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孔爱荣：香兰素及金属离子与溶菌酶相互作用的研究 三 香兰素及金属离子与溶菌酶相互作用的研究 摘要 蛋白质是最重要的生物大分子之一，是生物性状的直接表达者，在生物体内担负着各 种生理功能。在分子水平上研究小分子与蛋白质的相互作用以及金属离子存在时对这种作 用的影响，是当前生命科学、化学和医药学等众多领域所共同关注的课题之一。因此，深 入研究小分子物质( 特别是药物小分子) 与蛋白质的作用机理和规律，不仅对于阐明生命 的奥秘，了解小分子在体内的分配、运输、代谢、功效以及蛋白质的构象有重要的意义， 而且对药物的设计和筛选、疾病的诊断具有指导意义。 本文采用光谱法，分别对小分子香兰素和金属离子与溶菌酶的相互作用进行了研究。 论文包括以下几个部分： 第一部分简要介绍了香兰素的特性，溶菌酶的结构和功能性质，并概括了当今研究小 分子与蛋白质相互作用的主要方法。 第二部分以紫外可见吸收光谱法、荧光光谱法和圆二色谱法研究了香兰素与溶菌酶之 间的相互作用。荧光光谱结果表明，香兰素有规律的猝灭溶菌酶的内源荧光，且是一种因 相互作用形成复合物而引起的静态猝灭机制；并测定了不同温度下的猝灭常数和表观结合 常数，求得1 个香兰素分子约与1 个溶菌酶分子结合，两者间的作用力类型主要是氢键和 范德华力；基于f 6 r s t e r 非辐射能量转移理论测定了两者间的结合距离是3 0 1 n m 。同时， 通过同步荧光光谱法和圆二色谱法对溶菌酶的构象进行了检测，结果表明，随着香兰素的 加入，溶菌酶的二级结构发生改变，并且a 螺旋的含量有增加的趋势。另外，考察了香兰 素对溶菌酶酶活力的影响，结果变现为激活作用。 第三部分研究了金属离子与溶菌酶的相互作用。实验结果表明，金属离子均能使溶菌 酶的特征紫外吸收峰增强和特征荧光峰猝灭。根据荧光强度变化和荧光猝灭公式求得铁离 子、铜离子分别与溶菌酶作用的荧光猝灭常数、结合常数和结合位点数，推得其猝灭机制 属于静态猝灭，并根据热力学参数确定了主要作用力类型。 第四部分研究了香兰素与金属离子共存时，对溶菌酶( 如荧光猝灭机理、结合位点数、 作用力类型、酶结构变化等) 的影响情况。实验结果表明，香兰素与金属离子对溶菌酶的 荧光具有双重猝灭效应，使相互作用增强，并且与二元体系相比，结合位点数发生了变化。 关键词：香兰素，金属离子，溶菌酶，相互作用，紫外可见吸收光谱，荧光光谱，圆二色 谱，构象 2 一 扬州大学硕士学位论文 s t u d i e so nt h ei n t e r a c t i o nb e t w e e nv a n i l l i n ，m e t a li o n sa n d l y s o z y m e i- a b s t r a c t p r o t e i ni so n eo ft h em o s ti m p o r t a n tb i o m a c r o m o l e c u l e s i td i r e c t l ye x p r e s s e sb i o l o g i c c h a r a c t e r sa n dp e r f o r m saw i d ev a r i e t yo fp h y s i o l o g i c a lf u n c t i o n si nt h el i f e e x p l o r i n gt h e i n t e r a c t i o nm e c h a n i s m sb e t w e e ns m a l lm o l e c u l e sa n dp r o t e i n si so fc u r r e n ti n t e r e s ti nm a n y r e s e a r c ha r e a ss u c ha sb i o l o g y , c h e m i s t r y , m e d i c i n ea n ds oo n t h e r e f o r e ，f u 恤e ri n v e s t i g a t i n g t h eb i n d i n gm e c h a n i s m sb e t w e e ns m a l lm o l e c u l e s ( e s p e c i a l l yf o rt h o s ed r u gm o l e c u l e s ) a n d p r o t e i n si sw o r t h yt ob ed o n e t h i sw o r k n o to n l yh e l p su st oc l a r i f yt h es e c r e to fl i f e , u n d e r s t a n d t h ed i s t r i b u t i o n , t r a n s p o r t i o n , m e t a b o l i s m ，e f f i c a c yo fs m a l lm o l e c u l e si nt h eb o d ya n ds t r u c t u r a l f e a t u r e so fp r o t e i n , b u ta l s op r o v i d e sv a l u a b l ei n f o r m a t i o ni nd r u gd e s i g n i n ga n ds c r e e n i n g , o r d i s e a s ed i a g n o s i s i nt h i st h e s i s ，t h es m a l lm o l e c u l e ss u c ha sv a n i l l i nw a n ) a n dm e t a li o n s ( m e i n t e r a c t i o n w i t hl y s o z y m e ( l y s ) w e r es t u d i e du s i n gm o l e c u l es p e c t r o s c o p y t h ep a p e rw a sc o n s i s t e do ft h e f o l l o w i n gp a r t s ： i nt h ef i r s tp a r t ，t h ep r o p e r t i e so fv a n ，t h es t r u c t u r e sa n df u n c t i o n so fl y sw e r ei n t r o d u c e d b r i e f l y t h em e t h o d so ft h er e s e a r c ho nt h ei n t e r a c t i o nb e t w e e ns m a l lm o l e c u l e sa n dp r o t e i n s w e r es u m m a r i z e d i nt h es e c o n dp a r t ，t h ei n t e r a c t i o no fv a nw i t l ll y si nr e a l p h y s i o l o g i c a lb u f f e rc o n d i t i o nw a s i n v e s t i g a t e db yu v - v i sa b s o r p t i o ns p e c t r o s c o p y ,f l u o r e s c e n c es p e c t r o s c o p ya n dc i r c u l a r d i c h r o i s m ( c d ) s p e c t r o s c o p y t h ef l u o r e s c e n c ea n a l y s i s s h o w e dt h a tv a nc o u l dr e g u l a r l y q u e n c ht h ee n d o g e n o u sf l u o r e s c e n c eo fl y sa n dt h eq u e n c h i n gw a si n i t i a t e df r o mc o m p o u n d f o r m a t i o n , i tw a sas t a t i cq u e n c h i n gm e c h a n i s m t h eq u e n c h i n gc o n s t a n t sa n da p p a r e n tb i n d i n g c o n s t a n t sw e r eo b t a i n e da td i f f e r e n tt e m p e r a t u r e , a n de v e r yv a nc o m b i n e st oo n el y sm o l e c u l e i ts h o w e dt h a tt h eb i n d i n gp o w e rb e t w e e nv a na n dl y sw a sm a i n l yt h eh y d r o g e nb o n da n d v a n d e rw a a l sf o r c e t h eb i n d i n gd i s t a n c ew a sa l la r e a3 0 1 n ma w a yf r o ml y sb a s e do nf 6 r s t e r s n o n - r a d i a t i o ne n e r g yt r a n s f e rt h e o r y t h ec o n f o r m a t i o no fl y sw a sa n a l y z e db yc d s p e c t r o s c o p y a n d s y n c h r o n o u s f l u o r e s c e n c e s p e c t r o s c o p y , t h e r e s u l t si n d i c a t e dt h a t c o n f o r m a t i o no fl y sc h a n g e dw i t ht h ea d d i t i o no fv a n ，a n dt h ea - h e l i xw a sm o r et i g h t l yl i n k e d t h ee f f e c to nt h ea c t i v i t yo fl y sa f t e rt r e a t e db yv a nw a ss t u d i e d w ef o u n dt h a tv a nc 觚 i n c r e a s ei t se 1 1 z 州ca c t i v i t y 1 1 1m et h i r dp a r t , t h ei n t e r a c t i o no fd i f f e r e n tm ew i t hl y sw a si n v e s t i g a t e d i tw a sf o u n do u t t h a tt h e s em a l lc a ni n c r e a s et h eu va b s o r p t i o na n dq u e n c ht h ef l u o r e s c e n c ei n t e n s i t yo fl y s 孔爱荣：香兰素及金属离子与溶菌酶相互作用的研究 3 一 t h eq u e n c h i n gc o n s t a n t s ，b i n d i n gc o n s t a n t sa n dt h en u m b e ro fb i n d i n gs i t e sw e r ec a l c u l a t e d a c c o r d i n gt ot h ef l u o r e s c e n c ee f f e c ta n dq u e n c h i n ge q u a t i o n , a n dt h eq u e n c h i n gm e c h a n i s m b e l o n g st os t a t i cq u e n c h i n gb e t w e e nf e 3 + o rc u a n dl y s t h em a i ns o r t so fb i n d i n gf o r c ec a l l b ek n o w na c c o r d i n gt ot h et h e r m o d y n a m i cp a r a m e t e r s i nm ef o m lp a r t t h ee f f e c to ft h ec o e x i s t e n c eo fv a na n dm e n + o nt h ei n t e r a c t i o n c h a r a c t e r i s t i c sa m o n gv a n 。m a n dl y sw e r ei n v e s t i g a t e ds u c ha st h ec h a n g eo fq u e n c h i n g m e c h a n i s mo ff l u o r e s c e n c e , t h en u m b e ro fb i n d i n gs i t e s ，t h ei n t e r a c t i o nf o r c e s ，t h ec o n f o r m a t i o n o fe n z y m e t h ee x p e r i m e n t a lr e s u l t ss h o w e dt h a tv a na n dm c a nf u r t h e rq u e n c ht h e f l u o r e s c e n c eo fl y sa n de n h a n c e 廿l ei n t e r a c t i o n t h en u m b e ro fb i n d i n gs i t e sa l s oc h a n g e d c o m p a r e dw i t ht h eb i n a r ys y s t e m k e yw o r d s ：v a n i l l i n , m e t a li o n s ，l y s o z y m e , i n t e r a c t i o n , u v - v i sa b s o r p t i o n s p e c t r u m , f l u o r e s c e n c es p e c t r u m ，c i r c u l a rd i c h r o i s ms p e c t a n n ，c o n f o r m a o o n 4 一 扬州大学硕士学位论文 符号说明 扬州大学硕士学位论文 扬州大学学位论文原创性声明和版权使用授权书 学位论文原创性声明 本人声明：所呈交的学位论文是在导师指导下独立进行研究工作所取得的研究成果。 除文中已经标明引用的内容外，本论文不包含其他个人或集体已经发表的研究成果。对本 文的研究做出贡献的个人和集体，均已在文中以明确方式标明。本声明的法律结果由本人 承担。 学位论文作者签名： 况以 签字日期： w 1 0 年岁月冲日 学位论文版权使用授权书 本人完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定，即：学校有权保留并向国家有关 部门或机构送交学位论文的复印件和电子文档，允许论文被查阅和借阅。本人授权扬州大 学可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫 描等复制手段保存、汇编学位论文。同时授权中国科学技术信息研究所将本学位论文收录 到 0 ，a s 0 为典型的疏水作用力；a h 0 ，a s 0 为静电作用力。对于实际反应体系，往往同时存在多种作用 力。 由表2 - 2 结果可知，v a n 与l y s 的结合反应，体系的热力学参数a h 0 ，a s 0 ，z l g 0 。其中a h 0 ，说明此反应是放热反应，升高温度不利于v a n 分子与l y s 的结合；a s 0 ，可能为氢键和范德华力；a g 0 ，表明反应是自发的；a h 0 和a s 0 ，为氢键和范 德华力。因此，v a n 与l y s 的相互作用是一个可以自发进行的放热反应过程，且主要通 过氢键和范德华力相结合。 2 2 2 3 结合位点数研究 当小分子在蛋白质分子上有r 个相同且独立的结合位点时，分子之间的平衡满足下列 方程： l g ( f 0 - f ) f 1 9 k + n l g q 】 ( 2 7 ) 式中，局为不存在猝灭剂时荧光分子的荧光强度；f 为加入猝灭剂后荧光分子的荧光 强度： 纠为猝灭剂浓度；k 为结合常数。以l g ( f o - f ) f j 对1 9 q 作图可得线性关系，即可 通过斜率和截距得到v a n 与l y s 的结合位点数以和结合常数k 。 孔爱荣：香兰素及金属离子与溶菌酶相互作用的研究 0 0 _ 0 2 - 0 4 生旬6 l l l l 秀- 0 8 _ i 1 0 - 1 2 - 1 4 - 5 6- 5 4七z - 5 0 - 4 8- 4 6 l g 【q 图2 5 香兰素与溶菌酶作用的对数图 f i g 2 - 5t h el o g a r i t h m i cp l o t so f v a na n dl y si n t e r a c t i o n 由图2 5 求出在2 5 、3 0 和3 7 下的n 值分别为0 9 5 3 8 、0 9 4 6 8 、0 9 5 9 6 ，平均值 为0 9 5 3 4 。n 值接近1 ，即每1 个v a n 分子约与1 个l y s 分子结合形成复合物，说明v a n 可以由l y s 携带着在体内进行转运、贮存和分配。， 2 2 2 4 结合距离的测定 共振能量转移是指电子激发能在适当的能量供体和受体之间传递。当供体分子和受体 分子相隔的距离远大于它们的碰撞直径时，只要供体的基态和第一激发态两者的振动能级 间的能量差相当于受体的基态和第一激发态两者的振动能级间的能量差，就可以发生从供 体到受体的非辐射能量转移，这个过程是通过分子间偶极偶极耦合作用发生的，称为 f 6 r s t e r 偶极偶极非辐射能量转移理论【8 3 】。当两种化合物满足以下条件时会发生非辐射能 量转移：供能体发荧光；供能体的荧光发射光谱与受体的吸收光谱有足够重叠；供 能体与受能体足够接近，最大距离不超过7 r i m 。 在研究小分子与蛋白质相互作用时，可认为能量转移作用发生在小分子蛋白质复合物 内部和小分子与蛋白质之间。f 6 r s t e r 能量转移理论已被广泛用于小分子与蛋白质相互作用 的研究，可求出小分子在蛋白质上的结合位置与蛋白质分子中产生荧光的基团色氨酸残基 之间的距离，并有以下计算公式： e = i - f f o - - - 霹( 霹+ 厂6 ) 霹= 8 7 9 x 1 0 2 5 ( 必2 币n 4 ，j ) j = 旷( a ) s ( 旯) 从】 ，( 名) m 】 ( 2 8 ) ( 2 9 ) ( 2 1 0 ) 扬州大学硕士学位论文 式中，e 为能量转移效率；f 为荧光体与猝灭剂的摩尔比为1 ：1 时荧光体的荧光发射 强度；局为不存在猝灭剂时，荧光体的荧光发射强度；岛为e = 5 0 时的临界距离；，为荧 光体与猝灭剂间的真实距离；f 为偶极空间取向因子，计算时取供能体和受能体各向同性 的平均值2 3 ；以是介质折射指数，取水和有机物折射指数的平均值1 3 6 1 ；西为供能体的 荧光量子产率，取色氨酸的量子产率0 1 5 ；j 为供能体的荧光发射光谱与受能体的吸收光 谱之间的重叠部分的积分；厅矽为荧光供体在波长a 处的荧光强度；8 例为受能体在波长a 处的摩尔消光系数。 3 0 03 3 4 03 3 8 04 0 04 2 04 4 0 w a v e l e n g t h ( n m ) 图2 - 6 香兰素的吸收光谱和溶菌酶的荧光发射光谱的重叠图谱 f i g 2 - 6o v e r l a po f t h ea b s o r p t i o ns p e c t r u mo f v a n a n df l u o r e s c e n c ee m i s s i o ns p e c t r u mo f l y s 由v a n 的吸收光谱与l y s 的荧光发射光谱叠加图2 6 可知，两者的光谱有部分重叠。 根据f s m t e r 能量转移理论公式求得光谱的重叠积分j = 1 8 1x 1 0 d 5 c l l l 3 l t o o l 一，临界距离 r 0 = 1 8 9 n m ，能量转移效率庐5 8 1 ，v a n 在l y s 中的结合位置与t r p 残基间的距离 r = 3 0 1 n m 。由以上数值可知，结合距离，小于7 n m ，符合能量转移理论，说明v a n 与l y s 之间发生了能量转移，因此，非辐射能量转移也是引起l y s 荧光猝灭的原因之一。 2 3 香兰素对溶菌酶构象的影响 2 3 1 同步荧光光谱研究 图2 - 7 为v a n 与l y s 相互作用的a 2 = 1 5 n m 和6 0 n m 同步荧光光谱图。由图可以看出， 随v a n 浓度的增大，两种氨基酸残基的荧光强度均下降，说明v a n 与l y s 结合时同时猝 灭了这两种氨基酸产生的荧光。增加v a n 的浓度，a 3 t r 残基的最大发射波长基本保持不变 ( 见图( a ) ) ，表明v a n 的加入对l y s 中t y r 残基附近的微环境影响很小。当v a n 浓度小 于7 x 1 0 一m o l l 1 时，t r p 残基的最大发射波长也几乎不变( 见图d ) ) ，而高于这个浓度时， 一了一套一cm_c一 喜 枷 誊耋 枷 御 。 加 鹏 舶 肼 舵 加 o o 0 n n m ooc丘_jo丘 孔爱荣：香兰素及金属离子与溶菌酶相互作用的研究 最大发射波长逐渐蓝移，至加入的v a n 浓度为1 s x 0 4 m o ll 。时，位移近l o o m ，表明t i p 残基所处的微环境发生了变化，极性下降，疏水性增强，肽链的伸展程度有所减小，引起 l y s 的构象发生变化。 0 ， 一 珊瑚铷搿 w “d 日呻( 响) 一翟r n 型 i ： 。l 2 l o 埘瑚湖 捌 帅_ 目神c m ) 图2 - 7 v a n - l y s 体系的同步荧光光谱( 对0 a = 1 5 r t m ) 和( ”0 2 = 6 0 r i m ) f i 9 2 0 t h es y n c h r o n o 僻f l u o r e s o c u c es p c c t r u l l l o f v a n - l y ss y s t e m ( 曲凹忙1 5 a m ) a n d ( m 埘i - 6 0 m ) c m v e l 一1 4 ： v a i n ! i ( x t o s t o o l i f 卜0 ，0 5 ，1 ，1 5 ，2 ，3 ，4 ，5 ，t7 ，8 ，9 ，1 0 ，1 5 2 3 2 圆二色谱研究 2 0 0拗2 2 8 0 船口 w ”女咧m n 圈2 - 8 香兰素与溶苗酶作用的圆二色谱 f i 9 2 t h e c d $ p c c t l t l m o f v a na n d l y s i n l e r a c i i o n c u r v e l - 6 ： v a n ( x 1 05 t o o l l l ) = 0 ，0 3 ，0 t0 9 1 2 ，1 , 5 8 6 4 2 o 4 $ 一bd口e)口o 扬州大学硕士学位论文 由图2 8 可知，l y s 分子在2 0 5 n m - 2 3 5 n m 范围内有明显的负槽，其分子二级结构中既 含有反螺旋又含有伊折叠，且随着v a n 浓度的增大，2 0 8 n m 和2 2 2 n m 处的负峰值不断降 低。由于1 9 4 n m 处的正峰，2 0 8 r i m 和2 2 2 n m 左右的两个负槽是典型的a 螺旋c d 谱，说 明v a n 的加入，部分加剧了l y s 的a 螺旋结构。 2 4 香兰素对溶菌酶酶活力的影响 表2 - 3 香兰素对溶菌酶酶活力的影响 t a b l e2 3t h ee f f e c to f v a no l lt h ee n z y m i ca c t i v i t yo fl y s 表2 3 为v a n 与l y s 作用后l y s 酶活力的测定结果，实验中同时也验证了v a n 本 身对底物溶壁微球菌没有影响。结果表明，与l y s 相比，在v a n l y s 二元体系中，l y s 的酶活随着v a n 浓度的增加而提高，v a n 对l y s 的酶活呈现一定程度的激活作用，当v a n 的终浓度从3 1 0 气1 5 x 1 0 一m o l l 1 时，激活率从6 9 6 增加到2 6 0 3 。当反应体系中v a n 的终浓度达到1 5 x 1 0 - 3 t o o l l j 时，v a n 对l y s 的激活程度已有下降，激活率有2 7 3 2 。 当v a n 的终浓度提高到1 x1 0 之m o l l - 1 时，激活率降到2 4 7 4 ，但对体系中l y s 的酶活仍 呈激活状态。 3 结论 本章应用光谱法，在近生理p h 条件下研究了v a n 与l y s 的相互作用。 紫外可见吸收光谱的研究结果表明，v a n 与l y s 有着较强的结合，加入v a n 后，吸 收光谱图发生明显变化，表现在l y s 的紫外吸收峰增强。 荧光光谱的结果说明，v a n 能显著猝灭l y s 的内源荧光，当v a n 为1 5 x 1 0 0 1 l - 1 时，l y s 荧光将近完全被猝灭，且l y s 的荧光主要来自于t r p 残基的荧光发射峰，而t y r 和p h e 残基贡献很小，2 7 8 n m 激发时未见t y r 的特征发射峰，说明t y r 残基与t r p 残基之 间发生了能量转换，使t y r 残基的荧光猝灭及t r p 残基的荧光增强；由最大发射波长的变 化可知，l y s 中的t r p 残基处于l y s 分子内部的疏水环境中，同时还说明v a n 在一定程 度上影响了l y s 中发色团的微环境，干扰了l y s 的构象，使l y s 结构发生了变化，导致 孔爱荣：香兰素及金属离子与溶菌酶相互作用的研究韭 其内源荧光发生猝灭。v a n 与l y s 是以分子数1 ：1 结合形成稳定复合物的静态猝灭机制； 两者之间发生了能量转移，结合距离m 3 0 1 n m ，小于7 n m ；作用力类型主要是氢键和范德 华力。 圆二色谱研究显示，v a n 与l y s 结合后使l y s 的二级结构发生了改变，揭示了v a n 的加入干扰了l y s 的构象，使t r p 残基所处的微环境发生了明显变化。这与同步荧光研究 中t r p 残基光谱峰位蓝移的结果一致，更加说明推断的正确。 从实验中对v a n 与l y s 作用后l y s 酶活力的考察结果可见，在某一浓度范围内，v a n 具有激活l y s 酶活力的作用。因此，l y s 能作为v a n 的有效载体。 3 2 扬州大学硕士学位论文 第三章金属离子与溶菌酶相互作用的研究 生命过程离不开无机元素的参与，尤其是金属元素的参与更为重要。金属元素一方面 可以作为载体，某些金属和其它物质在体内的吸收、运输和传递，往往需要有载体，而金 属离子或它们所形成的一些配位化合物在这个过程中就担负着重要作用。另一方面可以组 成金属酶或作为酶的激活剂，人体内有1 3 酶的活性与金属有关，有些金属参与酶的固定 组成，还有一些酶必需有金属离子存在时才能被激活，发挥它的催化功能。如f e 是血液 中交换和输送氧所必需的一种元素，生物体内许多氧化还原体系都离不开它，体内大部分 铁分布在特殊的血细胞内，没有铁生物就无法生存。c u 对于人体也至关重要，它是生物系 统中一种独特而极为有效的催化剂，并且是3 0 多种酶的活性成分，对人体的新陈代谢起 着重要的调节作用。 在生物体内，多种金属( 如n a 、m g 、k 、c a 、m n 、f e 、c u 、z n 等) 离子是维持生 命活动所必不可少的，许多与金属离子有关的生命过程实际上是通过金属离子与生物大分 子的相互作用而发生的。金属离子与蛋白质的相互作用，是处于生命科学与化学之间的一 门边缘性研究课题，是生物学家与化学家共同感兴趣的问题。内源性或进入生物体的外源 性金属离子，与转运蛋白质结合从而在生物体内运输和分布是金属离子的重要途径之一， 对其相互作用的研究有助于人们深入了解金属离子的生物学效应，具有一定的理论意义。 本章利用紫外可见吸收光谱法和荧光光谱法对金属离子( m e t a li o n s ，m 矿) 与溶菌酶 的相互作用进行了研究。 l 材料与方法 1 1 实验材料 1 1 1 实验仪器 同第二章1 1 1 。 1 1 2 实验试剂 金属离子储备液( n 矿、m 9 2 + 、k + 、c a 2 + 、m n 2 + 、f e 3 + 、c u 2 + 、z n 2 + ) ，均为光谱纯或 超高纯试剂配制而成，由本实验室提供，且在测定条件下无吸收及荧光效应。 1 2 实验方法 1 2 1 吸收光谱法测定金属离子与溶菌酶的相互作用 ( 1 ) 在p h 7 2 的p b s 体系中，固定l y s 的浓度为0 0 4 m g m l 一，分别加入各种m e n + 溶液，使m ，在体系中的浓度相同，作用后用l e n a 石英比色皿，在紫外可见分光光度计 上扫描并记录1 9 0 , - 4 5 0 n m 的吸收光谱。 ( 2 ) 固定l y s 的浓度，依次加入不同量的f e 3 + 溶液，扫描并记录吸收光谱。 1 2 2 荧光光谱法测定金属离子与溶菌酶的相互作用 荧光测定样品制各同吸收光谱法，测定参数同第二章1 2 2 。 孔爱荣：香兰素及金属离子与溶苗酶相互作用的研究 2 结果与分析 2 1 金属离子对溶菌酶吸收光谱的影响 3 o w w g q r m ) ；= 0 0 劫锄鲫 栅蝴卸鼬卿蝴籼 w 州b 叫竹mw m b 神删 图3 - 1 金属离子作用溶苗酶后的吸收光谱 f 培3 1 t h ea o r , o r p t i o ns p e c t r a m o f l y s w i t h m ， ( a 山) 【m ，】= 3 1 0 4 o l _ l - 1 ：( c ) ：【m 一= 3 x 1 0 4 m o l l l ；( d ) ： f 分+ ( x 1 0 。4 m o ll - 1 户仉02 ，0 a ，06 ，08 ，t0 ，12 ，14 ，1 6 图3 - 1 为m ，对l y s 吸收光谱的影响。由图可知，当m ，浓度为3 1 0 4 m o l l 。1 时( 见 图( c ) ) 与l y s 的作用比3 x 1 0 6 m o l r l 时( 见图( a ) 和( b ) ) 显著。加入m 一后l y s 在2 8 0 a m 处的弱吸收带的吸收值有不同程度的增加，尤其加入f e 3 + 后吸收谱带变宽明显。从图( d ) 可 见，随f 一+ 浓度的增大，2 1 0 h m 附近的吸收值显著增强，l y s 特征吸收峰强度增大。这说 明m ，的加入使包围在l y s 分子内部的t r p 和t y r 残基的芳杂环疏水基团裸露出来，使吸 收增强。 22 金属离子对溶菌酶荧光光谱的影响 图3 - 2 ( a ) 和( b ) 为不同浓度m 矿对l y s 的荧光猝灭光谱。图( c ) 为同浓度下不同m 一对 曲 哺 帅 惜 旧 le口-2 ” ” 目tq_# 钟 拍 曲 ” ” 晡 g_e8宣 ” ” 吁 8c自 扬州大学硕士学位论文 l y s 荧光的猝灭效应图及不同浓度m e 叶对l y s 荧光猝灭效应的比较图。 由图可知，随着m ，的加入，l y s 特征峰的荧光强度都减弱，峰形没有改变。当m e 叶 浓度为3 1 0 - 4 t o o ll 1 时，对l y s 内源荧光的猝灭作用较3 x l o 。6 m o ll 1 明显，其中f e 3 + 的猝 灭作用最强，l y s 的荧光强度减少约8 6 ；z n 2 + 和c u 2 + 次之，减少4 0 左右。 蛳靳。 朴 ： ， l 三蛳 言 ；瑚9 三 肝 埘柳栅珊 瑚 w “d f 呻f m ) 惭曲呻呻 喜= 3 xl “f i 4 m “o ：，”m e ”4 y 。s ( c ) i8 0 。r 鲁j 础山山l z - 。 _i_i l_ 图3 0 金属离子对溶菌酶的荧光葬灭作用( b ) 及荧光猝灭百分数f c ) f i g3 - 2f h o r e s c c c q u e n c h i n g ( a ，b ) a n d q u c n c h l n g p e t c l m t a g e ( c 】o f l y s w i t h m 一 扣) ：m e ” = 3 l o o l l “；彻 m e l = 3 x l o o l n c 1 | f v e l - 9 ：l y s ，n a + ，m 9 2 + ，k + ，c a 2 + ，m n 2 + ，“”，z n 2 + ，f e 3 + 2 2 1 铁离子与溶菌酶作用的荧光光谱及猝灭机理 2 21 1 铁离子对溶菌酶荧光光谱的影响 图3 - 3 ( a ) 与嘞为f e 3 + 对l y s 的荧光猝灭效应及辑灭百分率。由图可知，随着f e 3 + 的加 入，l y s 荧光发射峰强度逐渐降低，当f 一+ 为1 x l m o ll1 时，l y s 荧光强度减少了4 1 左右；当f e 3 + 为16 x 1 0 4 t o o l | 1 时l y s 荧光强度仅为空白的1 0 。 册 计 带 心 0 1止。 孔爱荣：香兰素厦金属离子与溶苗酶相互作用的研究 呈枷 言 重瑚_ = 惭d 哪忡) 81 0th1 61 8 n p l r 1 图3 - 3 铁离子对溶菌酶的荧光骅灭作用( a ) 及荧光猝灭百分数m ) f i g3 3 h u o r e s c c n c c q u c a c h l n g ( a ) a n d q u c n e 曲g p e r c e n t a g e 0 ) o f l y sa t d i f f 蜘tc o n c c n i t a t i o n o f f ， c u r v e l - 9 f 乎1 ( x l o 。m o ll 。) 卸，2 ，4 ，6 ，8 ，1 0 ，1 2 ，1 4 ，1 6 2 21 2 铁离子对溶菌酶荧光猝灭机理的探讨 ( 1 ) 猝灭类型研究 分别考察在2 5 c 、3 00 c 和3 t c 下f e 3 + 对l y s 的荧光猝灭光谱，并作出s t c m - v o l m e r 和l i n e w e a v e r - b u r k 图。 z o 18 1 6 弋1 u 12 10 柏】p1 矿m 。| l 1 ) 图3 4 铁离子与溶苗酶作用的s t e r n - v o l m e r 固 h g3 - 4 t h e s t e m - v o l n a e f p l o t so f f c 3 + a n d l y s i n t e r a c t i o n 岫 f3|pgnbll【 扬州大学硕士学位论文 o 0 3 名0 0 2 l l o 们 0 0 10 20 30 40 50 0 q t l ( x1 0 5 l m o l l ) 图3 5 铁离子与溶菌酶作用的l i n e w e a v e r - b u r k 图 f i g 3 51 1 1 el i n e w e a v e r - b u r kp l o t so ff e 3 + a n dl y si n t e r a c t i o n 由图3 4 和3 5 可以看出，猝灭曲线呈线性关系，通过线性拟合计算了两个方程的相 关常数，结果见表3 1 。 表3 1 不同温度下铁离子与溶菌酶的相互作用常数 t a b l e3 1t h ei n t e r a c t i o nc o n s t a n t sb e t w e e nf e 3 + a n dl y sa td i f f e r e n tt e m p e r a t u r e 由表可知，在选定的浓度范围内，随着温度升高，珞y 和k 都呈降低趋势，且场大于 各种猝灭剂对生物大分子的最大扩散碰撞常数，初步表明f e 3 + 对l y s 的荧光猝灭为两者彼 此结合形成复合物而引起的静态猝灭。 ( 2 ) 相互作用力类型的确定 根据公式( 2 - 4 ) 一( 2 6 ) ，利用表3 1 中的相关数据，计算得出f e 3 + 与l y s 相互作用 的热力学参数，见表3 - 2 。 孔爱荣：香兰素及金属离子与溶菌酶相互作用的研究塑 表3 - 2 铁离子与溶菌酶相互作用的热力学参数 t a b l e3 - 2t h e r m o d y n a m i cp a r a m e t e r so ft h ei n t e r a c t i o nb e t w e e nf e 3 + a n dl y s 由表中结果可知，f e 3 + 与l y s 体系的热力学参数4 日 0 ，a g 0 是两者以静电和疏水作用力 结合的主要热力学特征；同时，彳日 0 也是水溶液中各种离子间以静电力相互作 用的热力学特征。因此，f e 3 + 与l y s 之间主要是靠静电作用力和疏水作用力相结合。 ( 3 ) 结合位点数研究 根据公式( 2 - 7 ) ，以l g ( f 0 - f ) f 对l g 翻作图，得到f e 3 + 与l y s 的结合位点数r 。 0 2 0 o 旬2 生旬4 u l l 秀- 0 6 - _ j 田8 - 1 o - 1 2 - 4 8- 4 6 - 4 4 - 4 2- 4 0 - 3 8 l g 【q 】 图3 石铁离子与溶菌酶作用的对数图 f i g 3 - 6t h el o g a r i t h m i cp l o t so ff e 3 + a n dl y si n t e r a c t i o n 由图3 - 6 求出在2 5 、3 0 和3 7 。c 下的露值分别为1 1 3 6 6 、1 1 3 5 8 、1 1 2 1 4 ，平均值 为1 1 3 1 3 ，说明1 个f e 3 十约与1 1 个l y s 分子结合形成复合物。 扬州大学硕士学位论文 2 2 2 铜离子与溶菌酶作用的荧光光谱及猝灭机理 2 2 2 1 铜离子对溶菌酶荧光光谱的影响 姗枷卿 w a v e l e 叼l h ( n m ) o24681 01 21 4 馅1 8 阳( x 1 0 5 n d 曲 图3 7 铜离子对溶菌酶的荧光猝灭作用( a ) 及荧光猝灭百分数嘞 f i g 3 7f l u o r e s c e n c eq u e n c h i n g ( a ) a n dq u e n c h i n gp e r c e n t a g e 嘞o fl y sa td i f f e r e n tc o n c e n t r a t i o no f c u 2 + c u r v e l 6 ： c u 2 + 】( x1o - 5 t o o l l 1 ) = o ，3 ，6 ，9 ，15 ，16 图3 - 7 ( a ) 与( b ) 为c l l 2 + 对l y s 的荧光猝灭效应及猝灭百分率。由图可知，随着c u 2 + 的加 入，l y s 荧光强度逐渐降低，当c u 2 + 为1 6 x 1 0 - 4 m o l l - 1 时，l y s 荧光强度减少近4 0 ，且 峰位有轻微蓝移。 2 2 2 2 铜离子对溶菌酶荧光猝灭机理的探讨 ( 1 ) 猝灭类型研究 分别考察在2 5 、3 0 和3 7 下c u 2 + 对l y s 的荧光猝灭光谱，并作出s t e r n - v o l m e r 和l i n e w e a v e r - b u r k 图。 田 l ；i o 一零一西耍con匕oa西ccocm3叮oocmu03一也 孔爱荣：香兰素及金属离子与溶菌酶相互作用的研究 l l 、 l l 1