（基础兽医学专业论文）辛酰乙醛αc衍生物对巨噬细胞功能的影响.pdf

摘要 辛酰乙醛仅c 衍生物对巨噬细胞功能的影响 基础兽医学专业硕士研究生余虹 指导教师李逐波副教授 摘要 本文以辛酰乙醛c 衍生物甲基辛酰乙醛亚硫酸钠、乙基辛酰乙醛亚硫酸钠和丁基辛 酰乙醛亚硫酸钠为受试对象，研究了它们对体外培养的小鼠巨噬细胞分泌酸性磷酸酶、溶菌 酶和s o d 的影响规律；建立了评价巨噬细胞吞噬功能的一种简单有效的体外吞噬法，并用这 种方法研究了辛酰乙醛c 衍生物对体外培养的小鼠巨噬细胞吞噬鸡红细胞的能力及变化规 律。 在辛酰乙醛的a 位接入烷基后，其结构修饰物能在不同程度上提高巨噬细胞分泌酸性磷 酸酶能力。其中甲基衍生物和乙基衍生物的促进作用较修饰前显著性提高( 庐0 0 5 ) 。同一化合 物提高巨噬细胞分泌酸性磷酸酶能力与剂量呈依赖关系。在剂量o 1 2 0 p 咖l l 范围内，药物剂 量与巨噬细胞产生的酸性磷酸酶含量相关性良好p ( o 0 1 ) ，从甲基衍生物到丁基衍生物，相关 系数r 依次为o 9 7 0 、o 9 5 8 、0 9 3 7 。在辛酰乙醛的n 位引入甲基时，其衍生物促进巨噬细胞 分泌酸性磷酸酶的作用最明显，但当q 位接入烷基碳原子数增加到一定程度即引入了乙基时， 这种促进作用的效率随着a 位接入烷基碳原子数增加开始降低，以丁基衍生物的作用最低。 本实验研究发现，在辛酰乙醛啦引入甲基和乙基后，其衍生物能显著性地促进巨噬细胞 分泌溶菌酶 o 0 5 ) ，但引入丁基后，这种促进作用不明显，甚至出现了在低浓度( 1 5 p l i l l ) 下溶菌酶的含量显著性降低的现象。结果提示，在辛酰乙醛仅位引入甲基和乙基，能在一定程 度上活化巨噬细胞。这种活化作用呈规律性的变化，即在o 6 0 p 咖l l 浓度范围内，药物浓度与 溶菌酶含量两者极相关0 0 1 ) 。从甲基衍生物到丁基衍生物，相关系数r 依次为o 7 6 7 、o 8 6 l 、 0 7 8 5 。在同一浓度下，随着小c 位接入的烷基碳原子数增加，溶菌酶的含量降低，且具有明显 的相关性 o 0 1 ) ；从1 5 i 咖垤0 6 0 p 咖l ，相关系数r 依次为o 8 6 7 、o 8 8 2 、o 7 3 8 。 本实验研究的三种辛酰乙醛q 一碳衍生物能明显地促进巨噬细胞产生s o d 的活力( 萨o 0 5 ) 。 与辛酰乙醛相比，在其a c 位接入甲基后，其促进巨噬细胞产生s o d 的效果最明显( 萨0 0 5 ) ； 接入乙基后，在中高浓度( 3 0 、6 0 p 咖1 ) 下，其衍生物促进巨噬细胞产生s o d 的能力也有显 著性提高 。在2 5 5 0 p 动麟浓度范围内，浓度与 吞噬百分率和吞噬指数分别都成很好的相关性 o 0 1 ) ，从甲基衍生物到丁基衍生物，相关系 数r 依次为0 9 6 8 、o 9 9 9 、0 9 3 0 和o 9 3 2 、0 9 2 9 、o 9 5 3 。辛酰乙醛娌c 位接入甲基后，其 对融噬细胞吞噬率和吞噬指数的提高最明显 o 0 5 ) ：引入乙基后这种促进俸用随弓l 入碳原子 数的增加薅降低，了基衍生物的促进作用最弱。程位按入的烷基碳缀子数与吞噬百分率翻 吞噬指数具有明显的相关性驴 o 0 1 ) 。从1 5 p 妫【l l l 到6 0 p 咖l ，其相关系数r 依次为o 9 4 3 、 0 9 3 2 、0 8 8 4 和0 9 4 3 、0 9 5 0 、o ，9 7 4 。本章结果显示，辛酰乙醛的a 位接入烷基后。其衍生 物最著性地增强了巨噬细胞的吞噬功黪，迸一步说明了辛_ 酰乙醛a 一碳衍生物具有良好地促进 巨噬缨胞活纯的作用。吞噬过程是臣噬缨胞抗原递呈和杀灭胞内寄生病原微生物的首要步骤。 增强巨噬细胞的吞噬功能及抗原递呈功能，将可能相应增强机体免疫应答反应，促进抗原特 异性抗体的产生。 关键词：辛酰乙醛a 一碳衍生物酸性磷酸酶溶菌酶超氧化物岐化酶( s o d ) 吞噬 l l t h ee f f e c to f 仅co c t a n o v la c e t a ls o d i u m s u i i l t ed e r l v a t l v e s0 nt n ei u n c t l o n0 i m a c r o p h a g e s b a s ev e t e r i n a r ys c i e n c e p o s t g r a d u a t e y - uh 0 n g a d v i s o r ：l iz h u b 0 s i 删a r y t a l 曲g 伍co c t a l l o y la c e t a ls o d i 啪s u l f i t ed e r i v a t i v 豁，、，i z ，m e n l y lo c t a l l o y l e t a ls o d i 啪 锄l f i t e ，e m y lo c t a i l o y la c e t a ls o d i 啪锄db u t y l0 c t a l l o y l e t a ls o d i 啪s u l f i t e 雒t e s t e ds 锄叩l e ，m e e 彘c to fm l 糯0 nm cp r o d _ u c t i o f 孔i dp h o s l ) h o t a s e ，l y s o 硼n e 锄ds o db y 胧i 啪p h g e si i l 、，i v 0 w e 他崩潜a r c h e d ；as i m p l e 觚de 腩c t i v em e t l l o dw 舔s e tu pf o re s 血m t i i l g 廿1 ep h a 9 0 c 州cf h l l c t i o f m 戤翻豫g e si n 、，i v 0 ，龃dt h ep l 磕9 0 9 如c 如n c 石o fm r o p l l a g e sb e i n g 仃e a t e db y 伍co c t a i l o y l a c e t a ls o d i u l ：ns u l f i t e ( k 痢v a t i v e sw a ss t u d i e d 、i t l li t 伍co c t a i m y l e t a ls o d i 啪s u j f i t c 捌v 撕v e sc 姐饥h 锄c em a 啪p h a g e st o c r e t e i d p h o s p h o t a t od i 丘i e 托n ta ( e n d t h ea u 孕n e n t a t i o no fm e t l l y lo c t a l l o 姐a c e t a ls o d i u ms u l f i t c 锄d e n l y l0 c t 锄o y l 扯e t a ls o d i u mw 舔n 柳n o t a b i l 时让姗0 c t a i l o y l e t a ls o d i u ms u l f i t e ( 萨0 0 5 ) 1 1 l c a u 舭n t a 缸0 no ft l l 他ed e r i v a n v e sd 印e n d e d 叽d o s a g e a taf e dd e r i v a d v e ，t l l el 他lo fa c i d p h o s p h o t 硒en a p p e du pl m e a r l yw i t l lt l l ei i l c r e a s co fc c e n 位m w i 廿1 i i lt l l e 姗g e 触n0 川岁锄t o 1 2 0 耀；b ( 萨0 0 1 ) 1 kc o n l a 矗v ec o e 伍c i e n t so fm 晌y l0 c t a l l o 妒a c e t a ls o d i u ms u l 矗t e ，e l 量l y l 0 c 乞m o y la c e t a ls o d i 啪锄db u t y lo c t 锄o y l e t a ls o d i 哪跚l f i t ea mo 9 7 0 ，o 9 5 8 ，o 9 3 7 ， 陀s p e c t i v c l y t h ec a p a b i l 姆o f 曲l l a n c i i l g 删l c r o p l l a g c st o c r j e t e i dp h o s p h o t a s eo fm e m y l o c t a l l o y la c e t a ls o d i 啪跚l f i t cw 私m o s to b 、，i o 璐b u tt l l ec 印a b i l i t yw 舔w e a l c e d 加m e 姗耐b e ro f c a r b a t c 吼e x c e e d e dac e r t a i l lr 龃g e ( c 2 h 5 ) ，t l l ec 印a b i l i t yo f 呻l0 c 劬o y l e t a ls o d i 硼ns u l f i t ew a st l l ew e a l 【e s t t h el y s o z ) ，i i l e 孔6 谛yi i l 嫩c r l a 哩 h g e ss t i i l m l a t e db ym e t h y lo c t 孤o y la c e t a ls o d i 啪s u l f i t ea n d e n l y lo c t a i l o y l e t a ls o d i 眦，b e l l a v e d 锄e x t e 啮i y e l yi r i 】p r 0 v e m e n t 仃锄d ( p 如0 5 ) n o to i l l ym e i i l 甲v e m e n t 州o fb u t y l 似勉n o y la c e t a ls o d i u m 鲫l f i t ei sn o t0 b “o u s ，b u ta l s o l el e v e lo f l y s o z ) m 圮w 嬲d e c 陀a da tt l l el o wc o l 垃e n 位岖( 1 5 p i m ) t h e 化；a r c hr e 跚l ti i l d i c a t e dt t l a t i 西南大学硕士学位论文 黜如y 重o c 鼬。舅a c e 纽ls o 蠢翻骶斑埝耄c 臻do 蛙蚺o c 纨粥，l 越e 壤区嘲棘曲粒蠢v 搬：嫩锶橼s 。 t h ec o l 撕、r i t yo fc o n c c n t 础锄t o 岫l c v e io fl y s o z y i 豫w 淞q u i t e 桃q 哪0 1 ) w i t l l i l lm c 越嘲妇蕊秽瓠魏o 弘醇癌熏。国箨动瞳，魄ec o 辩l 矮v ec 燕e i e l 瓣o f 戤| 耋螭纨蝴a 眺l s o d i l l i i ls u l f i t e ，e t l l y lo c t a 舭o y l e t a l d i u m 粗db u 哆l0 c t 孤o y la c e t a ls o d i 嘲s u l f i t ea r eo 7 6 7 ， o s 6 l ，袋7 8 5 ，犁耄主v e 取匙a 觚d 辩铭妇蛀锄，龇 l e 姥lo fl 弘嗡秘e & 镪络s 耐l i 臌建yw 涵重量辩 i i i c 他笛eo ft l l en 1 蛐b e fo f 口吒a 南o na t i d m o 0 1 ) f 如m1 5 | i 咖lt o6 0 p 咖儿t l 圮c o r r e l 撕v e e o e 签c i 馓毽a f e 8 6 7 ，0 。8 8 2 ，o 。7 3 s ，嬲泌蛾i v e l 箩 i k 如e 貔co c t 氇l l c y ja c e t a ls o d i i 姻s u l l i t ed e n v a t l v 铭a i lc 锄o b o 璐i ye n h 锄c e m a c p h a g e st o 辩c r e t es o dq 啄o 0 5 ) c o 蕾叩a r e dw 涟o c t a l l o y la c e 缸ls o d i 硼s u l 斑e ，娃l ec a p a b i l i t y o fl n e 如y lo c t a n o y la c e t a ls o d i u ms u l f i t et os t i m u l a t em a c p h a g e sl o c r c t es o dw 豁t l l es 乜m l g c s t ( p o 。0 5 ) a m o n gt 王l et 量l 越e 捌v a t i v e s ；t h ec a pa _ b i l i 够o fe 小y lo c 锄o y la c e t a ls o d i u mw 舔藏s o i 印v e d 缸也群a tm e d i 啪锄dh i g l lc o n c e i l 廿砒i o n( 3 0 、6 0 p g 枞) 弧ec o 玳l 撕v i 妙o f c o n c 跚溉t i o nt ot | 忙l e v c lo fs o dw a sq u i t ew e l l 。0 1 ) 谢t l 妇吐蛾c o 粥e n 彀诵傩黼g e 蠹c 粕 1 5 p g 枷t o6 0 | l g 触髓ec o 船l a 娃v ec o e 蕊c i 觊怄o fm e m y lo c 锄o y la c e t a ls o d i 啪s u l f i t e e m y l o c t 柚0 y la c e t a ls o d i 眦s u l f i t ea n db u t y lo c t 觚o y la c e t a ls o d i u ms u l 蠡t ew e r eo 9 0 5 ，o 8 9 l ，o 贴l ， f e s 秘c t i v e l y - a taf e dc 绷c 鼬妇n 鳓，她 l e v e lo fs o d d e e r e a s e dl 主芏1 e a r l y 诵吐l 她洫r e a s eo f 也e n 硼口_ b e ro f 旺t 酬b o na t i 哪 o 0 1 ) f 如m1 5 i l 动【i l lt o6 0 i l 甜，m ec o n e l 撕v ec o e 维c i e l 怄a r e0 7 8 3 ， o 。9 8 8 ，o 9 2 2 ，愆s ! 弦c l i v e 坟 m i l c ：i i l go c 锄o y l e t a l d i 啪s u 】匠t e 嬲t e s t e ds a l l 叩l e ，am e m o dw 嬲s e tu pl - o re s t i m a t i i l gm e 加g o c 砖e 铀蕊雠o f 麟蛐g e s 遗荫强e 蹴旺羚di se a s i l y 蠢秘蹬醚，珏s 堍& 掇i 柏稚e 强 o b t a i n 咖er e s u l 雠o b s e r 坩a l i v et e s tp h e n o n 舱舰蝴dc o s tl i m e h u l db ec o l l s i d e m d 越矾 e g 矗v e l y 拯e 氇o df b fe s t 泌豫鲑l 培像e 加螯e 辨主c 内嚣e 妊。薹lo f 翔戡：f p h 8 9 e s 迭证v 良 a f 酿b e i l l g 船雌乏e db ya co c t a n o y la c e t a l 跚d i u ms u l 五t e 赫v a t i v e s ，也eb u 擞o f m 卸p h a 鲫 w 勰a u 鲫n t e do b 、，i o u s l y t l l es h a p ew 舔妇n 蚰y 锄dm a n yp s e u d o p o d sa n dp f o 戚鹏n c i e s p | f o 虮l d 热w h i c hw e 犯t l l es h a p ec h 盆糟c l e = ro fl 珑i c f o 曲a g e sb e 衲ga c l i v a t e d c 珥x a r 耐w i mo c 锄o y l a c e t a ls o d i l 蚰s u l f i t e ，t l i et l l r a ：o c t a i l o y la c e t a ls o d i 嘲s u l f i t ed e n v a t i v e sa l lc a no b 啊o l 塔l y 抽c 豫觞e 也e 出砻o c y 幻s 弛gp 吒氍髑l a 誉络勰d 掰l 秽y t o s i n g 如d e x e so fi n a c f o 薹，h a g 髂o fm i c ei l l 试v o o k o 0 5 ) t h ec o 玳l a t i 、，i t yo fc o n c 蝴缸觚t ot l l ep h a g o c y t o s i i l gp e f c e n t a g c sa n dp h a g o c y t o s i l l g 酗如x 舔o f 搬a c 鞠脚攮g e sw e 糙驴i 埝w e l l 白嘲。0 1 ) w i 嫩纽也ec 伪k e n 锨糠o n 瑚l l 孽e 蛔n2 5 剃岁，越t o 5 0 p 酌【1 1 1 1 1 1 ec o 觥l a t i v e e 箍c i e n t so fm e t l l y l0 c 协n o y la c e t a ls o d i 啪s u l f i t e ，e t l l y l0 c 切m o y l e t a l s o d i 鼬s 溺五耋ea 谢b u 聊o c a 嘲i y l 妇i 刚i 渤s 越璩l ew e 渤9 6 8 ，o 9 9 9 晓9 3 0a 硇a 9 3 2 ，穗9 2 9 0 9 5 3 ，黼s 】p e c t i v c l y t h ec a p a b i l 时o fi i l c m 鹪i i l gt l l ep h a 9 0 c ”o s i i l gp e r c 伽妞g e sa n dp l l a g o c y t o s i i i g 遗l e x 豁o f 撙叠诺。洳g 嚣耐l ￥撼也蝣o e 拯l l o y la e 镰ls o d i 搬n 瓣l 蠡l ew 豁b 确沁噼s 1 b 迸l h e i v s u m m a k y 群i b i l i t yw 笛w l 【e 血e d 慨t l l em m i b c ro f 眦盯b m 踟m 托h e dt ot 帅，m ec 叩l a b i l 时o f 删 仪沲m 刚a c e t a l d i 哪淌t cw 弱t l l cw 翻妇t h ec 骶l 删哆o f 也en 嘶b c ro f a i r b o l la t 锄t 0 t h ep l 壕g 垃如i l l gp i e r c a l t 唱茚锄dp l 扭g ( c ：岫i n gi n d 甑髓w c 砖q i l i t ew e u ( p 卸0 1 ) w i t l l 也e c 0 e 咖d 瑚g e 舶ml5 p 咖lt o6 0 p 鲈l l l ，n 把c o m l a 6 v ec o e 塌c i 坞骶她w e 托o 9 4 3 ，0 9 3 2 ， 0 8 8 4a n d0 9 4 3 ，o 9 5 0 ，0 9 7 4 ，陀s p c c 6 v e l yt h er e 鲫l ts h 删e d 吐哦圮ac o c t a i l o y l e t a ls o d i 啪 跚l 丘t e 捌嘣v 锚no t y v i o 眦l yi m p i d v et l l ep i l a g c 啪i i l gf h i l c t i o no fm 礼r o p _ h a g e s ( p 、洳乙基辛酰乙醛 委硫酸钠( c 2 h 5 穗0 心0 秘鼬丁基辛酰乙醛亚硫酸镳( c 4 珏9 攥0 u c g ) 硫代乙醇钠：北京奥搏星生物技术责任有限公嗣 小牛衄清：中美合资兰州民海生物工程有限公司 m i 。1 6 4 0 培养基：s i 朗豫公司 。 溶菌酶试帮盒、酸性磷酸酶试帮盒、s o d 检测试齐4 盒：购自南京建成垒铅工程研究所。 3 1 5 主要仪器设备 1 4 s w 孓l f 型超净工作台：苏髑安泰空气技术有限公霹 髓0 1 6 g 型离心机：上海安亭科学仪器厂 j a 2 0 0 3 型电子天平：上海精天电子仪器有限公司 倒置光学显微镜：0 1 y 1 坤吣公司( 日本) s b d 5 0 型恒温水浴锅：h e 协- h o l 托啦公司( 丹麦) 手术剪、镊子、注射器：重庆北碚医药余司 粒p 5 新型小鼠饲养笼：重庆腾鑫桅电设备有限公司 斟s s - 3 2 5 型灭菌锅：m y 黼y o 有限公司 h h c p - t w 型c 0 2 培养箱：上海齐欣科学仪器有限公司 细胞培养瓶：北京拜尔特普生物科技发展有限公司 第三章辛酰乙醛a 碳衍生物对巨噬细胞分泌酸性磷酸酶、溶菌酶、超氧化物歧化酶能力的影响 3 1 6 主要溶液的配制 3 1 6 1 含有2 0 胎牛血清( f b s ) 的m i - 1 6 4 0 细胞培养液配制 将一袋l l 规格的时m i 1 6 4 0 细胞培养基粉末溶于8 0 0 i i l l 三蒸水中，加入2 0 0 i i l l 胎牛血 清1 nh c l 调p h 至4 ，加入1 0 0 万单位的青霉素和链霉素各5 i l l l ，2 0 9 n a h c 0 3 ，1 nn a o h 调 p h 至7 1 ，定容至l o o o i i l l ，最后用o 2 2 u m 微孔滤膜滤过除菌，4 保存。 3 1 6 2 辛酰乙醛亚硫酸钠及其旷碳衍生物溶液的配制 精确称取一定量辛酰乙醛亚硫酸钠及其a 碳衍生物，以r p m z l “0 细胞培养基配成浓度为 5 0 0 p 砌的溶液，o 2 2 岬微孔滤膜滤过除菌，超声振荡使其溶解，4 保存o 3 2 实验方法 3 2 1 巨噬细胞的分离 对小鼠腹腔注射0 2 i i l l3 硫代乙醇钠，第三天将小鼠眼眶放血，脱颈椎处死，浸入7 0 酒精3 m i l l 后取出，剪开皮肤暴露腹膜，腹腔注射3 栅m z 1 6 4 0 培养液，轻柔腹部。用注射 器取出腹腔液，注入离心管中，反复数次，直至吸出液颜色接近r p m z 1 6 4 0 培养液原色。 1 5 0 0 叩m 离心1 0 i t l i n ，弃去上清夜，r p m z 一1 6 4 0 液洗涤细胞2 次，用含2 似小牛血清的 ，m z 1 6 4 0 液制成细胞悬液。 3 2 2 巨噬细胞产生酸性磷酸酶能力的测定 设置细胞悬液的浓度为l 1 0 6 个r n l 。在2 4 孔细胞培养板每孔内加入0 5 i i l l 细胞悬液， 在3 7 ，5 c 0 2 培养箱中培养2 h ，更换培养液去除未贴壁细胞。向冲洗后的2 4 孔细胞培养 板每孔内加入o 5 l i l l 培养液及0 5 柚的受试药物溶液( 浓度分别为6 0 p 酌【i l l 、1 2 叫咖1 、 2 4 蛳咖1 ) 作为供试组或培养液作为对照组，不同浓度药物及培养液各加6 孔，放入c 0 2 培 养箱培养2 4 h 。 培养结束后，反复冻溶三次。以3 0 0 呻p m 的转速离心1 5 i i l i i l 后，依照酸性磷酸酶试剂盒 说明书哗】检测培养板每孔上清液中的酸性磷酸酶活力。 1 5 西南大学硕士学位论文 表3 1 酸性磷酸酶实验操作表 i a b l e 3 1 r b s to f 切n a r j ca c i di e s i s t a n ta c i dp h o s l 西l a 协s e 测定管标准管空白管 细胞培养液( i t l l ) 0 0 5 一 o 1 m 咖i 酚标准应用液( m 1 ) 一 o 0 5 - 双蒸水( 删) 缓冲液( i t l l ) 基质液( r n l ) 0 0 5 0 50 5o 5 o 5o 5o 5 充分混匀3 7 0 c 水浴3 0 分钟 碱液( m 1 ) 显色剂( t i l l ) 1 o1 o1 o 。 1 51 51 5 立即混匀，室温静置1 0 m 咄于5 2 0 i l m ，1 伽光径，空白管调零，测各管吸光度值。酸性磷 酸酶含量参照下面公式计算： 酸性磷酸酶( u 1 0 0 l i l l ) = 测定管吸光度标准管吸光度标准管含酚的量x1 0 0 删0 5 l l l l 3 2 3 巨噬细胞产生溶菌酶能力的测定 设置细胞悬液的浓度为l 1 0 6 个l i l l 。在2 4 孔细胞培养板每孔内加入o 5 r n i 细胞悬液， 在3 7 ，5 c 0 2 培养箱中培养2 h ，更换培养液去除未贴壁细胞。向冲洗后的2 4 孔细胞培养 板每孔内加入0 5 i i l l 培养液及o 5 i i l l 的辛酰乙醛亚硫酸钠及其a 碳衍生物溶液( 浓度分别为 1 5 p 咖i 、3 叽咖l 、6 0 p 鲈1 1 1 ) 作为供试组或培养液作为对照组，放入c q 培养箱培养2 4 h 。 培养结束后，依照溶菌酶试剂盒说明书8 5 1 检测培养板每孔上清液中的溶菌酶活力。 试菌悬液配制：浓度为o 2 5 m 咖l ，称取2 5 m g 微球菌粉倒入玻璃匀浆管中，加菌粉溶 剂1 0 0m l ，轻轻缓慢上下旋转研磨l n l i i l 。 溶菌酶标准液配制：称取一定量的标准品粉剂，用蒸馏水配制成o 1 m 咖l ( 即2 0 0 0 u 锄) 1 6 第三章辛酰乙醛a 碳衍生物对巨噬细胞分泌酸性磷酸酶、溶菌酶、超氧化物歧化酶能力的影响 浓度的溶液。 表3 2 溶菌酶实验操作表 t a b l e 3 2t e s t o f l ) ，s o 舭 按表3 2 ，在空白管、标准管、测定管中分别加入蒸馏水、溶菌酶标准液、样本( 血清) 各o 2 i i l i ，再各管加入菌悬液2 i i l l ，混匀，3 7 水浴1 5 l i i l ，立即取出置于o 的冰水中3 曲， 5 3 0 n m 处进行比色，测定其透光度。溶菌酶含量参照下面公式计算： 溶黼含量c 昭m ，= 需鬈糕筹黧粼标准管浓度q 吮 o t l 厂水浴1 5 m i l l 后的空白管透光度。 u t l 广水浴1 5 m i n 后的测定管透光度。 s t l 广水浴1 5 m i l l 后标准管得透光度： 3 2 4 巨噬细胞产生s o d 的测定 设置细胞悬液的浓度为l 1 0 6 个i n l 。在2 4 孔细胞培养板每孔内加入0 5 l i l l 细胞悬液， 在3 7 ，5 c 0 2 培养箱中培养2 h ，更换培养液去除未贴壁细胞。向冲洗后的2 4 孔细胞培养 板每孔内加入o 5 i i l l 培养液及o 5 l i l l 的受试药物溶液( 浓度分别为1 5 p g i l l l 、3 0 p 咖l 、6 0 p 咖1 ) 作为供试组或培养液作为对照组，不同浓度药物及培养液各加6 孔，放入c 0 2 培养箱培养 2 4 h 。 - 培养结束后，反复冻溶三次。以3 0 0 帅m 的转速离心1 5 m i i l 后，依照酸性磷酸酶试剂盒 说明书【8 6 】检测培养板每孔上清液中的s o d 活力。 分别取各样品l l i l l 加入4 l i l l 生理盐水中，旋涡混匀成1 ：5 稀释样品。然后按表5 2 加样 1 7 西南大学硕士学位论文 进行测定。混匀，室温静置l o 分钟后，以蒸馏水调零，用l 伽比色杯，在5 5 0 i l m 波长，测 定各管的吸光值。 表3 3s o d 活力测定加样表 t a b l e3 3 r g e n tv o l 姗o f m e 私l l r i l l gs o d t i 、r i t ) r 计算：s o d ( 删砂- b u ；b s x 3 3 3 标准液体积样品的体积 = b l 卜- b s 3 3 3 3 0 3 0 1 0 0 0 5 0 0 0 = b 一【j b s 1 6 7 计算公式中的b 、u 、s 分别代表空白管、测定管和标准管的吸光值。 3 3 实验结果 3 3 1 辛酰乙醛洳碳衍生物对巨噬细胞产生酸性磷酸酶的影响 如t 曲l e3 4 所示，空白对照组酸性磷酸酶浓度为o 2 4 3 士0 0 2 6 6u 1 0 0 m 1 。细胞培养液中 加入辛酰乙醛及其弘碳衍生物，即能够明显提高巨噬细胞所产生的酸性磷酸酶的水平 驴 0 0 5 ) c i n h o u c s 药物组中巨噬细胞分泌的酸性磷酸酶的水平与h o u 8 组相比都有所 提高，其中c h 3 h o u 8 、c 2 h 5 - h o u c 8 组与h o u 8 组相比，差异显著 0 0 5 ) ( 如图f i g 5 1 ) 。 结果说明，在辛酰乙醛的a 位接入烷基后，其结构修饰物能在不同程度上提高巨噬细胞分泌 酸性磷酸酶的能力。 1 8 第三章辛酰乙醛a 碳衍生物对巨噬细胞分泌酸性磷酸酶、溶菌酶、超氧化物歧化酶能力的影响 表3 4 辛酰乙醛及其n 碳衍生物对巨噬细胞产生酸性磷酸酶的影响 t a b l e3 4e 妇溉to f h o u 8 锄dc n h o u c 8 p m d u c t i o f a c i dp h 啊p h i 砌鼬i i l 删呶0 p l 埝g 组别剂量( p g ，m 1 ) 酸性磷酸酶( u l o o r n l ) l 冲m i 16 4 0 0o 2 4 3 士o 0 2 6 6 h o u c 8 c h 3 h o u c 8 c 2 h 5 - h o u c 8 c 4 h 9 - h o u c 8 o 3 1 2 士o 0 3 5 l 0 4 4 2 士o 0 4 8 4 o 513 士o 0 5 6 2 o 8l9 士o 0 8 9 9 o 8 7 7 士o 0 9 6 2 0 o 4 l l 士0 0 4 5 5 0 7 7 9 士o 0 8 5 4 0 3 7 7 士0 4l5 4 2 4 0o 5 3l 士o 0 5 8 5 t h el 州e l so f 扯i dp h o s p h o 协辩a r e 积p 懈辩d 舔m e a n t s d ，n = 6 s 面湎啪td i f f b 门明so f t h el “e l so f 孔j dp h o s p h o 协s eb e t w 咖 h o u 白卸d q l - h o u c l 疵锄e d 掣洮芦v c 幅峭t l 佗埘t 嘲t e d f o u p a 陀p 陀溯i t e d 笛+ p 0 0 5b y a n o l 9 仉8 n 7 n 6 鲥d 乱5 留蹄： a l j ，1 m d ： 2 ， o 6 01 2 02 0 c o 舭e 础咄吼( p b 触) c b 口c h 州o u c 8 c 2 h 5 卅o u c 日 口o i h 9 卅o u c 8 ：f 0 0 5c o m p 盯e dw 油c 8 图3 1 辛酰乙醛及其一碳衍生物对巨噬细胞产生酸性磷酸酶的影响 f i g 3 1e 妇溉to fh o u - c 8 锄dc n h o u c 8o np r o d u c t i o no f i dp h o s p h o t a s e i i lm a a r o p l l a g e s 在三种衍生物作用下，巨噬细胞分泌的酸性磷酸酶含量曲线如图3 2 。从图中可见：随着 加 柏 加 加 啪 枷 啪 狮 啪 狮 m 嚣南大学矮士学位论文 c 玲强o u c s 浓度( 蝴p 幽融) 增加，巨噬细胞分泌的酸性磷酸酶含蒙单调上升。酸性磷酸 酶含量上升越快( 上升速率k 值越大) 意味蓍这三种衍生物促进巨噬细胞分泌酸性磷酸酶的 效率越高。 十c h 3 - m m + c 2 袋 _ | 焱 乞8 + c 4 l 西姒l 弋8 瑟彝爨l 羽l 鞠 勰8 3 c a n c 蚴t f m 心c 蜘h o u c 8 姐酗曲 图3 2 辛酰乙醛a 碳衍生物对巨噬细胞产生酸性磷酸酶的影响 搿g 。3 2e 盏c to f e 矬h o u - c 8o 鼗p f o d 黼矗o no fa c 堪曲o s 薹庆。耄a s e 遮戤l e 由g e s 为了准确求得在兰种衍生物作用下，巨噬细胞分泌的酸性磷酸酶含量曲线的斜率k 值， 对曲线上升的部分( o 一1 2 0 p 斯【1 1 1 ) 进行线性拟合，得到相关性很好的直线庐o 0 1 ) ，见图3 3 。 从c 埯h o u s 到c 4 h 9 壬| 0 u c s ，曲线斜率隧c n 堪o u 8 分予中瑾链接入烷基碳原子数的 增加而降低，依次为o 。5 、o 3 、o 。2 ；相关系数r 依次为o 。9 7 0 、o 。9 5 8 、o 。9 3 7 。即c n h o u c s 分子中a 位接入烷基的碳原子数增加，促进巨噬细胞分泌的酸性磷酸酶的能力降低。 c 蚺c 蛳k 1 i 蝴o fc 洲0 u j 隧m 咖玲 鳖3 3 滚度葛酸性磷酸酶含量的相关性 f i g 3 3 黜1 a t i o n s h i p so f c o n c e n 妇舡彻w 浊也el e v e lo f i dp h o s | p h o 拓睇 l擎8事6暴4 3 2 l氇m凌仇&仉凌m& 一一_16口【n一母聃一pd鼻a强01置q硼n霸 仉&艮&n&良& 一h舌o_i，n一嚣矗葚墓亘a p t 譬 第三章辛酰乙醛a 碳衍生物对巨噬细胞分泌酸性磷酸酶、溶菌酶、超氧化物歧化酶能力的影响 3 3 2 辛酰乙醛弘碳衍生物对巨噬细胞产生溶菌酶的影响 如协l e3 5 所示，将巨噬细胞放入含有不同浓度药物的细胞培养液中培养2 4 小时以后， 在选定的剂量范围内，c h 3 h o u c 8 、c 2 h 5 - h o u - c 8 组的溶菌酶浓度与对照组相比均显著性 增加，但c 4 h 9 _ h o u c 8 组在低浓度( 1 5 p g 神) 下，其溶菌酶浓度显著性降低( p 0 0 5 ) 。 表3 5 辛酰乙醛及其a 一碳衍生物对巨噬细胞产生溶菌酶的影响 1 a b l e 3 5e 疏c to fh o u 8 卸dc n h o u c 80 np r o d u c t i o no fl y s o z y m ei n 姗c 哪，h g 皓 t kl 酬so f 蝣唧l i o f l y s o 驷c 丘d m 删埘o p h 鲳嚣a 他麟p n 络s e d 弱m m s d ，n = 6 s i 印i f i c a md i f i 细淄o ft l i el “c l so f 盯e t i 硼o fl y s o 巧m e 知帆m m p l l 鸱k t w 啪h o u c i 锄d0 1 h o u c 仇啦e dg 巾i l p sv c 陪憾n l e 帅饥a 刚g r o 叩玳p f 嚣舶伽 鸪t p 0 5b y a n 0 、，a 在m 6 0 p g 锄浓度范围内，考察c n h o u c 8 三种药物的浓度与其对应的溶菌酶含量的关系， 结果显示两者极相关( o 0 1 ) ，从c h 3 - h o u c 8 到c 4 h 9 - h o u c 8 ，相关系数r 依次为o 7 6 7 、 0 8 6 l 、o 7 8 5 。 以溶菌酶的含量对辛酰乙醛a 烃基修饰物的a - c 位接入烷基碳原子数作图( 图3 4 ) ， 可以看到：在同一浓度下，随着c 位接入的烷基碳原子数增加，溶菌酶的含量降低，具有 明显的相关性p 0 0 1 ) 。从1 5 p 驴i l l 到6 0 p 咖l ，线性相关系数r 依次为0 8 6 7 、0 8 8 2 、0 7 3 8 2 l 谣南大学硕士学位论文 薯 飘5 7 酝5 6 氐5 5 糠5 al2345 - l i 醇c a f b o 擐翻删b 娃 图3 霹烷基碳原子数与溶菡酶含量的相关性 哪 枷 蛳 y - 0 硝l 川翮 y - 一0 聊州7 珐 残孚3 4 馘锄娥秘o f 氐a 蚴龆触ln 妇蜒出龇l e v e lo f l y s o 虿臌 3 3 3 辛酰乙醛a 碳衍生物对巨噬细胞产生s o d 的影响 表3 6 辛酰艺醛及其程碳衍生物对臣噬细胞产生s o d l 均影晌 1 a b l e3 。6e 妇隐c o fh o u c 8 越l dc n h o u c 8o np d u c t i o no fs o di i lm a c r o p h a g e s 。 组别剂量( p 咖1 )s o d ( u m 1 ) r p m i 1 6 4 0o1 0 3 l 士1 0 2 l l o u q 测，- h o 班c l c 2 鞋，壤d 瞄龟 q 璃r 嚣o l 晒 1 5l l ，3 l 圭l ，1 3 l 搴 1 1 7 l 圭1 。1 4 3 1 2 3 2 1 2 5 6 1 2 5 轻1 11 3 1 3 9 ：独1 1 2 0 1 4 4 6 士1 3 l l 1 2 。铡隆l ，5 2 3 1 3 0 8 1 2 5 s 1 3 触1 4 5 i 1 2 1 3 5 4 1 2 1 2 士1 3 3 2 6 01 2 9 9 士1 4 2 5 t k w 出o f 婚驰t ；曩- o f s o d 如枇姗嘲唧l - 8 嚣a 膊雠尊s 甜笛删蹴惦d “蝤s i 印谢姻吡d 漱啪嚣o f 吐砖l 州幽o f 辨啊蜥嘶 o f s 毓糊蝴b d 榭l h o l 嗡酬c n 辩伽舀瓣撼稚弘秘删缸删黼瞳辨峰砒烨湖磷笛，哦酝 n o v a 如 曲 搭 搭 娃 ：暑 塔 抛 第三章辛酰乙醛a 碳衍生物对巨噬细胞分泌酸性磷酸酶、溶菌酶、超氧化物歧化酶能力的影响 如呦l e 3 6 所示，与空白对照组巨噬细胞分泌的s o d 活力相比，各受试药物组的s o d 活 力都显著性提高解0 0 5 ) 。c n - h o u c 8 药物组与h o u 8 组的s o d 活性相比都有提高，其中 c h 3 h o u c 8 组在各浓度下，c 2 h r h o u c 8 组在3 0 、6 0 肛咖l 浓度下与h o u c 8 组相比，差 异显著怔0 0 5 ) ( 如图f i g 3 5 ) ，：4 s ：彳 纪5 3 s 帅i ) ，艺 ，1 5 ， ，n 5 ，o h o u c 日 口c h 3 卅o u c 2 h 5 卅o u c b 口c 4 h 9 刖o u c 日 1 5了口b u c o n c i 曲砒i 口nm 目f 矗d 节 o 0 5c 1 p a r e d i t l lc 8 图3 5 辛酰乙醛及其a 一碳衍生物对巨噬细胞产生s o d 的影响 f i g - 3 5 e 彘c to f h o u c la n dc n h o u c 8 矽d d u c t i o no fs o di i lm a a r o p l h a g e s 在选定的剂量0 6 0 p 咖1 范围内，c n - h o u c 。提高细胞培养上清液中s o d 活力的作用具 有剂量依赖性。在浓度1 5 6 0 p 劝【i l l 范围内，c n - h o u c 。的浓度与s o d 活力极相关( f 0 0 1 ) ， 相关系数为0 9 0 5 、0 8 9 l 、o 9 6 l ( 如f i g 5 6 ) 。 薯 色 磊 01 5 3 0 4 5 印7 5 c 妞h 踟弋b c c 蜘t f 吐i o n ( w 多蛐 图3 6 浓度与s o d 含量的相关性 f i g 3 6r e l a t i o 璐h i p so f c c n 而w i ms o d 5 5 4 5 3 5 2 5 l 5 d扎n亿m蛾 西南大学硕士学位论文 在同一浓度下，随着a - c 位接入的烷基碳原子数增加，s o d 活力降低。以s o d 含量对