（生物化学与分子生物学专业论文）中国黄酒保健功能的研究.pdf

致谢 本论文是在导师史锋副教授及朱成钢老师的悉心指导下完成的。导师渊博的 学识、严谨求实的治学态度、富于开拓性的思维以及豁达宽容的处事态度，都使 我受益终身。导师在业务上的指导，生活上的关心，让我在美丽的华家池畔度过 了收获颇丰的两年，谨此向导师表示崇高的敬意和衷心的感谢! 特别感谢朱成钢老师在论文选题、设计、方案制定实施以及实验过程给予的 悉心指导和启发。同时感谢章骥老师、金勇丰老师和龚朝辉博士在实验工作中所 给予的指导、关心和启发。 本论文全部工作均在浙江大学生物化学研究所完成，二年的学习与工作时光飞逝而 过，难以忘怀求学过程中生化所老师、同学的关心与支持。谨此感谢陈英豪、田男、周 灵娟、梁静、李杰等研究生，另外感谢李钧、薛惠明以及叶晓伟同学在实验方面给予的 帮助。在这样一个团结上进、脚踏实地、互帮互助的集体中学习和生活，我感到 了大家庭的温暖，度过了人生重要的科研能力训练阶段。在此对他们表示衷心的 感谢! 特别感谢一直在身后默默支持我的家人，我的每一步成长都凝聚着他们的心血和汗 水，他们是我学习和生活的坚强后盾和精神支柱，对他们的感谢，我难于用文字表达 最后，谨向参加本文评阅、答辩的各位专家致以最诚挚的感谢! 倪赞 浙江大学生物化学研究所 二零零六年五月 浙江大学硕士学位论文 摘要 黄酒历来以营养丰富和保健养生而著称，然而目前对黄酒的认识和研究仍然停留在 蛋白质、氨基酸等常规营养物质成分分析的层次，缺乏像红酒保健功能那样研究深度， 影向了黄酒的宣传力度和市场开拓。因此本论文通过分析化学、生物化学和动物实验等 科学手段，对中国黄酒的保健功能进行研究，为黄酒后续开发和宣传提供科学依据。 本研究主要包括黄酒抗氧化性研究，免疫功能研究，代谫 功能以及机体功能研究 等四个方面内容。抗氧化性研究主要是通过对黄酒的总抗氧化性、还原性、清除d p p f i 自由基和超氧阴离子能力、总酚以及金属螯合能力等研究；免疫功能研究主要研究了黄 酒对体液免疫、细胞免疫以及非特异性免疫的影响；代谢功能研究了黄酒的排铅作用、 钙磷代谢调节以及影响肝脏g p t 活力；机体功能研究了黄酒抗衰老、改善记忆以及耐缺 氧能力。 通过以上四个方面的研究，黄酒具有抗衰老、抗氧化、抗骨质疏松、提高机体免疫 力、提高耐缺氧能力、提高学习记忆能力、促进排铅作用，改善老年痴呆等疾病等多种 效果，保健功能显著。 关键词：黄酒保健功能抗氧化体液免疫细胞免疫代谢功能机体功能 浙江大学硕士学位论文 a b s t r a c t c h i n e s ey e l l o ww i n e ( y w ) h a sb e e nf a m o u sf o ri t sg o o dn u t r i t i o na n dh e a l t h c a r e f u n c t i o n s n o ta sp r o f o u n da sr e dw i n e t h er e s e a r c h e so fy ws of a ra r ef o c u s e do nt h e c o m p o n e n tc o n t e n ta n a l y s i s ，w h i c hd i m i n i s ht h ee f f o r t si nt h ep r o m o t i o n so fy w i no u rs t u d y , w ec l a r i f i e dt h eh e a l t h c a r ef u n c t i o n s b y t h em e a n so fa n a l y t i c a l c h e m i s t r y , , a n i m a l e x p e r i m e n ta n db i o c h e m i s t r y , p r o v i d i n gb a s i sf o rt h ef u r t h e rd e v e l o p m e n t so f y w n l e r ew e r ef o u r s e c t i o n si nt h er e s e a r c ho fy w ：t h eo x i d a t i o nr e s i s t a n c e i m m u n e f u n c t i o n s ，m e t a b o l i cf u n c t i o n sa n db o d yf u n c t i o n s a tf i r s t ，w ee v a l u a t e dt h ea n t i o x i d a n t p r o p e r t i e so fyw ，i n c l u d i n gt h et o t a la n t i o x i d a n ta c t i v i t y , r e d u c i n gc a p a c i t y ，d p p hr a d i c a l a n ds u p e r o x i d ea n i o ns c a v e n g i n ga c t i v i t y ，t o t a lp h e n o l i cc o m p o u n d s ，a n dc h e l a t i n ga c t i v i t y ， s e c o n d ly ，t h ei m m u n ef u n c t i o n ss e c t i o nr e v e a l e dt h ee f f e c t so fy wo nh u m o r a li m m u n i t y , c e l l u l a ri m m u n i t ya n dn o n s p e c i f i ci m m u n i t yo fr a t s t h i r d l y ，i nt h em e t a b o l i cf u n c t i o n s s e c t i o n ，w ei n v e s t i g a t e dt h ee l i m i n a t i o ne f f e c to f y wo nl e a dc o n t e n t ，r e g u l a t i o ne f f e c to f y w o nt h ec a l c i u m 。p h o s p h o r o u sm e t a b o l i s m ，a n dt h ee f f e c to fy wo nt h er a tl i v e rg p t a c t i v i t y a tl a s t ，t h ea n t i a g i n g ，m e m o r yi m p r o v i n ga n dt h et o l e r a n c eo fo x y g e n d e f i c i e n tp r o p e r t i e so f y wi n d i c a t e dt h ee f f e c t so nb o d yf u n c t i o n s t os l i mu p ，w ed r e wt h ec o n c l u s i o nt h a ty wh a d a n t i a g i n g ，a n t i o x i d a t i o n ，i m p r o v i n g h u m a ni m m u n i t y , m e m o r y , a n dt h et o l e r a n c eo fo x y g e n d e f i c i e n t ，i m p r o v e m e n to fl e a d p o i s o n i n ga n db o n em e t a b o l i cd i s t u r b a n c et h e s ee x c e l l e n th e a l t h c a r ef u n c t i o n si n0 1 1 1 r e s e a r c h t h i sw o r ks u p p l i e si m p o r t a n tb a s i sf o rf n r t h e rs t u d y k e yw o r d s ：y e l l o ww i n e ，h e a l t h c a r ef u n c t i o n ，o x i d a t i o nr e s i s t a n c e ，h t u n o r a li r u n m n i t y c e l l u l a ri m m u n i t y ，m e t a b o l i cf u n c t i o n ，b o d yf u n c t i o n 4 浙江大学硕= k 学位论文 第一章文献综述 黄酒是我国的民族特产，与啤酒、红酒并称为世界三大古酒【1 1 。传统的黄酒是以玉 米、小米、小麦等谷物为原料，经蒸煮、加曲、糖化发酵、压榨、过滤、煎酒、贮存、 勾兑而成的酿造酒【2 j 。黄酒里含有丰富的碳水化合物、氨基酸、维生素、微量元素以及 多种活性物质，同时独特的酿造工艺使得黄酒具有酒精浓度低、酒兴醇厚、营养丰富、 风味独特、品种繁多等特性，因此黄酒不仅成为中国传统的保健养生佳品，而且还被用 作为中药服药的引子，被视为“百药之长”。本草纲目详细记载了6 9 种可以治疗疾 病的药酒，均是以黄酒制成。在长期的实践过程中，黄酒还被认为对肿瘤和心血管疾病 等具有不错的疗效 3 4 ”，但是缺乏实验和流行病学的实验支持。 黄酒在我国享有“国酒”之美誉。黄酒的杰出代表绍兴黄酒( 以占越龙山、沈永和 最为著名) 是我国民族瑰宝，多次荣获国际、国家金奖外销3 0 多个国家和地区。 1 1 黄酒营养价值 1 1 1 氨基酸及多肽 黄酒的蛋白质含量在各种酿造酒中是最高的，且以多肽和氨基酸的形式存在。黄酒 游离氨基酸达4 0 9 m g m l ”，可直接被肠、胃消化道吸收而进人血液，而且黄酒富含人 体所需的八种必须氨基酸( 见表1 1 ) 。根据国际粮农组织( f a o ) 制定的蛋白制品中必需 氨基酸含量标准陋1 ，黄酒中各种必需氨基酸含量均高于该标准。黄酒中多肽含量为 1 48 3 m g m l 7 1 ，远远高于啤酒和红酒。 表1 1 黄酒中八种人体必需氨基酸含量 浙江火学硕：b 学位论文 1 , 1 2 碳水化合物 黄酒中的碳水化合物基本上都是发酵产生的红糖、果糖等单糖以及麦芽糖、异麦芽 糖、乳糖等低聚糖。在黄酒中功能性低聚糖含量较高，以异麦芽低聚糖为主，包括异麦 芽糖、潘糖和异麦芽三糖，含量达2 7 7 m g m l 、2 8 6 m g m l 和1 2 5 m g m l 8 1 。它们可以直 接被吸收到血液而运送到全身，直接产生能量，其余部分以糖原的形式储存到肝脏和肌 肉中，不易使人发胖。黄酒的发热量8 5 k e e l l m l ，比啤酒多5 5 3 4 k c a l ，比白酒少 2 5 0 3 3 k c a l ，介于两者之间 1 1 3 无机盐及微量元素 人体内的无机盐是构成机体组织和维持正常生理功能所必需的，按其在体内含量的 多少分为常量元素和微量元素。由离子发射光谱法i c p a e s 测定黄酒中元素含量，黄 酒中含有钾、钠、钙、镁、磷、硒、锌、铁、铜、锰、镁、铬、铝等2 0 多种人体所必 需的常量和微量元素( 表1 2 列举了主要常量和微量元素) 。 表1 2 黄酒中主要常量元素和微量元素( m g l ) 黄酒中钾、钠、钙、磷、镁五种常量元素含量达1 3 9 m l ，远远高于啤酒和白酒， 也高于同为酿造酒的红酒。黄酒中钙磷等常量元素含量高，有利于人体对钙磷等元素的 吸收，尤其对缺钙的老年人来说黄酒是最理想的低酒精饮料。钾镁等常量元素对于保护 一心血管系统，预防心脏病具有重要意义。 硒是人类必需的微量营养元素，参与机体抗氧化过程，能够延缓衰老9 f l o l ，预防心 血管疾病及动脉粥样硬化旧，增强机体免疫力【”1 。f 临床试验和流行病研究显出 硒元素具有显著的抗肿瘤作用【 1 ，在癌症患者的硒元素水平要低于正常l i z l 。硒缺 乏会导致硒半胱氨酸及其氧化还原酶含量显著降低，大量自由基产生，从而引起心肌症、 风湿性关节炎、白内障、和肿瘤等病症【饽 。黄酒虽算不上富硒食品，但在酒中是最高的， 比红酒约高1 2 倍白葡萄酒约高2 0 倍【2 0 1 。 锌在黄酒中以配合物态有机锌的形式存在，是人体中多种酶的活性成分，是维持正 常生命活动的关键因子。锌在人类免疫系统中有着重要的作用，锌缺乏削弱机体免疫应 6 浙江大学硕士学位论文 答，尤其是细胞免疫，巨噬细胞吞噬功能，细胞因子产生，抗体分泌，抗体亲和力以及 补体系统刚【2 2 。实验证明，锌与多种慢性病的发生和康复相关，在适当的浓度，能够 引起肿瘤细胞凋亡，抑制增殖口”。 铜铁等是造血、活血和补血功能的关键成分；锰对调节中枢神经和内分泌有重要作 用，是抗衰老的关键因子 2 4 】 黄酒中这些有益元素与蛋白质、氨基酸、葡萄糖、维生素相互协调和相互补充，构 成了黄酒较高的营养价值及保健功效。 1 1 4 维生素 黄酒中富含维生素，据相关资料报道达六种之多。维生素是维持身体健康所必需的 有机化合物，是蛋白质、脂肪、碳水化合物代谢的催化剂，在人体内不能自行合成，必 须从饮食中摄取，而黄酒正是酒类饮料中维生素丰富的酒种。维生素在人体中需要量虽 然很少，但在物质代谢中起着重要的作用，缺乏它就会得病。从理论上讲，除v c 等少 数几种维生素外，黄酒中其它种类的维生素含量应比啤酒和红酒要高。 黄酒中维生素来自于原料和酵母自溶物。糯米和小麦作为黄酒酿造的原料，除了含 丰富的b 族维生素外，小麦胚中的v e 生育酚含量高达5 5 4 m g k g 【2 。v e 具有多种生理 功能，其中最重要的功能就是与谷胱甘肽过氧化酶协同作用，清除体内自由基。酵母是 维生素的宝库，黄酒在长时闻的发酵过程中有大量酵母自溶，将细胞中的维生素释放出 来。黄酒中含硫胺素达0 0 1 8 6 r a g 1 0 0 m l 。若每天饮2 0 0 m l ，相当于需要量的2 8 6 这在营养学上是很有价值的2 ”。 1 1 5 活性成分 多酚物质 多酚物质具有很强的自由基清除能力，防止心血管病，抗癌，抗衰老等生理功能。 经多年贮存后的古越龙山陈酒中酚类物质含量见表1 _ 3 。它们来自原料( 大米、小麦) 和 微生物( 米曲霉、酵母) 的转换，特别是由于发酵周期长达1 0 0 天左右，小麦带皮发酵， 麦皮中的大量酚类物质溶入酒中，因而黄酒中的多酚物质含量较高。 表1 3 黄酒中酚类物质含量 种类 含量种类含量 浙江大学硕= l 学位论文 含量较高的功能性低聚糖1 8 i 功能性低聚糖难以被人体消化，在摄入后很少或根本不产生热量，但能被肠道中的 有益微生物双歧杆菌利用，促进双歧杆菌增殖，改善肠道的微生态环境，促进b 族维生 素的合成和钙、镁、铁等矿物质的吸收，提高机体免疫力和抗病力，能分解肠内毒素及 致癌物质，预防各种慢性病及癌症，降低血清中胆固醇及血脂水平。古越龙山酒中功能 性低聚糖异麦芽糖、潘糖、异麦芽三糖的含量分别为2 7 7 m g m l 、2 8 6 m g m 1 芹e 1 1 2 5 m g m 1 其来源分两部分：一是支链淀粉的酶解，古越龙山酒以糯米为原料，糯米中的淀粉几乎 全部是支链淀粉，淀粉酶不易切断它的分支点，因而酒中残留的分支低聚糖较多；二是 麦曲中微生物分泌的葡萄糖苷转移酶通过转糖苷合成。 富含重要的抑制性神经递质y 一氨基丁酸1 2 6 1 1 2 i v 一氨基丁酸( g a b a ) 是一种重要的抑制性神经递质，参与多种代谢活动，具有降低 血压、改善脑功能、增强长期记忆、抗焦虑、高效减肥及提高肝肾机能等生理活性。古 越龙山酒中g a b a 含量高达3 4 8 m g l ，是富含g a b a 的保健饮品。 g a b a 它能作用于脊髓的血管运动中枢，有效促进血管扩张，达到降低血压的作用 ：2 9 1 。据报道，黄芪等中药的有效成分即g a b a ；g a b a 还能提高葡萄糖磷酸酯酶的活性， 使脑细胞活动旺盛，促进脑组织的新陈代谢和恢复脑细胞功能，改善神经机能。医学上 g a b a 对脑血管障碍引起的症状，如偏瘫、记忆障碍等有很好的疗效，同时用于尿毒症、 睡眠障碍的治疗药物中。此外，日本研究者以富含g a b a 的食品进行医学试验，结果显 示对帕金森综合症、老年痴呆有显著的改善效果。 生物活性肽 近年来的研究表明，以数个氨基酸结合而成的多肽具有比氨基酸更好的吸收性能， 而且许多多肽具有原蛋白质或其组成氨基酸所没有的生理功能，如促钙吸收、降血压、 降胆固醉、免疫调节、抗氧化、清除自由基、抗癌等功能。黄酒中的肽含量是其它任何 酒都无法比拟的。对古越龙山黄酒中的肽类组分进行提纯和降血压、降胆固醇的体外活 浙江大学硕：卜学位论文 性试验，发现酒中含具有活性很强的降血压生物活性肽和降胆固醇生物活性肽，初步确 定其组成及序列分别为g l n s e r g l y p r o 和c y s g l y g i y s e r 【2 “。 谷胱甘肽在人体内具有重要的生理功能。当人体摄入食物中含不洁净物或药物等有 毒物时，在肝脏中谷胱甘肽能和有毒物质结合而解毒。谷胱甘肽过氧化酶是一种含硒 酶能清除体内自由基的危害。黄酒中的谷胱甘肽是发酵过程中酵母分泌和自溶产生的。 酵母是提取谷胱甘肽最常用的原料，一般干酵母含1 左右的谷胱甘肽。黄酒发酵周期 长，酵母易自溶，因而自溶产生的谷胱甘肽也较多。 类黑精” 类黑精是美拉德反应的产物。美拉德反应是食品加工和贮藏过程中经常发生的反 应，生成类黑精的量取决于还原糖和氨基酸的浓度。黄酒中的还原糖和氨基酸含量高且 贮存时间长因而生成较多的类黑精，黄酒在储藏过程中色泽变深，也与美拉德反应生 成类黑精有关。类黑精是还原性胶体具有较强的抗突变性。有的研究指出其抗突变 机理是清除致突变自由基和通过与致突变化学物结合而减少其致突变毒性。 1 2 国内外相关研究进展 近年来，科学的研究表明适量的饮酒能够在预防很多疾病方面起到重要的作用。于 此同时，酒类里面除乙醇以外的许多物质功能纷纷被揭示，如对红酒里各成分尤其是对 特殊多酚类物质白藜芦醇的大量研究提出了白藜芦醇的含量、功能作用、分子结构、 前驱体、形成机制和作用机制，不但为红酒保健功能的宣传提供了科学的依据，而且极 大地提高了红酒的保健内涵和品位。还有和中国黄酒一样的稻米酒日本清酒研究研究 也比较深入。相比之下，中国黄酒研究还仅仅停留在上面营养价值的研究上，因此作为 酒类，红酒、清酒等研究方法思路可以为中国黄酒的研究提供借鉴，研究黄酒与世界知 名的酒类异同，揭示黄酒独特的保健功能。 1 2 1 抗氧化 大量的实验证明了活性氧( r o s ) ，如超氧阴离子自由基、氢氧自由基、过氧化氢 ( h 2 0 2 ) 、单线态氧等对生物体起着重要的作用，能够诱发低密度脂蛋白的氧化。低密 度脂蛋白的氧化正是动脉粥样化形成的氧化理论基础口3 2 】，能够引起许多慢性疾病如 癌症、心血管疾病、动脉硬化症以及糖尿病等的发生f 3 3 】( 3 4 3 5 】。许多种类的酒，尤其是 浙江大学硕士学位论文 红酒被证明在体内和体外都具有强的抗氧化性【3 7 】【3 8 】。同时，流行病学研究证明适当 的饮用红酒能够有效地降低患冠心病的几率 3 9 】【4 0 】。可以推断酒的抗氧化性一定程度上 起到了抗动脉硬化等疾病的作用 4 ”。国外的一些学者还认为红酒的抗氧化性与红酒里的 多酚复合物的浓度相关【4 2 j 4 3 】( 。多酚是一种强的抗氧化剂，在体外能够有效地防止低 密度脂蛋白的氧化。 谷胱甘肽和谷胱甘肽过氧化酶能够清除自由基和脂质过氧化物，抑制自由基的生成 反应。谷胱甘肽过氧化酶是含硒( s e ) 的酶蛋白，其活性由硒元素决定，而黄酒中恰恰富 含s e 元素和谷胱甘肽【4 5 】。 1 2 2 抗衰老和改善记忆 法国健康与医药国家研究中心的流行病学研究表明，适量的饮酒能够延缓衰老和降 低患帕金森综合症和老年痴呆症( a d ) 机率。衰老是一个非常复杂的过程，但自由基和衰 老之间密切联系已是大家所认同的【4 6 【4 7 】，维持体内适当水平的抗氧化剂和自由基清除 剂水平，可以延长寿命和推迟衰老 4 8 1 1 4 9 5 0 1 因此酒中多酚、谷胱甘肽以及类黑精等抗氧 化性物质对抗衰老和改善记忆起着重要作用1 5 2 1 5 3 】【5 4 】。另外研究表明，神经变性退化 是衰老发生的重要表现，往往伴随着神经递质j 泛地缺乏【5 5 【5 6 】【5 7 】。g a b a 作为重要的神 经递质，提高g a b a 体外摄取对帕金森综合症、老年痴呆有显著的改善效果【5 8 】【5 9 】。此外 研究表明，黄酒中的某些多肽能够抑制p e p 酶活性，这种酶在老年性痴呆发生过程中起 到重要作用1 6 。 1 2 3 免疫调节 免疫调节是一个复杂的调节体系，主要是通过清除机体内的自由基，抗脂质过氧化 作用：诱导多种细胞因子，促进干扰素如白细胞介素等的合成；激活巨噬细胞、自然杀 伤细胞和淋巴细胞提高机体免疫球蛋白的水平等途径发挥作用f 6 ”。酒类成分复杂，多种 物质有免疫调节的作用 6 2 10 其中酒的抗氧化性对免疫调节有重要作用【6 3 】，多酚等还原 性物质表现了酒的抗氧化性起着免疫调节的作用【6 5 】【“1 。酒里含量丰富的维生素e 和 脂肪酸诱导细胞因子，改变免疫细胞和相关蛋白酶结构来进行免疫调节【6 7 】 6 8 】。 浙江大学硕士学位论文 1 2 4 其他功能 尽管长期以及过度饮酒对人是有害处的，但是近年来研究表明，根据年龄，性别以 及其他因素，适当的饮酒有助于健康 6 9 】【。乙醇能够增加保护心血管的高密度脂蛋白 浓度 7 2 】。饮酒还能改善肠道菌群，具有抗菌作用；适当的饮酒能够抑制肥胖【7 4 】【7 5 】； 能够改善心肺功能，增加动脉弹性【7 6 】【7 7 1 。 浙江大学硕：t 学位论文 2 1 选题依据及目标 第二章实验设计方案 随着人们生活水平的提高和保健意识的增强，酒除了满足人们的嗜好外，其保健养 生功能也越来越受到重视。红酒十分重视保健养生功能的研究与宣传，并把它作为促进 消费的重要举措。1 9 8 1 年，r i c h a r d 提出“法国悖论” 7 8 】【7 9 ，之后经过对红酒成分的研 究和分析，发现红酒中含有大量的多酚类物质。现在已经分离鉴定的多酚类物质主要有 白藜芦醇、儿茶酚、表儿茶素、槲皮素、芸香苷、杨梅酮和没食子酸等( 8 0 】。这些多酚类 物质具有抗氧化功能，除了抑制低密度脂蛋白( l d l ) 的氧化，预防心血管病以外还有 抗癌、抗炎症和血小板凝聚的功能。特别是通过对特殊多酚类物质白藜芦醇的大量研究， 提出了白藜芦醇的含量、功能作用、分子结构、前驱体、形成机制和作用机制”。，不 但为红酒保健功能的宣传提供了科学的依据，而且极大地提高了红酒的保健内涵和品 位，使喝红酒有益健康的概念深入人心，从而极大地推动了红滔的消费。 黄酒历来以营养丰富、保健养生著称是行家推崇的传统保健养生佳品。本草纲 目详载了6 9 种药酒可治疾病，均以黄酒制成。就是在科学发达的今天，许多中药仍以 黄酒泡制，借以提高药效，且无法找到可以替代的东西。绍兴历来盛产黄酒。中医药界 也多用绍兴黄酒配方治病疗效显著，颇得民间赞赏。然而多年来黄酒的基础研究甚少， 对其保健内涵的认识与当今科技发展极不相称。在科学发达的今天，仅靠古书上的几旬 记载已经说服不了消费者，要说服消费者，就要有科学的依据，对保健养生功能要有科 学的解释。由于对黄酒的研究与认识仍然停留在蛋白质、氨基酸等常规营养物质的层次， 无法从机理上阐明它具有保健养生功能，缺乏像红酒保健功能研究深度，影响了黄酒的 宣传力度和市场开拓。 因此我们通过分析化学，生物化学和动物实验等科学手段，对古越龙山黄酒的保健 功能进行研究，从而确定黄酒究竟具有哪些保健功能，为进一步研究黄酒保健机理提供 基础，也为提升黄酒的产品形象和黄酒的宣传找到科学依据。同时也可使我们对绍兴黄 酒这一祖传的国酒有更深入、全面的了解。这项工作是从来没有人做过的，具有开创性。 课题完成后，将为绍兴黄酒企业带来巨大的经济效益和社会效益。 本课题在浙江省绍兴市与浙江大学科技合作专项资金项目支持下完成，目前已经通 过省级鉴定。 浙江大学硕士学位论文 2 2 主要内容 本课题对黄酒的研究有以下方面： _ 抗氧化性 抗氧化活性物质的引入有利于清除由人体产生的过量的内源性活性氧自由基，阻断 自由基对人体生物大分子的损伤，减少癌症及心脑血管疾病的发病几率。寻找有效的抗 氧化剂对疾病的治疗和人体保健非常有益。现有的抗氧化剂，如v e ( 0 【一t o c o p h e r 0 1 ) 、叔 丁基羟基茴香醚( b h a ) 、二丁基羟基甲苯( b h t ) 及没食子酸( p g ) 等，绝大多数为化学合 成产品，存在安全性问题【8 3 i 【8 4 】 8 5 ，因此人们越来越趋向尽可能使用天然抗氧化活性物 质。黄酒是酿造酒，含有大量的天然抗氧化化活性成分，我们采用抗油脂氧化能力，自 由基清除能力，金属螯合能力，还原性等指标来研究和评价黄酒抗氧化功效，为揭示黄 酒天然保健功能提供基础，为后续研究提供依据。 - 免疫功能 免疫系统是机体的一个重要系统，担负着免疫防御、免疫监视与免疫自稳的功能， 很多疾病的发生发展都与免疫系统的生理功能有着密不可分的关系。有效的免疫机制需 要细胞免疫和体液免疫相互合作与协调。为了研究黄酒对免疫功能的调节作用，本研究 从特异性和非特异性细胞免疫及体液免疫三个方面，观察黄酒及黄酒浓缩物对正常小鼠 免疫功能的影响，全面地阐述黄酒对免疫功能的影响。 一代谢功能 机体代谢是非常复杂，很多疾病的发生就是由某个代谢的失衡引起的。骨质疏松是 世界公认的六大疾病，通常是各种因素如激素、营养状态与重金属拮抗等引起的钙磷代 谢失衡造成的坤“。因此，我们研究黄酒对钙磷代谢的调节作用以及对重金属铅的排除作 用，从两个方面揭示黄酒对代谢功能的影响。作为代谢最主要的器官，我们最后测定了 黄酒对肝脏功能的影响，使我们深入了解黄酒与代谢功能关系。 _ 机体功能 衰老是生命过程中正常生理现象，是机体功能不断减弱过程。由于时间的一维性， 活体是开放性非平衡适度内稳态结构，因此衰老的发生和演变是不可抗拒的，最终趋向 死亡8 7 1 。寿命的长短，在一定程度上整体反映了机体功能的强弱。通过研究黄酒对寿命 的影响，揭示黄酒的抗衰老效果，直观地说明黄酒对机体功能增强。同时我们研究了黄 酒对记忆和耐缺氧能力等人们比较关注的机体功能的影响进行研究，更加全面地阐述黄 浙江大学硕士学位论文 酒抗衰老，增强机体功能的作用。 2 3 技术路线 薄衙 4 浙江大学硕士学位论文 3 1 实验材料 第三章抗氧化性的体外研究及其机理 黄酒由中国黄酒集团浙江古越龙山绍兴酒股份有限公司提供，2 0 0 4 年酿造。 1 ，1 - d i p h e n y l - 2 - p i c _ y l h y d r a z y l ( 二苯代苦昧酰肼，d p p h ) ，3 - ( 2 一p y r i d y l ) - 5 ，6 - b i s ( 4 一 p h e n y l s u l f o n i ca c i d ) 一1 , 2 ，4 - t r i a z i n e ( 菲洛嗪，f e r r o z i n e ) ，n i t r o b l u et e t r a z o l i u m ( n a d p h 一氮 蓝四唑，n b t ) ，d - t o c o p h e r o l ( 维生素e ) ，b u t y l a t e dh y d r o x y a n i s o l e ( 叔丁基羟基茴香醚， b h a ) ，b u t y l a t e dh y d r o x y t o l u e n e ( 二丁基羟基甲苯，b h t ) ，x a n t h i n e ( 黄嘌呤) ，x a n t h i n e o x i d a s e ( 黄嘌呤氧化酶) 购买自s i g m a 公司其它化学试剂都是分析纯。 3 2 实验方法 3 2 1 总抗氧化性的测定 黄酒的总抗氧化能力由硫氰酸铁比色法进行测定8 8 1 。取3 5 0m gt w e e n 2 0 和3 1 0u i 亚油酸，加磷酸钾缓冲液( 0 0 4m o l l ，p h 7 0 ) 至l j 5 0 m l 均质制备成亚油酸乳状液。将分别 含有5 0 ，1 0 0 ，2 0 0 l 黄酒的磷酸钾缓冲液中( p h7 0 ，o 0 4 m o l l ) 2 5 m l 和2 5m l 亚油 酸乳状液混合，同时做空白对照，即2 5m l 的磷酸钾缓冲液与2 5 m l 的亚油酸乳状液混合。 然后这些5m l 的混合液放入3 7 。c 培养箱中避光培养，每1 2 个小时对混合液进行取样，每 次1 0 0 扯1 ，总共取1 0 次。其氧化程度测定采用硫氰酸盐方法，样品溶液1 0 0i - d 加入到4 7 m l 乙醇( 7 5 ) 中，然后自n k l o op l 硫氰酸铵( 3 0 ) 和1 0 0p lf e c l 2 ( 2 0m m o l l 于 3 5 h c l e o ) 混匀，在5 0 0 n m 处测得吸光度值，并计算抑制百分率。 抑制率= ( 卜a l a o ) 1 0 0 其中a o ：空白在5 0 0 m n 处吸光值 a l ：含黄酒样品在5 0 0r l i i l 处吸光值 用1 0 0 腭b h a ，伐t o c o p h e r o l 作为阳性对照。 3 2 2 还原性的测定 浙江大学预士学位论文 黄酒的还原性由铁氰化钾法测定。由将5 0 、1 0 0 、2 0 0u l 黄酒加入到l m l 蒸馏水 中，然后与2 5m 1 的磷酸缓冲液混合( 0 2m o l l ，p h6 ，6 ) 混合，再加入l 铁氰化钾2 5 m l 。混合物于5 0 恒温2 0 m i n ，再加l m l1 0 三氯乙酸，然后3 0 0 0 “m 离心分离1 0 m i n ， 取上层清液2 5m l 加蒸馏水2 5 m l 和0 1 f e c l 30 5 m l ，在7 0 0 n m 处测定吸光度。吸光 度越高，说明这种反应混合物的还原性越强。用1 0 0 嵋b h a ，b h l 旺一t o c o p h e r o l 作为阳性 对照。 3 2 3 清除d p p h 自由基能力测定 黄酒清除d p p h 自由基能力参考s h i m a d a 等人的方法【9 0 】。将2m lo 1m m o i l 的d p p h 自由基醇溶液加入到2m l 含有5 0 ，1 0 0 ，2 0 0p 1 黄酒的水溶液中。室温放置3 0 分钟，于5 1 7 n l y l 处测定吸光值，吸光值越小，表明自由基清除能力越强。根据下列公式计算清除率。 清除率= ( 卜a l a o ) x 1 0 0 其中a o ：空白在5 1 7n m 处吸光值 a 。：含黄酒样品在5 1 7 n m 处吸光值 用1 0 0i x g b h a ，b h t , c 【一t o c o p h e r o l 作为阳性对照。 3 2 4 金属螫合能力的测定 黄酒的金属螯合能力由d i n i s 等人的方法来测定9 ”。在4 7 m i 含有2 0 0 ，5 0 0 ，1 0 0 0 m 黄酒中加入o 1 m l2 m m o l l 的f e c l 2 和0 2m l5m m o i l3 - ( 2 一p y r i d y l ) 一5 , 6 一b i s ( 4 一p h e n y l s u l f o n i ca c i d ) 一1 ，2 ，4 - t r i a z i n e ( f e r r o z i n e ) 。然后放置于室温2 0 分钟，于5 6 2 n r n 测定吸光值。吸光值越低，表明金属螯合能力越强。螯合能力用以下公式进行计算： 螯合率= ( 1 a l a o ) 1 0 0 其中a o ：空白在5 6 2n n - i 处吸光值 a l ：含黄酒样品在5 6 2n i n 处吸光值 用没e d t a ：f l l 柠檬酸作为阳性对照。 3 2 5 总酚的测定 黄酒中的总酚使用福林一酚制剂进行测定，使用没食子酸作为标样9 2 1 。l m l 黄酒用 浙江大学硕士学位论文 4 6m l 蒸馏水进行稀释，然后加入lm 1 福林一酚制剂并混合均匀。3 分钟后，加入3 m l2 的n a 2 c 0 3 溶液。放置于室温2 小时，其间每隔一段时间，将混合液振动。然后于7 6 0 n m 处测定吸光值。黄酒中的总酚含量按照以下公式进行计算： 吸光值a = 0 0 0 0 9 x 总酚含量+ o 0 1 8 3 3 2 6 清除超氧阴离子能力测定 使用黄嘌呤和黄嘌呤酶体系对黄酒清除超氧阴离子的能力进行测定【9 3 1 。o 5m l 含有 5 0 ，1 0 0 ，2 0 0i - d 黄酒分别加入到1 0m l 含有0 4m m o l l 黄嘌呤和o 2 4m m o l l 四甲基唑 蓝( n b t ) 的磷酸缓冲液中( 0 1m o l l ，p h8 o ) 。然后将溶解在磷酸缓冲液中的00 4 9 u n i t s m l 黄嘌呤酶1 0m l 加入到上述混合液中，3 7 水浴中恒温4 0 分钟。用2m 16 9 m m o l l 的十二烷基磺酸钠( s d s ) 终止反应，然后于5 6 0 n m 处测定吸光值，吸光值越小， 表明自由基清除能力越强。根据下列公式计算抑制率： 清除率= ( 卜a l a o ) 1 0 0 其中a o ：空白在5 6 0n l t l 处吸光值 a 1 ：含黄酒品在5 6 0n n l 处吸光值 用没食子酸作为阳性对照。 3 3 结果与分析 实验中所有的数据都是三个重复所得，以m e a n 表示。方差分析使用d p s6 5f o r w i n d o w s 。显著性差异检验使用邓肯多范围检验法。p 值 0 0 5 表示显著，p 值 o 0 5 ) 。 表4 1 黄酒浓缩物对小鼠脾淋巴细胞转化影响( m e a n + s d ，n = 1 0 ) 与空白对照组相比，”表示p 0 0 1 ，+ 表示p 0 0 5 黄酒浓缩物对小鼠脾淋巴细胞增殖也就是t 淋巴细胞的促进作用不明显。 4 3 2 溶血空斑 用绵羊红细胞( s r b c ) 免疫的小鼠脾细胞悬液与一定量的s r b c 混合，在补体参 与下，使抗体分泌细胞周围的s r b c 溶解，形成肉眼可见的空斑。溶血空斑数大体反映 抗体分泌细胞数。如图4 1 所示，与空白对照组相比，中剂量组和高剂量组的溶血空斑 数( p v c ) 增加1 8 0 矛n1 2 7 ，差异极其显著( p o 0 1 ) ，低剂量组的溶血空斑数差异不明 显。以上表明黄酒浓缩物对体液免疫有促进作用，能够促进b 细胞增殖。中剂量为最 适剂量。 浙江大学硕士学位论文 4 3 3 血清溶血素 兰 面 u a 分组 图4 1 抗体生成细胞检测各实验组空斑数 用s r b c 免疫动物后，产生抗s r b c 抗体( 溶血素) ，与s r b c 一起孵育，在补体参与 下，可发生溶血反应，释放血红蛋白，通过测定血红蛋白含量反映动物血清中溶血素的 含量。表4 2 所示是各试验组的h c * 值。经方差分析以及t u k e y 法多重比较表明( 图4 2 ) ， 与空白对照组相比，各剂量组溶血素增加，低剂量和高剂量差异极其显著( p o 0 1 ) ，中 剂量差异较显著( p o 0 5 ) 。以上表明黄酒浓缩物v c 能够有效促进小鼠的血清溶血素的 合成，提高机体的体液免疫功能。 表4 2 各实验组的半数溶血值h c 。( m e a n ，n = l o ) 工 分组 与空白对照组相比，表0p o0 1 ，+ 表爪p o0 5 图4 2 各实验组半数溶血值h c 。的统计分析 2 7 。两圈。函豳圈鏖囱纳 1刮f丑 浙江大学硕士学位论文 4 3 4 d t h 分析 d t h 是反应t 细胞功能的指标之一。从表43 可以看出，与空白组相比，实验组小鼠 免疫前后左后足跖部厚度有所下降，但是方差分析以及t u k e y 法多重比较没有统计学上 差异。因此黄酒浓缩物对小鼠足跖增厚效果不明显，对正常小鼠特异性细胞免疫功能没 有影响。 表4 3 免疫前后小鼠左后足跖部厚度( m e a n ，n = 1 0 ) 4 3 5 腹腔巨噬细胞吞噬功能 巨噬细胞对光滑表面如玻璃表面具有粘附的特性，将含有巨噬细胞的腹腔液滴于载 玻片上，加入鸡红细胞，孵育一定时间后，冲洗掉无粘附力或粘附力差的细胞，固定染 色，获得以巨噬细胞为主的标本，在显微镜下计数吞噬鸡红细胞的巨噬细胞的百分比和 吞噬指数，据此判定巨噬细胞的吞噬能力。表4 4 是小鼠腹腔巨噬细胞吞噬功能的实验 结果，由吞噬百分率和吞噬指数表示。通过方差分析以及t u k e y 法多重比较，由图4 3 可以看出，就吞噬百分率来看，与空白对照组相比，中剂量组表现出差异( p 0 0 5 ) ，高 低剂量组无显著差异：吞噬指数空白对照组和各剂量组无显著差异。总体上说，黄酒浓 缩物对小鼠腹腔巨噬细胞吞噬功能影响不显著。 表4 4 小鼠腹腔巨噬细胞吞噬功能实验结果 浙江大学硕士学位论文 与空白对照绢相比表示p 00 1 表示p 00 5 图4 3 小鼠巨噬细胞吞噬功能结果分析 4 3 6 小鼠胸腺指数和脾指数 实验过程中，黄酒浓缩物没有表现出任何毒性和致死率，空白对照组和各剂量组的 小鼠体重没有明显差异( 表4 5 ) 。同时与空白对照组相比，各剂量组胸腺指数无统计学 差异：在脾脏指数上，中剂量组和高剂量组比空白对照组增加了1 4 年h3 1 ，差异极 其显著( p 0 0 1 ) ，低剂量组与空白对照组差异不明显，同时黄酒浓缩物对小鼠脾脏指数 上表现出剂量效应。 表4 5 黄酒浓缩物v c 对小鼠胸腺指数和脾脏指数的影响( m e a n + s d ，n = 1 0 ) 与空白对照组相比，”表示p 0 0 1 ，4 表示p 0 0 5 威圈函豳圈函豳图一飘 卜 磊 1j11j 嘲 啡 呲 l 詈 鹾靼锑雌 函图撇最豳霞藤图 门u 一 浙江大学硕士学位论文 4 4 讨论 机体的细胞免疫功能主要由t 淋巴细胞负责，t 细胞受抗原刺激后，增殖分化为致 敏淋巴细胞，致敏淋巴细胞再遇到相同抗原时，通过直接杀伤和释放淋巴因子发挥的免 疫效应。免疫功能的强弱很大程度上由t 细胞功能来体现。t 细胞增殖试验是反映t 细 胞功能的重要指标【9 ”。迟发型过敏反应( d t h ) 是依赖细胞免疫的，与机体细胞免疫能 力相一致 9 8 】。实验结果表显示，黄酒浓缩物对t 细胞增殖和d t h 影响不显著。因此黄 酒浓缩物对机体细胞免疫功能影响不显著。 b 淋巴细胞受抗原刺激后增殖分化为浆细胞，浆细胞产生并与分泌抗体发挥的免疫 效应，由于抗体存在于血清等体液中，所以有抗体参与的特异性免疫，称为体液免疫。 溶血空斑和血清溶血素水平的测定都是体外衡量i g m 等i g 抗体形成细胞的一种方法【9 ”。 由实验结果可知，黄酒浓缩物能够显著促进正常小鼠脾脏抗体形成，能够显著提高正常 小鼠溶血素水平。从上面两个方面可以看出，黄酒浓缩物通过对抗体的合成的影响而发 挥其对体液免疫的调节作用，具有增强体液免疫的效果。 免疫器官的脏器指数以及巨噬细胞吞噬功能反映了机体的非特异性免疫水平i l ”】。 胸腺为中枢淋巴器官，是免疫细胞发生、分化和成熟的场所，对外周免疫器官的发育起 主导作用；脾脏为外周淋巴器官，使各种免疫细胞居住增殖并进行免疫应答及产生免疫 效应物质的重要基地，具有重要的免疫功能。脏器指数上升，提示对脏器有选择性刺激 增生作用，其机制可能为引起免疫器官活性细胞发生增生反应。实验结果发现黄酒浓缩 物能显著促进小鼠脾脏的发育，对胸腺发育没有影响。巨噬细胞在集体防御系统中起第 一道防线的作用，外来的致病因子或体内突变的细胞首当其冲最先受到巨噬细胞的防 御。实验结果证明黄酒浓缩物能增加巨噬细胞的吞噬功能有一定增强作用，但是不显著， 只有中剂量组的表现统计学差异。本实验的脏器指数和巨噬细胞吞噬功能实验表明黄酒 浓缩物能够提高小鼠的非特异性免疫。 综上所述，研究黄酒对小鼠的免疫功能的影响。实验发现黄酒能显著提高小鼠的脾 指数、促进小鼠抗体生成细胞的形成，提高溶血素水平，因此认为黄酒能促进小鼠的体 液免疫功能和非特异性免疫。对小鼠脾淋巴细胞的增殖促进作用不明显、对小鼠足跖增 厚影响不明显，。因此认为黄酒对小鼠的细胞免疫功能影响不明显。 浙江大学硕士学位论文 5 1 实验材料 第五章对代谢功能的影响 i c r 小鼠，6 8 周龄，体重2 0 2 2 9 ；s d 大鼠，体重2 2 0 2 5 0 9 ，由浙江省医学科学 院实验动物中心提供：黄酒由绍兴古越龙山黄酒有限公司提供；血清钙测定试剂盒，血 清磷测定试剂盒，g p t 检测试剂，宁波市慈城生化试