（应用化学专业论文）发酵法生产13丙二醇条件优化及相关策略研究.pdf

独创性声明 i i i ii ii ii iii ii i i ii iiil y 1817 7 3 2 本人声明所呈交的论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研 究成果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他 人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得湖南农业大学或其它教育机构 的学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均 已在论文中作了明确的说明并表示了谢意。 研究生签名：铆d 本五 时间： 一年月丛日 关于论文使用授权的说明 本人完全了解湖南农业大学有关保留、使用学位论文的规定，即：学校有权 保留送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅，可以采用影印、缩印或 扫描等复制手段保存、汇编学位论文。同意湖南农业大学可以用不同方式在不同 媒体上发表、传播学位论文的全部或部分内容。 ( 保密的学位论文在解密后应遵守此协议) 研究生签名：剞扣。芡 时间： 导师签名、1 力勿栽 导师签名： 函、力矽崎m 山士) 年听 时间：叼年月叮日 摘要 l ，3 丙二醇是一种重要的化工原料，主要作为单体生产聚酯( p t r ) 等高分子材 料。l ，3 丙二醇的生产方法有化学法和微生物发酵法两类。微生物发酵法以其环 境友好、生产过程中不含醛类物质、产率高、产品质量好以及可再生资源为原料 等优点，成为当前研究热点。为了进一步提高l ，3 丙二醇产量、实现发酵的有效 调控，本论文对克雷伯氏肺炎杆菌( k l e b s i e l l a p n e u m o n i a e ) 合成l ，3 丙二醇的发 酵条件优化、p n 值对中心碳代谢的影响、控制3 羟基丙醛( 3 i - n , a ) 保持持续发酵 等进行了系统研究，从而为工艺放大和菌种的基因改造提供指导。 利用了中心组合设计的商业软件d e s i g ne x p e r t7 0 2t r i a l 对k p n e u m o n i a e 合 成1 ，3 丙二醇的发酵条件，包括初始甘油浓度、搅拌速度、通风量以及p h 值四因 素进行了研究，获得了最佳的相关参数，使得批次发酵的生产强度提高，优化条 件下流加补料发酵实验的发酵周期明显缩短。 以p h 值作为考察因素，研究不同p h 值对发酵过程中各代谢产物代谢的影响， 结果显示，p u 值对足p n e u m o n i a e 产物谱有明显的影响，低p h 值下有机酸的合成 受到抑制，较高p h 值抑$ l j 2 ，3 丁二醇的合成。 3 羟基丙醛是甘油发酵生产l ，3 丙二醇的一个中间产物，3 羟基丙醛的积累 会造成发酵过程的异常终止。考察了初始甘油浓度、转速和氧化还原电势( o r p ) 三个因素对3 羟基丙醛积累的影响，实现了在不影响l ，3 丙二醇生产强度的情况 下，防止3 羟基丙醛的致死性积累。 研究了利用不同生物柴油副产物粗甘油对尼p n e u m o n i a e 发酵生产1 ，3 丙二 醇的影响。研究结果表明，生物柴油粗甘油浓度越高，1 ，3 丙二醇的得率和生产 强度也越高，且生产单位l ，3 丙二醇产品的经济效益也越高，证明了生物柴油和 l ，3 丙二醇耦联生产的可行性，为降低1 ，3 丙二醇工业化生产成本提供了依据。 关键词：1 ，3 一丙二醇；克雷伯氏肺炎杆菌；发酵条件优化；中心碳代谢。 a b s t r a c t 1 , 3 - p r o p a n e d i o li sa ni m p o r t a n tc h e m i c a l sm a i n l yu s e df o rt h es y n t h e s i so f p o l y t r i m e t h y l e n et e r e p h t h a l a t e ( p t t ) a n do t h e rp o l y e s t e rf i b e r s c o m p a r e dw i t ht h e c h e m i c a lm e t h o d s ，t h eb i o l o g i c a ls y n t h e s i sa p p r o a c hi si n c r e a s i n g l yf a v o r e dd u et ot h e e n v i r o n m e n t a lf r i e n d l yf e a t u r e s ，t h eh i g hy i e l da n dt h er e n e w a b l ef e e d s t o c k i no r d e r t of u r t h e re n h a n c et h e 1 , 3 一p r o p a n e d i o lp r o d u c t i v i t ya n d e n s u r et h ee f f e c t i v e f e r m e n t a t i o nr e g u l a t i o n , t h es t a t i s t i c a lo p t i m i z a t i o no fc u l t u r ec o n d i t i o n sa n dt h e c o n t r o l3 - h y d r o x y p r o p i o n a l d h y d e ( 3 - s p a ) c o n c e n t r a t i o nb e l o wt h et o x i c l e v e lt o 1 , 3 一p r o p a n e d i o lp r o d u c t i o nw e r ei n v e s t i g a t e d ，p r o v i d i n gt h es u b s t a n t i a li n s i g h t sf o r t h es u b s e q u e n tp i l o tp l a n te x p e r i m e n ta n dt h em e t a b o l i ca n a l y s i s ac e n t r a lc o m p o s i t ed e s i g nw a su s e dt os t u d yt h ee f f e c to fg l y c e r o l ，r a t eo f s t i r r i n g , a i ra e r a t i o na n dp ho nt h es y n t h e s i so f1 , 3 - p r o p a n e d i o lb yk p n e u m o n i a e t h eo p t i m u mc o m b i n a t i o n sf o r1 , 3 - p r o p a n e d i o lp r o d u c t i v i t yw a sg l y c e r o l ，r a t eo f s t i r r i n g , a i ra e r a t i o n ，a n dp ho fs 0g l ，318 叩i i l 0 6v v m , 6 4 8 ，r e s p e c t i v e l y a f t e rt h e o p t i m i z a t i o n , t h e1 , 3 一p r o p a n e d i o lp r o d u c t i v i t yo f t h eb a t c h c u l t u r ew a si n c r e a s e d t h e f e r m e n t a t i o nc y c l ef o rt h e f e db a t c hc u l t u r ew a sd e c e a s e d t h er e s p o n s eo fk p n e u m o n i a ec e n t r a lc a r b o nm e t a b o l i s mt oe n v i r o n m e n t a l p nh a sb e e ns t u d i e d t h er e s u l t si n d i c a t e dt h a tp hi n f l u e n c e dt h ep r o d u c ts p e c t r u m m o r eo r g a n i ca c i dw a sp r o d u c e da tl o wp h ，w h i l e2 , 3 - b u t a d i o ls y n t h e s i sw a si n h i b t e d a th i g hp hc o n d i t i o n 3 - h y d r o x y p r o p i o n a l d h y d e i sam e d i u mm e t a b o l i t e d u r i n g p r o d u c t i o n o f 1 , 3 一p r o p a n e d i 0 1 t h e1 , 3 一p r o p a n e d i o l f e r m e n t a t i o nw o u l dt e r m i n a t e dd u et ot h e 3 - h y d r o x y p r o p i o n a l d h y d e a c c u m u l a t i o n t h r e e a p p r o a c h e si n c l u d i n g t h ei n i t i a l g l y c e r o l ，t h es t i r r i n gr a t e ，a n dt h eo x i d o r e d u c t i o np o t e n t i a l ( o r p ) r e g u l a t i o nw e r e e m p l o y e dt oi n v e s t i g a t et h ei m p a c t so n3 - h y d r o x y p r o p i o n a l d e h y d ea c c u m u l a t i o n t h e g o a l o ft h i sw o r kw a st o s t u d y t h r e e s t r a t e g i e s i n f l u e n c e st o3 h y d r o x y p r o p i o n a l d e h y d ea c c u m u l a t i o na n dt op r e v e n tt h ea b n o r m a lc e s s a t i o n t h e r e s u l t sc o n f i r m e dt h a tt h ea c c u m u l a t i o no f3 - h y d r o x y p r o p i o n a l d h y d ec o u l db e r e g u l a t e d t h e1 , 3 一p r o p a n e d i o lp r o d u c t i o nw i t ht h ec r u d eg l y c e r o lf r o mb i o d i e s e lp r o c e s s w a si n v e s t i g a t e d t h er e s u l t sr e v e a l e dt h a t h i g h e rc o n c e n t r a t i o n c r u d eg l y c e r o l e x h i b i t e dh i g h e rp r o d u c t i v i t ya n dy i e l do f1 , 3 p r o p a n e d i o l ，t h ec o s ta n a l y s i ss h o w e d h i g h e rc o n c e n t r a t i o nc r u d eg l y c e r o lc o u l dr e d u c et h ec o s to fp r o d u c t i o n t h i sw o r k w a se x p e c t e dt op r o v i d et h eb a s i st oe f f e c t i v e l yi m p r o v eu t i l i z a t i o nr a t i oo fc r u d e g l y c e r o lf r o mb i o d i e s e lp r o c e s s ，p r o d u c eb i o d i e s e la n d1 , 3 p r o p a n e d i o l ，a n dr e d u c e t h ec o s to fp r o d u c t i o no f1 , 3 - p r o p a n e d i 0 1 k e y w o r d s ：1 ，3 - p r o p a n e d i o l ；k l e b s i e l l ap n e u m o n i a e ；o p t i m i z a t i o n o fc u l t u r e c o n d i t i o n s ；c e n t r a lc a r b o nm e t a b o l i s m 目录 第一章绪论1 1 前言1 11 刖吾 1 11 ，3 一丙二醇的理化性质1 1 21 ，3 一丙二醇的主要应用2 1 31 ，3 一丙二醇的生产方法2 1 3 1d e g u s s a 公司生产方法3 1 3 2s h e l l 公司的环氧乙烷合成法3 1 3 3 利用甘油选择性脱羟基法3 1 3 4 其它化学合成路线4 1 3 5 发酵法生产l ，3 一丙二醇4 2 微生物发酵生产1 ，3 一丙二醇的研究进展4 2 1 甘油代谢及1 ，3 一丙二醇生物合成途径5 2 1 1d h a 操纵子5 2 1 2g t p 操纵子6 2 2 代谢工程研究7 2 2 1 异源表达1 ，3 一丙二醇相关基因，构建新的生产菌株8 2 2 2 对原始菌株进行基因改造，构建g m o 菌株1 0 2 3 发酵优化1 0 2 3 1 培养基优化1 0 2 3 2 发酵中间产物积累的研究1 0 2 3 3 发酵工艺研究1 1 i v 2 4 生产1 ，3 一丙二醇的下游工程1 3 2 4 1 浓缩精镏分离工艺1 3 2 4 2 色谱分离工艺1 3 2 4 3 分子筛吸附分离工艺1 3 2 4 4 膜分离工艺1 3 2 4 5 反应萃取和反应精馏分离工艺1 3 3 本文研究意义和内容1 4 3 1 选题背景1 4 3 2 主要研究内容1 5 第二章利用中心组合优化1 ，3 一丙二醇的发酵条件1 6 1 材料与方法1 6 1 1 实验材料1 6 1 1 1 菌种1 6 1 1 2 培养基1 6 1 1 3 主要仪器设备及试剂1 8 1 2 细胞培养方法1 8 1 3 分析方法1 8 1 3 1 生物量测定1 8 1 3 2 底物和产物的测定1 9 1 3 3 铵基氮含量测定1 9 2 实验设计2 0 v 2 1k p n e u m o n i a e 菌体的元素组成3 0 2 2 不同p h 值对菌体生长的影响3 0 2 3 不同p h 值对甘油底物消耗的影响3 1 v i 2 4 不同p h 值对葡萄糖辅助底物消耗的影响3 2 2 5 不同p h 值对1 ，3 一丙二醇合成的影响3 2 2 6 不同p h 值对丁二酸合成的影响3 2 2 7 不同p h 值对乳酸合成的影响3 2 2 8 不同p h 值对乙酸合成的影响3 3 2 9 不同p h 值对2 ，3 一丁二醇合成的影响3 4 2 1 0 不同p h 值对乙醇合成的影响3 4 2 11 不同p h 值对产物终浓度的影响3 4 3 小结3 5 第四章控制3 一羟基丙醛保持持续发酵3 6 1 材料与方法3 6 1 1 实验材料3 6 1 1 1 菌种3 6 1 1 2 培养基3 6 1 1 3 主要仪器设备及试剂3 6 1 2 细胞培养方法3 7 1 3 分析方法3 7 1 3 1 生物量测定3 7 1 3 2 底物和产物的测定3 7 1 3 3 铵基氮含量测定3 7 1 3 4 尾气中c 0 2 含量的测定3 7 1 3 53 一羟基丙醛含量测定3 7 1 3 6 氧化还原电势的测定3 8 2 结果与讨论3 8 2 1 初始甘油浓度对3 - h p a 积累的影响3 8 2 2 转速对3 - h p a 积累的影响3 9 2 3 氧化还原电势对i ，3 一丙二醇合成和3 一h p a 积累的影响4 0 3 小结4 2 第五章生物柴油副产物甘油发酵生产i ，3 一丙二醇的研究4 3 1 材料与方法4 3 1 i 实验材料4 3 i 1 i 菌种4 3 i 1 2 培养基4 3 i 1 3 主要仪器设备及试剂4 3 i 2 细胞培养方法4 4 i 3 分析方法4 4 1 3 i 生物量测定4 4 i 3 2 底物和产物的测定4 4 i 3 3 铵基氮含量测定4 4 2 结果与讨论4 4 2 i 批次发酵实验4 4 2 2 以精制甘油为原料的流d h i i , 料发酵实验4 5 2 3 以生物柴油粗甘油a 为原料的流加补料发酵实验4 6 2 4 以生物柴油粗甘油b 为原料的流加补料发酵实验4 6 2 5 以生物柴油粗甘油c 为原料的流加补料发酵实验4 7 2 6 发酵生产1 ，3 一丙二醇的经济效益对比4 8 3 小结4 8 第六章结论与展望5 0 1 结论5 0 2 展望5 l 参考文献5 2 附录i ：h p l c 钡j j 定的标准曲线6 0 附录i i ：化学分析所用标准曲线6 2 致谢6 3 个人简历、在学期间的研究成果及发表的论文6 4 i x 3 眦 c d w 1 , 3 - p d a c e 2 ，3 - b d e t h g l y s u c l a c 国 a d p d h a k g d h t g d h n a d + n a d h o i 心 主要符号对照表 3 羟基丙醛 细胞干重 l ，3 丙二醇 乙酸 2 ，3 丁二醇 乙醇 甘油( 丙三醇) 琥珀酸( 丁二酸) 乳酸 三磷酸腺苷 二磷酸腺苷 二羟丙酮激酶 甘油脱水酶 甘油脱氢酶 尼克酰胺腺嘌呤二核苷酸一辅酶i ( 氧化型) 尼克酰胺腺嘌呤二核苷酸一辅酶i ( 还原型) 氧化还原电势 x 湖南农业大学硕士学位论文 1 前言 第一章绪论 l ，3 丙二醇( 1 ，3 p d ) 是一种重要的化工原料，可作为有机溶剂应用于油墨、 印染、涂料、润滑剂、抗冻剂等行业。目前最主要的用途是作为聚合物和某些有 机化合物生产的中间体。l ，3 丙二醇可以替代l ，4 丁二醇和新戊二醇等中间体用 于生产多醇聚酯及作为碳链延伸剂。以l ，3 丙二醇与对苯二甲酸( 酯) 合成的聚酯 p t t ( 聚对苯二甲酸丙二醇酯) ，显示了比以l ，2 丙二醇、丁二醇、乙二醇为单体 合成的聚合物更优良的性能。p t t 在1 9 9 8 年被美国评为六大石化新产品之一， 被认为是p e t 的升级产品，具有广阔的市场前景。但由于原料1 ，3 丙二醇生产技 术难度大、成本高而导致p t t 很难大规模工业化生产。s h e l l ( 壳牌) 和d u p o n t ( 杜邦) 两家跨国公司采用传统的化学合成路线，副产物多，工艺过程需要高温 高压，设备投资巨大。我国石油、石化两大集团也投入较大人力、财力研究1 ，3 丙二醇的化学合成工艺，但目前技术水平和工业化有较大差距。生物法生产1 ，3 丙二醇因为条件温和，选择性高，原料可再生等优势而日益受到关注。 1 11 3 一丙二醇的理化性质 分子式：c 3 h 8 0 2 相对分子量：7 6 0 9 结构式：h o c h 2 c h 2 c h 2 0 h 外观：通常情况下为无色或淡黄色粘稠状液体，略有刺激的咸味。 主要物理常数【1 】如下见表1 1 。 溶解性能：能与水、乙醇、丙酮等多种溶剂混溶，但不与苯、四氯化碳、石 油醚混溶。 无腐蚀性，微毒，小鼠口服l d s o 为1 4 1 5g k g 。易于生物降解，对环境影响 小。不能用于食品或可食用产品。 主要化学性质：长时间煮沸生成双( 3 羟基丙基) 醚。在金属催化剂存在下 气相脱水时，生成丙醛、烯丙醇、丙烯醛等。在过氧化氢作用下生成丙醛。用钒 酸氧化生成2 羟基丙醛、甲酸等。与羰基化合物形成环状缩醛。与羧酸酯化生成 单脂或双酯。既具有单醇的性质，又具有二醇的化学性质。与1 ，2 丙二醇一样， 在高温下与羧酸缩合成酯，与异氰酸盐及酸性氯化物生成聚氨酯。在酸性催化剂 湖南农业大学硕士学位论文 作用下与二元酸反应生成聚酯，特别是与对苯二甲酸聚合可生成聚对苯二甲酸丙 二醇酯( p t t ) 。 表1 1l ，3 一丙二醇主要物性表 t a b l e1 1p h y s i c a lp r o p e r t yo fl 3 - p r o p a n e d i o l 1 21 ，3 一丙二醇的主要应用 1 ，3 一丙二醇的主要用作单体生产聚酯材料，主要同对苯二甲酸生成聚对苯二 甲酸丙二醇酯( p t t ) ，其结构式如图1 1 所示。另外也能生产其他一些生物可 降解聚酯材料，如l ，3 一丙二醇和l ，4 环己烷二甲醇与琥珀酸聚合得到的聚合物。 啦c h 弗h 皇2 0 图1 1 聚对苯二甲酸丙二醇酯结构式 f i g u r e1 1c o n s t i t u t i o n a lf o r m u l ao fp o l y t r i m e t h y l e n et e r e p h t h a l a t e 在p t t 中由于丙二醇的骨架是3 个亚甲基，使得p t t 在空间的结构上形成 一种之字型的结构，这样在材料受到拉伸的时候，在分子水平应力上就转化成共 价键的弯曲而不是简单的共价键的拉伸。由于乙二醇和丁二醇的碳骨架是偶数， 所以它们形成的聚对苯二甲酸乙二醇酯( p e t ) 和聚对苯二甲酸丁二醇酯( p b t ) 在拉伸特性上不如p t t 优越2 1 。 p t t 除了具备一般聚酯材料的特点外还具有其它一些更优良的特性。如在全 色范围无需添加特殊化学药品即能呈现良好的连续印染特性；抗紫外、臭氧和氮 氧化合物的着色性；抗内应力；低水吸附、低静电以及良好的可生物降解性；可 循还利用性等。p t t 可以利用传统的方法和设备制成多种产品，在终端产品的性 质上，其机械性能与尼龙相当，某些方面还优于尼龙【3 嗣。 1 31 ，3 一丙二醇的生产方法 1 ，3 丙二醇有多种合成方法，目前具有工业应用前景的生产方法主要有三种： 丙烯醛水解法、环氧乙烷羰基化法和微生物法【7 】。前两种方法近年已工业化，后一 2 湖南农业大学硕士学位论文 种方法已经完成工业性试验，预计在2 年内可实现工业化。 1 3 1d e g u s s a 公司生产方法 丙烯醛为原料的路线的有三步反应【8 l ： 第一步：丙稀氧化生成丙烯醛；第二步：丙烯醛水合得到3 羟基丙醛 ( 3 a ) ；第三步：3 - h p a 加氢制得l ，3 丙二醇。 目前d e g u s s a 公司已在a n t w e r p e n 建成2k t a 的l ，3 - 丙二醇中试装置，5 0l ( t a 的大规模工业装置也即将投产。我国目前尚无丙烯醛路线合成l ，3 丙二醇的装 置和技术，但有丙烯醛生产装置，可望在有关单位的努力下，研究开发出生产 1 ，3 丙二醇的技术。 丙烯醛路线成本较高，反应条件比较温和，技术难度也不是很大。但丙烯醛 本身也是一种重要的有机中间体，而且属剧毒易燃易爆物品，难于储存。 1 3 2s h e l i 公司的环氧乙烷合成法 美国s h e l l 公司以环氧乙烷( 简称e o ) 作原料，经氢甲酰化反应得到3 羟基 丙醛，然后加氢得到l ，3 丙二醇【9 1 0 1 。 s h e l l 公司采用了不同的催化体系，由e o 与c o 和h 2 生产1 ，3 丙二醇的氢 甲酰化反应，是以叔膦络合羰基钴催化剂为基础。s h e l l 公司为提高催化剂活性， 将膦配位体部分氧化，转化率达3 4 ，3 - h p a 选择性为9 9 1 。 1 3 3 利用甘油选择性脱羟基法 这种方法的原理是利用甘油为原料选择性的将中间的羟基脱去生成l ，3 一丙 二醇，其主要包括三步反应【1 1 】：第一步是缩醛反应。利用苯甲醛与甘油反应形成 缩醛，保护l 位和3 位的羟基，缩醛反应是可逆反应，在反应过程中不断的除去 反应产物一水，可以使得反应正向进行。第二步是甲苯磺酰基化反应。相对于羟 基，甲苯磺酰羟基比较容易进行氢解。当1 位和3 位的羟基被保护后，甲苯磺酰 基化2 位游离的羟基，这一步反应的转化率是很高的，可以达到9 4 , - 一9 8 。第 三步是脱甲苯磺酰基化反应。脱甲苯磺酰基，使得2 位上的甲苯磺酰基脱掉，同 时进行氢解，使得羟基转变成氢。 这种方法中也存在一些问题，在第一步中，缩醛反应没有专一性，除了形成 1 ，3 位的缩醛外，还可以形成l ，2 位的缩醛产物，这种混合物必须进行分离才 能进行下步反应。 湖南农业大学硕士学位论文 1 3 4 其它化学合成路线n 习 ( 1 ) 烯醛缩合 甲醛等醛类和烯烃在酸( 稀硫酸、盐酸、磷酸、l e w i s 酸、强酸性阳离子交换 树脂) 催化作用下，加成可得1 ，3 丙二醇或其环状缩醛( 1 ，3 一二氧六环衍生物) ， 称烯醛缩合反应。该反应是亲电子加成反应，生成二醇，所以经过烷基取代的烯 烃对反应更有利。上海石化股份有限公司既生产烯烃又生产甲醛和乙醛，原料来 源方便，值得进一步探索。 ( 2 ) 醇醛缩合 在碱性介质中，醇醛缩合生成羟基醛，然后经加氢可得二醇。合成1 ，3 丙二 醇用到的原料是甲醛和乙醛，但因不同类醛缩合，副产品较多。而甲醛无洳氢， 只能作为接受洳氢部分，而不能作为给予洳氢部分，所以其产物相对较简单，对 于其反应机理，研究者存在不尽相同的认识，较认同的机理如下： 第一步是催化剂碱夺取醛分子中的洳氢，形成一个负碳离子： 第二步是负碳离子亲核进攻另一醛分子中的羰基，形成加成产物的负氧离子： 第三步是负氧离子和水作用，夺取氢而交还催化剂，并在加氢催化剂的作用 下还原为二醇。 1 3 5 发酵法生产1 3 一丙二醇 早在1 9 世纪人们就已经发现微生物可以代谢甘油生成l ，3 一丙二醇【1 3 1 。而 在厌氧条件下利用甘油代谢生成l ，3 一丙二醇，是鉴别柠檬酸菌属的一个特性f 1 4 】。 另外还有很多种属的细菌被报道可以利用甘油生产l ，3 一丙二醇，包括克雷 伯氏肺炎杆菌k l e b s i e l l a p n e u m o n i a e ，早先称为的产气菌彳啪妇脚傩彬一1 5 】； 克雷伯氏产酸杆菌k l e b s i e l l ao x y t o c a , 克雷伯氏植生杆菌k l e b s i e l l ap l a n t i c o l a 【1 4 1 ；絮凝肠杆菌e n t e r o b a c t e ra g g l o m e r a n s 【1 6 1 ；弗氏柠檬酸菌c i t r o b a c t e r f r e u n d i i 【1 刀；多营养e f t - 菌l l y o b a c t e r p o l y t r o p u s ；丁酸梭菌c l o s t r i d i u mb u t y 孵c u1 1 8 l ；巴斯 德梭菌c l o s t r i d i u mp a s t e u r i a n u m0 9 1 ；短乳杆菌l a c t o b a c i l l u sb r e v i s ；布氏乳杆菌 l a c t o b a c i l l u sb u c h n e r i1 2 0 】；以及罗伊氏乳杆菌l a c t o b a c i l l u s 膨z ，幼吁f 2 l l 。另外有国 内文献报道黑曲霉和米曲霉能够利用甘油产生l ，3 一丙二醇【2 2 1 。 2 微生物发酵生产1 ，3 一丙二醇的研究进展 4 湖南农业大学硕士学位论文 2 1 甘油代谢及1 ，3 一丙二醇生物合成途径 2 1 1d h a 操纵子 甘油在1 3 一丙二醇生产菌中的代谢是受不同机制的调控。在厌氧环境下利 用甘油作为唯一碳源，并且没有其他的电子受体时菌体利用甘油生产1 3 一丙二 醇【2 3 1 。1 ，3 一丙二醇的合成是一个歧化代谢途径，包括一个氧化支路和一个还原 支路1 2 4 1 ，如图1 2 所示。这4 个催化l ，3 一丙二醇合成的酶处于同一个操纵子上， 该操纵子受n - 羟丙酮( d h a ) 的诱导，所以称为d h a 操纵子2 5 1 。 图1 2 克雷伯氏肺炎杆菌中1 ，3 一丙二醇生成代谢途径 f i g u r e1 2p a t h w a yf o r1 , 3 - p r o p a n e d i o lg r o w t hi nk i m e u m o n i a e d h a 操纵子由五个基因组成，其中四个编码酶的结构基因，它们是甘油脱氢 酶基因( d h a d ) 、d h a 激酶基因( d h a k ) 、甘油脱水酶基因( d h a b ) 、1 ，3 丙 二醇氧化还原酶基因( d h a t ) ，另外还有调节基因编码的抑制酶( d h a r ) 。 d h a 操纵子受多个因素的调控。d h a r 编码的蛋白因子结合在启动子的位置， 抑制d h a 系统酶基因的表达。在d h a 存在下抑制子失活，其诱导机理可能是与 抑制子结合改变其构相，并使其不能与d n a 上特异的位点结创2 6 1 。氧对d h a 系 统有副调节作用。当细胞厌氧代谢甘油时，氧将引起甘油脱氢酶和1 3 丙二醇氧 5 湖南农业大学硕士学位论文 化还原酶不可逆失活。第三个调节因子是环化磷酸腺苷( c a m p ) 。c j 心口的正 调节作用可能是因为它能够刺激r n a 聚合酶和启动子结合从而激活m 3 u q a 的合 成1 2 7 1 。 甘油脱水酶是异源三聚体的二聚体( 0 t 2 p 2 丫2 ) 【捌，对甘油脱水酶晶体结构的 s d s p a g e 分析显示，三个亚基的分子量分别为6 1l ( 叻，2 2k d ( 1 3 ) 并f 1 1 6k d “) 。 利用晶体衍射构建的三位结构，确定了底物结合位点和催化位点。h n j ak n i e t s c h 等利用3 个环境样本构建的宏基因组文库( m e t a g e n o m i cl i b r a r y ) 2 9 】，得到了依赖 于辅酶b 1 2 的甘油脱水酶与复活相关的保守序列。 2 1 2 咖操纵子 当菌体处于有氧环境时，甘油通过另外的途径进行代谢。首先在甘油激酶的 作用下，甘油消耗a t p 形成3 磷酸甘油；3 磷酸甘油再经过3 磷酸甘油脱氢酶的 催化形成磷酸二羟丙酮，这两个酶组成一个操纵子受到3 磷酸甘油的诱导，命名 为g 勿操纵子【2 6 ，3 们，如图1 3 所示。 目前已经确认g t p 操纵子g a 6 个基因组成，g l p f k g 赢码膜蛋白和甘油激酶； 砌t o 编码g 3 p 透过酶和磷酸甘油二酯酶；g l p a b c g 岛码厌氧g 3 p 脱氢酶；g l p d 编 码好氧g 3 p 脱氢酶；调节基因g l p r 和g l p d 位置相邻方向相反，编码一个3 3k d 的 图1 3 加与g 勿操纵子 f i g u r e1 3d h a a n dg t po p e r o n 6 湖南农业大学硕士学位论文 抑制子。另两个结构基因幽娩和g 垂仍位于砌d 和朗哦之间，功能还不清楚。 甘油代谢首先从甘油扩散到细胞内开始。该过程需要膜蛋白，膜蛋白提供一 个大约0 4a m 的通道使甘油可以选择性扩散。然后胞内的甘油被依赖于a t p 的 甘油激酶( g l p k ) 磷酸化生成g 3 p 。g 3 p 也可以通过特异性的透性酶( g l p t ) 由 环境直接传递到细胞质中，环境中的g 3 p 也可以由磷酸甘油二酯水解生成。g 3 p 可以用于生物合成，也可以在g 3 p 脱氢酶的作用下生成磷酸二羟丙酮，然后进 一步代谢生成丙酮酸，丙酮酸进一步代谢为各种副产物，为微生物提供能量和还 原当量。g 3 p 脱氢主要由两个脱氢酶催化，一个是g l p d 编码的好氧脱氢酶，另 一个是g l p a b c 编码的厌氧脱氢酶。 g t p 操纵子的调控很复杂，大致由三种调控机理控制g t p 操纵子的表 达：1 ) 被g l p r 编码的抑制子抑制，2 ) 代谢物抑制，3 ) 来自外源电子受 体的呼吸抑制。g t p 编码的抑制子对于不同的咖基因有不同的亲和力。g l p d 的表达对抑制子最敏感，g t p t 次之，g l p k 最不敏感。g 3 p 与抑制子结合， 降低了抑制子对操纵子的亲和力，因此使g l p 操纵子得到诱导。g t p 操纵子 对葡萄糖抑制敏感。g l p d 和g l p a b c 也受好氧和厌氧代谢调控回路的影响 【2 6 l o 2 2 代谢工程研究 菌体生长过程中，细胞合成大量的大分子物质，如r n a ，蛋白质和多糖等， 它们的合成和基因表达水平有着密切的联系。细胞代谢的原则和方略是将各类物 质分别纳入各自不同的代谢途径。不同的代谢途径可通过交叉点上关键的中间代 谢物而相互作用、相互转化。代谢工程的研究主要包括基因转录水平和翻译水平 的研究以及对其进行基因操作和调控，改变细胞内酶活性，获得预期目标【3 1 1 。 f l o r e sn 等研究了ec o l i 磷酸烯醇式丙酮酸和磷酸转移酶系统( p t s ) 对于中 心碳代谢相关的1 0 0 多个基因转录水平的影响1 3 2 1 ，发现在所有p t s 一菌株中葡萄 糖转运能力降低，与此相关的基因表达量增加，从而推测这些基因可能存在自体 诱导。 d a r a n - l a p u j a d ep 采用微阵列( m i c r o a r a y ) 技术，研究了s a c c h a r o m y c e s c e r e v i s i a e 在限制碳源的好氧恒化培养时全基因组的表达水平【3 3 1 ，表明只有很少 的基因( 1 8 0 个) 对于碳源的改变有响应，相关基因的启动子体外分析证实了几 7 湖南农业大学硕士学位论文 个已知的调控因子涉及转录调控。同时发现，在乙醛酸循环和糖异生途径中转录 子和代谢通量有很高的相关性，但是糖酵解、五糖磷酸途径和t c a 途径中没有 相关性，暗示存在转录后水平调控。 二维( 2 d ) 凝胶电泳是分析细胞内蛋白的有效手段，和质谱相结合可以进 行蛋白鉴定，该技术被广泛应用于微生物的大规模蛋白( 超过4 0 0 种蛋白质) 鉴 定。到目前为止，大量的蛋白组图谱被成功绘制【3 铂5 1 。在限制碳源葡萄糖或乙醇 的情况下，恒化培养s a c c h a r o m y c e se e r e v i s i a ec e n p k l 13 7 d ，比较好氧恒化培 养时蛋白质组响应，获得了含约4 0 0 种蛋白质的图谱1 3 6 1 。在中心碳代谢的相关酶 中，如图1 4 所示，只有1 5 个酶的表达显著变化，比较蛋白质数据和m r n a 数据， 得到中心碳代谢的酶分别在转录和翻译水平调控。 恒化培养丁酸梭菌v p i3 2 6 6 ，研究细胞内的碳流和电子流受碳源的影响【，7 1 。 在葡萄糖作为单独碳源时，只产有机酸和大量的氢，甘油作为单独碳源时，主要 产物是l ，3 一丙二醇，氢量很少。和葡萄糖培养相比，葡萄糖和甘油混合培养时， 代谢相关的酶活变化较大，乙酰c o a c o a 和丁酰c o m c o a 降低，a t p a d p 增 加。同时发现，当氢酶活性降低时，跨膜p h 发生逆转，但是a t p 活性保持不变。 薹 薹：a m 拿l 堪 耄 l 弘t 口 膏 葛 l o ， 盼p ，鹊鳅细捌抛哪一 ，一一、 图1 4 葡萄糖和乙醇限制培养时表达水平变化的酶 f i g u r e1 4g l u c o s ea n da l c o h o lr e s t r i c tt h ee n z y m eo fe x p r e s s i n gl e v e lc h a n g ei nc u l t i v a t i n g 2 2 1 异源表达1 ，3 一丙二醇相关基因，构建新的生产菌株 利用葡萄糖生产甘油的微生物主要是酵母菌，细菌、真菌和藻类也可以生成 甘油。但是目前还没有发现同时存在合成甘油和合成1 ，3 丙二醇两个途径的微生 8 湖南农业大学硕士学位论文 物。利用代谢工程手段将这两个途径整合到一个微生物体内，希望获得能将葡萄 糖直接转化为1 ，3 丙二醇的生产菌株。实现这一过程可以采用下列三种手段： 在甘油产生菌中表达1 ，3 丙二醇合成途径的基因。l a f f e n d 等【2 3 1 以巴氏毕 赤酵母( p i c h i ap a s t o r i s ) 为宿主表达克雷伯氏肺炎杆菌中的甘油脱水酶和l ，3 丙二醇氧化还原酶基因，可以产生o 1 o 2m m 的1 3 丙二醇。c a m e r o n 等【3 8 l 在酿酒酵母( s a c c h a r o m y c e sc e r e v i s i a ) 中表达来自克雷伯氏肺炎杆菌中的两个酶 的基因。在发酵液中没有检测到1 , 3 丙二醇。发现自克雷伯氏肺炎杆菌的甘油脱 水酶的催化过程需要维生素b 1 2 。 在l ，3 丙二醇产生菌中表达甘油产生途径的基因。地衣芽孢杆菌( b a c i l l u s l i c h e n i f o r m i s ) 可以利用葡萄糖产生甘油，c a m e r o n 等i 3 8 】从其中得到了甘油3 磷 酸磷酸酯酶基因，但是检测酶活性发现该酶的特异性底物是d 甘油3 磷酸，对 l - 甘油3 磷酸没有活性，而细胞代谢葡萄糖生成的甘油3 磷酸是通常l 型的。 因为当时对d 甘油3 磷酸产生途径不清楚，故其对构建从葡萄糖到l ，3