（生物化学与分子生物学专业论文）运动过程中的羰基应激.pdf

摘要 随着现在竞技运动水平的提高和竞技比赛的节奏加快，高水平运动 队( 员) 之间的较量越来越受到疲劳和伤病的影响，运动性疲劳的积累 往往是造成伤病的主要原因之一。阐明运动性疲劳发生发展的机制对如 何采取有效的各种手段消除运动性疲劳有着重要的指导意义。 m d a 及相关毒性醛酮是机体运动过程中因氧化应激而形成的脂质过 氧化产物，是运动应激中重要的指标或所谓“运动应激因子 ( e x e r c i s e s t r e s sf a c t o r s 、e s f s ) 。也是自由基氧化和非酶糖基化在体内能量代谢过程 中必然发生的两大类生化副反应所产生的最具代表性的活性羰基类物质 之一。m d a 作为脂质过氧化过程中产生的一种含有两个羰基的化合物， 时时刻刻都伴随在生命活动的物质代谢和能量代谢之中。由于活性羰基 能与氨基( 巯基更易) 发生共价交联，即羰氨反应，因此，m d a 能与蛋 白质、核酸进一步发生交联反应，造成机体内蛋白、脂质和核酸等生物 大分子发生广泛而缓慢的不可修复性损伤。这也是说明羰基对机体的毒 化损伤无时不在，无处不在。 体内对抗氧化应激有三道防御系统，其中抗羰基应激体系是核心防 御体系，其对活性羰基类物质的共轭清理和降解是对抗氧应激伤害的关 键。因此，基于运动性疲劳形成的原因和羰基应激学说的核心理论，我 们提出“羰基应激是运动性疲劳形成的关键环节”的观点。本研究主要 以羰基应激衰老学说为理论基础，将活性羰基类物质m d a 引入研究体 系，建立羰基应激和去羰基应激的运动动物实验模型，运用实验室成熟 的红细胞模型，以羰基应激为切入点，通过确定羰基应激和去羰基应激 的一系列实验，以羰氨反应为线索，探讨运动性疲劳形成的机制和可能 存在的途径。 由于运动中m d a 大量增加，毒性作用增强，并且基于血液储存过程 中粘度不断增加，我们对羰基应激与血液粘度改变的相关性做了研究； 建立红细胞羰基应激实验模型，采用血液粘度测量、扫描电镜观察、荧 光偏振度检测和液相色谱质谱联用( l c m s 。e s i ) 等方法，从红细胞的表 观粘度、形态学、羰基蛋白含量、膜流动性及产物鉴定等诸多方面，对 血浆和红细胞两个影响血液粘度的重要因素的分别探讨；并选用含有氨 基和巯基的生物活性小分子( 谷胱甘肽、牛磺酸、褪黑素和赖氨酸) 进 行抗羰基应激防御体系的初探，建立大鼠跑台力竭运动的疲劳模型，研 究了牛磺酸和赖氨酸对m d a 的捕获作用；考虑到运动性疲劳形成过程中 氨基酸代谢引人注目，我们探讨了不同浓度的赖氨酸在不同p h 值的条件 下与m d a 反应情况，并探讨补充赖氨酸对运动大鼠抗疲劳的影响。 结果表明： 1 、m d a 处理组的红细胞悬浮液表观粘度的明显增高，g s h 则可使 红细胞表观粘度值下降；1 0 m m o l lm d a 处理后造成红细胞形态发生聚 集，g s h 能使聚集红细胞分散；g s h 能显著性降低红细胞膜蛋白羰基含 量( 氏o 0 1 ) ；5 0m m o l l m d a 可使红细胞膜的荧光偏振度和微粘度上升； 2 0 、5 0 、1 0 0 m m o l l 的g s h 均可降低红细胞膜的荧光偏振度和微粘度。 除2 0 m m o l l 的g s h 处理与对照比较未达到显著水平( p 0 0 5 ) 外，其余各 处理与对照比较均达到极显著水平妒 o 0 5 ) ；力竭运动后大鼠的m d a 含量显著地升高 ( o 0 1 ) ，s o d 活性、g s h 含量和总c a 2 + 浓度均显著地降低( r 0 0 1 ) ， 补充牛磺酸能使这种变化的幅度显著减小( 正o 0 1 ) 说明牛磺酸具有抗羰 基应激作用且能保护线粒体机能。 3 、在赖氨酸体系中，赖氨酸与m d a 的反应产物在4 0 0 n m 附近产生了 一个新的紫外吸收峰，且m d a 浓度及反应时间与紫外吸收峰值均呈正相 关；随着时间延长，在p h 7 4 的环境下紫外吸收峰值的升高最快。运动能 增加大鼠体内氨基酸代谢，并使游离赖氨酸和a 的浓度升高，补充赖 氨酸能显著降低急性力竭运动后大鼠m d a 的含量。 综上所述，通过对m d a 羰基毒性和去羰基毒性的研究，我们认为“运 动应激因子”中羰基类物质的羰氨反应是运动性疲劳形成的原因之一。 关键词：活性羰基类物质，羰基应激，丙二醛，氧化应激，运动性 疲劳，生物活性小分子 i i i a b s t r a c t w i t ht h ei n t e n s i t yi n c r e a s ea m o n gt e a m sa n da t h l e t i c si nh i 曲l e v e ls p o r t c o m p e t i t i o n s ，t oa v o i df a t i g u ea n d 岫u r yb e c o m em o r ea n dm o r ei m p o r t a n t f o ra c h i e v i n gv i c t o r i e s t h ea c c u m u l a t i v ee x e r c i s ef a t i g u ei so n eo ft h em a i n c a u s e so fa t h l e t i c s i n j u r y t ou n d e r s t a n da n dc l a r i f yt h em e c h a n i s mo f d e v e l o p m e n t o f f a t i g u em a yh e l pe f f e c t i v e l ye l i m i n a t i n g d i f f e r e n t e x e r c i s e i n d u c e df a t i g u ea n dt h u sh a v e g r e a ti m p o r t a n c ei nt h ef i e l d m d ai sa ni n t e r m e d i a t ep r o d u c e dd u r i n gt h e p r o c e s s o fp h y s i c a l a c t i v i t i e sd u et oo x i d a t i v es t r e s sa n dl i p i dp e r o x i d a t i o n i ti sa ni m p o r t a n t i n d e xo fe x e r c i s ea n ds t r e s s e s ，o rt h es oc a l l e d ”e x e r c i s es t r e s sf a c t o r s ( e s f s ) m d a - r e l a t e dt o x i cc a r b o n y l sc a ni n e v i t a b l e l yf o r m e df r o mt h es i d e - r e a c t i o n s o ft h ef r e er a d i c a lo x i d a t i o na n dn o n e n z y m a t i cg l y c o s y l a t i o no fe n e r g y m e t a b o l i s m m d a ，a sar e p r e s e n t a t i v ep r o d u c tc o n t a i n i n gt w oc a r b o n y l g r o u p s ，i sd e t e c t e dc o n s i s t e n t l yw i t ho x i d a t i v es t r e s sa n dg l y c a t i o ns t r e s s d u r i n ge n e r g ym e t a b o l i s m i t sr e a c t i o nc o v a l e n t l yw i t ht h ea m i n og r o u p ( m o r ea c t i v e l yw i t ht h i 0 1 ) t oc a u s ec r o s s l i n k i n go fd i f f e r e n tb i o m o l e c u l e s ，i s k n o w na st h e c a r b o n y l - a m i n or e a c t i o n s u c hr e a c t i o nw i t hp r o t e i n s ，n u c l e i c a c i d sa n df u r t h e rc r o s s - l i n k i n gw i t ho t h e rb i o l o g i c a lm a c r o m o l e c u l e sh a v e b e e nf o u n dt oi n d u c ee x t e n s i v ea n di r r e p a r a b l e i n j u r y s u c hc a r b o n y l p o i s o n i n gi n j u r i e sm a yp r e s e n te v e r y w h e r ea n de v e r y d a yi nh u m a nb o d y h u m a nb o d yp r e v e n t so x i d a t i v es t r e s sw i t hm a i n l yt h r e ed e f e n s es y s t e m s ， n a m e l ya n t i - o x i d a t i v es t r e s s ，a n t i - c a r b o n y ls t r e s sa n dr e p a i r i n gs y s t e m s t h e i v a n t i c a r b o n y ls t r e s ss y s t e mi st h ec e n t r a ld e f e n s es y s t e m w i t ha s s is t a n c eo f g l u t a t h i o n e ，c a r b o n y lc o m p o u n d sc a l lb ec l e a r e da n dd e g r a d e dt h u st op r e v e n t o x i d a t i v es t r e s s i n j u r y t h e r e f o r e ，b a s e do nt h em e c h a n i s ms t u d i e so f e x e r c i s e - i n d u c e d f a t i g u e ，a n dc a r b o n y ls t r e s st h e o r y , w ep r o p o s et h a tt h e c a r b o n y ls t r e s sm a yb ea l li m p o r t a n tk e yt ou n d e r s t a n dt h ee x e r c i s e i n d u c e d f a t i g u e t h i ss t u d yi sa i m i n gt oa p p l y i n gc a r b o n y ls t r e s st h e o r yo fa g i n ga s t h et h e o r e t i c a lb a s i st oi n v e s t i g a t et h et o x i c i t yo ft h ec a r b o n y l s u b s t a n c e s ， s u c ha sm d a ，i na n i m a le x e r c i s e i n d u c e df a t i g u em o d e l s r e db l o o dc e l l s m o d e lh a sa l s ob e e na p p l i e dt os t u d yc a r b o n y ls t r e s s t h r o u g hm e a s u r e m e n t o fc a r b o n y ls t r e s s ，v a r i o u sa n t i - f a t i g u ec h e m i c a l sw e r ea l s ou s e di nas e r i e so f e x p e r i m e n t st oe x p l o r et h ep o s s i b l em e c h a n i s mo fe x e r c i s e i n d u c e df a t i g u e as i g n i f i c a n ti n c r e a s eo fm d a r e l a t e d t o x i c i t ym a y i n c r e a s ed u r i n g e x e r c i s ea n db l o o ds t o r a g e as i m p l e e x p e r i m e n t a lm o d e lo fe r y t h r o c y t e s c a r b o n y ls t r e s sw a se s t a b l i s h e d f r o mv i s c o s i t ya n d m o r p h o l o g yo fr e db l o o d c e l l s ，t h ep r o t e i nc a r b o n y lc o n t e n ta n df l u i d i t yo fm e m b r a n el i p i da n dm a n y o t h e ra s p e c t sw e r ei n v e s t i g a t e d t h em d a i n d u c e dc a r b o n y ls t r e s sw a s a s s a y e db ys t u d y i n gt h eb l o o dv i s c o s i t y , t h ee l e c t r o m i c r o s c o p i cm o r p h o l o g y o f e r y t h r o c y t e s ，p r o t e i nc a r b o n y lc o n t e n ta n df l u o r e s c e n c ep o l a r i z a t i o no f m e m b r a n eo f e r y t h r o c y t e s ，a n a l y s i so fp r o d u c t i o n sb yl c m s e s i t h e r e l a t i o no fc a r b o n y ls t r e s sa n db l o o dv i s c o s i t yc h a n g e sh a sa l s ob e e n s t u d i e d d i f f e r e n ta m i n oa n dm e r c a p t oc o n t a i n i n gs m a l lm o l e c u l e sh a v eb e e na p p l i e d f o ra n t i c a r b o n y l a t i o ni nt h ed e f e n s es y s t e m t h er a te x h a u s t i v ee x e r c i s e v t r e a d m i l lf a t i g u em o d e lw a se s t a b l i s h e d ，a n dg l u t a t h i o n e ，t a u r i n e ，l y s i n ea n d m e l a t o n i nw e r et a k i n gi n t oa c c o u n ti nt h ee x e r c i s e - i n d u c e df a t i g u ei na m i n o a c i dm e t a b o l i s m d i f f e r e n tc o n c e n t r a t i o n so fl y s i n ea td i f f e r e n tp ht i n d e r d i f f e r e n tc o n d i t i o n so fm d aw e r ea l s oi n v e s t i g a t e di nt h es p o r t r e l a t e df a t i g u e s i t u a t i o n t h er e s u l t ss h o w e dt h a t ： 1 m d at r e a t e dr e db l o o dc e l ls u s p e n s i o ns i g n i f i c a n t l yi n c r e a s e db l o o d v i s c o s i t y ；g s h d e c r e a s e d a p p a r e n t l yt h ev i s c o s i t yo fr e d b l o o dc e l l s ； 10 m m o l lm d ac a u s e dr e db l o o dc e l l s a g g r e g a t i o nm o r p h o g e n e s i sa f t e r t r e a t m e n t ；g s hc a nr e v e r s es c a t t e r e dr e db l o o dc e l l s ；g s hc a ns i g n i f i c a n t l y l o w e re r f i h r o c y t em e m b r a n ep r o t e i nc a r b o n y lc o n t e n t ( p o 0 5 ) c o m p a r e dw i t ht h ec o n t r o l ，t h er e s to ft h et r e a t m e n tc o m p a r e dw i t ht h ec o n t r o l r e a c h e dt h es i g n i f i c a n tl e v e l ( p 0 0 5 ) a f t e re x h a u s t i v ee x e r c i s es i g n i f i c a n ti n c r e a s ew e r e v i o b s e r v e dw i t hm d a l e v e l s ( p o o1 ) a n ds o da c t i v i t y h o w e v e rg s hc o n t e n t a n dt o t a l c a 2 + c o n c e n t r a t i o n sw e r e s i g n i f i c a n t l yr e d u c e d ( p c g h 一菇甚 c 岳过 c n 。u 卫- - - x 3 ，u n 二 龟卫 。卫二 图1 - 9 碱催化条件下羰基与亲核试剂( n u 一) 的加成反应 3 2 活性羰基类物质作用的机制 尽管羰基化学物有很多种，但是，生物机体内能自发生成，且对机体 功能具有重大影响的主要还是一些具有很强反应活性的醛酮类物质，尤其 是醛类物质，如丙二醛( m a l o n d i a l d e h y d e ，m d a ) ，4 羟基壬烯醛 ( 4 - h y d o x y l n o n e n a l ，h n e ) 、乙二醛( g l y o x a l ，g o ) 、甲基乙二醛( m e t h y l g l y o x a l ，m g o ) 等。醛类修饰生物结构的方式，主要有：修饰非蛋白质 巯基化合物和蛋白质的巯基( s u l f h y d r y lg r o u p ) ；修饰低分子量胺、氨 基酸、蛋白质或核酸的氨基( a m i n og r o u p ) 。 总体而言，链醛、2 链烯醛和0 【酮醛主要攻击氨基和巯基；它们的效 应不仅存在于能量代谢、而且也存在与核酸和蛋白质的生物合成的过程， 甚至还存在于有丝分裂的过程。 ( 1 ) 醛类能与半胱氨酸( c y s t e i n e ) 的巯基反应，生成噻唑烷酸 ( t h i a z o l i d i n e c a r b o x y l i ca c i d ) 。具体而言，还会有希夫氏碱( s c h i f f sb a s e ) 博士学位论文 和半硫代半缩醛( h e m i m e r c a p t 0 1 ) 等中间产物的生成，但还是可以认为终 产物噻唑烷酸是通过希夫氏碱环化形成的。如图1 1 0 。 r t 量o ：一。辫s 婆命咖一 图1 1 0 链醛与半胱氨酸的巯基反应生成噻唑烷酸 ( 2 ) 醛类与氨基反应形成希夫氏碱或亚胺基类化合物( i m i n o c o m p o u n d s ) ，该反应具有广泛的生物功能，如与蛋白质氨基的反应是导 致蛋白质交联的重要原因。如图1 1 1 。 图1 1 1链醛与蛋白质氨基反应导致蛋白质交联 链醛可逆地与蛋白质反应，诱导酶的失活以及最终的肿瘤抑制效应 等，主要是通过抑制蛋白质的生物合成以及抑制氨基酸r n a 合成酶的活 性来实现的。 活性羰基类物质的主要来源是氧自由基与不饱和脂肪酸发生脂质过 氧化反应过程中的非自由基产物，包括中间产物和终产物。目前从不饱和 脂肪酸自氧化过程所生成的一系列脂质过氧化物中，已鉴定出了多种羰基 类物质。见表1 1 。 一 毗c i h ：卜 运动过程中的羰基应激 表1 1脂过氧化中发现的羰基类物质 类别主要的羰基类物质 2 一丁烯醛、2 一戊烯醛、2 一己烯醛、2 一辛烯醛、 单烯醛 2 一壬烯醛、2 一癸烯醛、2 一十一烯醛 2 ，4 一庚二烯醛、2 ，4 一辛二烯醛、2 ，4 一壬二烯醛、2 ，4 一癸二烯醛、 多烯醛 2 ，4 ，7 一癸三烯醛 酮醛类2 一酮基己醛、2 一酮基庚醛、2 一酮基壬醛 羟烯醛类4 一羟基一2 一己烯醛、4 一羟基一2 一辛烯醛、4 一羟基- 2 - 壬烯醛 其他烯醛类4 一过氧一2 一壬烯醛 3 3 脂质过氧化物形成羰基类物质的机制 从脂氢过氧化物形成羰基类物质的机制有多种，其主要机制是：脂氢 过氧化物任意一边的c c 键发生均裂。该反应历程经过脂烷氧基自由基 一 上一上上 中间体，同时痕量还原态的过渡金属离子如f e 一、c o “或c u 。能极大的促 进反应进行( 见反应1 ，反应2 ) 。 r 1 - 5 , - h _ 1 ：2 b o h ， r l 一啡r 2 ，r l 四。+ r 2 b 、r i + r 2 c h o ( 1 ) 七蚪 + n n c h o ( 2 ) 除了c c 键均裂外，链烯自由基可捕获氢原子生成链烯，或与一个 羟自由基结合形成醇，该醇能重排生成羰基类物质；或与氧反应生成氢过 氧化物，它能分解成醇，然后形成羰基类物质( 反应3 ) 。我们称之为第 二种机制。 博士学位论文 r c h = c h o 0 ( 3 ) 除了裂解，脂肪酸氢过氧化物还能发生许多保持母链长度的反应，这 些反应重排生成环氧羟基的、酮羟基的和二羟基的脂肪酸。进一步氧化能 生成二氢过氧化脂肪酸和氢过氧化环二氧化物。后者尤为重要，因为它 很可能是机体发生了过氧化的生物样品中m d a 的主要来源。这就是脂质 过氧化产生应激醛的第三种机制。见图1 1 2 。 图1 1 2 脂质过氧化产生应激醛的第三种机制 m d a 在体内的代谢有其独特的途径。在大鼠的肝脏中，通过线粒体 脱氢酶将m d a 转化为丙二酸半醛( m a l o n i ca c i ds e m i a l d e h y d e ) ，而丙二 酸半醛能自发脱去羰基，生成乙醛。乙醛在醛脱氢酶的作用下，生成乙酸 盐，进一步生成c 0 2 和h 2 0 。在小鼠肝脏中，丙二酸半醛是在胞浆中的醛 运动过程中的羰基应激 脱氢酶作用下生成的。另外，有一小部分的m d a 在肝脏中被氧化成丙二 酸盐，该物质转化成丙二酰辅酶a ，再脱去羰基生成乙酰辅酶a 。 尽管人体大部分的4 h n e 、m d a 等应激醛能被肝、胸腺细胞等转化 成其它无毒物质排至体外，但m d a 和4 h n e 等能在生理条件下与几乎所 有的重要生物分子( 如蛋白质、核苷酸) 自发反应。而且在代谢应激醛能 力不强的器官、组织中会有4 h n e 、m d a 等缓慢积累；特别是机体在进 行大强度长时间的运动时，应激醛急剧增多，而代谢能力有限，必然造成 m d a 等应激醛的大量积聚。此外，在炎症、许多疾病如动脉粥样硬化、 传染病、糖尿病等病理过程中，m d a 和4 h n e 产生的量也会增多。这都 使4 h n e 、m d a 等与生物大分子的反应机率大大增加，造成羰基应激的 损害加大。所以羰基应激对生物体的损害是广泛存在的，尤其是剧烈运动 后造成较长时间的m d a 等醛类积聚。 4 能捕获羰基的生物活性小分子 由于m d a 符合前期“运动应激因子 的基本条件，而且根据m d a 羰基应激的特点，凡含有巯基、氨基的小分子化合物自然成为我们在运动 性疲劳研究中重点关注的对象。我们将这些能捕获羰基的小分子称为活性 生物小分子( 如图1 1 3 ) ，包括谷胱甘肽( g s h ) 、牛磺酸( t a u r i n e ) 、赖 氨酸( l y s i n e ) 和褪黑素( m e l a t o n i n ) 等。 吣父久 6 hh 由h o h s 0 n h j o h i i o 谷胱甘肽结构式 o i i 一墓v n h 2 牛磺酸结构式 博士学位论文 褪黑素的结构式赖氨酸结构式 图1 1 3 活性小分子结构示意图 4 1 谷胱甘肽 谷胱甘肽( g s h ) 是由谷氨酸、半胱氨酸和甘氨酸经肽键缩合而成的 含巯基的三肽，在人体和动物红细胞、肝脏和眼睛晶状体中含量均较高 4 5 1 。g s h 在细胞生物过程中起着重要的作用【4 6 1 ，是细胞自由基防御系统 中的一个重要物质，它能有效清除生物氧化产生的自由基4 7 4 8 1 ，使暴露于 氧化环境的细胞膜免受自由基损害，以维持细胞内环境的稳定4 9 1 。其抗 氧化作用有助于蛋白巯基维持还原状态，防止因巯基氧化而导致的蛋白质 变性( 如血红蛋白) ，还可以维持含巯基酶( 如a t p 酶) 的活性状态【4 7 1 。g s h 可以作为g s h p x 的底物，进而抑制脂质过氧化。在代谢过程中红细胞经 常产生少量的h 2 0 2 ；在炎症和免疫的呼吸爆发过程中白细胞制造出来大 量的h 2 0 2 。h 2 0 2 可有效地杀伤病原体，但也会造成正常细胞尤其是红细 胞膜的巯基、氨基以及细胞膜上的磷脂分子中的不饱和脂肪酸发生氧化反 应，产生脂质过氧化物，进一步和膜蛋白发生反应，而使红细胞膜遭受损 伤而发生溶血【5 0 - 5 1 1 。以g s h 为底物的g s h p x 通过催化h 2 0 2 生成h 2 0 ， 催化脂质过氧化物生成相应的醇，从而避免了对红细胞的损伤【5 2 1 。 4 2 牛磺酸 牛磺酸( t a u r i n e ，t a u ) 又名牛胆素，是名贵中药“牛黄”的主要成分 运动过程中的羰基应激 之一，它不仅存在于胆汁中，亦广泛存在于所有动物的组织细胞内。牛磺 酸具有广泛的生理功能，在防治动脉粥样硬化、高血压、糖尿病、阿尔茨 海默病等老年退行性疾病有重要的作用5 3 1 。许多研究表明t a u 具有抗氧 化，清除自由基的能力 5 4 - 5 6 】，其抗氧化清除自由基的机理仍在进一步研究 中。t a u 另一个重要功能就是降低糖基化反应，中和具有反应活性的醛或 者羰基类物质，其反应机制涉及到t a u 的氨基与毒性类物质的羰基反应 【5 刀。因此t a u 能清除这些不饱和醛酮，抑制羰氨反应的发生，对防病抗病 及延缓机体衰老有重要的作用。 4 3 赖氨酸 赖氨酸( l y s i n e ，k y s ) 分子中含有两个氨基，一个羧基，呈碱性，属 于碱性氨基酸，是人体必需氨基酸之一。赖氨酸为合成肉碱提供结构 组分，而肉碱会促使细胞中脂肪酸的合成。赖氨酸能提高钙的吸收及 其在体内的积累，加速骨骼生长。赖氨酸在医药上还可作为利尿剂的 辅助药物，治疗因血中氯化物减少而引起的铅中毒现象，还可与酸性 药物( 如水杨酸等) 生成盐来减轻不良反应，与蛋氨酸合用则可抑制 重症高血压病，也可用于治疗糖尿病及其并发症【5 8 1 。 l 赖氨酸是控制人体生长的抑长素中最重要的成份，对人的中枢 神经和周围神经系统都起着重要作用。人体补充足够的l 赖氨酸可以 提高食物中其他蛋白质的吸收和利用，达到均衡营养，促进生长发育。 运动前大量补充氨基酸提高运动能力的报道很多，但是氨基酸在运动 过程中作为能源物质提供能量令人质疑，人们在小鼠和人类的尿液中 发现m d a 与赖氨酸结合后以n - 2 丙烯醛赖氨酸和n o 【乙酰酯两种物质 博士学位论文 形式存在，这就表明在体内m d a 主要是作用于蛋白质中的赖氨酸残基， 启动了机体“抗羰基应激 的防御体系，通过补充外源性氨基酸竞争 性地与活性羰基类物质发生羰一氨反应以保护机体组织蛋白免受伤 害，这可能是以l 赖氨酸为主要成份的复合氨基酸补剂抗疲劳的主要 机制之一。 4 4 褪黑素 褪黑素( m e l a t o n i n ，m t ) 即5 甲氧基n 乙酰吲哚乙胺，m t 能有效 地促进生理性睡眠冲动，改善睡眠质量和脑电活动，具有恢复和矫正机体 生物钟的功能。m t 依赖于其吲哚上的5 位甲氧基，其侧链上乙酰基具有 协同作用可以清除人体内在氧化过程中产生的对人体有害的自由基【5 9 1 ； 可增加对病毒自然杀伤细胞( n k ) 的细胞活性，促进白细胞介素( i l 2 ) 合成，从而提高免疫功能6 0 - 6 5 1 。m t 用于肝炎、高血压、糖尿病，肿瘤等 病人的m t 分泌紊乱的辅助治疗，能显著缩短病程或改善生活质量。m t 通过维护大脑细胞，促进睡眠中枢的活动，清除脑内脂质过氧化物质，保 护大脑细胞修复细胞能量代谢，促进机体生长、延缓衰老过程 6 4 , 6 6 - 6 8 】。 考虑到运动过程中大量产生的m d a 与蛋白氨基和巯基反应活性很 强，很容易攻击生物大分子产生细胞毒性，导致细胞功能的紊乱和机体疲 劳。所以，本研究试图从羰基应激和去羰基应激的角度来解释运动性疲劳 的发生机制。 运动过程中的羰基应激 5 本文实验设计思路 综上所述，在运动性疲劳形成过程中，人体运动能力逐渐衰退下降的 特征与衰老过程极其相似。在对 运动应激因子”的研究中，发现m d a 实际上与运动强度与运动时间密切相关，也就是说，作为羰基应激中主要 代表物m d a 可能就是我们一直在寻找的“运动应激因子”，并且很有可 能在运动性疲劳发生发展过程起着极其重要的作用。本研究借鉴衰老研究 领域中最新研究成果羰基应激衰老学说的核心理论基础，以羰基应激 为切入点，通过确定羰基应激和去羰基应激的一系列实验，以羰氨反应为 线索，探讨运动性疲劳形成的机制和可能存在的途径。 长时间大强度的有氧运动中，运动员心肺功能的高低对耐力运动成绩 影响很大，特别是血液中红细胞的功能正常对运动员有氧运动能力至关重 要 6 9 - 7 1 】。血液储存过程中血液粘度的升高是由羰基应激介导的。那么在运 动过程中大量产生的毒性羰基物质的必然对血液粘度影响很大。基于血液 储存过程中粘度不断增加的实验结果，考虑到自由基氧化和非酶糖基化等 生物体内不可避免的生化副反应，我们通过对羰基应激与血液粘度改变相 关性研究，试图通过对血浆和红细胞两个影响血液粘度的重要因素的分别 探索，解释运动过程中血液粘度的增高与红细胞的氧化应激的关系；从而 进一步证实我们的推断：氧化应激相关的血液粘度变化是通过羰基应激介 导的，运动中血液粘度的持续升高可能是运动性疲劳的原因之一。 从去羰基应激的角度，采用含有氨基和巯基的生物活性小分子( 如谷 胱甘肽，牛磺酸、赖氨酸和褪黑素) ，进行抗羰基应激防御体系的初探。 为了进一步证实m d a 羰基活性，我们观察了富含氨基结构的活一陛小分子 博士学位论文 褪黑素对m d a 的捕获作用。考虑到运动性疲劳形成过程中，氨基酸代谢 引人注目【7 2 - 7 4 1 ，运动过程中异常的氨基酸代谢是否有其他原因? 故我们选 择了赖氨酸为研究手段，探讨了不同浓度的赖氨酸在不向p h 值的条件下 与m d a 反应情况，并结合动物实验探讨补充赖氨酸对运动大鼠抗疲劳的 影响。 m d a 具有很强的生物毒性，能与蛋白质、氨基酸等生物分子发生羰 氨反应，造成生物分子功能性损伤。m d a 也是机体运动过程产生的最有 代表性的醛类物质，而且对运动强度具有一定的依赖性，极可能是我们寻 找的“运动应激因子 之一。故本研究主要以羰基应激衰老学说为理论基 础，将活性羰基类物质m d a 引入研究体系，建立羰基应激和去羰基应激 的动物实验的运动模型，运用实验室成熟的红细胞模型，探讨m d a 对红 细胞和其他组织的羰基应激作用，并对赖氨酸、谷胱甘肽和牛磺酸等生物 活性小分子的去羰基应激作用的进行实验，为试图解释运动应激中机体疲 劳和运动能力下降的机制提供理论依据。 运动过程中的羰基应激 第二章红细胞羰基应激及谷胱甘肽的保护作用 1 前言 。 谷胱甘肽是生物体内重要的含巯基的三肽，在人体肝脏、眼睛晶状体 及红细胞中含量较高 7 5 1 。考虑到血液中的红细胞是自由基氧化7 司和非酶 糖基化应激首当其冲的细胞，本文研究了脂质过氧化中间产物m d a 对红 细胞的羰基应激损伤以及g s h 的抗羰基应激作用。本实验选用成熟的红 细胞羰基应激模型，采用血粘测量、电镜扫描、羰基化蛋白含量测定以及 荧光偏振度检测等方法，从红细胞表观粘度、红细胞形态、红细胞膜上羰 基化蛋白含量以及红细胞膜脂流动性等指标上研究了m d a 对红细胞组织 的羰基应激过程以及谷胱甘肽的保护作用。 2 材料与方法 2 1 材料 四甲氧基丙烷( t m p ) ，购f l u k a 公司( 瑞士) ；g s h 、l ，6 二苯基1 ，3 ， 5 三己烯( d p h ) 均购于s i g m a 公司( 美国) ；盐酸胍g e n v i e w 分装购于北 京鼎国生物技术有限公司；羟乙基哌嗪乙磺酸( h e p e s ) ；2 ，4 二硝基苯肼 ( d n p h ) ；三氯乙酸( t c a ) ；乙酸乙酯；配制磷酸缓冲液( p h7 4 ) 的磷酸 氢二钠、磷酸二氢钠等试剂均为国产分析纯；新鲜悬浮红细胞( 悬浮于复 方枸橼酸注射液中) 、血浆购于长沙市血液中心。 2 0 0m m o l lm d a 储存液的配置：将0 3 3 8 m lt m p 与2m l1t o o l l 的h c l 混合，并在4 0 水浴约2m i n ，水解得到加a ，然后置于冰浴上加 0 4m l6t o o l l 的n a 0 h 调至p h = 7 4 ，力 j k p h 值为7 4 1 约h e p e s 缓冲液或 磷酸缓冲液定容至1 0m l ( 现配现用) 。 博士学位论文 2 2 仪器设备 d v i l l + 锥板式血液粘度计( 美 虱b r o o k f i e l d 公司) ；l a m b d a b i o4 0 型紫 外可见分光光度计( 美l 雪p e r k i n e l m e r 公司) ；j s m 6 3 6 0 l v 扫描电镜( 日本 t e o l 公司) ；f - 4 5 0 0 型荧光分光光度计( 日本h i t a c h 公司) ；d 3 7 5 2 0 高速冷 冻离心机( 德l 雪h e r a u sb i o f u g e 公司) 。 2 3 方法 2 3 1 两种红细胞悬浮液表观粘度的测定 将新鲜的红细胞分别悬浮于血浆和皿p e s 缓冲液中，红细胞压积为 4 0 。分5 个处理组：1 ) 空白对照组；2 ) m d a 处理组，p a m d a 分别处 理两种红细胞悬浮液，m d a 终浓度为1 0m m o l l ；3 ) g s h 处理组，以 g s h 分别处理两种红细胞悬浮液，g s h 终浓度为0 5 、l 、5m m o l l ；4 ) 先力i g s h 后i j h m d a 组，两种红细胞悬浮液中先加入g s h ( 最终浓度为0 5 、 1 、5m m o l l ) ，3 7 。c 水浴1 5m i n 后加入m d a ( 最终浓度为1 0m m o l l ) ； 5 ) 先 j n m d a 后力n g s h 组，两种红细胞悬浮液中先加入加a ( 最终浓度为 1 0m m o l l ) ，3 7 。c 水浴1 5m i n 后加入g s h ( 最终浓度为0 5 、1 、5 m m o l l ) 然后将各组置于3 7 c 水浴3 0m i n 后用d v i i i 锥板式粘度计测定其不同剪 切率( 1 0 0 4 0 0s 。) 下的表观粘度，t 扫r h e o c a l c 3 2 软件记录和处理相关数 据。 2 3 2 红细胞形态学检测 取新鲜的悬浮红细胞用0 9 生理盐水清洗3 次，得到压积红细胞， 然后分为4 组，按以下操作分别进行不同处理：1 ) 空白对照组；2 ) m d a 处理组，m d a 处理压积红细胞，终浓度为1 0 m m o l l ；3 ) 先力n g s h 后加 运动过程中的羰基应激 m d a 组，压积红细胞中先j j i n g s h ( 最终浓度为5 0m m o l l ) ，3 7 。c 水浴 1 5m i n 后加入m d a ( 最终浓度为1 0 m m o l l ) ；4 ) 先j j i m d a 后；0 1 g s h 组， 压积红细胞中先加入m d a ( 最终浓度为1 0m m o l l ) ，3 7 c 水浴1 5m i n 后 力i , n g s h ( 最终浓度为5 0m m o l l ) 。处理好之后将红细胞涂布于小盖玻片 上，接着用3 戊二醛4 。c 固定2h ；然后用磷酸缓冲溶液冲洗3 次，每次 间隔1 0m i n ；再依次用3 0 ，5 0 ，7 0 ，9 0 ，1 0 0 ，1 0 0 ，10 0 乙 醇脱水各1 0m i n ；玻片置于叔丁醇中浸泡2h 后置于冷冻干燥仪中干燥， 喷金后在j s m 6 3 6 0 l v 扫描电镜下观察并拍照 2 3 3 红细胞膜的提取 取新鲜的悬浮红细胞按l ：2 的比例加入生理盐水，20 0 0r m i n 离 心1 0m i n 后吸去上层清液，重复2 次得压积红细胞。按1 ：1 0 比例加入预 冷的双蒸水并轻轻摇匀，置于4 冰箱中2h 以上，使其充分溶血。然后混 匀，于60 0 0r m i n 离心1 0m i n ，反复离心5 次，直至沉淀部分呈乳白色， 得到红细胞膜，置于2 0 冰箱中备用。 2 3 4 红细胞膜羰基化蛋白的测定 在文献7 7 1 的方法上略有改进。取上述提取的红细胞膜加磷酸缓冲液 悬浮分成3 组： 1 ) 空白对照组( 红细胞膜仅加磷酸缓冲液) ；2 ) m d a 处理 组( m d a 最终浓度为1 0m m o l l ) ；3 ) g s h ) ) i m d a 组( 红细胞膜悬浮液中先 加入g s h ，后加入m d a ，g s h 最终浓度为2 0 、5 0 、1 0 0m m o l l ，1 m d a 最 终浓度为1 0m m o l l ) 。材料处理好后在3 7 下保温6 0m i n ，加入1r n l2 0 的t c a ，以60 0 0r m i n 离一c 。, 1 0m i n 后弃上清，往沉淀中加入1 0m m o l l 的d n p hl m l ，于3 7 。c 保温6 0m i n ，加入1m l2 0 的t c a ，6 0 0 0r r a i n 博士学位论文 离一c , , 1 0r a i n ，所得沉淀再用2 m l2 0 的t c a 洗涤离心2 次，然后再用1 m l 的乙酸乙酯洗2 次，将蛋白质相关沉淀物用3 m l6m o l l 的盐酸