（动物学专业论文）利用微卫星标记对中国恒河猴mhc基因遗传同质性分群的研究.pdf

北京协和医学院硕士研究生学位论文 中文摘要 恒河猴是医学生物学研究中重要的非人灵长类模式动物，广泛应用于传染性疾 病模型制作、疫苗开发、干细胞研究以及器官移植，尤其在模拟艾滋病感染人体的 实验中，是不可代替的猴艾滋病模型。由于恒河猴地理分布广泛，而且驯化程度有 限、无法建立近交系，所以在同一个实验分组中参与实验的恒河猴个体往往是遗传 背景异质性，但是医学实验中需要参与实验的动物尽量保持遗传背景的同质性从而 使实验结果便于分析，这样的客观矛盾导致实验中往往会出现个体差异。 相同地理来源的恒河猴往往由于地理隔离，个体差异比较小，而主要组织相容 性复合物分子是免疫遗传学中最重要的基因，所以选取相同地域来源和相同主要组 织相容性复合物分子基因型的恒河猴实验动物参与实验将有利于缩小个体差异。 本文试图根据已知地域性微卫星遗传标记与特定m h c 基因高度连锁的微卫星 遗传标记，建立一套恒河猴免疫遗传学同质性分类方法。实验结果表明，中国恒河 猴的遗传背景复杂，地理来源遗传标记需要进一步完善。特定m h c 基因高度连锁 的微卫星遗传标记则可以替代连锁的m h c 基因，将恒河猴区分为若干个不同的群 体。 本方法的建立和进一步完善，在对中国恒河猴遗传背景缺乏详细了解的情况 下，将为中国恒河猴参与实验分组提供参考，也可以指导恒河猴繁育管理，长远可 用于对相对封闭地区中国恒河猴进行遗传调查并逐步建立遗传同质性群体。 关键词：恒河猴，组织相容性复合体，微卫星遗传标记 北京协和医学院硕士研究生学位论文 a b s t r a c t m a c a e am u l a t t ai sa l li m p o r t a n tn o n h u m a np r i m a t em o d e li nb i o m e d i c a lr e s e a r c h t h e ya r ew i d e l yu s e di nn u m b e r so fi n f e c t i o u sd i s e a s e s ，v a c c i n ed e v e l o p m e n t ，s t e mc e l l r e s e a r c h , o r g a nt r a n s p l a n t sa n de s p e c i a l l ya sa l le s s e n t i a la i d sm o d e li n as i m u l a t e d h u m a nb o d yo fh i vi n f e c t i o ne x p e r i m e n t s d u et oi t sw i d eg e o g r a p h i c a ld i s t r i b u t i o na n d d o m e s t i c a t i o no fal i m i t e dd e g r e e ，i ti sv e r yd i f f i c u l tt oe s t a b l i s ht h ei n b r e ds t r a i n s r e s e a r c h e rm a d eg r e a te f f o r t st om a i n t a i nt h eh o m o g e n e i t yo fg e n e t i cb a c k g r o u n do f e x p e r i m e n t a lr e s u l t st od e c r e a s et h er e s u l t se r r o ri nm e d i c a le x p e r i m e n t s h o w e v e r , m a c a c am u l a t t ap a r t i c i p a t e di nt h es a l n ee x p e r i m e n ta l ea l m o s tw i t hh e t e r o g e n e o u s g e n e t i cb a c k g r o u n d s o ，t h ei n d i v i d u a ld i f f e r e n c e sr e s u l t si nt h ea c t u a le x p e r i m e n t a lm o r e c o m p l i c a t e d m a c a e am u l a t t a 、析mt h es a n l eg e o g r a p h i c a lo r i g i na l ec l o s ei ng e n e t i cr e l a t i o n s h i p a n dr e l a t i v e l ys m a l li n d i v i d u a ld i f f e r e n c e s t h em a j o rh i s t o c o m p a t i b i l i t yc o m p l e x m o l e c u l a r ( m h c ) g e n e sa l et h em o s ti m p o r t a n ti m m u n o g e n e t i cg e n e s s oa n i m a l s 、 丘m t h es a n l eg e o g r a p h i c a lo r i g i na n dt h es a m em h c g e n o t y p ew i l lb eb e n e f i c i a lt or e d u c e i n d i v i d u a ld i f f e r e n c e si nt h ee x p e r i m e n t i nt h i sp a p e r , w ee s t a b l i s h e dam a c a c am u l a t t ai m m u n o g e n e t i ch o m o g e n e i t y c l a s s i f i c a t i o nb a s e do nt h ek n o w nr e g i o n a lm i c r o - s a t e l l i t e g e n e t i cm a r k e r sa n d m i c r o - s a t e l l i t el i n k e dd e f m i t u d em h cg e n e s o u rr e s u l t si n d i c a t e dt h a tt h eg e n e t i c b a c k g r o u n do fc h i n e s em a e a c am u l a t t aw a sc o m p l i c a t e d s ot h eg e n e t i cm a r k e ro f d e m o g r a p h i co r i g i ns h o u l db ef u r t h e rs t u d i e d w ec o u l dr e p l a c et h el i n k e dm h cg e n e s w i t hm i c r o - s a t e l l i t el i n k e dd e f m i t u d em h cg e n e st od i v i d et h ea n i m a l si n t on u m b e r so f s u b g r o u p s a st h el a c ko fd e t a i l e du n d e r s t a n d i n ga b o u tt h eg e n e t i cb a c k g r o u n do fc h i n e s e m a c a c am u l a t t a , o u rm e t h o d sw i l lp r o v i d et h eb a s i cr e s e a r c hr e f e r e n c ef o rt h em a c a c a m u l a t t am e d i c a le x p e r i m e n t sa n dt h em a n a g e m e n tf o rt h ea n i m a l s p r o p a g a t i o n i tc o u l d b ea p p l i e di ng e n e t i ci n v e s t i g a t i o no nm a c a c am u l a t t af r o mc l o s e dr e g i o nt oe s t a b l i s h e d t h e h o m o g e n e o u sg e n e t i cb a c k g r o u n ds u b g r o u p si nt h ef u t u r e k e y w o r d ：m a c a c am u l a t t a , m a j o rh i s t o c o m p a t i b i l i t yc o m p l e x m o l e c u l a r , m i c r o s a t e l l i t eg e n e t i cm a r k e r s 4 北京协和医学院硕士研究生学位论文 独创性声明 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的研 究成果。论文中除了特别加以标注和致谢的地方外，不包含其他人已经发表或撰写 过的研究成果，也不包含为获得其他教育机构的学位或证书而使用过的材料。与我 一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示谢 意。 学位论文作者签名： f 习受与 签字日期： 二，尹年 j 月喀e l 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解j 量塞协塑医堂院有关保存、使用学位论文的管理 办法。有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查 阅和借阅。本人授权j 匕哀协塑医堂院可以将学位论文的全部或部分内容编入有关 数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。 ( 保密的学位论文在解密后适用本授权书) 学位论文作者签名： 问哆 签字日期：口口，年岁月谚日 学位论文作者毕业后去向： 工作单位： 通讯地址： 6 7 刷程各匆学 眵v 、 签字e t 期：1 叫年【月 电话： 邮编： 、 扔? k 垅日 北京协和医学院硕士研究生学位论文 恒河猴是一种应用于医学生物学研究的重要模式动物，广泛应用于感染性疾病 模型制作、疫苗开发【l 】、克隆与干细胞研究2 1 、神经科学研究【3 1 和器官移植4 1 ，尤其 在获得性免疫缺陷综合症( a c q u k e di m m u n ed e f i c i e n e ys y n d r o m e ，a i d s ) 研究领 域，恒河猴感染猴免疫缺陷病毒( s i m i a ni m m u n o d e f i c i e n c yv i r u s e s ，s i v ) 或者s h i v 是不可替代的研究人类感染h i v 和评价疫苗效果的模型【i j 。 恒河猴主要分布于印度、中国和东南亚国家，由于其地理来源广泛，驯化程度 较低，并未形成近交系或者封闭群，进行实验的恒河猴往往在遗传背景上是复杂和 不统一的，也就是说参与实验的动物是遗传异质而非同质的，而实验动物的遗传背 景对实验结果往往会造成巨大的影响。例如，在传染性疾病感染恒河猴的实验中， 经常可以看到同一实验分组内的恒河猴病程不同，对干预因素的反应也不同，其原 因就来自于恒河猴的遗传背景不同。但是医学实验要求受试动物在遗传背景上尽可 能保持一致，以减少不同背景对实验造成的影响，有利于分析结果，同时也便于减 少受试动物数量，保护实验动物资源。目前，提高恒河猴遗传背景的同质性面临一 些问题。首先，不同于实验用小鼠，恒河猴近交后会导致严重的近交衰退，不仅无 法建立近交系，而且在恒河猴管理中近交衰退是要重点避免的问题1 5 1 。其次，恒河 猴属于灵长类，具有发情期。每年秋冬季发情，妊娠周期长，为1 6 3 天左右，而且 每次妊娠只生一胎，难于在一次实验中凑齐同窝恒河猴而无法利用相同遗传背景来 减少遗传差异。因此，恒河猴的遗传异质性对于实验者而言一直是个需要解决的难 题。 恒河猴被应用最广泛的领域是建立传染性疾病模型和器官移植模型等涉及免 疫学的领域，所以减少恒河猴在免疫遗传学背景上的差异可以部分简化遗传异质性 的差异，即选取与免疫相关反应的同种等位基因的恒河猴参与实验。在免疫相关的 实验中，主要组织相容性复合体( m a j o rh i s t o c o m p a t i b i l i t yc o m p l e x ，m h c ) 基因是其 中最为重要的基因1 6 j 。 m h c 是脊椎动物染色体上一组基因群，人类的m h c 基因被称为硼l a 基因， 位于6 号染色体，恒河猴的m h c 基因则称为m a m u 基因，位于4 号染色体。m h c 基因通常由i 类、i i 类和i i i 类基因组成，编码与免疫反应相关的糖蛋白。i 类分子 表达在所有有核细胞表面，负责提呈内源性抗原肽段给c d 8 + 杀伤性t 细胞，引发 c t l 反应杀伤靶细胞。h 类分子表达在免疫系统细胞表面，负责提呈外源性抗原肽 段给c d 4 + 杀伤性t 细胞，使之产生抗体，这两类基因都与特异性免疫反应相关， 北京协和医学院硕士研究生学位论文 显示了高度的多态性。i i i 类基因以及除经典的i 、i i 类基因之外的基因则负责调控 固有免疫反应，多态性比较有限。i 、i i 类基因高度多态性的原因被认为主要与疾病 尤其是病原与动物的协同进化有关系。在存在某些微生物的特定环境中，携带有针 对微生物抗原反应有优势m h c 等位基因的动物自然可以获得高的生存率，经过自 然选择，该等位基因在基因频率上得到提高，而在另外一个环境中，在其它微生物 存在的条件下，可能携带这种等位基因的动物并不具备生存优势，甚至面临劣势， 其基因频率自然会降低，而具备相对优势的等位基因基因频率自然会上升，于是各 种等位基因在其群体中得到积累，由于重组和进化，赋予了个体针对各种环境条件 不同的应变能力。 例如研究发现，携带h l a b 5 7 、h l a b 2 7 的人群在感染h i v 病毒后，病程 缓慢 6 - s ，而携带h l a b 3 5 的h i v 感染者疾病进展迅速【8 】。同样，携带某些m h c 等位基因的恒河猴在感染病毒的实验中表现出预后趋势的一致性。例如携带 m a m u - a * 0 1 等位基因的恒河猴在感染s i v 病毒后病毒载量低，病程缓慢。 m a m u - b * 1 7 分子也被发现是一种与s i v 感染预后良好密切相关的m h c i 类分子， 类似预后良好的基因包括m a m u d r b 木w 6 0 6 、m a m u d r b 水w 2 1 0 4 、m a m u d r b l 宰0 3 0 6 、m a m u d r b l 木1 0 0 3 、m a m u d p b l * 0 6 等基因。而与预后差相关的基 因包括m a m u - b * 0 1 、m a m u b * 0 2 、m a m u a * 0 4 、m a m u - a * 1 3 0 2 、m a m u a 枣1 4 0 2 等 【9 1 o 当前，选取具备同种m a m u 等位基因的恒河猴参与实验正成为趋势【lo 1 1 】。当然 也有专门选择m h c 等位基因相异的恒河猴参与实验。例如，f e c h n e r , j j 等人进行 肾脏移植实验时选择了恒河猴m h c i i 类基因相异的恒河猴进行同种异型移植实 验，以测试使用针对t 细胞的免疫毒素对t 细胞删除后，受体对供体的排斥效应是 否减低，移植物在体内生存时间是否延长。 由于印度从7 0 年代末起停止出口恒河猴，所以中国和其它来自东南亚的国家 正日益成为国际上恒河猴供应的主要来源国。但是选取具有相同免疫遗传学背景的 中国恒河猴参与实验具有以下困难： 1 中国恒河猴m h c 基因缺乏积累而且难于积累 由于目前世界上所积累的各m a m u 基因等位基因序列主要来自于印度恒河猴， 而中国恒河猴m a m u 基因序列几乎是空白，所以尚且无法根据中国恒河猴m h c 等 位基因对参试恒河猴进行分类。 另外，对恒河猴m h c 基因进行克隆测序也遇到了困难。恒河猴m a m u 基因区域 虽然与人类的h l a 基因区域在结构上具有类似性，但是要复杂得多，整体上看恒河 猴m a m u 基因所在染色体区域出现了相当大的延伸，人类h l a 区域为3 6 m b ，而恒 6 北京协和医学院硕士研究生学位论文 河猴m a m u 区域则达到了5 3 m b 。衍生的主要长度位于i 类基因分布区，尤以m a m u b 区域为甚【1 2 1 ，表明恒河猴m h c 基因在m h c i 类区域出现了较大程度的重复现象。对 应与人类的h l a a b c - - - 种i 类m h c 基因，恒河猴存在m a m u - a b 两种i 类基因，缺 乏m h c c 这一种，但另外存在一种与m a m u b 相关的m a m u i 基因【乃j 。恒河猴i 类基 因比较于人类，相同点是其分布于几乎所有有核细胞表面而且功能相当，不同点是 恒河猴i 类m h c 分子在染色体上排列异常复杂，存在大量的重复现象并且造成一些 假基因。例如在一些单元型中，可以重复m a m u a2 7 次或者重复m a m u b 基因3 1 4 次。m a m u i i 类基因则与人类所拥有的h l a d r a d r b 、h l a d p a d p b 、 h l a - d q a d q b 三种类型基因对应存在m a m u d r a d r b 、m a m u - d p a d p b 、 m a m u d q a d q b = 种。但是在某些单元型m a m u - d r b 基因有重复数量上的增加， 而且m h c d r 基因区域在人类中是1 个d r a 与4 个d r b ( 包含2 个假基因) 组合，发 现有5 种组合形式，为高度多态性和低度多基因组合类型性。d r b 基因组合在恒河 猴中则是3 0 种以上的多基因组合形式( 组合数目不等，2 6 个左右) 。为低度多态性 ( 相比较人类) 和高度多基因组合类型性。与人类正好相反【1 4 1 。这种复杂的构型使 克隆m a m u 基因的工作只能在m r n a 水平上先逆转录后挑取单克隆获得，而且获取 的序列由于重复基因的原因无法确定其位于哪个基因座上，只能根据转录水平的高 低依次归类为不同的基因座，一般认为在同一个样本中获得3 个相同的克隆而且比 对恒河猴m h c 现存数据库没有发现重复，即可以认定为一个新等位基因。按照国际 动物遗传学会国际兽医免疫研讨会一兽医免疫委员会( i s a g i u i s 。v i c ) 的原则， 以如下法则命名新发现的等位基因：该动物m h c 基因缩写在前，之后是等位基因名 称、基因座位号、星号、主型号、等位基因号、同义突变号u 引。例女f l m a m u - a l * 0 1 0 1 0 1 ： m a m u a 代表恒河猴m h c 基因中a 基因，a 1 代表a 基因第1 基因座，a 1 * 0 1 代表a 1 基 因座第1 主型，a 1 * 0 1 0 1 代表a 1 基因座第1 主型第1 种等位基因，第1 种等位基因命名 来自于发现的顺序先后。a i * 0 1 0 1 0 1 则代表此等位基因同义序y 0 0 1 型，存在不同型 别但是它们所翻译的多肽相同。m h c i i 类基因则是根据恒河猴与人类的m h c 基因 的序列进化树确定名称，如果没有找到类似的，那么就在序列号后加一个w 表示新 出现的类型，例如：d r b 奉w 3 1 4 。 n e lo t t i n g 等人【1 5 】对1 0 0 0 只荷兰国家灵长类中心饲养的恒河猴以及大批保存的 永生化恒河猴b 细胞拥有的m h c 序列进行了分析( 以上动物和细胞主要为印度恒河 猴) ，每个样本同逆转录获得挑取3 2 个m a m u - a 克隆，6 4 个m a m u b 克隆，获得了1 3 0 个未报道的m a m u a 序列。 可见，获得m a m u 等位基因数据的工作成为极其耗资耗力和耗时的工作，而国 内的财力和入力无法负担如此庞大的工作。当然积累一些零星数据则是可行的，例 j t n k a r lj a i l 6 | 等人在1 2 只中国恒河猴上发现了4 1 种不同f l 勺m a m u a 、m a m u bc d n a 序列，其中2 7 个是从未报道过的。o u y a n gd ，o u y a n gd y t r 7 18 j 等人也在少量的中国 7 北京协和医学院硕士研究生学位论文 恒河猴上取得了一些新的等位基因信息。这些新等位基因来自少量的恒河猴，数量 不到2 0 只的恒河猴就提供了如此多的新等位基因，说明与印度恒河猴比较而言，我 们对中国恒河猴的遗传信息知之甚少，而且其发掘的潜力十分巨大。当然进行考察 的动物数量仍然较少，取得的新等位基因可以提供序列信息，但是其基因频率等信 息由于样本有限，仍然不足以代表中国恒河猴中这些基因的频率。 2 中国恒河猴遗传背景与印度恒河猴差异遗传背景差异很大，难于直接套用印度恒 河猴资料以现有的方法难于直接检测 研究证明中国恒河猴与印度恒河猴在1 6 2 万年前由喜马拉雅山脉阻隔而种 群分离，此后前者规模扩张了8 倍，而后者规模压缩到了原来的1 1 6 t 1 9 1 ，中国恒河 猴的遗传背景要远比印度恒河猴遗传背景复杂得多【2 0 1 。单纯对中国恒河猴进行的类 似实验中【”j ，仅仅来自1 2 个恒河猴的8 6 4 条e d n a 序列被克隆分析，获得了4 1 条 不同的序列，其中从未被报道过的就达2 7 条。可见中国恒河猴的遗传背景与印度 恒河猴大有不同。基于核酸序列识别的方法主要有p c r r f l p ( 聚合酶链式反应限 制性酶切片段长度多态性法，p c r r e 蚵c t i o nf r a g m e n tl e n g t hp o l y m o r p h i s m ) 、 p c r - s s o ( 聚合酶链式反应序列特异性探针法，p c r s e q u e n c es p e c i f i c o l i g o n u c l e o t i d e ) 、p c r s s p ( 聚合酶链式反应序列特异性引物法，p c r s e q u e n c e s p e c i f i cp r i m e r ) 和基因芯片法。基于构象识别的方法主要有p c r - s s c p 法( 聚合酶 链式反应单链构象多态性分析，p c r - s i n g l es t r a n dc o n f o r m a t i o n a lp o l y m o r p h i s m ) 和r s c a 法( 参比链介导的构象分析，r e f e r e n c es t r a n dm e d i a t e dc o n f o r m a t i o n a n a l y s i s ) 。其中，应用最广的是p c r - s s p 法，最高效的是r s c a 法，最具前途的 是基因芯片法。 p c r s s p 法，其原理是利用己知序列比对，根据差异核苷酸位点设计引物，以 扩增产物的大小和有无来判定是否存在该基因。例如：a n d r e wl l o b a s h e v s k y 和j u d y m t h o m a s 针对m a m u - a * 0 1 、a 木0 2 、a * 0 3 、a * 0 4 、a * 0 5 、a * 0 6 、a * 0 7 等位基因和 一系列的m a m u d r b 等位基因设计了特异性引物。后来，m a s a h i k ok a i z u 等人针对 a i d s 试验中，最常鉴定的m a m u a * 0 1 、m a m u a * 0 2 、m a m u - a * 0 8 、m a m u a 幸1 1 、 m a m u b 木0 1 、m a m u b * 0 3 、m a m u b * 0 4 和m a m u b 幸1 7 设计或者重新设计了引物， 提高了检测的正确率。p c r s s p 法简单易行，分辨率可从低到高，成本低。但是必 须检测的是事先所知的等位基因，而且容易被复杂的m h c 区域序列干扰而出现假阳 性。对于未知的等位基因，还无法检测，而且通量较小。 r s c a 法的原理是：依据根据异源二聚体未配对区域的长度和核苷酸分布差异 而进行电泳时速度，选定了特异性荧光标记的参照d n a 片段，与样本d n a 分子的互 补链形成异源二聚体并在测序机上进行电泳并扫描。根据对荧光峰值的读取，分辨 8 北京协和医学院硕士研究生学位论文 迁移速度的差别来鉴定样本的基因型。在针对恒河猴经典的m h c i 类基因鉴定时， 通常需要采取r t - p c r 法，这样可以避免假基因干扰。对比p c r - s s p 法，p c r - r s c a 法具有以下的优点：1 分辨率高，可以检测到1 个核苷酸的差异。荧光标记的灵敏 度好，而且有内对照。2 准确度到1 0 0 ( 人类实验中) ，9 8 ( 恒河猴1 2 个样本) ， 而且重复性好。实验中随机抽取样本2 0 个( 人类实验) 重复率为1 0 0 。很少出现摸 棱两可的情况( 人类实验中) 。3 可以发现新的等位基因和s n p ，此为p c r s s p 法 所不能。4 可以解决单体型和重复基因以及假基因问题，对复杂的恒河猴i 类基因 很必要，此更为s s p 法所不能，而且可以分析恒河猴有多少等位基因同时转录。5 可 以辅助用于家系分析。6 具备高通量，可一次完成大量大量样本，但是其缺点是需 要专门的测序仪并且测试的d n a 要求高的纯度，其次是一次实验需要近1 0 d , 时，比 较费时。利用此方法，日本学者y u m i k o1 h a k a 一诎a 1 1 a s l l i 【2 0 】等利用此方法，检测了 1 6 0 只来自东南亚恒河猴样本，结合家系资料鉴定出数十种单体型，并将明确结果 与感染s h i v 病毒后疾病进程进行了相关分析，阐明了疾病易感和抗性的单体型【2 1 1 。 基因芯片法的原理是将大量靶基因片段有序地、高密度地排列在玻璃、硅等载 体上，p c r 产物与探针进行杂交，结果扫描后，计算机分析获取数据。目前已经有 用于h l a 基因分型的芯片。其优势是高通量，快速准确。对恒河猴m a m u 基因分型， 一般应针对第2 、3 外显子( m h c i 类基因) 和第2 p b 显子( m h c i i 类基因) 中单核苷酸多 态性高的区域选取和设计寡核苷酸探针，长度控制在1 7 2 0 n t 。原则是所选取的探针 退火温度彼此接近并且探针的g c 含量接近，杂交位点应该远离荧光标记位点，多态 性位点应该包含在2 个以上且位于探针中部，并且需要设计阳性对照探针，阴性对 照探针以及扫描定位探针，探针设计后需要摸索条件优化出合理的探针。探针构成 的矩阵需要设置重复，一般重复两次，可进行多点重复点样，保证结果的可重复性。 例虫i b e t s y f e r g u s o n t 2 2 】等人为了有效区分中国恒河猴和印度恒河猴，对1 0 r 中国恒河 猴和1 0 只印度恒河猴的9 4 个基因的3 末端进行了s n p ( 单核苷酸多态性) 调查和比 较，发现了6 6 1 个s n p ( 单核苷酸多态性) 位点，其中4 4 1 个有排他性，通过对9 7 个 动物进行的盲法测试中，最终选定了3 8 个s n p ( 单核苷酸多态性) 位点作为最特异 测试位点建立种群特异性区分基因芯片。通过该芯片，可有效区分中国恒河猴，印 度恒河猴和中国印度杂交恒河猴。 国内学者试图利用已经报道的印度恒河猴m h c 基因资料设计探针，以 p c r s s p 法对中国恒河猴m a m u 基因进行检测，测序结果与报道资料存在不同【2 3 1 。 而使用r s c a 法需要序列已知的标准品，而且需要自动测序仪，并不便于推广。使 用基因芯片，除了成本太高以外，尚需摸索最适宜的条件。关键问题是这些方法都 有赖于对参照序列的已知，而作为参照序列的印度恒河猴序列与中国恒河猴序列大 为不同。 面对以上问题，我们尝试能否不直接获得m h c 基因的序列信息，而通过分析 9 北京协和医学院硕士研究生学位论文 遗传标记的方法来代替获取特定的等位基因进行分类呢? 答案是可行的。 遗传标记是指可追踪遗传物质如染色体某一节段、某个基因座在家系中传递的 一种遗传特性。它具有两个基本特征，即可遗传性和可识别性。遗传标记包括形态 学标记( m o r p h o l o g i c a lm a r k e r ) 、细胞学标记( c y t o l o g i c a lm a r k e r ) 、生物化学标记 ( b i o c h e m i c a lm a r k e r ) 、免疫学标记( i m m u n eg e n e t i cm a r k e r s ) 和分子标记( m o l e c u l a r m a r k e r ) 五种类型，除去细胞学标记外，都可以用于恒河猴遗传分析。 形态学标记主要依据形态差别作为参照，例如中国恒河猴和印度恒河猴在外貌 上有细微差别，中国恒河猴体形更大，眉骨更宽。 生物化学标记是以动物体内的某些生化性状为遗传标记，主要指血型、血清蛋 白及同工酶，例如可对某些蛋白多态性进行检测来进行遗传分析t 2 4 。 免疫学标记主要是动物的免疫学特征为遗传标记，主要的标记有：红细胞抗原、 白细胞抗原、胸腺细胞抗原等，针对m h c 分子可以有m h c 分子抗体进行区分， 在印度恒河猴m h c 血清学分类中，将印度恒河猴分为1 4 个m a m u a 和1 6 个 m a m u - b 血清型【2 5 1 。但是此方法由于有较多交叉型反应而已经被淘汰。如果将其用 于中国恒河猴，不仅面临交叉反应的问题，获得足够覆盖主要恒河猴种群纯化的抗 血清也很困难。 分子标记，是以个体间遗传物质内核苷酸序列变异为基础的遗传标记，是d n a 水平遗传多态性的直接的反映。典型的分子标记包括限制性片断长度多态性( r e s t r - i c t i o nf r a g m e n tl e n g t hp o l y m o r p h i s m ，r f l p ) 、d n a 指纹图谱( d n af i n g e r p r i n t i n g ) 、 随机扩增的多态d n a ( r a n d o m am p l i f i e dp o l y m o r p h i s md n a ，r a p d ) 、微卫星( m i c r o s a t e l l i t e ，m s ) 、单核苷酸多态性( s i n g l en u c l e o t i d ep o l y m o r p h i s m s ，s n p ) 等。 r f l p 是指d n a 分子中的某种限制性内切酶的识别位点发生不同，导致限制性 内切酶的识别位点消失或是增加，所以酶切后生成的d n a 片段的长度也随之改变的 现象。例如在同一d n a 片段的某个碱基发生了突变，使突变所在部位的d n a 序列 产生( 或缺失) 某种限制性内切酶的位点。这样，利用该限制性内切酶消化此d n a 时，便会产生与正常不同的限制性片段，通过电泳即可检测。这样，在同种生物的 不同个体中，由于遗传差异，会出现不同长度的限制性片段类型。以此类多态性来 代表不同遗传背景的个体在此d n a 片段附近的差异，所以其可作为一种分子标记。 d n a 指纹图谱( d n af i n g e r p r i n t i n g ) ，动物中存在由几百个核苷酸对的单元重复 组成的重复序列，被称为“小卫星d n a ”。“小卫星d n a 具有高度的可变性，不同个 体彼此不同。但“小卫星d n a 中有一小段序y 0 贝, u 在所有个体中都一样，称为“核心 序列”。如果把核心序列串联起来作为分子探针，与不同个体的d n a 进行分子杂交， 就会呈现出各自特有的杂交图谱，它们与人的指纹一样，具有专一性和特征性，因 个体而异，因此被称作“d n a 指纹”( d n af m g e r p r i n t ) 。由于具有稳定的遗传性，那么 来自同一个种群的个体可能携带同样的小卫星序列，如同是商品的条形码一样，其 l o 北京协和医学院硕士研究生学位论文 即可作为分子标记。 r a p d 该技术建立于p c r 技术基础上，它是利用一系列的不同的随机排列碱基 顺序的寡聚核苷酸单链，通常为1 0 聚体作为引物，对所研究基因组d n a 进行p c r 扩 增。通过聚丙烯酰胺或琼脂糖电泳分离，检测扩增产物d n a 片段的多态性，这些扩 增产物d n a 片段的多态性反映了基因组相应区域的d n a 多态性。其所用的一系列引 物d n a 序列各不相同，但对于任一特异的引物，它同基因组d n a 序列有其特异的结 合位点。这些特异的结合位点在基因组某些区域内的分布如符合p c r 扩增反应的条 件，即引物在模板的两条链上有互补位置，且引物3 端相距在一定的长度范围之内 就可扩增出d n a 片段。因此如果基因组在这些区域发生d n a 片段插入、缺失或碱基 突变就可能导致这些特定结合位点分布发生相应的变化，而使p c r 产物增加、缺少 或发生分子量的改变。通过对p c r 产物检测即可检出基因组d n a 的多态性。 m s 是指由2 4 个碱基对不断重复而成的d n a 片断，又被称作短串连重复 ( s h o r tt a n d e mr e p e a t s ，s r r s ) 。根据微卫星序列两端互补序列设计引物，通过p c r 反应扩增微卫星片段，由于核心序列串联重复数目不同，因而能够用p c r 的方法扩 增出不同长度的p c r 产物，将扩增产物进行凝胶电泳，根据分离片段的大小决定基 因型并通过样本统计来计算等位基因频率。微卫星遗传标记具有以下一些优点：( 1 ) 一般检测到的是一个单一的多等位基因位点；( 2 ) 微卫星遗传标记呈共显性遗传，故 可鉴别杂合子和纯合子；( 3 ) 所需d n a 量少，只要可以进行p c r 反应，就可以用 于检测。( 4 ) 基因组中广泛而随机分布，多态性高。 s n p 主要是指在基因组水平上由单个核苷酸的变异所引起的d n a 序列多态性， s n p 在人类基因组中广泛存在，平均每5 0 0 - - 1 0 0 0 个碱基对中就有1 个，估计其总数 可达3 0 0 万个甚至更多。 综合分子标记的特点，我们可以认为微卫星遗传标记是利用微卫星遗传标记是 比较适宜代替m h c 区域等位基因的分子标记。限制性片断长度多态性r f l p 、d n a 指纹图谱( d n af i n g e r p r i n t i n g ) 、r a p d 这三种遗传标记所代表的多态性对于m h c 分 子而言，前两者过于有限，后者操作和设计过于烦琐。而s n p 不能作为m h c 基因多 态性标记，因为实际上m h c 基因的多态性就可以看作是单核苷酸多态性的组合，了 解了m h c 区域所有的单核苷酸多态性以及其组合就等于调查清了所有的m h c 等位 基因。只有微卫星遗传标记适宜作为代替等位基因的分子标记。 来代替等位基因的原理可以看做是路标与公路的关系，与特定等位基因紧密连 锁的微卫星位点可以看做是特定公路段上标记的路标，而该等位基因可以看做是一 段高速公路，遗传标记与等位基因共分离就如同路标固定于公路。个体恒河猴单体 型m h c 基因区域可以看作是北京到广州的一条公路路线，所有恒河猴的单体型 m h c 基因区域可以看作北京到广州的很多条公路网，不同基因座代表不同地理位置 的路段，而分布在不同基因座附近的微卫星位点可以看作是该地的路标，单个地理 北京协和医学院硕士研究生学位论文 位置可以有途径其的不同公路，所以路标也可以不同，在微卫星位点上就反映为重 复序列的不同。了解存在多少种不同的路标就知道同一地点存在多少条不同的公 路，那么指示同一个基因座的遗传标记有多少种类该基因座上就可能有多少不同的 等位基因。这些不同地点的路标组合起来构成了一个北京到广州的一条公路线路 图，那么不同基因座上的微卫星标记组合起来就构成了一种携带不同基因座上的特 定等位基因的单体型。这样可以对恒河猴m h c 区域或者全区域( 整个m h c 连锁的 单体型) 或者特定区域( 如某个基因座) 进行遗传同质性分类。 根据这一假设，我们必须选定与m h c 区域基因座上高度连锁的微卫星，即找到 固定在路段上的路标。这一工作，m c e c i l i at p e n e d o 等人已经做了探索【2 5 1 ，他们 对m h c 区域分布的8 个微卫星位点和其附近分布的m a m u a 矛t l m a m u b 的血清型以 及m h c i i 类分子m a m u - d r b 、m a m u d q a 、m a m u - d q b 各等位基因的连锁关系进 行了分析。发现这8 个微卫星标记中，d 6 s 2 8 7 6 和d r a c a 两个微卫星标记与两个标 记中间的m a m u d r b 、m a m u d q a 、m a m u - d q b 基因座上的等位基因连锁紧密，较 少出现重组。鉴于d r a c a 具有较多的等位基因，可以划分得更细，所以我们选择 其作为指示m h c i i 类分子的遗传标记。 最近，j a s o na w o j c e c h o w s k y j 等人又发现了与m a m u b 4 基因座高度连锁的 h 11 - 9 2 6 8 微卫星位点【2 6 l ，研究证明m a m u b 4 基因座上存在的m a m u b 宰1 7 基因总是与 h 11 - 9 2 6 8 微卫星上的2 3 5 b p 等位基因位点共分离，那么h 11 - 9 2 6 8 微卫星上的其他等 位基因可能指示m a m u b 4 基因座上的其他不同的等位基因。所以我们选择其作为指 示m a m u b 4 基因座的遗传标记。 遗憾的是其他m a m u - b 基因座位点和各m a m u - a 基因座附近高度连锁的微卫星 仍然没有被发现。由于中国恒河猴和印度恒河猴存在很大的遗传异质性，即地域隔 离造成的遗传异质性，因此有效区别两种地域来源的恒河猴也是必要的。依据d a v i d 提出的方法，利用包括3 个微卫星位点和1 个线粒体基因多态性在内的4 个性状中的3 个可以有效区分中国恒河猴和印度恒河猴，所以我们也将3 个微卫星位点纳入检测。 利用这5 个微卫星位点，我们可以首先在地域水平上区分来自中国和印度的恒 河猴种群，挑选同一地域的恒河猴进行实验。再在此基础上，对其m h c 基因区域进 行分析，选取携带同一微卫星遗传标记等位基因的恒河猴参与实验，减少遗传异质 性引起的误差。 本文中，我们利用此方法对5 2 只恒河猴进行了探索性的分析和分类，考察了这 些微卫星遗传标记在恒河猴中的基因频率，依据其共有的基因情况，可以依据不同 的需求制定入选恒河猴的标准，例如可以选择m h c i 类基因相同单体型或者m h c i i 类基因相同单体型或者包含相同m h c u i i 类基因单体型的恒河猴参与实验，如果有 可能，甚至可以选择单体型相同的纯合子参与实验，当然选择m h c - h i 类基因紧密 连锁的单体型需要在家系完整的情况下根据基因的共分离判断。其次，此检测方法 1 2 北京协和医学院硕士研究生学位论文 的建立可以对恒河猴的繁殖管理提供参考，例如选择含有相同单体型的恒河猴进行 繁殖，建立封闭群，这样可以确保恒河猴在一个相当的种群中维持遗传的同质性和 多样性的稳定，防止近交系数上升。并为进一步阐明m a m u 基因的各等位基因具体 序列和其它遗传信息奠定基础。此外，此种检测方法的建立，尤其是m h c 区域遗传 标记的应用可以为进一步考察m h c 等位基因的具体信息提供奠定基础，例如选择不 同单体型的恒河猴参与m h c 等位基因调查，减少重复考察的几率。又如根据微卫星 基因在恒河猴基因组中的定位逐步定位与之高连锁m h c 基因座的区域。总之，该方 法的建立将推动恒河猴在动物实验中的应用，并且为恒河猴遗传学的深入研究提供 参考信息。 北京协和医学院硕士研究生学位论文 一、实验材料 1 研究对象 材料与方法 1 ) 实验动物与组织：5 3 只恒河猴，来自实验动物研究所卢耀增教授课题组和 实验动物研究所病毒研究室。 2 ) 甲醛固定样本：来自于实验动物研究所病理室。 2 质粒 p u c l 9 一s v d 质粒：来自实验动物研究所新发病原中心李万波教授馈赠。 3 主要化学试剂、试剂盒及应用软件 化学试剂、试剂盒及应用软件 普通r t a q 酶 高保真p 丘卜t a q 酶 蛋白酶k d l 2 0 0 0 ，d l l 5 0 0 0 酚氯仿 氯仿 异丙醇