耐胆盐革兰阴性菌PPT课件.pptx

耐胆盐革兰阴性菌定量试验,1,.,目录,2,3,在药物分析中经常可以用到:定性试验:指的是用适当的方法(化学分析或仪器分析等等)，来确定所测物质是否为已知的,你要鉴别的物质定量试验:指的是在确定为你要鉴定的物质的基础上,用适宜的方法(同上),来测定你要鉴定的物质的量是多少.,定性与定量的区别,4,微生物的定量在实际工作中应用极广,它不仅是微生物工作者常用手段之一,而且在各行业上应用也十分广泛。微生物的定量是基础微生物内容之一。需要菌体的微生物发酵大型生产,更需微生物的定量。和灾害微生物作斗争中,了解不同环境微生物污染情况,例如,水的污染、空气的污染,定量实验的定义,5,中药饮片厂与药厂视频,6,中药饮片与药厂差别,药片饮片厂从本质上来说也属于药厂，只是属于药材加工这一方面，所以要求比较低。,7,操作程序,1.概述:培养基是微生物试验的基础，直接影响微生物试验结果。适宜的培养基制备方法、贮藏条件和质量控制是提供优质培养基的保证。供试品微生物限度检查中所使用的培养基应进行适用性检查。2.验证目的：本次验证的目的是确认耐胆盐革兰阴性菌检查用培养基适用性检查用的肠道菌增菌液体培养基、紫红胆盐葡萄糖琼脂培养基的质量，以及其制备程序、保存条件等是否满足微生物限度检查用要求。3.验证依据：中国药典2015年版四部“1106非无菌产品微生物限度检查：微生物控制菌检查”、“9203药品微生物实验室质量管理指导原则”。4.验证项目：肠道菌增菌液体培养基、紫红胆盐葡萄糖琼脂培养基的适用性检查。5.适用范围：成品培养基、由脱水培养基或按处方配制的培养基均应进行培养基适用性检查。,8,操作过程,定量试验：选择和分离培养取相当于0.1g、O.Olg和O.OOlg(或0.1ml、0.01ml和0.OOlml)供试品的预培养物或其稀释液分别接种至适宜体积(经方法适用性试验确定）肠道菌增菌液体培养基中，3035C培养2448小时。上述每一培养物分别划线接种于紫红胆盐葡萄糖琼脂培养基平板上，3035*C培养1824小时。,9,备料单,胰酪大豆胨液体培养基1支（10ml支）肠道增菌液体培养基5支（10ml支）刻度吸管1ml56支缓冲液3支（9ml支）角勺、玻璃棒各1个；每2小组准备研钵一套，消毒用品。,10,胰酪大豆胨液体培养基10ml1g供试品,取供试品，用胰酪大豆胨液体作为稀释剂照“非无菌产品微生物限度检查微生物计数法”（通则1105）制成1：10供试液，混匀在2025培养培养时间应使供试品中的细菌充分恢复但不增殖（约2小时）,PH7.0无菌氯化钠蛋白胨缓冲液9ml,缓冲液9ml,缓冲液9ml,101,102,103,肠道增菌液体培养基10ml,肠道增菌液体培养基10ml,肠道增菌液体培养基10ml,肠道增菌液体培养基10ml,阳性菌阳性菌液液,阳性菌液,肠道增菌液体培养基10ml,3035培养2448小时,3035培养1824小时,11,结果判断：若紫红胆盐葡萄糖琼脂培养基平板上有菌落生长，则对应培养管为阳性，否则为阴性。根据各培养管检查结果，从MPN表查对1g或1ml供试品中含有耐胆盐革兰阴性菌的最大可能数。,12,什么是MPN?它的用途又是什么？微生物限度检查与它有着怎样的联系？,思考,13,MPN,最大或然数(mostprobablenumber，MPN)计数又称稀释培养计数，即最近似数法，也称最大可能数法，是食品检验中常用的方法。1915年McCrady首次发表了用MPN法来估算细菌浓度的方法，这是一种应用概率理论来估算细菌浓度的方法。,14,原理,其特点是利用待测微生物的特殊生理功能的选择性来摆脱其他微生物类群的干扰，并通过该生理功能的表现来判断该类群微生物的存在和丰度。缺点是只适于进行特殊生理类群的测定，结果也较粗放，只有在因某种原因不能使用平板计数时才采用。,15,MPN法,优点：操作简便，灵敏度较高，时间短，可直接观察试管得出结论，若发酵培养基不产气，24h即刻报告控制菌阴性，每个接种稀释度均有重复，重复次数越多，误差就会越小。,缺点：要求样品具有均一性，适合检验液体样品，且只能用于检验在发酵培养基中产气的菌种。,适用性：MPN法适用于具有特殊生理功能的微生物类群或者检测带有大量竞争菌的食品及其原料和未经处理的含少量的金黄色葡萄球菌的食品(土壤，污水，牛奶等）,16,耐胆盐革兰阴性菌的可能菌数,注：代表紫红胆盐葡萄糖琼脂平板上有菌落生长；代表紫红胆盐葡萄糖琼脂平板上无菌落生长。若供试品量减少10倍（如0.01g或0.01ml，0.001g或0.001ml，0.0001g或0.0001ml），则每1g(或1mL)供试品中可能的菌数（N）应相应增加10倍。,17,局限性,例如，MPN值为90时，有四种不同情况的阳性管数。阳性管数为“0-0-0”“0-1-2”对应的最大概率（Pmax）极小，此时的MPN值90MPN/100ml(g）无意义，所以在FDA细菌学手册中，已删除了这两种情况。阳性管数为“0-3-0”对应的最大概率（Pmax）为0.00417%，而国标中并没有列出相应的95%置信区间，是考虑到该置信区间过广，已没有很大的指导意义。而阳性管数为“2-0-0”的最大概率（Pmax)为31.91613%，表明实际的菌落数在10360cfu/100ml(g）之间。所以，测定MPN值时，要考虑阳性管数。相同的MPN值，代表的实际菌落数范围却有很大的差别。假如你的产品标准为100MPN/100g，实测值为90MPN/100g（阳性管数“0-3-0”），那么很难判定你的产品是否合格。,18,MPN法与平板法卫生学意义,两者都是检测的活菌数，MPN是通过极大近似值然后估计，求出分布函数中的参数，置信区间，再估计；但是CFU(平板计数法)通过数据直接求平均值和方差。,测定结果判定食品被细菌污染的程度及卫生质量，一定程度反映食品在生产过程中是否符合卫生要求，以便对被检样品做出适当的卫生学评价。多少在一定程度上标志着食品卫生质量的优劣,19,20,注意事项,1）在使用移液管时尽量靠近液体，使其充分融合2）在接种完后，在酒精灯上灭菌3）如果阴性培养有长菌的话要注意分析操作过程是否规范,21,22,供试品介绍,枸杞,药用价值果实（中药称枸杞子）枸杞药材药用功能与宁夏枸杞同；根皮（中药称地骨皮），有解热止咳之效用。中医认为，枸杞子具有补肾益精、养肝明目、润肺止咳的功效。现代研究表明，枸杞含有大量胡萝卜素、维生素、人体必需的蛋白质、粗脂肪和磷、铁等营养物质。其中，维生素C的含量比橙子高。,23,处理,固体细粉原辅料取样方法物流置层流罩下，打开层流罩调节电压210V，打开紫外灯30min后，关闭紫外灯。开启送风系统，打开包装封口，对应取样的每个样件，用取样器对角斜插各取样一次。取样点3个以上，其分布应呈几何对称形。先以无菌手续取约30g于三角瓶内，加塞包口，然后放入密实塑料袋内。取完各样件后将放有样品的密实袋充气密封，反复颠倒数次，使样品充分混匀，用台秤称取所需量，置于另一密实袋内，密封。,24,品牌：环凯生产批号：3104591供应商：广东环凯微生物科技有限公司数量：1000保质期：三年保存条件：阴凉干燥处规格：250g产品名称：紫红胆盐葡萄糖琼脂培养基022223PRODUCTNAME：VioletRedBileGlucoseAgar【紫红胆盐葡萄糖琼脂培养基包装规格】紫红胆盐葡萄糖琼脂培养基【紫红胆盐葡萄糖琼脂培养基产品用途】用于耐胆盐革兰氏阴性菌的选择性分离培养。(2015版CP),25,紫红胆盐葡萄糖琼脂培养基配方成分成分含量(g/L)酵母浸出粉3.0明胶胰酶水解物7.0葡萄糖10.0中性红0.03mg结晶紫0.002mg氯化钠5.0脱氧胆酸钠1.5琼脂15.0蒸馏水(干粉培养基不含此成分)1000最终pH5.60.2,26,明胶胰酶消化物(进口）：培养基选择与优化技术对未来生物领域的发展有极其重要的影响，其涵盖所有常检细菌及其他细菌，涉及食品卫生检验、医药、水质、临床、化妆品等各个领域。酵母浸粉：富含蛋白质、氨基酸、多肽、核苷酸、B族维生素、生长因子、微量元素等营养成分，比例协调，为微生物发酵培养提供全面均衡的营养；脱氧胆酸钠：配制细菌培养基，代替脑磷脂作胆固醇絮状试验，蛋白质分析。裂解液中脱氧胆酸钠和原矾酸钠的作用前者是离子型去垢剂，后者是抑制酪氨酸磷酸酶活性的。氯化钠：氯化钠是许多生物学反应所必需的，如分子生物学试验中多种溶液配方都含有氯化钠，细菌培养基中大多含有氯化钠。中性红：中性红(Neutralred)，学名“3-氨基-7-甲氨基-2-甲基吩嗪盐酸盐”，cas号：553-24-2，是细胞活体染色和酸碱性指示剂的一种碱性吩嗪染料。结晶紫药理作用：甲紫属于三苯甲烷类染料消毒剂，和微生物酶系统发生氢离子的竞争性对抗，使酶成为无活性的氧化状态，从而发挥杀菌作用。主要对革兰氏阳性菌如葡萄球菌、白喉杆菌，以及绿脓杆菌、白念珠菌、表皮癣菌有杀灭作用，对其他革兰氏阴性菌和抗酸菌几乎无作用。,27,产品中文名：肠道菌增菌液体培养基PRODUCTNAME：ENTEROBACTERIAENRICHMENTBROTH-MOSSEL【包装规格】肠道菌增菌液体培养【产品用途】用于耐胆盐革兰氏阴性菌的选择性分离培养。(2015版CP)【检验原理】明胶胰酶水解物提供蛋白质、维生素和氨基酸;葡萄糖提供碳源;磷酸氢二钠和磷酸二氢钾为缓冲剂;牛胆盐和亮绿为选择性抑菌剂，抑制非肠杆菌科细菌的生长。【配方成分】成分含量(g/L)明胶胰酶水解物10.0二水合磷酸氢二钠8.0牛胆盐20.0亮绿0.015葡萄糖5.0磷酸二氢钾2.0蒸馏水(干粉培养基不含此成分)1000最终pH7.20.2【使用方法】外观方面：脱水干粉培养基：淡绿色粉末培养基溶解后：绿色液体，清晰无沉淀。,28,中药饮片污染耐胆盐革兰阴性菌的考察,目的：考察中药饮片耐胆盐革兰阴性菌的污染状况。方法：依据2015年版中国药典微生物限度检查法草案中耐胆盐革兰阴性菌检查方法对中药饮片耐胆盐革兰阴性菌进行定性检查，对阳性样品进行定量检查，比较预培养2h和不预培养两种方法对耐胆盐革兰阴性菌定量检出的差异。结果：通过对17个品种174批中药饮片的考察，结果显示中药饮片耐胆盐革兰阴性菌污染比较严重，达81.0。按2015年版中国药典中药饮片耐胆盐革兰阴性菌标准来判断，16.1不合格，且预培养2h和不预培养两种方法检验结果没有显著差异（P0.05）。结论：本研究可为2015年版中国药典中药饮片耐胆盐革兰阴性菌限度标准的制定提供参考依据。,29,30,样品,31,32,33,34,涂片。首先在载玻片上滴一小滴蒸馏水，用灼烧过的接种针挑取少量细菌，置载玻片的水滴中与水混合并涂抹开，注意涂抹要均匀平坦，涂抹后直径约为1cm的薄层。固定。将载玻片在火焰上方快速来回通过一两次，以载玻片的加热面接触手背皮肤，不觉过烫为佳，待冷却后再在火焰上方来回通过一两次，再冷却，这样重复操作直到薄层干了为止。染色。在制好的片上滴一滴草酸铵结晶紫，染色1min