（生物化学与分子生物学专业论文）银环蛇蛇毒相关基因的克隆和表达研究.pdf

银环蛇蛇毒相关基因的克隆和表达研究 银环蛇蛇毒相关基因的克隆和表达研究 摘要 本研究利用前期研究中构建的p g e x b g t x ( p 2 2 a 3 1 ) 质粒在大肠杆菌b l 2 1 ( d e 3 ) 中表达并纯化后得到了较纯的重组a 银环蛇毒素同工毒素，得率约为 1 2 2 5m 牡。用重组蛋白与天然* 银环蛇毒素的抗原性一致。重组a 银环蛇毒素 同工毒素的半致死剂量l d s o 为1 5 9 8m g k g ，约为天然a - 银环蛇毒素的l ，5 且有 一定的镇痛药效，1 4l d 5 0 剂量的镇痛百分率为5 5 2 ，1 8l d 5 0 剂量的镇痛百 分率为2 0 5 ，在外周镇痛作用中呈一定的量效关系。以上结果表明，本研究重 组表达的值银环蛇毒素同工毒素( p 2 2 - a 3 1 ) 具有与天然a 银环蛇毒素相似的生 物学活性。 伽银环蛇毒素e d n a 序列的多态性及其引起这种多态性的原因一直存在争 议。本文从同一银环蛇个体中克隆并测序了5 个舡银环蛇毒素基因组序列，又在 同一次反转录的e d n a 中克隆神经生长因子的e d n a ，并通过计算多个克隆间的 突变情况，与同一体系中得到的1 2 种银环蛇毒素e d n a 序列突变率做比较， 并统计了前人克隆到的多种洳银环蛇毒素e d n a 序列突变的情况，得出结论：a 银环蛇毒素e d n a 序列的多态性不是由于基因组不同而来的，也不是由r n a 编 辑造成，很可能是由于反转录过程，p c r ，基因克隆及d n a 测序过程人为引入 的。 运用r a c e 技术从银环蛇毒腺e d n a 中克隆到2 个c 型凝集素基因的全长 e d n a 序列，b m l j 和b m l 2 ，其中b a i l 2 是首次从银环蛇( b u n g a r u s m u l t i c i n c t u s ) 中克隆到。并将这2 个蛋白1 3 5 个氨基酸的成熟肽部分和1 3 7 个氨 基酸的成熟肽部分分别连入p e t - h i s 载体后在b l 2 1 ( d e 3 ) p l y s s 中表达，重组 蛋白以包涵体的形式存在，复性后的重组c 型凝集素具有凝集红细胞活性。其 中由1 3 5 个氨基酸组成的重组c 型凝集素以单体形式存在，由1 3 7 个氨基酸组 成的重组c 型凝集素有5 0 以二聚体的形式存在，另5 0 以单体形式存在。 w e s t e r nb l o t t i n g 和亲和纯化结果表明，天然c 型凝集素是以更小分子量的单体形 成的二聚体。纯化到的4 种分子量不同的蛋白中1 4 4 k d 左右的蛋白可以形成二 聚体，认为是目的蛋白。银环蛇c 型凝集素基因的克隆和表达研究对对阐明银 银环蛇蛇毒相关基因的克隆和表达研究 环蛇蛇毒中c 型凝集素的性质、组成及其功能起到重要的作用。 关键词：蛇毒蛋白，a 银环蛇毒素，c 型凝集素，克隆，重组表达 i i 银环蛇蛇毒相关基因的克隆和表达研究 c l o n i n ga n de x p r e s s i o no fg e n e sf r o mv e n o m g l a n do f b u n g a r u sm u l t i c i n c t u s a b s t r a c t a - b t m g a r o t o x i np l a y sv e r yi m p o r t a n tr o l ei nn e u r o s c i e n c er e s e a r c h , c l i n i c a l a p p l i c a t i o n a n dt h e p h a r m a c e u t i c a li n d u s t r y i no r d e rt oa c q u i r eq u a n t i t e s o f a - b u n g a r o t o x i n , w ee x p r e s s e dg s t - o t - b a n g a r o t o x i nf u s i o np r o t e i nu s i n gc o n s t r u c t e d p l a s m i dp g e x - b g t x ( p 2 2 a 3 1 ) i nec o l ib l 2 1 ( d e 3 ) c e l la n df i n a l l yo b t a i n e d r e c o m b i n a n ta - b u n g a r o t o x i nw i t hy i e l d so fa b o u t1 2 2 5m g l t h er e s u l t so fb o t h e l i s aa n dw e s t e r nb l o ts h o w e dt h a tr e c o m b i n a n tt t - b u n g a r o t o x i nh a st h es a m e a n t i g e n i c i t ya sn a t u r a la - b m a g a t m o x i n i nv i v ot o x i c i t yt e s t ss h o w e dt h a tt h el d s 0o f r e c o m b i n a n t q - b u n g a r o t o x i n w a s1 5 9 8 m g k g ，a b o u t 1 5t h a to fn a t u r a l a - b u n g a r o t o x i n a n a l g e s i sp e r c e n t a g e sw i t hd o s e so f1 4l d s oa n d1 8l d s ow e r e 5 5 2 a n d2 0 5 r e s p e c t i v e l y , i n d i c a t i n gt h a tr e c o m b i n a n ta - b u n g a r o t o x i np o s s e s s e s a n a l g e s i ce f f i d e n c y i ti sd i s p u t e dw h e t h e rt h e r ei sp o l y m o r p h i s mi ne d n ao f ( z - b u n g a r o t o x i n ，a n d w h a ti st h em e c h a n i s mt or e s u l to ft h i sp h e n o m e n o n i no r d e rt of ：l l r t h e rs t u d yt h i s q u e s t i o n w ec l o n e da n ds e q u e n c e da - b u n g a r o t o x i ng e n ef r o mt h es 啪ei n d i v i d u a la n d n e r v eg r o w t hf a c t o re d n af r o mt h es a m er e v e r s et r a n s c r i p t i o np r o d u c t sb yw a n gda 1 a n da n a l y z e dt h e i rm u t a t i o nr a t e s t h o s er e s u l t si n d i c a t et h a tp o l y m o r p h i s mo f a - b u n g a r o t o x i ne d n a i sn o tt r a n s c r i p t e df r o mg e n o r n i cd n ao rr n ae d i t i n g ，b u t r e s u l t sf r o mr e v e r s et r a n s c r i p t i o np r o c e s s ，p c r , a n dg e n ec l o n i n g c - t y p el e c t i n sa r ef o u n di nm a n ya n i m a l sa n db i n di nac a 2 + _ d e p e n d e n tf a s h i o n t om o n o a n do l i g o s a c c h a r i d e s i no u rr e s e a r c h ，w ec l o n e dt w oc - t y p el e c t i n f u l l l e n g t he d n af r o mb u n g a r u sm u l t i c i n c t u sv e n o mg l a n db yr a c et e c h n o l o g y , n a m e db m l j ，b m l 2 i ti st h ef i r s tr e p o r tt oc l o n eb m l - 2e d n af r o mv e n o mg l a n d o f b u n g a r u sm u l t i c i n c t u s w ea l s oc o n s t r u c t e de x p r e s s i o nv e c t o ru s i n g1 3 5a n d1 3 7 a m i n oa c i d so ft w oc - t y p el e c t i n sl i g a t e di n t op e t - h i sp l a s m i da n dt h e ne x p r e s s e d i i i 银环蛇蛇毒相关基因的克隆和表达研究 t h e ni nb l 2 1 ( d e 3 ) p l y s sc e l l r e c o m b i n a n tp r o t e i ni si n c l u s i o nb o d ya n da c c o u n tf o r 3 0 f u l lp r o t e i no fe x p r e s s i o nb a c t e r i aa n dt h er e f o l d i n gr a t ei s3 0 t h er e f o l d e d r e c o m b i n a n tc t y p el e c t i n sa r ea b l et oa g g l u t i n a t er a b b i te r y t h r o c y t e s ，r e c o m b i n a n t b m l 一1 ，b m l 一2w i t h1 3 5a m i n oa c i d sa l et h em o n o m e r s ，a n dr e c o m b i n a n tb m l 一1 ， b m l - 2w i t h13 7a m i n oa c i d sa r ed i m m e r so f5 0 ，m o n o m e r so f5 0 w e s t e r n b l o t t i n ga n dp u r i f i c a t i o no fn a t u r a lc t y p el e c t i n ss h o w e dt h a tc t y p el e c t i n sf o r m d i m e r si np h y s i o l o g i c a lc o n d i t i o n c l o n i n ga n de x p r e s s i o no fc t y p el e c t i n sf r o m b u n g a r u sm u l t i c i n c t u sv e n o mi sv e r yi m p o r t a n tt o f u l t h e r s t u d yc h a r a c t e r i s t i c s ， s t r u c t u r ea n df u n c t i o n so fc - t y p el e c t i n si nb u n g a r u sm u l t i c i n c t u s k e y w o r d s ：v e n o mp r o t e i n , a b u n g a r o t o x i n ，c t y p el e c t i n , c l o n i n g ，r e c o m b i n a n t e x p r e s s z o n 厦门大学学位论文原创性声明 兹呈交的学位论文，是本人在导师指导下独立完成的研究成 果。本人在论文写作中参考的其他个人或集体的研究成果，均在 文中以明确方式标明。本人依法享有和承担由此论文产生的权利 和责任。 声明人( 签名) ： 协鳓聋 j i 。6 年7 月( 汨 勺￥气。曰 厦门大学学位论文著作权使用声明 本人完全了解厦门大学有关保留、使用学位论文的规定。厦 门大学有权保留并向国家主管部门或其指定机构送交论文的纸 质版和电子版，有权将学位论文用于非赢利目的的少量复制并允 许论文进入学校图书馆被查阅，有权将学位论文的内容编入有关 数据库进行检索，有权将学位论文的标题和摘要汇编出版。保密 的学位论文在解密后适用本规定。 本学位论文属于 1 、保密() ，在年解密后适用本授权书。 2 、不保密( ) ( 请在以上相应括号内打“”) 作者签名：概强日期：。6 年7 月f f 日 导师签名：取投、日期：p 6 年7 月f ? e l 银环蛇蛇毒相关基因的克隆和表达研究 丽舌 蛇毒是由蛇毒腺分泌的一种天然毒蛋白，含多种蛋白质、多肽、酶类和其它 小分子物质，具有广泛的生物学活性。蛇毒是一类复杂的混合物，其中含有l o 1 5 种酶，1 2 1 8 种非酶类的蛋白和多肽，以及少量的中性脂、磷酸和游离单糖； 无机盐中以钠、钾、锌离子含量较高，其次是钙、锰离子。有毒成分主要是蛋白 质和多肽，占干毒的8 5 9 0 ，而蛋白质中9 0 是白蛋白和球蛋白。 l 神经毒素 神经毒素广泛存在于眼镜蛇科和海蛇科，相对分子质量6 , 0 0 0 1 2 ，0 0 0 ，p h9 以上，其含量在不同种类的蛇中有较大区别，一般含量在2 0 5 0 之间。可通 过多种不同的方式改变中枢和周围神经系统正常的兴奋传导，从而影响正常的神 经活动。根据其一级结构可分为三类：短链神经毒素( 6 0 6 2 氨基酸残基，4 对 二硫键) 1 l 、长链神经毒素( 7 0 7 4 氨基酸残基，5 对二硫键) 【2 】、k - 神经毒素( 6 6 氨基酸碱基，5 对二硫键) 【3 “】。短链神经毒素和长链神经毒素主要是竞争性地与 神经肌肉接头处的乙酰胆碱受体结合，从而阻断神经递质的传导：其中短链神经 毒素的阻断作用与长链神经毒素相比较，具有一定的可逆性。k 神经毒素则可能 主要特异性地结合神经系统中的乙酰胆碱受体。另一些具体生物学活性还不十分 清楚的统称为神经毒素类似物5 。 另一方面，根据其作用机制和作用位点，并结合其分子结构特征，又可分为 4 大类，即突触前神经毒素( p r e s y n a p t i c a l l y - a c f i n gn e u r o t o x i n ) 或b - 神经毒素 ( p n e u r o t o x i n ) 10 1 、突触后神经毒素( p o s t s y i l a p t i c a i l y - a c t i n gn e u r o t o x i n ) 或洳神经 毒素( n n e u r o t o x i n ) 【1 i 】、离子通道型神经毒素( i o n - c h a n n e ln e u r o t o x i n ) 和抗胆碱酯 酶神经毒素( a n t i c h o l i n e s t e m s en e u r o t o x i n ) 。 从e l a p i d a e 和h y d r o p h i i d a e 中分离的突触后洳神经毒素可以选择性地与n - 乙酰胆碱受体结合来阻断神经肌肉的传递。到目前为止有8 0 种以上的洳神经毒素 的一级序列被测定，且可以分为短链神经毒素( 6 0 6 2 个氨基酸，4 对二硫键) 和长链神经毒素( 6 6 7 4 个氨基酸，5 对二硫键) 。2 种毒素的氨基酸序列和拓扑 结构十分相似。3 条反向平行的b 折叠和三指型环状结构从一个球状中心突出。 序列比对的结果表明，b 神经毒素的序列比对表明短链神经毒素和长链神经毒素 银环蛇蛇毒相关基因的克隆和表达研究 有1 2 个氨基酸非常保守。这些基团可能都直接间接地与n 乙酰胆碱受体结合。 对舭神经毒素化学修饰和突变研究为他们结构功能关系提供一定依据，暗示a 神 经毒素几个保守不变的基团可能参与它们毒素的功能。一系列的毒素蛋白，心脏 毒素( 6 0 6 2 氨基酸残基，4 对二硫键) ，也被从蛇毒中分离出来。心脏毒素和神 经毒素序列比对结果表明，半胱氨酸残基都在相同的位置出现。而且心脏毒素晶 体结构解析后发现它也具有三指结构。然而心脏毒素却没有神经毒素的药用效 果，它没有特定的细胞受体。而且心脏毒素的5 非编码区和3 非编码区，还有 信号肽系列与洳神经毒素同源性很高，暗示这两种蛋白可能是同一起源。系统分 析表明旺神经毒素与心脏毒素的关系比与长链神经毒素近i l “。 蛇毒神经毒素是蛇毒蛋白的重要组成部分，在不同种类的蛇中存在较大的区 别，差异百分比一般在2 0 5 0 之间。q 神经毒素是一种由7 4 氨基酸组成的碱 性多肽，属于典型的长链神经毒素，晶体结构如图1 所示，银环蛇毒素与鱼雷 烟酰胆碱受体a 亚基1 8 5 1 9 6 片段结合复合物的晶体结构如图2 所示。 图i m 银环蛇毒素晶体结构 i 埘。 f i g1 c r y s t a ls t r u c t u r eo f c t - b u n g a r o t o x i n 图2 m 银环蛇毒素与乙酰胆 碱受体a 亚基1 8 5 1 9 6 片段结合 复合物的晶体结构“。 f i g2 n m rs t r o c t a r eo f u - b u n g a r o t o x i nf r e ea n d b o u n dt oam i m o t o p eo f t h e n i c o t i n i c a c e t y l c h o l i n e r e c e p t o r 图3 i t 银环蛇毒素晶体结 构i “i 。 f i g3 c r y s t a ls t r u c t u r eo f - b u n g a r o t o x i n a i r d 等人”1 从银环蛇毒素中分离到y 一银环蛇毒素，晶体结构的解析表明它在 n 一末端区域多出1 个二硫键和1 个r g d 序列区。但它的功能还未被阐明，值得 2 银环蛇蛇毒相关基因的克隆和表达研究 注意的是，在y 银环蛇毒素的序列中不包含0 t - 神经毒素中高度保守又发挥重要功 能的氨基酸残基。k 银环蛇毒素结构如图3 所示。k - 银环蛇毒素表现出一定的作用 在神经元烟碱受体上而且可以阻断小神经毒素不起作用的神经系统的传递。结构 一功能研究表明，b 银环蛇毒素的a r g 3 4 和p r o 3 6 参与了毒素分子与神经元受体 的结合。虽然a 神经毒素和挣银环蛇毒素在氨基酸序列和功能上分化较大但他们 的e d n a 序列在37 非编码区、和信号肽部分同源性很高，暗示神经毒素和k _ 银 环蛇毒素可能有共同的起源。 长链神经毒素的基因组结构相似，都是3 个外显子被2 个内含予隔开1 1 6 】。如 图四所示： 图t 长链神经毒素基因结构霉 f i g4 - g h eo r g a n i z a t i o no f l o n gn e u r o t a x j n - 目前的对神经毒素的研究内容主要有：( 1 ) 确定毒素作用的分子靶位；( 2 ) 研究 毒素与靶位点之间作用方式及过程；( 3 ) 研究毒素的结构与功能之间的关系；( 4 ) 研 究毒素分子的基因表达调控等。蛇神经毒素既是研究的对象和材料，也是开展其 它理论研究的工具和手段。 蛇神经毒素应用领域主要有以下的几方面：( 1 ) 蛇神经毒素的特异性好、亲和 力强，用作研究神经递质受体组织及细胞特异性分布的探针；( 2 ) 用蛇神经毒素的 特异性好的特点，分离提纯特异的神经递质受体；( 3 ) 蛇神经毒素的稳定性好、种 类丰富且来源广泛，易于结晶，是研究构效关系的极好模型；( 4 ) 蛇神经毒素的免 疫原性强，而分子量小，可用来探讨抗原结构与免疫原性的关系；( 5 ) 蛇神经毒素 是探讨神经信号的运输过程以及其它神经活动的重要工具。( 6 ) 蛇毒神经毒素及其 改构的神经毒素在临床上主要用于治理神经性疼痛、癌痛及神经硬化症等，用于 诊断重肌症无力等神经性疾病。由于蛇毒神经毒素止痛无瘾，没有药物依赖性， 因此在吸毒者戒毒方面前景广阔。美国f d a 已批准了2 种蛇毒神经毒素作为药物， 银环蛇蛇毒栩关基凼的克隆和表达研究 一个用于治疗顽固性神经痛和癌痛的c o b r o x i n ，一个是治疗关节疼痛的n y l o x i n 。 我国分离的蛇毒神经毒素( 商品名克痛宁) 用于临床，曹宜生研制的复方可痛宁 在治疗神经性疼痛、癌痛及戒毒方面显示了很好的疗效；但还存在生效慢、效能 不高的缺点。 2 c 型凝集素 蛇毒包含多种有着不同药用活性的蛋白质，这些蛋白已经被分离并测定一级 结构。他们属于一个多蛋自家族，比如说磷酸脂酶a 2 ，丝氨酸蛋白酶，c 型凝集 素、c 型凝集素样蛋白、ku n i t z - t y p e 蛋白酶抑制剂，以及前文介绍的三指型毒素， 他们都是由多基因编码的。进化分析表明这些蛋白家族的进化大都遵循达尔文加 速度进化的理论，现在很多通过抑制或激活特异的血小板的膜受体和血液凝集因 子影响凝血和出血的c 型凝集素样蛋白已经从各种各样的蛇毒中被分离【。 2 1c 型凝集素样蛋白家族 c 型凝集素是在很多动物中都存在的非酶类蛋白，它们是钙离子依赖性的与 单糖或寡糖结合。他们大多具有多个结构域，包括一个或多个高保守的，由1 1 5 1 3 0 氨基酸组成的区域，这个区域具有唯一一个a b 拓扑结构，被称为碳水化合 物结合结构域( c r d ) 1 1 8 】。在有钙离子存在的条件下，c 型凝集素表现出广泛的 生物学活性，例如说黏附、内吞作用、病原体中和掣1 9 i 。这些蛋白根据他们结构 不同可以分为七个类型【1 9 ，2 0 l 。i 型包括四个成员，v e r s i c a n ，a g g r e c a n ，n e u r o c a n 和 b r e v i c a n l 2 1 1 ，他包括一个蛋白多糖中心肽和一个在c 端附近的c 型凝集素结构域。 i i 型c 型凝集素有一一个跨膜结构域，一个细胞外的羧基端和一个细胞内的氨基端， 这一组一个典型的例子就是细胞a s i a l o 糖蛋白受体。i i i 型c 型凝集素是c o l l e c t i n s ， 它通过补充激活参与宿主的防御机制，这型c 型凝集素包括血清甘露糖结合蛋白， 肺表面活性剂s p a 和s p d ，牛血清蛋白和c o n g l u t i n i n ，还包含一个氨基末端的 胶原蛋白基团和一个羧基术端的c 型凝集素基团。i v 型的凝集素，或者叫做 s e l e c t i n ，他们参与白细胞和血管表皮细胞的黏附相互作用，这是白细胞溢出的一 个重要步骤。现在已发现有3 种s e l e c t i n s ：l s e l e c t i n ( 白细胞) ，e s e l e c t i n ( 表皮 4 银环蛇蛇毒相关基凼的克隆和表达研究 细胞) ，和p s e l e c t i n ( 血小板) 。v 型c 型凝集素有一个与i i 型c 型凝集素相似 的i i 型跨膜结构，参与白细胞受体相关的信号转导过程，其中最典型的例子就是 自然杀伤细胞受体 2 2 1 和低亲和力的i g e 受体1 。v i 型c 型凝集素是i 型跨膜蛋白， 具有1 个富含丝氨酸的胞外区域，紧接着是f i b r o n e c t i ni i 型结构域，和一前一后 的c r d 紧随在跨膜基团和羧基端的细胞质结构域。这型的c 型凝集素包括巨嗜 细胞表面甘露糖受体和1 个树枝细胞表面分子d e c 2 0 5 。v i ic 型凝集素，在胰腺 和蛇毒中都有发现，包括简单的c r d ，只能和糖结合【1 7 1 。 2 2c 型凝集素样蛋白 没有碳水化合物结合活性，只在蛇毒中发现。例如，r u s s e l sv i p e r ( v i p e r a r u s s e m 中发现的的血液凝集因子x 激活因子( r v v - x ) 【2 4 1 ，一种异质二聚体金 属蛋白酶，包含一个c 型凝集素类似结构域作为它的轻链，虽然轻链与半乳糖特 异凝集素同源性很高，但r w - x 并没有半乳糖结合活性。虽然与c 型凝集素高度 同源，但这些蛋白与c 型凝集素在生理活性上并不同。例如，抗凝集蛋白，i x 结合蛋白【2 5 1 ，i x 结合蛋白【2 6 】，都已经从竹叶青蛇毒中分离到。从a g k i s t r o d o na c u t u s 中也分离到x 一结合蛋1 刍 2 7 , 2 s ，b o t r o c e t i n 可以加强v w f 因子与糖蛋白i b 结合， 而且可以阻止血小板的凝集 2 9 ，3 0 l ： b o t h r o j a r a c i n 一种从b o t h r o p sj a r a r a c a 中分 离到的h i r u d i n 具有类似的c t 凝血酶抑制荆【3 ”。 约有8 0 种从蛇毒中分离的c 型凝集素和c 型凝集素样蛋白的一级序列被测 副1 7 1 。虽然c 型凝集素样蛋白在结构上与c 型凝集素相似，包括一个c r d 结构 域，他们都属于v i ic 型凝集素家族，表现出广泛的抗凝集因子、抗血小板并且 影响出血和凝血的药物活性。根据功能大致将蛇毒c 型凝集素分为几类：凝集素、 凝集蛋白、血小板凝集激活剂、血小板拮抗剂。非常有趣的是，蛇毒c 型凝集素 或者是由两个相同亚基组成的同质二聚体，或者是有a 亚基和b 亚基组成的异质 二聚体。 2 3 蛇毒中的c 型凝集素 半乳糖特异的c 型凝集素已经在响尾蛇( ，口船a t r o x ) 口2 1 b j a r a r a c a 例和 其他属于眼镜蛇科和蝰科毒蛇的毒素中被分离。这些凝集素可以引起红细胞的凝 银环蛇蛇毒相关基因的克隆和表达研究 集，且凝集作用是剂量依赖性的。9 个这样的c 型凝集素的一级序列已经被测定1 3 ” 3 5 1 。他们大多都有两个相同的亚基由共价键连接，由1 3 5 1 4 1 个氨基酸组成。和 其他的c 型凝集素的c r d 一样，他们在序列中c y s 3 9 ，g i u 4 8 ，g l y 8 2 ，a s p 8 5 ，t r p 9 2 ， p r o l l 3 ，g l u l 2 0 ，c y s l 2 2 ，t r p l 3 4 ，a s h l 3 5 ，a s p l 3 6 ，c y s l 3 9 ，和c y s l 4 7 这些氨基酸非 常保守。响尾蛇c 型凝集素三级结构已经用x r a y 解析了，结果表明r s l 是一个 十聚体的蛋白，由两个平行的五水合物背靠背交错连接而成的【3 “。 2 4 抗凝集蛋白 很多的抗凝集的c 型凝集素样蛋白己经从多种蛇毒中分离。根据他们配体识 别的的不同，将他们分为3 种类型：1 ) 凝集因子i x x 结合蛋白，比如说从z 肋o v 护瑚j 口5 】中分离的h a b ui x x 结合蛋白，从最j a r a r a c a e 3 7 1 中分离的j a r a r a c a i x x 结合蛋白，从e c h i s c a r i n a t u s l e u c o g a s t e r 3 8 l 中分离的e c l v i x x 结合蛋白， 和从a h a l y sb r e v 妇“跏【圳中分离的h a l y x i n 。2 ) ，凝集因子i x 结合蛋白， 例 如从t f l a v o v 以以6 1 中分离的h a b ux x 结合蛋白，从zs t e j n e g r i 4 0 】分离的t s v f i x 结合蛋白，和从爿施加p a l l a s 4 1 1 中分离的a h p i x 结合蛋白。3 ) 凝集因 子x 结合蛋白如从d e i n a g k i s t r o d o na c u t u s 中分离的x 结合蛋白，和从a a c u t u s 中分离的a a a c p 。在有钙离子存在的情况下，这些蛋白和和x 凝集因子的y 一羧基谷氨酸结构域结合。有趣的是h a b ui x 结合蛋白和i x x 结合蛋白有相似的b 亚基，而0 t 亚基在全部的1 2 9 个氨基酸中只有1 9 ( 1 5 ) 个氨基酸的差距。h a b u i x 结合蛋白和i x x 结合蛋白的晶体结构表明，它们在中心环都有个结构域交换 的结构，他们由一对链间二硫键连接，形成一个凹型表面，推测是g l a 一结构域的 结合位点。i x 结合蛋白和i x x 结合蛋白氨基酸残基的不同主要集中在部分凹型 表面。 2 。5 血小板凝集激活剂 在出血和病态的凝血过程中，血小板凝集是由血小板糖蛋白i b 因子和v 因子 复合物与v w f 相互作用引起的。这个相互作用不仅是血管损伤位点血小板黏附的 首要步骤，而且可以促进纤维蛋白原与整合素a i i b l 3 3 ( g b i b i i i a ) 结合，这个过 程最终导致血小板聚集。激活的血小板在细胞外通过两个胶原蛋白受体，g p i a l l i a ( 2 6 1 ) 和g p v i 紧密地与胶原蛋白结合。 银环蛇蛇毒相关基因的克隆和表达研究 这些血小板上的糖蛋白受体也是蛇毒c 型凝集素样蛋白的靶位，例如，从z a l b o l a b i r i s 中分离的a l b o a g g r e g ；i na 可以通过和g p v i 和g p i b 3 0 ，4 2 , 4 3 】结合而激活 血小板。从cd u r i s s u st e r i 谚c u s 中分离的c o n v u l x i n ( c v x ) 可以通过胶原蛋白受体、 g p v i 和g p i a l l a 4 4 4 6 他与天然的人血小板g p i b t t 的结合力比结合鼠血小板 g p i i x t 高1 4 7 1 。一系列被c v x 激活的a p v i 受体可以激活s r c 激酶、f c 受体r 链的磷酸化和p 7 2 8 y k 1 的激活。最近，c v x 的晶体结构已经被解析，它是四聚体 结构，包括一个柱状的a 4 p 4 四聚物由一对附加的二硫键连接a 亚基1 3 5 半胱氨酸 和p 亚基3 半胱氨酸d g 。从c a l l o s e l a s m ar h o d o s t o m a 中分离的r h o d o c y t i n 是第一 个被报道的可以通过g p i d l l a 来激活血小板的聚集【5 0 5 2 l 。然而，b e r g m e i e r 等人 报道说r h o d o e y t i n 可以在缺乏g p i a l l a 、g p v i 和g p i i m 配体结合结构域的情况下 激活血小板的聚集。而且，e b l e 等人发现可溶的、缺少跨膜结构的g p i a 仃i a 可以 识别胶原蛋白，却不能被r h o d o c y t i n 识别。这些结果与认为r h o d o c y t i n 与g p i a l l a 结合的观点矛盾t t 5 4 1 。最近，s h i r a i s h i 等人报道了一些胶原蛋白和r h o d o c y t i n 介 导的反应中些共同特征删。他们介导了一个相似的肌动蛋白聚合抑制剂、细胞 松弛素d ，而事实上c h e d i a k - h i g a s h i 综合症病人的血小板在与胶原蛋白和 r h o d o c y t i n 的亲和力降低，表明r h o d o c y t i n 可以识别g p l a i l a 或其他的到目前为止 还未被确定的胶原蛋白受体，这些受体对c y t o c h a l a s i nd 很敏感。因此，r h o d o c y t i n 激活血小板的机制还不清楚。更有趣的是，一种有效的血小板激活剂，从 o p h i o p h a g u sh a n n a h 中分离的o p h i o l u x i n , 已经被证明可以通过g p v i f r 复合物而 激活血小板，这个方式与c v x 相似【5 6 1 。 另外一种c 型凝集素样蛋白血小板聚集激活机制是用从丑j a r a r a c a 2 9 ，5 7 1 中分 离的b o t r o c e t i n 和从b # i sa r i e t a n s e t s s 中分离的b i t i s c e t i n 来研究的。在体外这些蛋 白都可以直接与v w f 结合来激活复合物然后与通过与g p i b 相互作用诱导血小板 聚集。v w f ，一种由几个2 7 5 k d 的亚基组成的多聚体，通过与g p i b 相互作用 在受损的血管壁上形成血栓【5 9 1 。b o t o r o c e t i n 与v w f 的a l 结构域结合形成一个 简单的复合物，k o 约为2 3 n m ，它可以增加与g p i b 结合力从3 3 u m 增加到1 2 u m 。 b i f i s c e t i n 结合v w fa 1 结构域的位点是在a r 9 6 3 2 ，l y s 6 6 0 ，g l u 6 6 6 ，和l y s 6 7 3 ，跨 越c t 4 a 和旺5 螺旋和一个在a 5 和b 6 之间的环，接近通过重组v w f 的丙氨酸扫 描筛选到的b o t r o c e t i n 结合位点 6 0 1 。而且，b i t i s c e t i n 和b i t i s c e t i n v w fa l 复合物m 银环蛇蛇毒相关基因的克隆和表达研究 6 2 1 ，b o t o m c e t i n 【6 3 】，和b o t o r o c e t i n v w fa 1 6 4 】复合物的x 晶体衍射结果表明 b o t r o c e t i n 和b i t i s c e t i n 都是通过结合到g p i b 结合表面来激活v w f 之后诱导v w f a 1 结构域与g p i b a 结合，而不引起v w f 构象的变化。 2 6 血小板聚集拮抗剂 正如上面描述的，v w f 与g p i b 因子的因子v 复合物结合是血小板激活 过程中的重要步骤。c 型凝集素样蛋白还可以作为血小板凝集的拮抗剂，它直接 与g p i b 作用而抑制了v w f 与g p i b 的相互作用，并且已经被分离出来了。有从 a a c u t u s 6 5 1 毒素中分离的a g k i c e t i n ，从a h a 咖b l o m o h o 游 6 6 】毒素中分离的 m a m u s h i g a n ，从ch o r r i d u s d 眦p 0 】毒素中分离的c h h - a b ，从d 叩础撂【6 7 1 中 分离的a g l d c e t i n c 从ec a r i n a t u s m 4 ，6 8 ，6 明中分离的e c h i c e t i n ，从za l b o l a b i s 7 0 7 u 毒素中分离的a l b o a g g r e g i n b ，和从t f l a v o v i r i d i s 【7 2 7 3 】中分离f l a v o c e t i n - a 。虽然所 有这些蛋白都是阻断了v w f 与g p i b 的结合，他们的作用方式和作用部位还是有 所不同。例如，f l a v o c e t i n a 与g p i b 的结合能力是其他蛋白，比如e c h i c e t i n 和 a l b o a g g r e g i n b 的1 0 1 0 0 倍，而且在高剪切压力下抑制剪切诱导的血小板聚集【7 2 1 。 对这些结构相关的蛋白( a l b o a g g r e g i n b ，e c h i c e t i n ，c h h 怕) 交叉封阻 ( c r o s s b l o c k i n g ) 研究和抗g p l b a 单克隆抗体都表明这些蛋白的结合位点是不相 同的【3 0 】。而且e c h i c e t i n 还可以封阻低浓度( o 2 u m 1 ) 的旺一凝血酶与g p i b 结合， 还包含一个与在血浆中应答血小板聚集的i g m k 的结合位点。f l a v o c e t i n a 2 5 a 下 解析的晶体结构表明是个柱状的四聚体a 4 1 3 4 四聚体，由四个d b 异质二聚体通过 a 的c 末端的半胱氨酸和b 亚基n 一末端的半胱氨酸通过一对链间二硫键连接【7 ”， 这种结果在c v x ( 另一种g p l b 结合的血小板拮抗剂) 中也存在。 新的血小板聚集抑制剂r h o d o c e t i n 和e m s l 6 先后从cr h o d o s t o m a 和e m u l t i s q r u a m a t u s 被分离【7 5 1 。r h o d o c e t i n 和e m s l 6 都是有效的胶原蛋白受体、 g p i a f l l a ( a 2 b 1 整合素) 选择性抑制剂，抑制率i c 5 0 分别为4 1 n m 和0 5 n m 。一个 用抗2 的单克隆抗体竞争重组整合素2 的i 结构域和a 1 亚基说明e m s l 6 可以 识别整合素的c 【2 亚基【7 6 】。最近，用整合素的a 2 a 结构域的突变体和单克隆抗体 的研究说明r h o d o c e t i n 是与以a 结构域结合的。e m s l 6 和r h o d o c e t i n 还可以抑制 应答i 型胶原蛋白的细胞迁移，例如，h u v e c 的迁移和胶原质细胞侵入的基质细 胞的迁移彻。在1 9 a 下解析e m s l 6 的晶体结构表明e m s l 6 的异质二聚体在中心 银环蛇蛇毒相关基斟的克隆和表达研究 环的部位有一个结构域交换结构，形成一个与其他凝集素样蛋白相似的凹入表面 ”。e m a l 6 在凹入的表面有一个唯一的带正电荷的疏水基团，这可能是与g p i “i i a 相互作用的部位。几种c 型凝集素样蛋白的结构表明在他们的区别都表现在凹入 表面的不同，这一点可能是他们与目标分子相互作用上起重要作用。 另两种属于血小板聚集拮抗剂的c 型凝集素样蛋白也已经从b o t h r o p s 蛇毒中 得到分离，它们是从矗 a r a r a c a 分离的b o t h r o j a r a c i n ，还有从最a l t e r n a t u s 中分离 的b o t h r o a l t e m i n l 7 8 ，7 9 1 。b o t h r o j a r a c i n 和b o t h r o a l t e r n i n 可以抑制由凝血酶诱导的血 小板聚集，i c 5 0 分别为o 1 9 u g m 1 0 0 6u g m l 。而且，b o t h r o a l t e m i n 与凝血酶外位 和a b e i i 的阴离子c 位( a b e ) i 结合，其中( a b e ) i 还是纤维蛋白原、血小板 受体、凝血调节蛋白和肝磷脂结合位点，因此就封阻了凝血酶凝集活性和凝血酶 诱导的血小板的激活唧1 。蛋白分子量约为2 7 k d ，由两条不同的分子量分别为1 5 k d 和1 3 k d 多肽链和b 由一对二硫键连接f 8 l 】。 2 7 其他的c 型凝集素样蛋自 c 型凝集素样蛋白还在一些与多聚体结构的丝氨酸结构域有联系的蛋白中发 现。因子x 的激活因子，从矿r 跚e 肼【2 4 】毒腺中分离的r w x 和从ec a r i n a t u s 8 2 】 毒素中分离c a r i n a c t i v a s e 凝血酶前体激活因子就属于这个类型。c a r i n a c t i v a s e 包括 两个亚基非共价紧密连接。一个弧基是6 2 k d 的金属蛋白酶，而另一个亚基( 2 5 k d ) 由两对二硫键连接的多肽组成，这与c 型凝集素样蛋白的结构相似，而且特异性 地与凝集因子i x 和x 的g l a 结构域结合。r v v x 有一个5 9 k d 的金属蛋白酶亚 基，而另一个亚基是由一对二硫键连接一个1 8 k d 和2 1 k