（生物化学与分子生物学专业论文）禾本科22kd醇溶蛋白基因家族的比较研究.pdf

上海大学硕士学位论文 摘要 比较基因组学是以遗传图谱和基因组序列为基础，对已知基因和基因组结 构进行比较来了解基因组进化的机制以及物种形成。以往在禾本科植物中进行 的比较基因组学研究揭示了植物基因组组织结构的多样性和保守性，但是这些 研究很少涉及到基因家族的比较。多基因家族是一类起源于共同的祖先，具有 相似的结构与功能的基因，是植物基因组的重要组成部分，其中串联重复基因 ( t a n d e m l ya r r a y e dg e n e s ，t a g s ) 占了很大的比例。 醇溶蛋白( p r o l a m i n ) 是大部分粮食作物中主要的储藏蛋白成分，在玉米中 占蛋白总量的6 0 左右，其中最大的一类是a 醇溶蛋白( a - z e i n ) ，它又可分为 1 9 k d 和2 2 k d 两类。在玉米b s s s 5 3 自交系中，2 2 k da 醇溶蛋白( z l c ) 共有 2 3 个拷贝，其中2 2 个成簇分布，而在高粱中，其对应的2 2 k d 醇溶蛋白( k a f i r i n ) 有1 1 个基因拷贝成簇分布。以往的比较分析显示玉米与高粱的2 2 k d 醇溶蛋白 区域中基因呈“马赛克 式的分布，在玉米自交系之间的比较中也发现了很大 的差异，但是关于2 2 k d 醇溶蛋白基因家族的扩增、演化与表达还没有深入研 究。 本研究以薏苡为材料，选取了薏苡中2 2 k d 醇溶蛋白( c o 及i n ) 基因家族位 点，进行了比较基因组学研究。薏苡是玉米的野生近缘属，曾被认为是玉米可 能的祖先，薏苡种子具有蛋白含量高的优点，因此克隆和分析薏苡中主要的种 子储藏蛋白是提高种子蛋白含量和改善蛋白品质的基础。有研究显示，惹苡基 因组中，2 2 k d 醇溶蛋白也是成簇分布，但是还没有进一步进行基因组学研究。 本实验室已有1 9 个含有2 2 k dc o i x i n 基因的b a c 克隆并且其中2 个已完 成了初步测序。我们通过进一步筛选得到了它们的重叠克隆，经过“鸟枪法” 测序、序列组装以及后期的序列修补，总共得到了2 8 3 ，0 3 7 b p 的连续序列。序 列比较分析显示，玉米自交系b s s s 5 3 中的醇溶蛋白基因密度是7 6 k b 基因，在 自交系b 7 3 中的密度是7 9 k b 基因，在薏苡中的密度稍低，为1 3 5 k b 基因，而 高粱1 0 个紧密相连基因的密度达到了3 k b 基因。基因密度的差异可能是因为不 同程度的转座因子( t r a n s p o s a b l ee l e m e n t s ，t e s ) 插入导致，我们在高粱k a f i r i n v 上海大学硕士学位论文 基因簇中没有发现反转座子只有少量的转座子，玉米b s s s 5 3 与b 7 3 自交系的 转座因子分别占了所测序列的3 0 和3 8 ，而在薏苡的2 8 3 k b 序列中，转座因 子占了6 0 。 通过基因家族成员的进化分析并结合它们的相对位置，我们提出了高梁、 玉米和薏苡2 2 k d 基因家族的进化模型，k a j 皇r i n 、z l c 和c o i x i n 基因都经历了两 轮的基因扩增：早期的局部基因复制和后期的快速基因扩增。早期的扩增发生 在大约1 , 0 0 0 万年之前，产生了一个或数个复制基因。后期的扩增主要发生在 5 0 0 万年至1 0 0 万年之间( 高粱1 0 0 万年之内) ，串联重复基因之间错配导致的 不等交换( u c o ，u n e q u a lc r o s s i n go v e r ) 是复制的主要机制，结果产生了头尾 相连的重复基因。在扩增的后期，玉米和薏苡基因组有大规模的反转座子入侵， 使得这一区域更加复杂、庞大。同时基因组的膨胀也被不等交换和异常重组中 和，我们认为异常重组( i l l e g i t i m a t er e c o m b i n a t i o n ) 对z l c 基因区域删除d n a 起了主要作用，而不等交换在c o i x i n 基因区域中发挥了更大的作用。 通过对该基因家族的表达情况研究发现，基因家族成员的表达与编码区结 构的完整性相关，几乎所有完整的基因都是表达的，而所有表达的基因几乎都 是完整的。基因的年龄与表达量的高低没有明显关联，基因的表达方式在基因 复制后迅速产生分化。 对k a f i r i n 、z e i n 和c o i x i n 基因区域的比较研究，丰富了我们对禾本科植物 基因家族进化与表达的认识，同时也为我们研究基因家族的演化与利用野生近 缘种的基因资源奠定了基础。 关键词：比较基因组学，薏苡，2 2 k d 醇溶蛋白，基因家族进化，基因家族表 达 上海火学硕士学位论文 a b s t r a c t c o m p a r a t i v eg e n o m i c sc o m p a r e sg e n e sa n dg e n o m i cs t r u c t u r et oc l a r i f yt h e m e c h a n i s m so fg e n o m e l e v o l u t i o na n ds p e c i a t i o nv i ag e n e t i cm a p sa n dg e n o m e s e q u e n c e s p r e v i o u sc o m p a r a t i v eg e n o m i cs t u d i e so fg r a s s e sh a dr e v e a l e dt h ev a r i e t y a n dc o n s e r v a t i o no fg r a s sg e n o m e ，b u tt h ec o m p a r i s o no fg e n e sf a m i l i e sw a sn o tw e l l s t u d i e d ag e n ef a m i l yi sag r o u po fg e n e st h a th a v ed e s c e n d e df r o mac o m m o n a n c e s t r a lg e n ea n dt h e r e f o r eh a v es i m i l a rd n a s e q u e n c e sa n df u n c t i o n s g e n ef a m i l y i sa m a j o rc o m p o n e n t o fp l a n tg e n o m ea n da l a r g ep r o p o r t i o no ft h e ma g ec l u s t e r e di n g e n o m e p r o l a m i n sa r et h em a i ns t o r a g ep r o t e i nf r a c t i o no fm o s tc e r e a lg r a i n s i nm a i z e ，i t c o m p o s e d6 0 o fs e e d sp r o t e i n s t h el a r g e s tc l a s si sa l p h a - z e i n ，i tc a nb ef u r t h e r d i v i d e di n t ot w of a m i l i e s ：1 9 k da n d2 2 k d i nm a i z ei n b r e dl i n eb s s s 5 3 ，2 2 一k d a l p h a - z e i n c ) h a d2 3c o p i e sa n d2 2o ft h e ma l ec l u s t e r e di nc h r o m o s o m e i t s c o r r e s p o n d i n gg e n ei ns o r g h a m ，k a f i r i n ，h a d1 1c o p i e sa l s oc l u s t e r e di nc h r o m o s o m e p r e v i o u sc o m p a r a t i v ea n a l y s i so fm a i z ea n ds o r g h u m2 2 - k dg e n ec l u s t e r sr e v e a l e da m o s a i co r g a n i z a t i o n i n t r a s p e c i e sc o m p a r a t i v es t u d i e sa l s or e v e a l e dd r a m a t i cv a r i a t i o n h o w e v e r , d e t a i la n a l y s i so fg e n ef a m i l ye x p a n d i n g , e v o l u t i o na n de x p r e s s i o nh a dn o t b e e np e r f o r m e d i n t h i ss t u d y , w ec h o s ec h r o m o s o m el o c ic o n t a i n i n gc o i x2 2 - k dc o i x i ng e n e c l u s t e rf o rc o m p a r a t i v eg e n o m i c ss t u d y c o i xh a sac l o s er e l a t i o n s h i pt om a i z ea n d o n c ec o n s i d e r e dt ob et h ea n c e s t o ro fm a i z e c o i xh a sa l la d v a n t a g eo fh i g hq u a n t i t y o fs e e dp r o t e i n ，a n dc l o n i n ga n da n a l y s i so ft h em a j o rp r o l a m i ns t o r a g ep r o t e i ni nc o i x s e e d si st h ef o u n d a t i o nf o ri n c r e a s i n gt h ep r o t e i nc o n t e n ta n di m p r o v i n gt h ep r o t e i n q u a l i t yi ns e e d s p r e v i o u ss t u d i e ss h o wt h a t2 2 - k dc o i x i ng e n e sw e r ea l s oo r g a n i z e d a sg e n ec l u s t e r , b u tt h e r ei sn of u r t h e rg e n o m es t u d yo nc o i xg e n o m e o u rl a bh a s1 9b a cc l o n e sc o n t a i n i n g2 2 一k dc o i x i ng e n e sa n dt w oh a db e e n s e q u e n c e d i nt h i ss t u d y , w ei s o l a t e dt h eo v e r l a p p i n gb a cc l o n ea n dc o n s t r u c t e da s h o t g u nl i b r a r yf o rs e q u e n c i n g f i n a l l y , w eo b t a i n e dac o n t i n u o u ss e q u e n c eo f v 上海大学硕士学位论文 2 8 3 ，0 3 7 b p s e q u e n c ea n a l y s i sr e v e a l e dt h a tt h ea v e r a g eg e n ed e n s i t yo f2 2 - k d p r o l a m i ng e n e si s7 6 k b g e n ei nb s s s 5 3 ( a z s 2 2 ；l l - z p 2 2 d 8 7 ) ，7 9k b g e n ei nb 7 3 ( a z s 2 2 ；1 1 - a z s 2 2 ；2 0 ) ，3k b g e n ei ns o r g h u m ( k a f i r i n o l - k a f i r i n l a n d1 3 5k b g e n ei n c o i x ( c o i x i n o l - c o i x i n l7 ) t h ev a r i a t i o no fg e n ed e n s i t ya p p e a r st ob ea t t r i b u t a b l et o t r a n s p o s a b l ee l e m e n t s ( 1 1 b s ) i n s e r t i o n s t e sc o m p r i s e d3 0 o ft h eb s s s 5 32 2 - k d g e n er e g i o n ，3 8 o ft h eb 7 32 2 - k dg e n er e g i o n ，a n dn or e t r o t r a n s p o s o n sb u tf e w t r a n s p o s o n sw e r ef o u n di ns o r g h u m i nt h e2 2 一k dc o i x i ng e n er e g i o n ，t e sa c c o u n tf o r a b o u t6 0 o ft h es e q u e n c e p h y l o g e n e t i ca n a l y s i sc o m b i n e dw i t hr e l a t i v el o c a t i o n s ，w ep r o p o s e dt h e e v o l u t i o nm o d eo f2 2 - k dp r o l a m i ng e n e si ns o r g h u m ，m a i z ea n dc o i x w et h i n kt h e y h a de x p e r i e n c e dt w or o u n d so fd u p l i c a t i o n ：e a r l yl o c a ld u p l i c a t i o na n dl a t e rr a p i d g e n ea m p l i f i c a t i o n e a r l yd u p l i c a t i o no c c u r r e da b o u tt e nm i l l i o ny e a r sa g o ( m y a ) a n d g e n e r a t e do n eo rs e v e r a ld u p l i c a t e dg e n e s l a t e rg e n ea m p l i f i c a t i o n sw e r eo c c u r r e d5 t o1m y a ( w i t h i n1m y ai ns o r g h u m ) u n e q u a lc r o s s i n go v e r ( u c o ) b e t w e e nt a n d e m r e p e a t si st h em a j o rm e c h a n i s mo fg e n ed u p l i c a t i o n ，a n dr e s u l ti nh e a dt ot a i la r r a n g e d d u p l i c a t e dg e n e s i nt h el a t e rs t a g eo fg e n ed u p l i c a t i o n ，m a i z ea n dc o i xh a dl a r g e a m o u n t so fr e t r o t r a n s p o s o ni n v a s i o ne v e n t s ，a n d2 2 - k dz e i na n dc o i x i nr e g i o nb e c a m e m o r ec o m p l e xa n do b e s i t y t h ei n c r e a s eo fg e n o m es i z ei sc o u n t e r a c t e db y i l l e g i t i m a t er e c o m b i n a t i o no ru n e q u a lc r o s s i n go v e ri n d u c e dd e l e t i o n s w ef o u n dt h a t i l l e g i t i m a t er e c o m b i n a t i o nw a st h ed r i v i n gf o r c eo fd n a r e m o v e m e n ti n2 2 一k dz e i n r e g i o n ，a n du c o b e t w e e nl t r sp l a y sa ni m p o r t a n tp a r ti ng e n o m es i z er e d u c t i o n ，o r a tl e a s ti to c c u r r e dm o r ef r e q u e n t l yt h a ni l l e g i t i m a t er e c o m b i n a t i o ni nc o i x w ea l s of o u n dt h a tt h ee x p r e s s i o no f f a m i l ym e m b e rc o r r e l a t e dw i t ht h ei n t e g r i t y o fc o d i n gr e g i o n m o s ti n t a c tg e n e sw e r ee x p r e s s e da n dm o s te x p r e s s e dg e n es e e m e d t ob ei n t a c t n oo b v i o u sc o r r e l a t i o nw a sf o u n db e t w e e ng e n e a g e a n dm r n a e x p r e s s i o np a t t e r n ，a n dt h ee x p r e s s i o np a t t e r n so fd u p l i c a t e dg e n e sd i v e r g er a p i d l y a f t e rg e n ed u p l i c a t i o n t h ec o m p a r a t i v es t u d yo f2 2 一k dk a f i r i n ，z e i na n dc o i x i ng e n er e g i o ne n h a n c e d o u rk n o w l e d g eo fg e n ef a m i l ye v o l u t i o na n de x p r e s s i o ni ng r a s s e s ，a n dw o u l da l s o 上海大学硕士学位论文 f a c i l i c a t et h ef u r t h e rr e s e a r c ho fg e n ef a m i l ye v o l v e m e n ta n du t i l i z a t i o no fw i l d s p e c i e sg e n er e s o u r c e s k e y w o r d s ：c o m p a r a t i v eg e n o m i c s ，c o i x 肠州口j o b i ，2 2 一k dp r o l a m i n ，g e n ef a m i l y e v o l u t i o n ，g e n ef a m i l ye x p r e s s i o n i x 上海大学硕一t 学位论文 原创性声明 本人声明：所呈交的论文是本人在导师指导下进行的研究工作。 除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已发 表或撰写过的研究成果。参与同一工作的其他同志对本研究所做的 任何贡献均己在论文中作了明确的说明并表示了谢意。 本论文使用授权说明 本人完全了解上海大学有关保留、使用学位论文的规定，即： 学校有权保留论文及送交论文复印件，允许论文被查阅和借阅；学 校可以公布论文的全部或部分内容。 ( 保密的论文在解密后应遵守此规定) 签名： 导师签名：牲日期： 上海大学硕士学位论文 1 1 比较基因组学 第一章前言与综述 比较基因组学( c o m p a r a t i v eg e n o m i c s ) 以遗传图谱和基因组序列为基础， 研究不同物种之间的基因组关系，揭示了基因组中的保守区域和特有区域以及基 因排列的宏观共线性和微观共线性，帮助我们了解基因组进化的机制以及物种形 成。通过模式生物与其它研究较少的物种之间的比较，我们可以比较容易的发现 同源基因。随着2 0 0 0 年拟南芥( a r a b i d o p s i s it h a l i a n a ) 基因组测序计划的完成 1 ，2 0 0 2 年水稻( o 哆z as a t i v a ) 基因组测序计划完成 2 ，3 ，2 0 0 5 年另一禾本 科重要作物玉米( z e am a y s ) 基因组测序计划的顺利进行 ( h t t p ：w w w m a i z e g e n o m e o r g ) ，以及其它植物大量基因组序列的测定，高通量 的比较基因组学将在植物基因组的结构，功能和进化的研究领域发挥重要作用。 1 1 1 宏观共线性( m a c r o c o ii n e a r i t y ) 在比较基因组学研究中，使用同一套遗传标记在不同基因组中进行遗传或物 理作图，使得人们可以从不同基因组间的基因类型，排列次序和方向的保守程度 进行比较，从标记水平重新认识和证实植物的亲缘关系及进化过程中遗产上的共 线性。比较遗传图谱显示，即使植物倍性，染色体数目和基因组大小差异巨大， 遗传标记的排列仍能保持很好的保守性。 最初对禾本科基因组的比较是使用r f l p ( r e s t r i c t i o nf r a g m e n t l e n g t h p o l y m o r p h i s m s ) 标记，证实了即使是在5 , 0 0 0 万年至7 , 0 0 0 万年之间分离，除了 部分染色体的重排，遗传标记的线性排列大致还是保守的【4 ，5 1 。第一张比较遗 传图谱是在茄科植物马铃薯，番茄和辣椒中获得的，这三种植物具有相同的染色 体数目( n = 1 2 ) ，但基因组的大小却相差数倍，马铃薯和番茄的基因组差别很小， 而在辣椒中发现了许多重排【6 ，7 】。h u l b e r t 等【8 】对玉米，高粱和其它作物进行了 研究，绘制了第一张玉米和高粱的比较基因组连锁图。d e v o s 和d u b c o v s k y 【9 ，1 0 1 上海大学硕士学位论文 研究表明，同源六倍体小麦的a ，b ，d 三套基因组在总体上表现出共线性，大 多数基因则有三个拷贝，三套基因组间也存在广泛的共线性。m o o r e 和d e v o s 等将已有的数据整合，绘制了著名的c r o pc i r c l e 【5 ，1 1 ，包含了禾本科的八种作 物：水稻，小米，珍珠粟，黑麦，高粱，玉米，小麦和燕麦。 然而，基于遗传图谱的比较基因组学也有不足：( 1 ) 遗传做图的分辨率低， 平均l o c m 一个遗传标记只能检测大的染色体重排，( 2 ) 由于遗传标记一般都是 低拷贝，限制了它对大量存在于基因组中的基因家族的检测，( 3 ) 比较遗传做图 着重于多态区域，而这些区域在基因组中并非平均分布，特别是在着丝粒附近。 随着拟南芥和水稻基因组测序的公开和e s t 序列数量的迅速增加，以及其 它禾本科作物序列的大量公开，基因组比较图谱的分辨率得到了进一步的提高。 1 1 2 微观共线性( m i c r o c o ii n e a r i t y ) 微观共线性是指在亚兆碱基( s u b m e g a b a s el e v e l ) 水平上不同物种基因组中 基因的内容与排列顺序显示保守性。最早的微观共线性研究是在玉米，高粱和水 稻的s h r u n k e n2 a n t h o c y a n i n l e s s ( s h 2 a 1 ) 直向同源区域 1 2 ，1 3 ，在玉米中这两 个基因相隔1 4 0 k b 而在高粱和水稻中仅相隔1 9 k b ，在高粱中a 1 基因还有另一个 复制拷贝，尽管如此，s h 2 ，x 1 ，x 2 和a 1 这四个基因还是保守的。对该区域的 序列比较还表明，玉米，高粱和水稻的高度序列同源性仅仅限于外显子序列，而 对应的内含子序列的同源性较差。l j 等 1 4 1 在对麦类( 大麦，小麦，黑麦) s h 2 a l 区域的分析中发现，只有s h 2 和x 1 保持了共线性，x 2 和a 1 则在另一条染色体 上被发现，暗示了在与禾本科其它作物分离之后，在麦类基因组中发生了大量重 排。对玉米的醇溶蛋白( z e i n ) ，高粱的醇溶蛋白( k a f i r i n ) 和水稻中的直向同源 区域的比较研究，发现玉米和高粱的对应基因在结构上是高度相似的，醇溶蛋白 基因位点是串联重复的，但拷贝数不同，整个区域表现为保守的同源基因镶嵌在 不保守的非基因区域中1 5 1 。 w i c k e r 等1 1 6 1 对二倍体小麦( t r i t i c u mm o n o c o c c u ms u b s pm o n o c o c c u m ) 和四 倍体小麦( t r i t i c u mt u r g j i d u ms u b s pd u r u m ) a 基因组的麦谷蛋白区域进行比较分 析，9 0 以上的区域都是不保守的，只有部分的基因区域是保： 的。造成基因问 区域差异的原因是大量的转座子和反转座子的插入以及异常重组( i l l e g i t i m a t e 2 上海大学硕士学位论文 r e c o m b i n a t i o n ) 导致的大片段缺失。g u 等【1 7 】在比较四倍体小麦( t r i t i c u m t u r g i d u m ，a a b b ) a ，b 基因组和二倍体小麦( a e g i l o p st a u s c h i i ，d d ) d 基因 组的麦谷蛋白区域时也看到了相同的情况，与六倍体小麦( t r i t i c u ma e s t i v u m ， a a b b d d ) a ，b ，d 基因组的对应麦谷蛋白区域比较发现非基因区域也有很好 的保守性。 在m c c 和b 7 3 的b z l 区域【1 8 】，m c c 中的1 0 个基因在b 7 3 中缺失了4 个； b s s s 5 3 和b 7 3 的z l c 区域【1 9 】中，不仅z l c 基因的拷贝数相差7 个( 2 2 1 5 ) ， b s s s 5 3 在基因簇下游还有两个基因，而这两个基因在b 7 3 ，水稻和高粱的对应 区域中都不存在；m 0 1 7 和b 7 3 上总共2 8 m b 序列的比较分析显示，三分之一以 上的基因( 2 7 刀2 ) 只存在于一个自交系 1 2 0 1 。即使是同一个物种的不同自交系， 不仅基因间区域不保守，基因的数目，排列也有不小的差异。这种种内的基因差 异，可能是转座子h e l i t r o n 引发的，h e l i t r o n 以r o l l i n g c i r c l e 模式连同侧翼序列 一起发生转座【2 1 ，2 2 。x u 等 2 3 1 发现b s s s 5 3 的z l c 基因簇下游的两个基因是 由于h e l i t r o n 转座而导致的基因插入。 1 1 3 基于比较图谱的基因克隆 发现新基因是当前国际基因组研究的热点，使用比较基因组学的方法是发现 新基因的重要手段。物种间直向同源区间序列的保守性经常表现为基因功能的相 似性。最好的例子就是“绿色革命 基因s d l ( 水稻) ，r h t 1 ( 小麦) 和d 8 ( 玉 米) 【2 4 ，2 5 1 。早期的比较遗传学研究使用r f l p 标记分离了很多基因和q t l ， k i l l a n 等【2 6 】利用水稻和其它作物间的共线性克隆了大麦抗秆锈病基因r p g l 和 r p 9 4 。啤酒酵母完整基因组所包含的约6 0 0 0 个基因，大约6 0 是通过序列的比 较信息分析所得到。科学家从c a e n o r h a b d i t i se l e g a n 线虫与其亲缘品系c b r i g g s a e 的比对中发现了大约1 3 0 0 个新基因。比较基因组学将是功能基因时代发现基因 的强有力工具。 根据不同基因组之问基因编码区的同源性远远高于非编码区，基于e s t 的 比较基因组学研究反映了基因组功能区域的相似度，可以指导基因功能的预测和 基因的克隆。对2 7 2 9 4 条玉米e s t 序列与拟南芥的e s t 序列比较发现，6 2 6 8 的玉米e s t 序列与拟南芥蛋白质的编码序列匹配【2 7 】，说明拟南芥和玉米在 3 上海大学硕士学位论文 e s t 序列上具有很高的同源性。但在玉米与水稻e s t 的比较研究中，仍然有许 多玉米e s t 不能在水稻中找到同源序列。b r e n d e l 等对玉米和拟南芥之间的蛋白 质组进行了比较研究，对1 1 4 3 条玉米蛋白质序列与2 5 6 1 7 条拟南芥的假定的蛋 白质序列进行蛋白比对分析，发现仅有1 1 7 条序列不能匹配，由此推算9 0 的 玉米蛋白与拟芥蛋白同源，但是b r e n d e l 等所用的蛋白序列有限( 2 6 2 9 条) ，少于 整个玉米组基因数目的1 0 ，所以9 0 可能并不精确。 1 2 多基因家族 多基因家族是一类起源于共同的祖先的基因，并因此具有相似的核苷酸序列 和相同的功能。在大肠杆菌( e c o l i ) 的基因中，已知的基因家族成员超过了 5 0 2 8 1 ，而在真核生物中这个比例甚至有可能更高 2 9 ，3 0 。在植物基因组中， 多基因家族更是普遍存在。例如，有6 5 的拟南芥基因属于基因家族，并且其中 一半的家族有至少五个成员基因【1 1 。因此研究一个基因家族中所有基因从而获 得对这个基因家族进化历史和表达模式的正确认识是十分必需的。 1 2 1 基因家族形成模式 基因家族的成员可以以成簇( c l u s t e r e d ) 或者分散( d i s p e r s e d ) 的形式存在 于基因组中。而它们的产生可以通过以下几种途径( 图1 ) ： 1 多倍体化。多倍体在植物进化中普遍存在【3 1 3 4 1 ，通过种问杂交或属间 杂交形成同源多倍体或异源多倍体是植物进化的重要途径。通过多倍体化，植物 基因组可以在一代之内加倍所有基因。 2 逆转座( r e t r o p o s i t i o n ) 。逆转录酶以m r n a 为模板反转录合成相应的d n a 互补链，然后在整合酶( i n t e r g r a s e ) 的作用下随机插入到染色体中，由此产生的 逆转座基因有以下结构特征，基因序列中没有内含子，3 端有p o l y a 尾巴，有 靶点重复序列( t a r g e ts i t ed u p l i c a t i o n s ，t s d s ) 。 3 转座( t r a n s p o s i t i o n ) 。某些类型的转座子在转座的时候没有严格的切除限 制，转座子附近的序列会和转座予一起被切除并发生转座，例如水稻中的m u l e s 4 上海大学硕士学位论文 ( m u t a t o r - l i k et r a n s p o s a b l ee l e m e n t s ) 【3 5 1 nt , 米中的h e l i t r o n 【3 6 ，这类转座子 所带来的基因复制也是随机分散在基因组中。 4 不等交换( u n e q u a lc r o s s i n go v e r ，u c o ) 。同源染色体或姐妹染色体之间 没有准确配对而发生了交换，结果使得一条染色体多了一部分而另一条少了一部 分，这种交换的结果往往是“头尾相连 的串联重复基因。 a m r n c d n af - 垆入基因组 c a 廿工卜 b 切除切除 联o 卜 耍互 沣 袱翱组b 士复制 -：_：_?：i；i三i!：卜 图l 基因复制模式示意图。细线条与虚线为d n a 序列，方框为外显子，粗线条为内含子， 深色方框与白色方框为同源基冈。( a ) 逆转库。m r n a 被反转录为c d n a ，插入剑基冈组 中。( b ) 转座子介导的基冈复制。侧翼基冈同转座子起被切除后插入基冈组其它区域。( c ) 串联重复基因间的不等交换。 1 2 2 多基因家族进化模式 5 上海大学硕二t 学位论文 对于超级基因家族的进化许多年来直存在着争论。“趋异进化 ( d i v e r g e n t e v o l u t i o n ) 模型是第一个提出的进化模型【3 7 】。但是后来在爪蟾中发现，核糖体 r n a ( r i b o s o m a lr n a s ) 家族各个成员之间的序列相似度高于物种之f b j 3 8 ，使 用“趋异进化模型难以解释一些现象，于是又提出了一个新的模型叫做“协同 进化”( c o n c e r t e de v o l u t i o n ) ，这个模型认为基因家族成员是协同而不是单独进化 的，一个突变会通过不等交换和基因回复( g e n ec o n v e r s i o n ) 传给所有家族成员， “协同进化 模型很快便被普遍接受并用于解释基因家族的进化，直至另一个模 型的出现，这个模型叫做“出生和死亡进化 ( b i r t h a n d d e a t he v o l u t i o n ) 【3 9 1 。 根据这个模型，基因复制产生了新的基因，其中一些在基因组中长期保留，而另 一些则被丢失或者由于缺失突变而失去功能 4 0 1 。这个模型提出来后，就发现有 许多基因家族的进化都符合这个模式，例如免疫球蛋白基因家族，主要组织相容 性复合体( m h c ) 基因家族，抗病基因家族和泛素蛋白基因家族 4 1 4 3 1 。 1 2 3 串联重复基因家族 串联重复基因是真核生物基因组的重要组成部分。在动物中，2 1 、2 4 7 和2 5 4 的人类、大鼠和小鼠的复制基因是串联重复的【4 4 】；而在植物中，1 4 的水稻基因、1 7 的拟南芥基因和3 5 的玉米基因是串联重复的【1 ，4 5 ，4 6 。 z h a n g 和g a u t 对拟南芥基因组中的串联重复基因做了分析 4 7 1 ，他们把串联 重复基因定义为在染色体上相邻、相隔0 1 0 个不相关基因的同源基因，在基因 组中发现6 9 的串联重复基因只有两个成员，1 8 的串联重复基因有3 个成员， 只有1 3 含有超过3 个的串联重复基因。r i z z o n 研究了水稻基因组中的串联重 复基n 1 4 8 ，发现了在数量、组成、重组率等各方面都和拟南芥中的情况非常相 似，而水稻和拟南芥的分离是在1 亿5 千万年前，说明了在不同基因组中，串联 重复基因的产生和维持有着相似的机理。 不等交换被广泛接受为产生串联重复基因的主要原因，首次发现是在果蝇棒 眼( b a re y e ) 突变体中【4 9 ，后来在h o x 基因家族、核糖体基因、抗病基i 羞1 1 5 0 5 3 1 和玉米中的r p l 、r p 3 、r _ ，、b z l 、k n l 、p l 、2 7 k d a 醇溶蛋白中都发现了不等交 换引起的串联重复 5 4 6 0 】。y a n d e a u n e l s o n 等在对玉米口j 基因的研究中发现， 6 上海大学硕士学位论文 9 4 ( 2 6 4 2 8 1 ) 的不等交换发生在同源染色体之间，而对交换点的选择也是有 倾向性的 6 1 1 。 1 2 4 2 2 - k d 醇溶蛋白多基因家族 醇溶蛋白是一类在种子发育过程中特异表达的蛋白，主要起贮存自由氨基酸 的作用。在玉米中约占蛋白总量的6 0 左右，可进一步分为四类，分别是a 、b 、 t 和d 醇溶蛋白，其中最大的一类是a 醇溶蛋白。 早期的研究表明在玉米中a 醇溶蛋白由一个庞大的超级基因家族编码，可分 为四个基因家族：z l a ，z l b ，z l c 和z l d 6 2 1 。其中三个基因家族，z l a ，z l b 和z l d 在s d s 聚丙烯酰胺凝胶上的相对分子量为1 9 k d ( 1 9 k d 醇溶蛋白) ，然而z l c 基因家族的分子量为2 2 k d ( 2 2 k d 醇溶蛋白) 。2 2 k d 醇溶蛋白在高粱和薏苡中 被命名为k a f i r i n 和c o i x i n ，而在水稻中没有对应的蛋白，说明2 2 k d 醇溶蛋白多 基因家族是在玉米、高粱和薏苡的共同祖先与水稻分离后出现的 6 3 ，6 4 。 2 2 k d 醇溶蛋白基因家族的各个成员基因在染色体上成簇分布，s o n g 等的 研究表明整个z l c 基因家族在b s s s 5 3 自交系中总共有2 3 个拷贝，其中2 2 个分 布在1 6 8 k b 内，a z s 2 2 ；1 6 分散在染色体的其它位置【6 5 】，在b 7 3 自交系中有1 6 个基因拷贝，其中1 5 个分布在1 1 2 k b 内，a z s 2 2 ；1 6 分散在染色体的其它位置 1 9 1 ， 在高粱中有1 1 个k a f i r i n 基因拷贝分布在7 5 k b 内【1 5 1 。而在薏苡中c o i x i n 基因也 是成簇分布 6 6 】，但是其结构与分布还没有深入研究。 1 3 本课题的内容及研究意义 对于基因家族的研究是个十分复杂但同时也非常重要的问题。一个基因家族 中所有基因的获得对于这个基因家族总体功能的正确认识是十分必需的。对于基 因家族的研究，不仅可以探究基因家族在进化方式上是如何演化的，同时也为物 种基因组的进化以及物种中基因是如何复制、移动、失活等问题的研究提供方法。 薏苡( c o i x ) 是一种禾本科( g r a m i n e a e ) 植物，和玉米同属m a y d e a e 族， 薏苡中的2 2 k d 基因家族有证据显示也是成簇分布。我们从薏苡基因组文库中分 7 上海大学硕士学位论文 离了2 2 k dc o i x i n 基因簇，并进行了测序，分析了玉米、高粱和薏苡在这一共线 性区间的序列组成与结构特征的差异。并且我们根据进化分析结果，综合基因家 族各成员的相对位置，预测了k a f i r i n 、z e i n 和c o i x i n 基因的扩增历史，对三者的 基因家族进化史做比较分析。最后对所有2 2 k d 基因家族各个成员的表达量进行 研究，发现了基因家族成员的表达规律。 以往比较基因组学分析都集中在单个基因，研究序列组成、染色体结构与局 部染色体活动，少有对基因家族的比较分析，而对基因家族的研究也是在单个物 种之内。本研究选取了玉米、高粱和薏苡的一段直向同源( o r t h o l o g ) 序列，其 中包含了2 2 k d 多基因家族，对基因家族进行比较进化分析，为基因家族的起源 与演化研究奠定了基础。同时，薏苡种子还有一个引人注意的特点，也是作物育 种更感兴趣的方面，就是它具有很高的种子蛋白含量。薏苡种子的蛋白质含量高 达1 8 7 ，是所有禾谷类种子中最高的。相比之下，水稻、玉米和小麦的种子中 的蛋白含量都仅在1 0 左右。种子储藏蛋白中醇溶蛋白是主要的一种，而a 醇 溶蛋白又是醇溶蛋白中的主要家族，但目前在薏苡中对于a 醇溶蛋白的研究很 少。克隆和分析薏苡种子储藏蛋白基因是研究薏苡高蛋白含量的一个关键。本研 究通过对2 2 k d 基因家族的表达分析，为提高其它禾谷类作物，如玉米等的种子 蛋白含量的遗传育种奠定基础。因此本研究的主要目的就是分析比较玉米、高粱 和薏苡2 2 k d 醇溶蛋白基因区域的进化历史，并研究该醇溶蛋白基因家族中的各 成员基因表达情况。 8