（化学工艺专业论文）生姜蛋白酶的提取.pdf

摘要 采用溶剂沉淀法对多种状态生姜中的生姜蛋白酶进行提取。通过单因素试验 研究了工艺条件对生姜蛋白酶提取率的影响，对不同物料状况下提取的生姜蛋白 酶进行了研究；建立了提取物中生姜蛋白酶含量的测定方法；建立了提取物中生 姜蛋白酶活性测定方法，通过均匀设计的试验方法研究了生姜蛋白酶活性测定的 条件；采用超临界c 0 2 萃取蛋白酶萃余物中的姜油树脂，并与生姜的超临界c 0 2 提取的姜油树脂及溶剂葶取的姜油树脂在萃取率、化学成分、物理性能等方面进 行了对比研究。 首先通过试验确定了各种分析测试方法，此方面的主要试验和结论如下。 采用考马斯亮蓝g 2 5 0 法测定提取物中生姜蛋白酶的含量。通过试验证明， 此方法能正确地测定粗提物中的生姜蛋白酶含量，测试的浓度范围为1 0 5 0 p g m l 。 采用酪蛋白消化法测定生姜蛋白酶的酶活力。生姜蛋白酶活力测定的影响因 素比较多，经分析选取反应温度、p h 、底物浓度、酶溶液浓度及激活剂的浓度5 个条件进行试验研究，以生成物的浓度作为考查目标，通过均匀设计及数据分析， 得到了生姜蛋白酶活性测定结果与测试条件之间的关联方程式，并由此获得了生 姜蛋白酶活性测定的适当条件。关联方程式预报的最优测定条件下，所用生姜蛋 白酶样品酶活力为0 5 8 6 ( 以吸光度表示的) ，实际试验结果为0 5 6 5 ，其方程预 报值与实际测试结果接近。 采用气相色谱与质谱联用技术测定姜油树脂的化学成分，测试条件由试验确 定，主要考察姜油树脂中的呈香和姜辣素两大类成分。 采用标准方法测定姜油树脂的物理性质。 其次，试验研究了溶剂沉淀法提取生姜蛋白酶的合理工艺条件。并采用此条 件，以上述分析方法为考查依据，研究了鲜姜、常温干燥生姜、冷冻干燥生姜、 超临界c 0 2 萃取姜油树脂萃余物等各种不同物科状况下生姜蛋白酶的提取率和 活性，研究了物料处理过程对生姜蛋白酶的影响。 以超临界c 0 2 萃取生姜的萃取率和气相色谱质谱分析的萃取产物成分为考 察目标，研究了鲜姜提取生姜蛋白酶后萃余物萃取姜油树脂的可行性，并与生姜 超临界c 0 2 萃取姜油树脂及溶剂萃取姜油树脂对比。同时考察了三种姜油树脂 的相对密度、折光指数、旋光度等物理性能。 提取试验得到的主要结论如下： 乙醇适合作为提取生姜蛋白酶的溶剂。 生姜蛋白酶溶剂沉淀法提取的分析结果说明，溶剂加入量越大，产物的提取 率和生姜蛋白酶的提取率越高，但是随着溶剂加入量的增大，生姜蛋白酶的酶活 力下降。因此，在提取生姜蛋白酶时，应综合蛋白酶的提取率和活性两方面考虑 溶剂的加入量。 不同物料状态下溶剂沉淀法提取生姜蛋白酶的提取率和活性的分析结果说 明，鲜姜经过不同的方式干燥经超临界c 0 2 提取姜油树脂后，萃余物中生姜蛋 白酶的提取率和活性比较鲜姜的有所下降，相同活力水平下提取率下降明显；两 种萃余物中生姜蛋白酶的提取率和活性差别不大；经冷冻干燥后，相同活力水平 下生姜蛋白酶提取率下降明显。 生姜蛋白酶萃余物超临界c 0 2 萃取、生姜超临界c 0 2 萃取和生姜溶剂萃取 三种姜油树脂的萃取率、化学成分、物理性质的分析结果说明，蛋白酶萃余物和 生姜直接超临界c 0 2 流体萃取的萃取率相当，生姜直接溶剂萃取的萃取率高于 超i 临界c 0 2 萃取；三个姜油树脂样品的主要化学成分均为倍半萜烯类和姜辣素 类，但各类成分含量有所不同，溶剂萃取姜辣素含量最高，蛋白酶萃余物超临界 c 0 2 萃取的次之，生姜直接超临界c 0 2 萃取的最低：三者的旋光度、折光指数等 物理性质无明显差异，溶剂萃取姜油树脂的相对密度高于超临界萃取。说明蛋白 酶萃余物超临界c 0 2 萃取姜油树脂无论从品质、成分及物理性质上均与生姜直 接超临界c 0 2 萃取相当。 关键词：生姜蛋白酶；姜油树脂；超临界流体萃取； 2 a b s t r a c t g i n g e rp r o t e a s ew a se x t r a c t e db ys o l v e n tp r e c i p i t a t i o nf r o md i f f e r e n t r a w m a t e r i a l s t h ei n f l u e n c e so fo p e r a t i o nc o n d i t i o n so ne x t r a c t i o nr a t e sw e r es t u d i e db y s i n g l ef a c t o re x p e r i m e n t g i n g e rp r o t e a s e se x t r a c t e df r o md i f f e r e n n tr a wm a t e r i a l s w e r es t u d i e d t h em e t h o du s e dt om e n s u r a t et h ec o n t e n to fg i n g e rp r o t e a s ew a s s t u d i e d t h em e t h o do fm e n s u r a t i n gt h ea c t i v i t yo fg i n g e rp r o t e a s ew a se s t a b i l i s h e d u n i f o r md e s i g ne x p e r i m e n t a lm e t h o dw a su s e dt os t u d yt h ea c t i v i t ym e n s u r a t i o n c o n d i t i o n g i n g e ro l e o r e s i nw a se x t r a c t e db ys c - c 0 2f r o mt h er e m a i n d e ro fg i n g e r p r o t e a s ee x t r a c t i n g , a n dt h ee x t r a c t i o nr a t e s ，c h e m i c a lc o m p o s i t i o n sa n dp h y s i c a l p r o p e r l i e sw e r ec o m p a r e dw i t hg i n g e ro l e o r e s i n se x t r a c t e df r o ms u n d r i e dg i n g e rb y s c - c 0 2a n ds o l v e n t t h ea n a l y s i sa n dt e s tm e t h o d sw e r ec o n f i r m e db ye x p e r i m e n t sf i r s t l y t h e e x p e r i m e n t sa n dc o n c l u s i o n sa r ed e s c r i b e db e l o w n ec o n t e n to fg i n g e rp r o t e a s ew a sm e a s u r e db yt h em e t h o do fc c o m a s s i e b r i l l r a n tb l u eg 2 5 0 i tw a st e s t i f i e dt h a tt h i sm e t h o dc o u l dm e a s u r et h ec o n t e n to f p r o t e a s ei nt h er a we x t r a c ta c c u r a t e l y , a n dt h el i n e a rs c o p ew a sl o 5 0 a g m 1 t h ea c t i v i t yo fg i n g e rp r o t e a s ew a sm e a s u r e db yc a s e i na s s i m i l a t i o nm e t h o d i n t h eu n i f o r md e s i g ne x p e r i m e n t ，f i v ef a c t e r si nt h er e a c t i o nw e r ec o n s i d e r e dt h a t i n f l u e n c e dt h e a c t i v i t y o fg i n g e rp r o t e a s e ，w h i c hw e r et e m p e r a t u r e ，p h ，t h e c o n c e n t r a t i o no fc a s e i n p r o t e a s ea n da c t i v a t i o n 1 r h ec o n c e n t r a t i o no fl - t y r o s i n ea s t h er e s u l t a n ti nr e a c t i o nw a st e s t e d b yu n i f o r md e s i g na n dd a t aa n a l y s i s ，t h e r e l a t i o n a le x p r e s s i o nw a sa c q u i r e dt oe x p l a i nt h er e l a t i o n s h i p so fg i n g e rp r o t e a s e a c t i v i t ya n dm e n s u r a t i o nc o n d i t i o n ，a n dt h eb e s tc o n d i t i o nw a sg o t t e na n dv a l i d a t e d u n d e ro p t i m a lc o n d i t i o n s ，t h ee q u a t i o nh a da0 。5 8 6 ( a b s ) r e p o r tf o rp r o t e a s ea c t i v i t y i nf a c t , t h ea c t i v i t yw a s0 5 6 5 ( a b s ) 。s ot h ed e v i a t i o nc o u l db ea c c e p t e d g a sc h r o m a t o g r a p h y m a s ss p e c t r o m e t r yw a su s e dt oq u a n t i f ya n dq u a l i f yt h e c h e m i c a lc o m p o s i t i o n so ft h eo l e o r e s i n s t h et e s t i n gc o n d i t i o nw a sa s c e r t a i n e db y e x p e r i m e n t ，a n dt h ef r a g r a n ta n dp u n g e n tc o m p o u n d sw e r em a i nc o m p o s i t i o n s 3 e x a m i n e d t h e p h y s i c a lp r o p e r t i e s o ft h eo l e o r e s i n sw e r em e n s u r a t e d a c c o r d i n g t o s t a n d a r d s s e c o n d l y , t h eb e s tc o n d i t i o ni nt h ee x t r a c t i o no fg i n g e rp r o t e a s eb ys o l v e n t p r e c i p i t a t i o nw a ss t u d i e d t h eb e s tc o n d i t i o na n dt h ea n a l y s i sm e t h o d sd e s c r i b e d a b o v ew e r eu s e dt od e t e r m i n et h ei n f l u e n c e so fm a t e r i a l p r e p r o c e s s i n go nt h e e x t r a c t i o nr a t e sa n da c t i v i t i e so fg i n g e rp r o t e a s e s t h ep o s s i b i l i t yo fe x t r a c t i n go l e o r e s i nf r o mt h er e m a i n d e ro fg i n g e rp r o t e a s e e x t r a c t i n gw a sc o n f i r m e db ys t u d i n gt h ee x t r a c t i o nr a t ea n dc h e m i c a lc o m p o s i t i o n s a n a l y s e db yg c m so ft h eo l e o r e s i n a n di tw a sc o m p a r e dw i t ht h eo l e o r e s i n s e x t r a c t e df r o ms u n d r i e dg i n g e rb ys c - c 0 2a n ds o l v e n t t h ep h y s i c a lp r o p e r t i e so ft h e o l e o r e s i n s ，s u c ha so p t i c a lr o t a t i o n ，r e f r a c t i v ei n d e xa n dr e l a t i v ed e n s i t yo fg i n g e r o l c o r e s i n sw e r ea l s ot e s t e d c o n c l u s i o n so b t a i n e df r o mt h ee x t r a c t i o ne x p e r i m e n t sd e s c r i b e db e l o w i tw a s ；p r o v e dt h a te t h a n o li ss u i t a b l es o l v e n ti ns o l v e n tp r e c i p i t a t i o n t h ea n a l y s i sr e s u l t so fs o l v e n tp r e c i p i t a t i o ni n d i c a t e dt h a tt h ee x t r a c t i o nr a t e so f l a we x t r a c t sa n dg i n g e rp r o t e a s e sr o s ew i t ht h ei n c r e a s eo fe t h a n o lq u a n t i t i e s ，b u tt h e a c t i v i t i e su fg i n g e rp r o t e a s ef e l l t h eq u a n t i t i e so fs o l v e n ts h o u db ec o n s i d e r e di ni h c a s p e c t so fe x t r a c t i o nr a t e sa n da c t i x i t i e so fg i n g e rp r o t e a s e c o m p a r e dt h ee x t r a c t i o nr a t e sa n da c t i v i t i e so fg i n g e rp r o t e a s e se x t r a c t e df r o m d i f f e r e n tm a t e r i a l s ，i ts h o w e dt h a tt h ea c t i v i t i e sa n dr a t e sf r o mt h er e m a i n d e r so f s c f ew e r ea l ld e c l i n e dc o m p a r e dt of b s hg i n g e r t h er a t e sa n da c t i v i t i e so ft h et w o r e m a i n d e r sw e r eo fn oo b v i o u sd i f f e r e n c e s a n dt h ep r o c e s so ff r e e z e d r yh a ds o m e n e g a t i v ei n f l u e n c e so ng i n g e rp r o t e a s e b yc o m p a r i n g t h ee x t r a c t i o n r a t e s ，c h e m i c a lc o m p o s i t i o n s a n d p h y s i c a l p r o p e r t i e so fg i n g e ro l e o r e s i n s ，w h i c hw e r ee x t r a c t e df r o ms u n d r i e dg i n g e r , t h e r e m a i n d e ro fg i n g e rp r o t e a s ee x t r a c t i n gb ys c - c 0 2a n ds o l v e n t ，i ts h o w e dt h a tt h e e x t r a c t i o nr a t eo fg i n g e ro l e o r e s i ne a t r a c t e df r o mt h er e m a i n d e rw a st h es a m ea sf r o m 4 s u n d r i e dg i n g e rb ys c f e t h ee x t r a c t i o nr a t eo fs o l v e n tw a sh i g h e rt h a ns c f e t h e m a i nc o m p o s i t i o n so ft h eo l e o r e s i n sw e r ea l ls e s q u i t e r p e n ea n dp u n g e n tc o m p o u n d s t h ep u n g e n tc o m p o u n di ns o l v e n te x t r a c tw a sh i g h e s t ，h i g h e l t h a nt h ee x t r a c t sb y s c f e ，a n dt h ee x t r a c tf r o ms u n d f i e dg i n g e rb ys c f ew a sp o o r e s t t h eo p t i c a l r o t a t i o i l sa n dr e f r a c t i v ei n d e x e so ft h eo l e o r e s i n sw e r eo fn oo b v i o u sd i f f e r e n c e s ，a n d t h er e l a t i v ed e n s i t yo fs o l v e n te x t r a c tw a sh e a v i e rt h a nt h eo t h e r i ti m p l i e dt h a tt h e o l e o r e s i ne x t r a c t e df r o mt h er e m a i n d e ro fg i n g e rp r o t e a s ee x t r a c t i n gw a sc o m p a r a t i v e i ne x t r a c t i o nr a t e ，c h e m i c a lc o m p o s i t i o n sa n dp h y s i c a lp r o p e r t i e sw i t ho l e o r e s i n s e x t r a c t e df r o ms u n d r i e dg i n g e r k e y w o r d s ：g i n g e rp r o t e a s e ；g i n g e ro l e o r e s i n ；s u p e r c r i t i c a lf l u i de x t r a c t i o n ； 5 符号说明 超临界流体萃取 超临界流体 超临界二氧化碳流体 临界压力( m p a ) 临界温度( ) 气相色谱 质谱 气相色谱一质谱 高效液相色谱 均匀设计 吸光度 温度( ) 底物 酶 激活剂 电荷( c ) 力( n ) 介电常数 电荷间距离( m ) 一；ir l凇一一皿觚t s e a q f 。 ， 原创性声明 本人郑重声明：所呈交的学位论文，是本人在导师的指导下，独 立进行研究所取得的成果。除文中已经注明引用的内容外，本论文不 包含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的科研成果。对本文的研 究作出重要贡献的个人和集体，均已在文中以明确方式标明。本声明 的法律责任由本人承担。 论文作者签名：叠拯壶塾馨 日 关于学位论文使用授权的声明 本人完全了解山东大学有关保留、使用学位论文的规定，同意学 校保留或向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论 文被查阅和借阅；本人授权山东大学可以将本学位论文的全部或部分 内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或其他复制手段 保存论文和汇编本学位论文。 ( 保密论文在解密后应遵守此规定) 论文作者签名：避导师签名：燃日期：甚牟。上：i f 出丕太堂亟堂位i 金塞 来进行，很少从综合利用的角度对原材料进行充分利用，目i i 主要的深加工方法 为将姜精油、姜油树脂作为目标产物进行单一提取，生姜蛋白酶的大规模提取及 工业应用也很不成熟，造成生姜中的某种高附加值产品丢失。另外无论是作为香 料还是药用要用我国对生姜的利用主要是以传统的鲜姜、干姜为主，产品均为粗 原材料或简单加工产品，难以满足日益增长的新型市场的需求，利用率低。进行 生姜深加工综合利用的研究有利于生姜的加工、储存、运输等，充分利用姜中的 有用成分，提高利用率，提高产品附加值，增加经济效益。 1 2 生姜蛋白酶的提取 1 2 1 生姜蛋白酶的提取方法 酶的提取方法主要有很多，提取蛋白酶的方法都可用于生姜蛋白酶的提取。 有机溶剂沉淀法、超滤浓缩法、盐析法、吸附法、冻干法一般为粗分离方法，主 要用于蛋白酶的浓缩和富集。聚丙烯酰胺凝胶、葡聚糖凝胶、d e a e 纤维素、 d e a e 琼脂糖、电泳层析等各种分离方法为精细分离方法，用于提纯高纯度的蛋 白酶。喷雾干燥法和冷冻干燥法比较适合于大规模的提取蛋白酶。人们已经试验 出硫酸铵、单宁、聚丙烯酰胺凝胶、葡聚糖凝胶、d e a e 纤维素、d e a e - - 琼脂 糖、电泳层析等分离技术对生姜蛋白酶进行了分离纯化。但这些提取方法成本高、 产量低、操作繁琐、不适于工业化大规模生产生姜蛋白酶，正是由于缺少工业化 的提取方法，才严重阻碍了生姜蛋白酶在实际生产中的应用。因此，研究适用生 姜蛋白酶的提取分离方法也就成了一个噬待解决的课题。 1 2 1 i 有机溶剂沉淀法 有机溶剂沉淀法历来是大规模浓缩蛋白质常用的方法，有机溶剂沉淀法已广 泛应用于生产蛋白质制剂。有机溶剂沉淀法不仅用于浓缩蛋白，还用于蛋白的提 纯，但是纯化效果差、分辨率较低。有机溶剂的加入量不同，混合溶液的介电常 数即不同，酶的分级提纯就是利用了介电常数的改变来实现的，故要实现酶的提 纯有机溶剂的量需要严格控制。生物制品在有机溶剂的环境下很容易失活，这就 要求在操作过程中要严格控制有机溶剂的加入量，控制有机溶剂加入以后整个体 系的温度。有机溶剂沉淀法一般选择的有机溶剂的量为蛋白溶液的3 5 倍为宜， 出丕太堂亟堂位i 金塞 体系温度一般要控制在5 c 以下，有的酶类稳定性比较高可根据实际情况掌握， 以操作过程不影响酶的活性为标准。 有机溶剂的原则是必须能完全与水互溶不与蛋白质发生反应要有较好 的沉淀效应溶剂蒸汽无毒，且不易燃烧。丙酮和乙醇符合上述要求，因此是使 用最广泛的两种溶剂。唐晓珍等采用有机溶剂沉淀的方法提取生姜蛋白酶 1 9 1 。 目前，未见单独使用有机溶剂沉淀法分离提纯生姜蛋白酶的报道，多是以有机溶 剂沉淀法进行粗提，使用凝胶过滤、柱层析等方法分离纯化。 1 2 1 2 超滤法 超滤浓缩法是进行蛋白质浓缩的重要方法。在酶的分离过程中为了要除去酶 溶液中的盐分、有机溶剂等小分子物质等通常要用到超滤将各种小分子化合物去 掉。超滤是利用微孔膜将各种小分子化合物去掉，这种膜的微孔从大到小有各种 规格，可以摒除5 0 0 、1 0 0 0 乃至3 0 0 0 0 0 各分子量的化合物。现在经常用到的超 滤膜组件式的设备是利用蠕动泵对溶液施加压力使小分子的化合物透过超滤膜， 导出组件外部，而大分子的酶则继续在管路里循环直到达到一定的浓缩度，以上 操作只能得到酶的浓缩液，得不到易保存的酶粗提物，经过浓缩以后还要再经过 一步冷冻干燥得到粗酶制品。超滤法不仅有浓缩蛋白质的作用，而且有除盐、分 级、纯化的作用，但是分辨率较低，较其它的浓缩方法来说具有方便、迅速、温 和的优点。唐晓珍【2 0 悃超滤法浓缩得到生姜蛋白酶，确定了最佳工艺条件。未见 使用超滤技术分级提纯生姜蛋白酶的报道。 1 2 1 3 盐析法 向蛋白质水溶液中加入中性盐，可以产生两种影响：在盐的浓度较低时蛋白 质的溶解度增加，产生“盐溶”现象，表现蛋白溶解度增加。在盐浓度较高时产 生“盐析”现象，表现蛋白溶解度降低、析出。盐析法是一种实验室常用的蛋白 浓缩方法，此法操作简单，中性盐对易变性的蛋白质有一定的保护作用，同时盐 析能除去较多的杂质，有纯化作用，但固一液难以分离，且离心分离只能把各种 下沉物或不溶物与溶液分开而无法把分子、性质、构造相近的蛋白质、核酸和糖 类等大分子细分，故盐析法分辨率低，纯化倍数低。在实际工作中，常用的盐析 剂是硫酸铵，因为它盐析能力强，在水中溶解度大，浓度高时也不会使蛋白质生 4 出丕太堂亟堂位论塞 物活性降低。代景泉研究了硫酸氨沉淀法提取生姜蛋白酶的条件1 2 。 以上各种方法均适合对生姜蛋白酶进行大规模的粗提、浓缩，有利于进一步 纯化时操作，但是提纯效果差，分辨率低。 1 2 1 4 单宁沉淀法 在低温( 2 0 ) 下，用丙酮处理生姜破碎物，可以抽离出大部分脂肪，所 得的无水生姜丙酮干粉可以储存很长时问。将丙酮干粉溶于水溶性缓冲溶液后， 可以得到可溶性蛋白酶溶液。这是一种经典的现在仍在使用的方法。用单宁处理 这种生姜丙酮粉，得到生姜蛋白酶沉淀，冷冻干燥后可以得到生姜蛋白酶1 2 2 1 ，单 宁法同样是适合于生姜蛋白酶的浓缩、粗提，纯化倍数较低。 1 2 1 5 生姜蛋白酶的分离纯化 经过粗分级后的蛋白质为了得到更高的纯度，还需要进行细分级，这主要是 通过各种层析和电泳技术来实现的，生姜蛋白酶的分离纯化方法主要有离子交换 层析法、凝胶过滤法、等电点聚焦电泳法掣2 3 洲，在生姜蛋白酶的精制、分离、 纯化过程中一般是这几种技术联合使用，国外关于生姜蛋白酶的层析、电泳分离 提纯研究报道较多，技术较成熟，随着生姜蛋白酶分离纯化技术的成熟，人们再 辅以更高的科技手段，生姜蛋白酶的氨基酸序列、晶体构型的一系列微观结构进 一步呈现在人们眼前f 2 5 , 2 6 。 1 2 2 生姜蛋白酶酶学性质的研究 1 9 6 8 年m i c h i 等人首先做了有关生姜中存在蛋白酶的报道，1 9 7 3 年t h o m p s o n 等用丙酮沉淀法初步分离了这种酶并研究了它的酶学性质及在肉的嫩化中的 作用，此后各国研究人员对生姜蛋白酶的分子量、活性中心、提取、纯化、酶学 性质等做了更广泛的研究。近年来国内关于生姜蛋白酶的提取、提纯、酶学性质 及应用等的报道也开始出现。 1 9 7 3 年，t h o m p s o ne h 等人发现生姜蛋白酶的最适温度为6 0 c 等性质，对 生姜蛋白酶在肉类嫩化中的作用做了初步阐述，同年，i c k i k a w a l z 0 j 匝过d e a e 一 纤维素层析柱对该酶进行纯化，证明该酶是由两个组分组成，除电泳迁移率外两 个组分在其它方面基本相同，用s e p h a d e x g 1 0 0 测得分子量均为2 2 5 0 0 ，最适p h 5 出丕太堂亟主堂位i 金塞 为6 5 7 0 ，巯基化合物为激活剂，等电点分别为7 0 和8 o ，纯化酶的结晶为六 面体。o h t s u k i 勰噜人研究了酶的稳定性，证明该酶可以与h g c l 2 形成稳定的化 合物，对氯汞苯甲酸对纯化酶的抑制作用大于未纯化的酶，并用p 1 0 0 生物凝胶 过滤的方法得出该酶的分子量为2 9 0 0 0 。1 9 8 6 年k e 【2 9 】等根据试验指出生姜蛋白 酶是一种很好的肉类嫩化剂。h a s h i m o t o a k i h i k o 等人通过凝胶过滤精制， s d s p a g e 电泳，证实了生姜蛋白酶不仅具有蛋白酶的活性同时还具有胶原酶的 活性，生姜蛋白酶具有蛋白酶和胶原酶双重活性。还证明了该酶是由大小约为 3 0 0 0 0 d a 的亚单元组成的蛋白质，经过计算推测约占粗酶的7 0 以上。j u n g 等 人也通过s d s * p a g e 电泳测得纯化酶的分子量为3 0 0 0 0 d a 。o h t s u k i 2 3 垤用d e a e 一纤维素凝胶和交联葡聚糖g 7 5 对该酶进行纯化，用等电点聚焦的方法将该酶 分为三个组分，p i 值分别为4 5 、4 6 、4 8 ，并用s d s 聚丙烯酰胺凝胶电泳和t s k g 2 0 0 s w 凝胶过滤再次证明该酶的分子量为2 9 0 0 0 ，证明该酶的活性受到p c m b ， c u 2 + 、p b 2 + 、z n 2 + 等二价金属离子的强烈抑制，而c a 2 + 不会抑制该酶的活性，而 d t t 和e d t a 对该酶的活性具有激活作用。赵帜平【2 4 噜采d e a e 纤维素d e 5 2 和交联葡聚糖g 7 5 纯化该酶得到两个组分，等电点分别为7 0 和8 0 ，并鉴定这 两种酶均为糖蛋白，证实糖肽型均为非o 型。最近k y o n g 2 5 ，2 6 】等人对生姜蛋白 酶的研究更为深入研究表明生姜蛋白2 是一个具有2 2 1 个氨基酸残基的糖蛋白， 在a s h 9 9 和a s h 1 5 6 上有两条寡糖链，并证明了寡糖残基的组成及连接方式；， 利用x 射线衍射浃研究了生姜蛋向酶在21 埃精确度下的晶体结构：生姜蛋向酶 2 的总体结构类似于p a p a i n 等植物巯基蛋白水解酶，初步断定了活性中心的位 置：r r 对该酶具有很强的激活作用；讨论了该酶底物专一性的作用机理；测 定了生姜蛋白酶两种形式的氨基酸序列，表明两种蛋白酶具有8 2 的相似性， 同时还发现该蛋白酶组分中半胱氨酸残基序列与其它的巯基植物蛋白酶如无花 果蛋白酶、木瓜蛋白酶、猕猴桃蛋白酶等的同源性达到约5 0 。至此，人们对 生姜蛋白酶有了一个全面的认识，随着对生姜蛋白酶的理化性质及酶学特性研究 的深入人们对生姜蛋白酶的认识将会进一步加深。 1 2 3 生姜蛋白酶在食品工业上的应用 蛋白酶是催化肽键水解的一类酶。蛋白质在蛋白酶作用下，迅速水解为胨、 肽，最后成为氨基酸。在食品工业中，主要用于肉类嫩化、啤酒澄清、乳酪制造、 6 出丕太堂亟堂位i 佥塞 酱油、面包及蛋白水解物制造等。此外，也广泛用于皮革、毛皮、毛纺、丝绸、 医药、日用化工等行业。蛋白酶作为一种重要的工业用酶具有反应专一性强，作 用条件温和经济、高效、无毒、无副作用无臭等优良特性，广泛应用于食品、化 工、医药等领域，其中食品领域应用最广泛。 蛋白酶种类众多，按其活性中心基团不同可分为四大类，即丝氨酸蛋白酶、 巯基蛋白酶、酸性蛋白酶、金属蛋白酶。植物蛋白酶以巯基蛋白酶最为普遍。 生姜蛋白酶是蛋白水解酶的一种，具体的说它是作用于肽键的一种巯基植物蛋白 水解酶类，它能特征的水解大分子的肽链产生小分子的氨基酸和小肽。生姜蛋白 酶作为一种新型的植物蛋白酶是蛋白水解酶的一种新来源，与木瓜蛋白酶、菠萝 蛋白酶一样同属巯基蛋白酶，其活性部位是半胱氨酸残基上的巯基。生姜蛋白酶 共有三种酶组成：蛋白酶、凝乳酶、胶原酶。它具有分解蛋白、凝乳、肉类嫩化、 酒类澄清等作用。 蛋白酶可以使肉类嫩化，在适当的条件下能有效的降解胶原纤维和缔结组织 中的蛋白质，分解其中的肌动球蛋白和胶原蛋白，透过肌纤维膜水解肌原纤维和 其他物质，破坏他们的分子结构从而大大提高了肉的嫩度，使肉的品质变得柔软 适口、易于咀嚼，提高经济效益，多年来一直受肉类加工行业的重视。作为嫩化 剂研究较多的植物蛋白酶主要有猕猴桃蛋白酶、生姜蛋白酶和木瓜蛋白酶。生姜 蛋白酶，它作为肉类嫩化剂具有安全、卫生、无毒的特点，而且有助于提高有的 品质，增加肉的营养价值，是一种很有应用价值的肉类嫩化剂f 3 1 3 2 j 3 1 。 作为一种新的酒类澄清剂生姜蛋白酶具有天然、健康、风味独特等特点。生 姜蛋白酶的酶法水解可以在不降低营养价值的前提下改善食品的加工品质。利用 生姜蛋白酶的酶法水解可以促进酪蛋白、大豆分离蛋白等不易消化和吸收的蛋白 水解1 3 4 捌，分解成小分子的小肽和氨基酸，利于人体的消化吸收，并生成某些具 有生物活性的小分子肽，是一种非常重要的保健食品，同时大豆蛋白还具有良好 的加工性能，可以作为食品添加剂应用到各种食品中去，大豆蛋白经水解后其酶 解物比氨基酸和蛋白质更易于消化吸收，且促进了乳酸菌、双歧杆菌等人体有宜 菌类的生理活性和生长发育，还能改变其溶解性、降低粘度等，更进一步促进了 其在食品工业中的应用。 姜汁奶是我国的传统乳制品之一。具有丰富的营养价值及健胃益脾等功能。 7 出盔太堂亟堂盆i 金塞 但其产品仍局限于部分地区，凝乳机理也有争议。张和平等人认为姜汁之所以能 够凝乳是由于姜中含有的蛋白酶的作用；纪丽莲等人则认为其凝乳是由于姜中的 挥发油的作用。已有试验证实姜汁奶即是应用了姜汁中存在的凝乳酶的作用i 州。 生姜蛋白酶能作用于乳酪蛋白胶柬细i c c l l a e ) 夕b 围的k 酪蛋白，使之部分分解， 失去对酪蛋白胶柬的保护作用，从而使对c a + 敏感的a 酪蛋白和口一酪蛋白与形 成网状的凝胶体，从而使蛋白发生凝固。随着人们对生姜蛋白酶的凝乳机理的进 一步认识，及对该酶酶学性质的深入研究，生姜蛋白酶在新型乳制品的开发上将 会有更加广泛的用途。 国外很早就有关于生姜蛋白酶的提取和作用理论研究，研究主要集中于蛋白 酶的分离纯化及酶学性质研究上，使生姜蛋白酶的理化特性越来越为人们共知。 目前，关于适合工业应用的提取方法及实际应用研究较少。开展适合工业应用的 生姜蛋白酶提取方法研究和生姜蛋白酶的应用研究将会为食品工业增添新的酶 源，拓宽食用植物蛋白酶的应用领域。生姜蛋白酶作为一种新的天然植物蛋白酶 资源丰富，具有很高的应用价值，市场前景广阔。 1 3 生姜的其它提取产物 从十九世纪初生姜就被广泛的研究，关于生姜的研究进展主要在二十世纪。 姜的化学成分复杂，有关生姜中有效成分的分析，由于分析方法的差异，所能得 出和鉴定的成分有较大的区别，目前已经发现的化学成分有1 0 0 多种? 基本可叫 归为挥发油、姜辣素。作为食用调味料，其辣味和芳香成分主要是姜油酮、姜烯 酚和姜辣素以及柠檬醛、姜醇等【3 7 1 。 姜油树脂和姜精油是从姜中提取出来的微量、高价的浓缩物质，属植物油脂， 统称姜油【3 8 l 。其中姜精油是指从姜根茎中用水蒸汽蒸馏的方法得到的挥发性油 分，几乎不含高沸点成分，具有浓郁的芳香气味，主要用于食品及饮料的加香、 调味，也是国内外市场都需要的价格不斐的香精原料和药用原料。姜油树脂则是 用溶剂萃取姜的根茎，然后回收溶剂，获得的比较糙稠的半流体物质。它既含有 少量精油的挥发性成分，也含有精油不具备的非挥发性的脂肪成分，口感芳香、 辛辣，含有姜作为香辛料的全部风味。其中的不挥发成分高沸点不易挥发的特性 特别适用于进行高温加工的食品，是一种高品质的调味料和食品配料。其中所含 s 出丕太堂亟堂位j 金室 的主要成分之一一姜辣素( g i n g e r 0 1 ) 是生姜起多种药理作用的重要功能成分1 3 9 】， 被现代医学证明具有多种生理药理功效，是极具价值的药品和保健食品原料。 1 3 1 姜精油、姜油树脂的研究现状 水蒸气提取的姜精油是一种透明浅黄到桔黄色的易流动的液体，不溶于水易 溶于乙醇、丙酮等，不同品种不同地域的生姜其精油主成分及含量各不相同【删 其化学成分主要为萜类物质，如单萜类的n 获烯、b 水芹烯等，倍半萜类的 姜烯、没药烯等，这两类物质的含氧衍生物大多具有较强的香气和生物活性，是 医药、食品、香料和化妆品工业的重要原料。 姜油树脂则是用溶剂萃取姜的根茎，然后回收溶剂，获得的比较粘稠的半流 体物质，几乎不溶于水，醇溶度也很低，可溶于丙酮。它既含有少量精油的挥发 性成分，也含有精油不具备的非挥发性的脂肪成分，商业用的姜油树脂含有2 5 3 0 的挥发油。气味芬芳、温和、辛香，口感芳香、辛辣，姜油树脂含有的 挥发性油分、姜辣素成分以及脂肪油、棕榈酸、树脂和碳水化合物等 4 1 1 化学组成 通常较为稳定，但是姜辣素中的姜酚类化合物不稳定，在受热、酸、碱处理时可 转变成姜酮、姜脑等姜辣素类物质【4 2 】。姜辣素中各组分物质分子中均含有酚基结 构，在常温下为粘稠液体，有很强的抗氧化作用，其中起抗氧化作用的主物质成 分是酚类物质，包括姜酚、姜脑、姜酮等，这些酚类物质具有较强的供氢、供电 子能力，能清除体内所产生的自由基，因此生姜提取物具有较强的抗氧化能力。 生姜中的萜类化合物，如，姜醇，龙脑、1 3 水芹烯等具有较强的杀菌作用【4 3 1 。 姜精油和姜油树脂含有姜作为香辛料的全部风味。姜精油与姜油树脂与传统 的生姜香辛料相比，具有卫生、经济、稳定耐储存、使用快速干净便捷、香味均 匀、用途更为广泛的特点 4 4 1 。同时姜精油和姜油树脂中的具有药理功能的组分具 有很好的生物活性，具有抗氧化、防腐抑菌的效果，使得生姜提取物既有调味功 能又具有保健功能，是值得开发研究的具有抗氧化、防腐抑菌功能的天然食品香 料添加剂。 1 3 2 生姜中起药理作用的主要成分及在医药领域的应用 1 3 1 1 生姜中起药理作用的主要成分 姜的特征性辛辣风味及药理作用来自其非挥发性油份油树脂中的姜辣素。 出丕太堂亟堂位i 盆塞 姜辣素为多种物质构成的混合物，其组成结构中均含有3 甲氧基4 羟基苯基官 能团。根据该官能团所连脂肪链的不同，我们可以把姜辣素分为六类。 ( 1 ) 姜酚类 在通常情况下，姜酚为油状液体，在晶体熔点在5 c 1 54 c 之间。重结晶可 以得至u 6 1 、c 8 、 1 0 姜酚的混合物，其重量比为5 3 ：1 7 ：3 0 1 4 5 1 。另外在d j h a r v e y 的研究中发现姜中还有【4 】- 姜酚和 1 2 卜姜酚的存在，但其含量均很小。姜酚类化 合物的结构式见下图1 1 ； c h ，) n c h ， 0 c k 图i - i ( 姜酚) 的化学结构式 f i g 1 1t h ec h e m i c a ls t r u c t u r eo f g i n g e r o l ( 2 ) 姜脑( 姜烯酚) 类 与姜酚类不同的是，虽然姜脑亦为一个油状液体，但其可任意溶解在冷的己 烷中。姜油树脂经硅胶和氧化铝柱层析后可得到姜脑类化合物。姜脑类化合物在 氢氧化钠溶液中加热时可以发生分解反应，生成姜酮和一些挥发性的醛，主要为 己醛和辛醛。 姜脑类化合物在生姜中是否有天然存在这个问题，有待于进一步研究。1 9 1 8 年n o m u r a 首次从姜根茎中分离出姜脑。但这并不能说明在生姜中的存在。鲜姜 提取物的t l c 结果表明，鲜姜中姜辣素的主要成分是姜酚。与此相反的是市售 的姜油树脂中姜辣素的主要成分是姜脑，而姜酚的含量很小。这说明姜脑很可能 是在姜辣素提取过程中形成的，至少说明它们在生姜中含量极小。 1 0 舯p 。 图i - 2 姜脑的化学结构式 f i g 1 - 2t h ec h e m i c a ls t r u c t u r eo f s h o g a o b 出丕太堂亟堂位论塞 利用柱色谱法分离已分离鉴定了 4 】一、【6 】一、【8 】、和【1 0 】姜脑的存在，姜烯 酚类化合物的结构式见图1 2 。 ( 3 ) 副姜油酮类 副姜油酮类化合物具有下面的结构图1 3 ： ( 4 ) 姜酮 4 ，【6 】一p 6 8 - p 8 ，【l o 一p 图1 3 副姜油酮的化学结构式 f i g 1 - 3t h ec h e m i c a