本高，催化效率低、稳定性差等缺点，极大地影响了其工 业化发展通过固定化技术提高纤维素酶的催化效率和稳定性则有可能改善这种局面。 1 2 国内外研究状况 1 2 1 酶的固定化研究 游离酶虽然在现代化工工业中得到了广泛应用，但是由于存在一些缺点：溶液酶与 产品分离困难，无法充分利用l 溶液酶稳定性差：溶液酶易随产品流失，并会影响产品 的质量，从而限制了它的应用范围【8 】。为了解决这些问题，2 0 世纪6 0 年代出现了固定 化技术1 9 6 9 年千烟一郎用固定化氨基酞化酶拆分d l 氨基酸，并投入工业生产，成为 世界上第一个将固定化酶技术得到了迅速发展和广泛的应用。固定化酶比游离酶具有较 好的稳定性，并且可以重复使用和回收又便于连续化操作，因而可以大大降低成本。 7 0 年代初，美国、日本开始进行纤维素酶固定化( i m m o b i l i z a t i o no fc e l l u l a s ，简称i c ) 的研究目前已有许多不溶性或可溶性载体被广泛用于纤维素酶的固定化，我国对l c 的研究，只在近些年才有少量报道。由于纤维素酶的底物纤维素是不溶性的，许多人都 认为要设计一种对它具有活性的固定化酶( i c ) 是非常困难的，但自从1 9 7 6 年美国v i e t h 用不溶性载体胶原蛋白成功地固定纤维素酶，获得专利后，给人们带来了希望，并开辟 了纤维素酶研究的新领域。1 9 7 7 年，k a r u b e 等曾报道用胶原蛋白纤维固定t r i c h o d e r m a r e e s e l 纤维素酶，在流动床式反应器中水解微晶纤维素，转化率达8 0 。1 9 7 8 年，b i s s e t t 报道，他获得的固定化a s p e r g i l l u sp h o e n i c sp - 葡萄糖苷酶活性半衰期从0 5h 延长到 2 5 2 h 1 9 8 0 年，r y u 又将a s p e r g i l l u s p h o e n i c sp - 葡萄糖苷酶用戊二醛固定在脱己酰几丁 质上。再加到木霉( t r e e s e 0 纤维素酶上，可明显提高葡萄糖的含量。还有人通过物理吸 附或共价结合等方法将真菌纤维素酶固定在皂土、矾土、陶瓷、硅石玻璃、海藻酸钙 胶粒，e d t a 纤维素和离子交换树脂等不溶性载体上，得到的固定化酶( i c ) 都不同程度地 保留了原酶的活性。 酶蛋白的构象与酶的活性密切相关，而酶的催化作用由其活性中心完成，因此在制 备固定化酶时，必须注意活性中心的氨基酸残基不发生变化，避免那些导致酶蛋白高级 结构破坏的操作，如高温、强酸、强碱等，固定化过程应尽量在温和条件下进行。固定 化酶的制备方法可分为以下四类，吸附法，包埋法，共价结合法和交联法，而固定化酶 湖南大学硕上毕业论文 载体的选择则取决于固定化方法和酶的性质。 1 2 1 1 基于吸附的固定化方法 基于吸附的固定化方法是最早发展起来的酶的固定化方法之一。最早采用此方法制 的的固定化酶之一是由n e l l s o n 和g r i f f i n l 9 1 在1 9 1 6 年报道完成的，他们发现以物理方 法吸附在木炭上的蔗糖酶仍然保持催化活力。最早应用于工业化过程的固定化酶是将氨 基酰化酶吸附在d e a e 纤维素上面而制的i l o l 。 尽管经过非共价结合的固定化方法很多，如非特异的物理吸附【i 、离子结合【l 2 1 、 金属螯合【1 3 1 和亲和吸附1 4 1 等，但吸附法固定化酶法技术可以分为以下类型：非特异性物 理吸附：这些酶经过非特异性的结合力( 如范德华力、氢键和亲水作用) 被吸附；生物 特异性吸附：指给吸附酶提供配基的生物吸附；亲和吸附：指对染料或固定化金属的 离子吸附1 1 5 1 ；静电作用或离子结合作用1 1 6 1 ：是基于载体和酶之间的电荷和电荷的相互 作用。 过去的几十年里，吸附法固定化酶技术已被研究的很多，它主要具有以下优势：可 逆性，这不仅可以进行蛋白质的纯化，而且是载体可重复利用；简单性，可在温和的条 件下进行操作：与酶的共价固定化相比【1 7 】，吸附法固定化酶技术避免了化学修饰【1 8 】，更 有可能在很高程度上保持酶活力。然而通常采用此方法制的的固定化酶易于从载体中泄 露出去，这是由于酶和载体间的相互作用相对较弱，容易被高离子强度、p h 等破坏掉。 很多情况下酶可以被合适的载体牢牢的吸附，或者吸附较为稳定，足以满足再生产条件。 现在许多种变通方法被用来克服吸附法的固有缺陷，如交联吸附法、共价修饰吸附法、 选择性吸附共价交联法和吸附包埋法等。 1 2 1 2 基于共价结合的固定化方法 酶共价结合固定化是以共价结合方式将酶固定到一个合适的载体上。共价结合固定 化方法的研究从2 0 世纪5 0 年代开始盛行，现在已经成为酶固定化的一种重要方法。该 方法与基于非共价的、吸附作用的固定化方法相比，通常能给酶和载体之间提供最强的 结合力【1 9 1 ，因而共价结合固定化基质中酶漏出量是最小的。 酶与载体间的共价结合是基于化学反应，即酶表面( a ) 的活性氨基酸残基( a a r ， a c t i v ea m i n or e s i d u e s ) 与在体表面( b ) 的活性官能团( a c t i v ef u n c t i o n a l i t i e s ) 之间的反 应。与载体共价结合的酶的功能基团包括：氨基、羧基、酚基、巯基、羟基、咪唑基、吲 哚基。实际上，最常见的共价键结合反应包括氨基，羧基或酩氨酸和组氨酸的芳环。直 觉上载体的功能似乎就是作为一个支架，但是人们已经逐渐认识到载体对固定化酶的性 质有着较大的影响。从某种意义上说，载体上共价结合的酶可以看作是经过化学作用或 物理作用修饰过的酶，它们的理化性质被所使用的载体修饰了。因而选择载体的理化特 性决定了固定化酶的性能及应用，如活力、选择性、稳定性等。 通常酶与载体间的共价结合是一种激烈的固定化方法。共价结合固定化酶，不仅其 共价结合具有不可逆性、酶构象的空间变化受到限制，以及化学性质的改变，而且与其 6 湖南人学硕士毕业论文 他方法固定化的酶或天然酶相比，其性能如活力、选择性、以及稳定性等都得到了显著 改变。 1 2 1 3 基于包埋的固定化方法 酶的包埋是指酶分子或酶制剂被限制在某种载体中，通过把催化组分分散到多聚物 溶液中，然后借助化学方法或物理方法形成含酶的或其他生物催化剂的不溶性载体。这 种方法还具备同时固定一种以上酶的特征i z o j 2 0 世纪5 0 年代中期首次报道了酶能被物理包埋于一种无机凝胶载体中，同时保留 有生物活力1 2 。b e r n f c l d 和w a n 证实了水溶性丙烯酰胺单体能在交联剂n ，n 。亚甲基双 丙烯酰胺和溶解酶存在的情况下聚合，形成维持生物活力的固定化酶的包埋瞄】。之后 这种方法被m o s b a e h 扩展到整体细胞和颗粒状固定化酶制剂的包埋田l 。很明显所形成的 载体应该有理由小分子底物的渗透。载体可以制成颗粒状、膜状、圆盘状和纤维状。 在最初的包埋技术中，酶或全细胞必须首先分散到一种溶液中，然后是一个以形成 物理包埋为目的的凝聚过程。如今载体的形成可以通过其他几种方法实现，例如化学的 方法如交联、聚合，物理的方法如物理的凝胶化，或这来年各种方法的结合。酶分子同 样也可以通过物理的或共价的方法固定在包埋的载体内。后者与物理包埋相比，通常能 减弱酶的渗漏近几十年出现了很多各种各样的包埋技术，如共价包埋、双包埋、后装 载包埋、包埋交联等，以解决原始包埋技术存在的本质上的不足之处。 目前不仅是全细胞的固定化，而且单酶的固定化包埋技术的应用都呈上升趋势，因 为包埋是一种简单方便的技术。除此之外在凝胶载体中被包埋的酶分子往往由于受到限 制而稳定，而且选择适宜的体系或变化凝胶的组分能够为酶的活力和稳定性的调节提供 简单有效的方法1 2 4 l 。 1 2 1 4 基于微囊化的固定化方法 酶的微囊化是指将酶通过物理或化学方法包封在直径为l - 1 0 0 p m 的半透性高分子 膜内的方法【2 5 1 通常胶囊内的酶分子无需经过任何化学修饰，但可能需要降低酶的溶解 性，以减少渗出。虽然酶分子通过物理作用被胶囊膜限制在内部，底物或产物却可以自 由扩散通过膜因此膜只对酶分子形成物理屏障，如图1 5 所示。 尽管制备微囊化酶的方法很多如原位微囊化、微囊化交联、固定微囊化以及液 膜法等但可以大致分为以下几类：界面聚合法即在酶周围形成固体壳的方法、相转换 法、液体干燥法、液膜法与其他酶固定化技术相比，微囊化技术的特征是可以同时固 定多种酶，而且反应条件温和。 为了克服原有微囊化技术的缺点以及满足实际应用的需要，最近又发展了许多不同 的微囊化技术，包括：微囊化后交联：首先将酶包埋在囊内，然后用带有双动能团的物 质进行交联，降低酶的溶解性。固定后微囊化：首先通过共价键、吸附、，包封及交联等 方法将酶固定化，然后再用囊化材料进行微囊化，使酶更加稳定。载酶后微囊化：先将 酶溶液注入中空微球内，再利用其他方法如交联或聚合一交联法来降低酶的溶解性。 7 湖南火学硕十毕业论文 1 2 1 5 固定化酶的新方法 近几十年来酶固定化技术飞速发展，出现了许多新的固定化载体村料及固定化方 法。例如新的载体材料有壳聚糖及其衍生物、脂质体、人工合成高分子材料等【2 6 1 。 壳聚糖类载体属于天然高分子材料，对人体无毒，具有良好的生物相容性和可降解 性，因此是近年来国内外研究最热门的固定化材料之一。k e i s u k ek u r i t a ( 2 7 】等人对壳聚 糖进行巯基化处理，获得了6 巯基壳聚糖。这种载体可以直接与酸性磷酸酶结合，以此 固定化酶水解4 硝基苯磷酸时发现其几乎保持了全部活力，并且反复使用时仍具有较高 活力。 脂质体是微胶囊包合酶的良好壁材。脂质体主要由卵磷脂、生育酚等有益健康的成 分构成，无毒，特别适合于食品，比其它壁材制成的微胶囊小，能更好地分散，有利于 酶均匀地发挥作用，对酶的包容量大。a p i c o n t 2 8 】等人用脂质体为壁材，微胶囊化包合洋 蓟酶( 从朝鲜鲜蓟乳汁中提取到的一种蛋白酶) 用于奶酪的加工过程。微胶囊化的洋蓟酶 在凝乳酶之前加到奶酪中，均匀地分散在奶酪凝块中，不因乳清排出而流失。而后脂质 体裂开，放出洋蓟酶，洋蓟酶可加速奶酪的成熟；缩短熟化时间，加快奶酪风味物质的 形成，无不良气味。以脂质体为壁材对酶进行微胶囊包埋固定，在有些国家已进入商业 应用阶段。 人工合成高分子材料具有良好的抗微生物性能，机械强度大，有再生能力和价格优 势。l e asb o n n i n g t o n 等人用聚醚氨与p ( c h 2 0 h ) 3 ，反应得到一种新型高聚物膜，再利 用膜上过剩的o h 与尿酶上的- n h 键合得到固定化酶。此酶在催化尿素水解反应中催 化活力与用乙酰甲壳素固定化的尿酶活力相等，比键合到尼龙载体上的尿酶活力高三 倍。 新的固定化方法通常包含两种以上的固定化方法，而且组合的方法也越来越多的用 于解决一种基本的固定化技术所不能解决的特定问题。 ( 1 ) 包被为基础的酶固定化：这种类型的酶固定化使酶分子通过非共价结合的包 埋方式包被到固体载体的表面。这些将酶包被于固定相载体表面的方法可以分成五类： 单层酶包在固体载体表面、多层包被、凝胶化包被、亲和包被、和疏合物包被即聚合电 解质和酶之间形成复合物。除单层酶包被外，其他包被法的特点是通过化学或物理的方 法将多层酶分子包被到载体上。然而酶和载体之间作用力的本质都是物理作用。 ( 2 ) 位点特异的固定化：酶分子通过特定的结合位点与载体共价结合和亲和连接 的技术。位点特异的酶固定化技术有许多优点，包括可控制酶的方向性，这样可以很好 的接近酶活性中心，避免对重要氨基酸的化学修饰；与随机固定化酶相比可以增加酶活 力的保持性1 2 9 1 ；增加稳定性 3 0 l ；减少失活3 1 l ：支持基质的再利用【3 2 】，并且与随机固定 化酶相比可以提高酶的承载量。这些特性提高的原因是基于避免多点结合、多重定位和 空问障碍。 ( 3 ) 稳定化固定化：从2 0 世纪7 0 年代以来，人们广泛认识到将酶适当的固定化 8 湖南人学硕十毕业论文 能够提高酶的稳定性，抵抗许多变性因素对酶活力的影响，如热、极端p h 和有机溶剂。 这要归功于由于所选的固定技术所产生的一下一个或更多的效应：多点附着到一个互补 表面通过多点结合到固体表面达到稳定酶的作用 3 3 1 ；通过在固定化酶附近创造有利 的微环境达到稳定酶的作用；将酶的表面功能基团进行修饰，产生修饰效应，以达到稳 定酶的作用：将酶分子限制在有限空间内达到稳定酶的作用，因此酶解聚的熵值降低； 通过多个非共价相互作用达到稳定每的作用。 ， 近年来人们也认识到固定化酶的稳定性可以在酶固定之前就得到改善【3 4 1 ，意味着酶 在固定之前可以先通过适当的化学手段或物理手段使其稳定，随后所选用的固定技术仅 限于将酶定格在预先确定的稳定构象中。尽管稳定的酶来源广泛( 如嗜热菌株或工程菌 株) 但这些稳定化固定化技术为酶的固定化提供了一个简单的与其他方法互补的方法， 因为它能够提供一个设计具有特定性质固定化酶的理性方法，也就是提高酶的稳定性和 选择性。 ( 4 ) 基于修饰的酶固定化。基于修饰的酶固定化包括首先用化学试剂或化学交联 剂对天然酶进行化学修饰，从而改进酶的功能。随后修饰后的酶制剂可以选用适当的固 定化技术进一步固定。此外这种固定化酶还可以进一步的修饰改造，以改善其稳定性、， 反应活力和选择性2 0 世纪7 0 年代初z a b o r s k y 首先提出运用固定前修饰 ( p r c i m m o b i l i z a t i o nm o d i f i c a t i o n p i m ) 来改善酶在诸如稳定性等方面特性的观点】。 总体上来说基于修饰的酶固定化技术可以分为修饰后固定和固定后修饰两大类。 ( 5 ) 后固定化技术- 2 0 世纪7 0 年代以来，人们认识到将酶结合到一种载体上并 非是酶固定化过程的全部，固定化了的酶往往受到各种物理化学手段的进一步处理，如 借助冻干等手段改进存储稳定性，以改进其活力和稳定性。用于改进享有固定化酶的这 些技术通常称为后固定化技术 3 s l 。该技术的潜力有：经冻干的改进存储稳定性1 3 q ；改进 载体与酶分子问连接的稳定性；改进酶活力吲；改进酶稳定性：增加酶构象的稳定性； 转换成化学酶p 硼；借助固相化学导入新功能；用有机溶剂洗涤均一化固定化酶；制止因 采用后固定化交联或其他技术引起的酶渗漏；有机溶剂中用于调控水活度。 由于一种固定化酶含有两种基本功能：催化功能如活力、稳定性及选择性等；非催 化功能如非催化物质的物理和化学稳定性，形状、尺度等几何学性质。所以后处理的目 标分为：改进活力；改进稳定性：改进选择性；改进几何学性质；改进化学和物理稳定 性由此可将后处理技术分为两组，即物理后处理和化学后处理。前者包括p h 印记技 术、溶剂洗涤1 3 9 1 和同多元醇添加剂的共冻干m l 。后者就是使用化学手段修饰已经制备好 的固定化酶，包括酶的化学修饰、采用增加固定化介质p h 、增加多点附着1 4 、中和过 剩的活性结合能即阻断或淬灭处理【4 2 1 或改变固定化酶的微环境。 为了解决单一的固定化技术所不能解决的特定问题，除了将几种固定化方法联用以 外，也可以将新材料与酶固定化技术结合。例如将纳米材料与固定化酶技术结合以提高 固定化酶的反应活性和稳定性i 3 j ，还可以将磁性纳米颗粒与固定化酶技术结合，制备出 9 湖南大学硕i ：毕业论文 带有磁性的，易于分离的固定化酶。利用外部磁场控制磁性材料固定化酶的运动方式和 方向，代替传统的机械搅拌方式，提高固定化酶的催化效率。 1 2 2 磁性纳米颗粒的研究 1 2 2 1 纳米颗粒的特性 纳米粒子也叫超微颗粒，一般是指尺寸在1 一- 1 0 0 n m 间的粒子，是处在原子簇和宏 观物体交界的过渡区域，从通常的关于微观和宏观的观点看，这样的系统既非典型的微 观系统亦非典型的宏观系统，是一种典型的介观系统，它具有表面效应、小尺寸效应和 宏观量子隧道效应。当人们将宏观物体细分成超微颗粒( 纳米级) 后，它将显示出许多 奇异的特性，即它的光学、热学、电学、磁学、力学以及化学方面的性质和大块固体时 相比将会有显著的不同。在应用时直接使用纳米颗粒的形态称为纳米颗粒型材料。这种 纳米颗粒型材料的表面积大大增加，表面结构发生较大的变化。与表面状态有关的吸附、 催化以及扩散等物理化学性质有明显改变。纳米颗粒型材料在催化领域有很好的前景。 1 2 2 2 磁性纳米颗粒的特性 磁性纳米粒子具有许多不同于常规材料的独特效应，如量子尺寸效应、表面效应、 小尺寸效应及宏观量子隧道效应等，这些效应使磁性纳米粒子具有不同于常规材料的 光、电、声、热、磁、敏感特性】。其原因是关联于与磁相关的特征物理长度恰好处于 纳米量级，例如：磁单畴尺寸，超顺磁性临界尺寸，交换作用长度，以及电子平均自由 路程等大致处于l - 1 0 0 n m 量级，当磁性体的尺寸与这些特征物理长度相当时，就会呈 现反常的磁学性质。当磁性纳米粒子的粒径小于其超顺磁性临界尺寸时，粒子进入超顺 磁性状态，无矫顽力和剩磁。众所周知，对于块状磁性材料( 如f e 、c o 、n i ) ，其体内 往往形成多畴结构以降低体系的退磁场能。纳米粒子尺寸处于单畴临界尺寸时矫顽力 ( 鼠) 将呈现极大值。小尺寸效应和表面效应导致磁性纳米粒子具有较低的居里温度。另 外，磁性纳米粒子的饱和磁化强度( 聪) 比常规材料低，并且其比饱和磁化强度随粒径 的减小而减小。当粒子尺寸降低到纳米量级时，磁性材料甚至会发生磁性相变。 1 2 2 3 磁纳米颗粒的制备及各制备方法的特点 磁性纳米材料的制备方法可分为物理法，生物法和化学法【4 5 1 。其中物理法以机械球 磨法为主要代表，尽管该法便于操作，但所制的的粒子尺寸分布较宽( 纳米微米) ， 同时制备过程耗时长。生物法制备的磁性纳米粒子的优势在于其有很好的生物相容性， 但该法的缺点是细菌培养困难，粒子提取过程较为烦琐，同时得到的粒子的粒径可控范 围也比较受限制。化学制备方法有包括共沉淀法、高温分解法、微乳液法、溶胶凝胶 法、超声化学法、激光分解法和电化学沉淀法等。目前磁性纳米材料的制备主要依赖于 化学制备方法。在这几种方法中共沉淀法具有实验操作简便，反应条件温和等特点。虽 然得到的粒子普遍存在尺寸分布比较宽的缺点，但是可以采用尺寸选择性沉淀方法对制 1 0 湖南人学硕十毕业论文 备的粒子进行后处理以得到单分散性更好的磁性纳米粒子，制备流程如图1 5 所示。 图1 5 共沉淀法制备? - f e 2 0 3 流程图 f i 9 1 5t h ep r e p a r a t i o no f t f e 2 0 3t h r o u g hc o p r e c i p i t a t i o n 1 2 2 4 磁纳米颗粒在生物技术及酶固定化中的应用 德国学者报道了含有7 5 - - 一8 0 铁氧化物的超顺磁多糖纳米粒子( 2 0 0 , - - - 4 0 0n m ) 的 合成和物理化学性质l 蛔将它与纳米尺寸的s i 0 2 相互作用，提高了颗粒基体的强度， 并进行了纳米磁性颗粒在分子生物学中的应用研究。试验了具有一定比表面的葡聚糖和 二氧化硅增强的纳米粒子。在下列方面与工业上可获得的人造磁珠作了比较：d n a 自 动提纯、蛋白质检测、分离和提纯、生物材料中逆转录病毒检测、内毒素清除和磁性细 胞分离等。此外，还可以将磁性纳米粒子表面涂覆高分子材料后与蛋白质结合，作为药 物载体注入到人体内，在外加磁场作用下，通过纳米磁性粒子的磁性导向性，使其向病 变部位移动，从而达到定向治疗的目的。在酶的固定化方面，酶具有c o o h 、o h 、- n h 2 等活性官能团，可通过物理吸附、交联、共价偶合、包埋、鳌合等方式和磁性微球结合， 具体实施法有吸附交联法、共价结合、过渡金属与酶的螫合、包埋法和共价键偶合法等。 磁性纳米颗粒固定化酶能提高酶的生物兼容性和免疫活性、亲疏水性和稳定性；易于将 酶与底物或产物分离、操作简单易行；可利用外部磁场控制磁性材料固定化酶的运动方 式和方向，提高固定化酶的催化效率。 用磁性纳米粒子固定化纤维索酶具有磁性，它可以较好地应用在高速分离技术中， 消除了由于离心导致的机械毁坏，并且能够借助外部磁场，简单、方便地回收和磁性导 向，大大提高了纤维素酶的利用率，并可实现生产的连续化、自动化，为纤维质原料生 产酒精的工业化提供了技术基础 湖南火学硕l ：毕业论文 1 3 课题研究目的和意义 为了探索新颖、有效的纤维素酶的固定化方法，在基于纳米技术的基础上，本文采 用一系列新的实验材料和方法来固定化纤维素酶颗粒。由于y - f e 2 0 3 纳米颗粒具有良好 的表面活性和吸附性能，更重要的是其具有很好的超顺磁性，实验采用了丫一f e 2 0 3 纳米 颗粒作为固定化酶载体的骨架之一，从而使固定化酶在外加磁场的条件下能方便的回 收，避免的离心回收，筛板过滤等耗能步骤。p v a 是一种优质的高分子可溶性材料，其 性质稳定，无毒害，生物相容性好，可塑性强。p v a 有多种交联方法，可以用硼酸进行 交联，也可以用戊二醛等双功能试剂进行交联，还不引入任何化学试剂而用反复冻融的 方法对p v a 进行交联，用于生物相容性材料的制备【4 7 1 。有文献报道p v a 包裹的丫f e 2 0 3 复合纳米颗粒与y