（生物化学与分子生物学专业论文）铝胁迫下玉米基因表达谱分析.pdf

ip i i ii i i ii iii i i ii ii ii i i i n l l i i i i i i i l l l l l l l l l li i i i i i i i i i i l l l l il l irilil 广西大学学位论文原创性声明和使用授裂0 臼8 1 7 3 6 5 原创性声明 本人声明：所呈交的学位论文是在导师指导下完成的，研究工作所取得的成果和 相关知识产权属广西大学所有，本人保证不以其它单位为第一署名单位发表或使用本 论文的研究内容。除已注明部分外，论文中不包含其他人已经发表过的研究成果，也 不包含本人为获得其它学位而使用过的内容。对本文的研究工作提供过重要帮助的个 人和集体，均已在论文中明确说明并致谢。 论文作者签名：阵乃云 亨年6 月乙9 日 学位论文使用授权说明 本人完全了解广西大学关于收集、保存、使用学位论文的规定，即： 按照学校要求提交学位论文的印刷本和电子版本： 学校有权保存学位论文的印刷本和电子版，并提供目录检索与阅览服务； 学校可以采用影印、缩印、数字化或其它复制手段保存论文； 在不以赢利为目的的前提下，学校可以公布论文的部分或全部内容。 请选择发布时间： 口即时发布囤解密后发布 ( 保密论文需注明，并在解密后遵守此规定) 尊文作者签名：阪呖导师签名：考锣幺捌年勿月w 日 铝胁迫下玉米基因表达谱分析 摘要 在酸性土壤中，铝毒是植物生长最大的毒害之一，而且世界上有大约 4 0 的潜在耕地是酸性土壤。玉米三叶期是对渗透胁迫较敏感的重要生理时 期，本研究采用水培的方法，培养了三叶期的玉米幼苗，经过o 5 m ma i c l 3 处理后，利用e d n a 阵列杂交技术，研究了玉米叶与根的基因表达谱变化。 研究结果表明： 1 ) 在铝胁迫下玉米叶和根有不同的基因表达谱。在叶子部分，共鉴定 出1 1 3 个差异表达基因，单独上调表达基因7 8 个，单独下调表达基3 5 个， 其中有5 个是在不同时间点差异表达；根中共鉴定出8 6 个差异表达基因， 单独上调表达基因5 6 个，单独下调表达基因2 9 个，还有1 个是在不同时 间点同时上下调差异表达。在去胁迫4 8 h 时，叶子中鉴定出1 5 个差异表达 基因，根部鉴定出9 4 个差异表达基因。 2 ) k m e a n s 均值聚类表明铝胁迫及其撤胁迫叶和根组织有不同的基因 表达模式。 3 ) 在叶和根胁迫以及去胁迫响应的有g o 功能分类基因中，分别有4 6 7 和5 6 9 的基因是与催化活性相关的：表明铝胁迫对玉米生长过程中需 要催化功能的各种生理反应有很大影响。 4 ) 利用m a p m a n 软件对部分差异表达基因的代谢途径分析，表明相应 功能的基因有着对应的代谢路径功能作用位点。 本研究鉴定出许多差异表达基因，有利于了解玉米在铝胁迫时的分子 应答机制，为提高重要农作物的抗逆性提供分子探针；而鉴定出的许多未 知功能基因，为新基因新机制的发现提供了研究的基础。 关键词：玉米铝胁迫c d n a 阵列基因表达谱代谢途径 n g e n ee x p r e s s i o np r o f i l e so fm a i z e u n d e ra l u m i n u ms t r e s s a b s t r a c t a l u m i n u mt o x i c i t yi so n eo ft h em o s td e l e t e r i o u sf a c t o r sf o rp l a n tg r o w t hi n a c i d i cs o i l sb e c a u s eo v e r5 0 o ft h ew o r l d sp o t e n t i a l l ya r a b l el a n d sa r ea c i d i c m a i z ea tt h r e e 1 e a f - p h a s ei sav e r ys e n s i t i v ep h y s i o l o g i c a ls t a g et oi n f il t r a t i o n s t r e s s i nt h i ss t u d y , w eu s e dw a t e rc u l t u r em e t h o dp l a n t e dt h r e e l e a f - p h a s e m a i z es e e d l i n g ，a f t e rt r e a t e db y0 5 m ma i c l 3 ，e d n aa r r a yt e c h n o l o g yb eu s e d t os t u d yg e n ee x p r e s s i o np r o f i l e so fl e a fa n dr o o tt i s s u e sb ya l u m i n u ms t r e s s t h er e s u l t si n d i c a t et h a t ： 1 ) l e a fa n dr o o th a v ed i f f e r e n tg e n ee x p r e s s i o np r o f i l e s 1 13d i f f e r e n t i a l p r e s s i o ng i d e n t i f i e di nl e a f , 7 8 o n l 一r e g u l a t e d 3 5g enesexoresslong e n e sw e r el d e n t l l e di nl e a t g e n e so n l yu pr e g u l a t e o , g e n e s - d o w n r e g u l a t e d ，a n d5g e n e sr e g u l a t e ds i m u l t a n e o u s l ya t d i f f e r e n tt i m ep o i n t t o t a l8 6d i f f e r e n t i a l e x p r e s s i o ng e n e sw e r e i d e n t i f i e di nr o o t ，5 6g e n e s u p r e g u l a t e da n d2 9g e n e sd o w n r e g u l a t e d ，b u t 1g e n er e g u l a t e du p r e g u l a t e d a n dd o w n r e g u l a t e ds i m u l t a n e o u s l ya td i f f e r e n tt i m ep o i n t 15g e n e sw e r ea l s o i d e n t i f i e di nl e a fa n d9 4g e n e si nr o o td i f f e r e n t i a l l ye x p r e s s e d 2 ) k m e a n sc l u s t e ra n a l y s i si n d i c a t e dt h a tl e a f a n dr o o th a v ed i f f e r e n tt y p e s i l i o f g e n ee x p r e s s i o nc h a n g e s 3 ) u n d e ra l u m i n u ms t r e s sa n dr e m o v a lo f a l u m i n u ms t r e s s ，i nl e a fa n dr o o t t i s s u e ss e p a r a t eh a v e4 6 7 a n d5 6 9 g e n e sw h i c hh a v ef u n c t i o n a lc a t e g o r i e s r e l a t i v et oc a t a l y t i ca c t i v i t y 4 ) w ea n a l y s e dm e t a b o l i s mp a t h w a y so fp a r t i a ld i f f e r e n t i a le x p r e s s i o n g e n e sb yu s i n gm a p m a ns o f t w a r e ，i n d i c a t e dt h a tr e s p o n s eg e n e sh a v er e l a t i v e f u n c t i o n a ll o c a t i o ni nt h ep a t h w a y s a c c o r d i n g t ot h es t u d i e s ，i tw a su n d e r s t o o dm o l e c u l a rr e s p o n s em e c h a n i s m w h e nm a i z eu n d e ra l u m i n u ms t r e s s ，a n di m p r o v e dm o l e c u l a rp r o b e s o f i m p o r t a n tp l a n ta d a p t a t i o nb yi d e n t i f i e dag r e a tm a n yo f d i f f e r e n t i a le x p r e s s i o n g e n e s i tw o u l d o f f e rf u n d a m e n t a lr e s e a r c hi nf i n d i n gm e c h a n i s mo fn e wg e n e s w h i c hh a db e e ni d e n t i f i e dag r e a tm a n yo fu n k n o w nf u n c t i o n a lg e n e s k e y w o r d s ：m a i z e ；a l u m i n u ms t r e s s ；e d n aa r r a y ；g e n ep r o f i l e ；p a t h w a y i v 目录 第一章前言1 1 1 立题依据。l 1 2 铝对植物的毒害1 1 2 1 铝毒使植物根系、茎部和叶片生长停止，功能坏死2 1 2 2 对养分的吸收和代谢的影响2 1 3 铝毒害的机制3 1 3 1 砧3 + 与细胞骨架的作用3 1 3 2 铝毒诱导细胞死亡机制3 1 3 3 铝毒诱导细胞壁反应。3 1 4 植物抗铝毒机理4 1 4 1 细胞壁对铝的固定与质膜对铝的选择透性4 1 4 2p h 屏障与分泌无机磷及有机螯合剂4 1 4 3a 1 3 + 的跨膜外流5 1 4 4 细胞内溶物质的螯合与液泡的分隔化以及诱导耐铝酶系的形成5 1 5 植物抗铝基因工程的研究6 1 6 表达序列标签( e s t ) 技术及其应用6 1 6 1 表达序列标签( e s t ) 的概念6 1 6 2e s t 技术的应用7 1 7 基因芯片技术及其应用9 1 7 1 基因芯片技术原理9 1 7 2 基因芯片的分类9 1 7 3d n a 微阵列的应用1 0 1 8 研究目的1 2 第二章材料与方法1 3 2 1 材料13 2 1 1 玉米材料13 i 2 1 2 溶液配方和主要试剂1 3 2 2 方法1 4 2 2 1 玉米幼苗培养及其胁迫处理1 4 2 2 2i 矾a 抽提l5 2 2 3c d n a 阵列的制备1 5 2 2 4c d n a 阵列杂交探针的制备1 6 2 2 5c d n a 阵列的杂交和数据提取1 7 2 2 6c d n a 阵列杂交数据分析1 9 2 2 7 差异表达基因的代谢途径( p a t h w a y ) 分析方法2 0 第三章结果与分析一2 4 3 1 用于制备c d n a 阵列杂交探针的玉米总r n a 的提取2 4 3 2c d n a 阵列杂交信号数据分析2 5 3 3 叶和根在铝胁迫下表达谱的比较分析2 8 3 4 铝胁迫下不同功能类别基因的响应3 9 3 4 1 叶中功能基因的响应3 9 3 4 2 根部功能基因的响应3 9 3 5 撤胁迫4 8 h 不同功能类别基因的响应3 9 3 5 1 叶中功能基因的响应3 9 3 5 2 根部功能基因的响应4 0 3 6 差异表达基因功能分析4 1 3 6 1 与光合作用相关的差异表达基因功能分析4 1 3 6 2 铝胁迫与撤胁迫下与催化活性相关基因的响应4 4 3 6 3 铝胁迫与撤胁迫下与核酸结合相关基因的响应4 8 3 6 4 铝胁迫与撤胁迫下其他基因的响应4 9 3 7 差异表达基因代谢途径( p a t h w a y ) 分析5 l 3 7 1 叶中差异表达基因代谢途径分析结果5 l 3 7 2 根部差异表达基因代谢途径分析结果5 7 第四章结论与讨论6 0 4 1c d n a 阵列的制备6 0 4 2 铝胁迫对三叶期玉米光合响应基因调节6 0 i i 4 3 讨论6 1 参考文献。6 2 附j 畏71 附录l 两张相同e d n a 阵列与e d n a 探针杂交的重复性检验r 2 图7 l 附录2 荧光定量p c r 引物序列7 5 j l | 【谢7 6 攻读硕士学位期间发表的学术论文7 7 铝胁迫下玉米基因表达谱分析 1 1 立题依据 第一章前言 玉米作为全球重要的粮、经、饲三元作物，在维护粮食安全、促进畜牧业发展以及 为淀粉加工业提供原料上具有举足轻重的重要作用。随着全球人口增加与人们生活水平 的提高，全球对玉米的需求将会急剧增加。目前，酸性土壤占全世界耕地土壤的4 0 ， 主要分布在热带及亚热带地区【l 】特别是发展中国家。大约8 0 0 万h m 2 玉米生长在酸性 土壤上，我国也有占全部播种面积3 0 左右的玉米生长在酸性土壤上，尤其是在我国南 部地区。铝并非植物矿质营养中的必需元素，微量的铝( 3 1 3 9 9 m 1 ) n - i 刺激一些植物的生 长，但浓度偏高便会发生毒害。在酸性条件下( p h 5 ) ，土壤中的铝常以毒害的活性铝 形式存在，对环境产生影响1 2 1 ，对植物根系的毒害作用也最大【3 1 。 由于受地带性生物气候条件的影响，加之环境污染导致的酸雨问题加重，铝离子毒 害已经成为我国南方作物生长主要的限制因子之一。在酸性土壤中，由于铝的交换量占 土壤阳离子交换总量的2 0 8 0 ，导致土壤中阳离子易于淋失，致使钾、钙、镁、硼、 钼等营养元素缺乏，每年导致作物约减产2 0 8 0 t 4 1 。因此，提高玉米产量将是全球长 期面临的任重而道远的任务。在种植面积无法增加、化肥施用量已近极限、水资源短缺 不可逆转的形势下，充分发挥遗传资源的巨大潜力，提高玉米单产才能满足日益对玉米 需求的增加。通过遗传改良提高玉米产量可以从两方面入手：一是直接提高产量的遗传 潜力；另一方面通过改良对各种非生物和生物胁迫因素的抗逆性。近年来，后者的潜力 和可行性受到广泛的关注和重视。可见，选育栽培具有抗铝毒能力的作物具有重要意义。 因此，研究玉米对酸性土壤铝毒环境的适应性及其机制，弄清楚铝胁迫对玉米生产的影 响及在铝胁迫下的适应及其调节机制成为目前研究的重点。 1 2 铝对植物的毒害 酸性环境中铝可对植物产生毒害作用，铝可与蛋白质结合，也可与脂质、糖类、核 酸等结合，干扰植物细胞内一些离子代谢，影响各种生理生化过程正常进行，从而抑制 广西大掌硕士学位论文铝胁追下玉米基因表这谱分析 植物的生长发育。 1 2 1 铝毒使植物根系、茎部和叶片生长停止，功能坏死 铝毒最明显的外在表现是根系和地上部生长受阻。具体为根主轴伸长受到抑制，根 尖、侧根粗短而脆，呈褐色，根毛减少，根尖表皮细胞体积变小，表皮和外皮层细胞受 到破坏，根冠脱落【5 】。 铝毒影响细胞分裂，对细胞分裂期间d n a 复制有直接抑制作用【6 ：7 】。铝与d n a 结 合，增加d n a 双螺旋结构的稳定性，阻止了d n a 的复制，影响细胞的分裂阴。 1 2 2 对养分的吸收和代谢的影响 铝毒影响植物营养成分的吸收与代谢，其主要表现为：抑制c a 2 + 、k + 等离子的吸收 以及影响酶的活性和和破坏膜的结构。 细胞内的钙是维持细胞结构和功能的重要元素，铝和钙的相互作用将会影响植物的 正常生理功能。a 1 3 + 通过与膜上特殊通道受体结合位点结合，阻碍c a 2 + 在膜上的整合， 影响c a 2 + 跨膜运输的g t p 蛋白活性，降低原生质体c a 2 + 通道的流量，从而导致c a 2 + 外 流量增加【8 】；铝毒抑制根系对k + 的吸收，降低植物根系和地上部钾的含量，a 1 3 + 是阳离 子通道阻断剂，可阻断小麦根细胞的k + 和c a 2 + 通道，长时间阻断k + 通道，会导致地上 部出现缺钾症状 9 1 。 植物体的细胞壁具有很强的积累阳离子的能力。砧”主要与细胞壁的成分相结合， 影响植物正常的代谢活动【i o l 。如可以与细胞壁的胶质、蛋白质等成分相结合，降低细胞 壁的弹性及导水性，影响植物的生长；可与细胞质膜的脂质【l l 】及膜蛋白结合，影响膜的 结构和功能。 铝可与a t p 形成m a t p 复合物，使植物细胞能量代谢过程受限制。s u l l a y d a 等从 玉米根部分离出质膜微粒，用铝处理后发现m 9 2 + a t p a s e 和k + m 9 2 + a t p a s e 活性下降， 质膜的结构受到破坏，其可能机制是a l ”与酶底物a t p 结合形成a 1 3 + a t p 复合物，限 制了酶与底物复合物的形成【1 2 l 。 铝可与与细胞内其它的功能蛋白结合，影响它们的活性。如它可与钙调蛋白( c a m ) 结合，改变其结构并对其功能产生影响【1 3 1 ，也可与酶蛋白结合，影响酶活性。 2 广西大学硕士学位论文 铝胁迫下玉米基因表达谱分析 1 3 铝毒害的机制 1 3 1a 1 3 + 与细胞骨架的作用 细胞骨架主要由微管和微丝组成，在许多细胞功能如细胞分裂、细胞增大、细胞壁 的合成、细胞器的移动以及根的形态建成等方面起着重要的作用【1 4 1 。有些研究表明a 1 3 + 会诱导大豆根悬浮细胞肌动蛋白网硬化1 1 5 】。 1 3 2 铝毒诱导细胞死亡机制 铝毒诱导细胞死亡的机制现已成为研究热点【1 6 1 。有些人认为，铝主要抑制根尖分生 组织的细胞分裂。根系在铝处理后几小时内细胞分裂就停止，以后虽然又恢复分裂，但 细胞分裂的速度要比未经铝处理的低1 1 7 】。m e g a w a 等用铝处理烟草悬浮细胞时发现，在 铝处理过程中或铝处理后无铝恢复培养过程中，细胞生长受到很大抑制，并伴随大量的 细胞死亡。因此，他们推测铝毒引起的细胞生长抑制很可能是通过铝诱导细胞死亡来实 现的【埔j 。最近还有一些报道表明，铝毒能诱导动植物细胞产生活性氧( r e a c t i v eo x y g e n s p e c i e s ，r o s ) 【1 9 御】，并激活一些氧化酶的活性【2 。低浓度的r o s 能提高植物细胞的抗 氧化防御机制，从而清除活性氧，使细胞不受伤害。但r o s 也可以氧化植物细胞内的 一些生物分子，使细胞受害甚至死亡。而r o s 的主要攻击目标是质膜和细胞器膜中的 不饱和脂肪酸，引起膜脂过氧化，膜透性增大，细胞内容物大量外渗，细胞发生死亡【2 2 l 。 因此，铝可通过诱导植物细胞产生r o s ，再由r o s 作为信号分子激发细胞程序性死亡 的信号传导途径。 1 3 3 铝毒诱导细胞壁反应 植物根尖细胞壁对铝的积累是铝对植物根尖产生铝毒的先决条件，是植物铝毒敏感 性的重要特征。所以铝离子如何结合到细胞壁上，并且是如何在细胞壁上起作用的，已 逐渐成为研究热点。一种观点认为由于细胞壁带负电荷，外源阳离子能通过离子交换的 形式结合到细胞壁上，细胞壁阳离子交换能力( c a t i o ne x c h 觚g ec a p a c i w ，c e c ) 越强，a l ” 结合到壁上越多，毒害就会越大【2 4 1 。另一种观点认为果胶( p c c t i n ) 是a l 结合到细胞壁的 主要位点f 2 ”。钙调蛋白( c a m ) 在植物的代谢中起着重要的调节功能，c a m 只有与c a 2 + 结合形成复合物才具有生物活性，c a m 与c a ”结合后激活靶酶，从而起到调节作用。 广西大掌硕士掌位论文 铝胁迫下玉米基因表达谱分析 而铝毒常引起c a 2 + 的吸收受抑制，由此必然影响c a m 的生物活性，进而影响植物的多 种生理生化过程，最终导致植物生长发育受阻【2 6 1 。 1 4 植物抗铝毒机理 植物抗铝毒机制可概括为外部排斥和内部解毒两方面。植物对铝毒的外部排斥机理 中，根系分泌物起了极其重要的作用。常见排斥机理有：细胞壁对铝的固定；质膜对铝 的选择透性；诱导产生p h 屏障；有机螯合剂和无机磷的分泌以及a l ”的跨膜外流。内 部解毒是指植物将吸收的铝转化为无毒或毒性较小的化合物，从而达到解铝毒的目的。 其机理有：细胞内溶物质的螯合作用、液泡的分隔化、形成铝结合蛋白、诱导耐铝酶系 的形成等机理达到缓解体内铝毒的目的。 1 4 1 细胞壁对铝的固定与质膜对铝的选择透性 在外部抗性中，细胞壁和细胞膜起着关键的作用。当处于铝胁迫条件下时，铝首先 与根细胞壁接触，植物细胞壁都具有很强的络合阳离子的能力。因此表皮细胞和叶肉细 胞的细胞壁与铝结合，阻止铝进入细胞内的作用位点。铝改变膜的透性是诱导葡聚糖的 合成，铝与膜的结合性质很可能与植物耐铝特性密切相关【2 7 1 。质膜是铝吸收的天然屏障， 铝的跨膜运输受质膜表面的电荷性质控制，质膜表面电荷性质能调节铝的跨膜运输以及 质膜本身对铝的敏感性。质膜表面强负电性会使带正电荷的铝离子强烈结合在膜上，从 而使膜结构对a 1 3 + 更加敏感【2 钔，减小了a 1 3 + 的毒害。耐铝品种铝对根细胞的破坏只局限 在根尖和外部的细胞，而敏感品种则是近轴的和上部的细胞也受到破坏【2 纠。 1 4 2p h 屏障与分泌无机磷及有机螯合剂 耐铝植物品种根际维持较高的p h 值，在根与土的界面形成一个p h 屏障，从而降 低铝的溶解度，而铝敏感性品种根际p h 较低，遭受较高的铝浓度胁迫和较大的毒害效 应。植物诱导根际产生p h 屏障可认为：p h 提高，引起铝的水解和聚合反应，从而形成 毒性较小的化合物。溶解度较低的铝化合物在近中性p h 条件下，形成微溶性的 a i ( o h ) 3 3 h 2 0 ；在溶液中有磷存在时形成a i ( o h ) 2 h 2 p 0 4 沉淀或p h 提高而产生铝的聚 合反应，均可降低铝单体在溶液中的活度【3 们。植物诱导产生p h 变化在品种问的差异具 4 广西大学硕士学位论文铝胁追下玉米基因表达谱分析 有一定的生物学和生态学意义。谢正苗等人研究证实，假苹婆( s t e r c u l i al a n c e o l a t a 工) 、 大罗伞紫金牛似r d i s i ac r e ，】a t a 三) 、相思树( a c a c i a f o j rm o s al ) 和红楠( m a c h u s 砌甜刀6 p ，g f f 工) 等铝排斥植物通过使净o h 根离子流出根系，增加根系土壤p h ，使铝通过沉淀和络 合在根际土壤中积累，最终把铝排斥在根系之外3 1 ：3 2 1 。 铝毒胁迫条件下，根分泌的无机磷在根表面或根际中形成a 1 p i 复合物，从而减少 a l 计的毒性【3 3 j 。 根系分泌物特别是低分子量的有机酸在缓解铝毒方面具有重要作用：这些物质在根 际或根表面与a 1 3 + 形成有机复合体，降低其毒性；同时，根系分泌的粘胶物质能有效阻 止铝对根系的直接毒害作用 3 4 1 。根系分泌的有机酸主要有柠檬酸、苹果酸、磷酸、草酸、 氨基酸和糖类【8 ；3 5 ；3 6 1 ，柠檬酸、草酸等能与铝形成稳定的5 或6 环状结构，是较强的铝 解毒剂。进一步的研究证实，柠檬酸与a 1 3 + 形成牢固的螯合结构，在铝解毒方面比苹果 酸更有效【3 7 1 。铝毒诱导有机酸的分泌是植物的一种普遍适应机制。 1 4 3a t 3 + 的跨膜外流 z h a n g 和t a y l o r 发现二硝基苯酚( d n p ) 处理能够增加耐铝小麦品种对a l ”的吸收， 对敏感品种则没有影响。d n p 能够使氧化磷酸化解偶联，破坏跨膜质子梯度，影响质膜 结构和透性【3 8 1 。r i n c o n 和g o n t _ m c s 发现氧化磷酸化抑制剂碳酰氰间氯苯腙( e a r b o n y l e y a n i d e m c h l o r o p h e n y 和蛋白质合成抑制剂放线菌酮增加了耐铝小麦品种根 尖细胞a 1 3 + 的含量，因而提出可能存在一种a 1 3 + a t p 酶将a 1 3 + 通过质膜运出细胞陬柏】。 1 4 4 细胞内溶物质的螯合与液泡的分隔化以及诱导耐铝酶系的形成 高耐铝植物能够积累大量的铝而不表现任何的毒害症状，是与其体内铝的存在形式 有关。如茶( c a m e m as i n e n s i s ) 叶片细胞中铝以儿茶酚舢3 + 的形式存在【4 ，绣球花 ( 枷僻口所口c 唧砂砌) 叶片中的铝主要以可溶性a 1 3 + 柠檬酸的形式存在【4 2 1 ，耐铝荞麦 ( f o g o p y r u mp s c 甜昆刀f 甜m ) 叶片中的铝主要以a 1 3 + 草酸的形式存在于细胞液中【8 2 1 ，植物细 胞溶质中螯合剂对铝的螯合作用可以有效地降低铝的活度从而降低对植物的毒害f 3 4 j 【4 l j 。 植物的耐铝性还可以通过把铝分隔在对铝不敏感的部位如液泡中完成【4 1 ：4 3 1 。核磁共 振技术检测表明，铝进入液泡后，与磷形成稳定的磷铝化合物沉淀，从而减轻铝的毒害 作用【州。 5 广西大掌硕士学位论文铝胁迫下玉米基因表达谱分析 铝诱导蛋白的合成可能也是作物的一种重要的内部耐铝机制。铝毒能诱导植株产生 低分子量螯合肽，并诱导耐铝酶系的形成【4 5 1 。 1 5 植物抗铝基因工程的研究 对植物耐铝的生理研究有利于提高在进行图谱的克隆时对目的基因的选择，为基因 组的研究奠定了良好的基础。 1 9 9 3 年，s n o w d e n 和g a r d n e r 首先从一个抗性和一个敏感小麦品种根尖内克隆出5 个受a 1 3 + 诱导的c d n a ，命名为w a l i l w a l i 5 。d el af u e n t e 等采用转基因手段将细菌 ( p s e u d o m o n a sa e r u g i n o s a ) 的柠檬酸合成酶基因在烟草x a n t t f i 体内过量表达，结果植物 的耐铝能力增强，这是人类首次采用转基因技术提高植物耐铝特性的尝试i 峒。 作为一种模式植物，小麦常作为铝毒和耐铝研究的材料。一些研究组已经对小麦中 铝诱导基因的表达作了研究【1 9 ：4 7 l 。近几年，m i l l a 等采用基于表达序列标签的基因表 达分析对黑麦中的铝诱导基因作了详细地介绍。然而，由于有成千上万的基因表达，这 使得我们要分离目的基因变得极其困难。为了克服这种困难，我们可以通过比较对照处 理和铝处理基因表达的差异来大大缩小选择范围，这可通过几种方法如基因芯片等能同 时分析几千个转录产物的技术实现。 1 6 表达序列标签( e s t ) 技术及其应用 1 6 1 表达序列标签( e s t ) 的概念 近年来，随着人类基因组计划在世界范围内的开展，使人类对生命奥秘的探索迈向 了新纪元。真核生物基因组庞大，其中仅有2 - 3 的序列编码基因，如人的基因组由3 1 6 亿个碱基对组成，约有2 的序列编码3 3 万个基因【4 9 1 ；玉米基因组大小约为5 0 亿个碱 基对，编码约3 5 万个基因。 e s t ( e x p r e s s e ds e q u e n c et a g s ，表达序列标签) 是c d n a 的部分序列，平均长度为 1 5 0 5 0 0 b p 。1 个e s t 代表生物体某种组织某一时期的1 个表达基因。e s t 技术是将m r n a 反转录成c d n a 并克隆到载体构建成e d n a 文库后，大规模随机挑选c d n a 克隆，对 其5 或3 端进行测序，所获序列与基因数据库已知序列比较，从而获得对生物体生长发 育、繁殖分化、遗传变异、衰老死亡等一系列生命过程认识的技术【5 0 1 。 6 广西大学硕士掌位论文铝胁迫- i r 玉米基因表达谱分析 近年来，随着各种生物e s t 计划的不断开展，来源于不同物种、不同组织、不同细 胞类型和不同发育阶段的表达基因序列的数目急剧上升。例如，1 9 9 1 年各个公共数据库 中的e s t 数目不足2 0 0 0 条，而截止到2 0 0 8 年5 月3 0 日，n c b i ( h t t p ：w w w n c b i h i m i l i h g o v ) 的d b e s t 数据库中共积存的e s t 数量为5 2 ，8 5 8 ，7 6 6 条， 其中玉米的e s t 数量为1 , 4 6 2 ，6 1 4 条，水稻的e s t 数量有1 , 2 2 0 ，8 7 6 条，小麦的e s t 数 量是1 , 0 5 1 ，4 6 5 条，拟南芥的e s t 数量为1 , 5 2 6 ，1 3 3 条 ( h t t p ：w w w n c b i n l m n i h g o v d b e s t d b e s t 。目前， 技术已经逐渐_ s u m m a r y h t m l )e s t 成为在特定组织和发育阶段研究基因表达的有效手段【5 1 ；5 2 ；5 3 1 。 其中主要有以下几个方面的应用。 1 6 2e s t 技术的应用 1 6 2 1 构建遗传图谱 遗传图谱( g e n e t i cm a p ) 又称连锁图谱( 1 i n k a g em a p ) 或者遗传连锁图谱( g e n e t i cl i n k a g e m a p ) ，是指基因组内基因以及专一的多肽性d n a 标记( m a k e r ) 相对位置的图谱，其标记 有r f l p 、m i c r o s a t e l l i t e s 和s n p 等。 构建遗传学图谱构建染色体物理图谱需要大量的单拷贝短序y l j ( s e q u e n c et a g g e d s i t e ，s t s ) 作为路标，e s t 可以用来充当路标来构建物理图谱【5 4 1 。同样e s t 也可以作为 分子标记，用来构建遗传连锁图谱。h a r u s h i m a 等用两个水稻品种n i p p o n b a r e 和k a s a l a t h 杂交的f 2 代1 8 6 个植株构建有2 2 7 5 个标记的高密度连锁图，其中1 4 4 5 个标记是e s t 5 卯。 1 6 2 2 分离与鉴定新基因 e s t 技术使基因克隆发生革命性变革，e s t 本身为表达基因的产物，用其取代c d n a 全长的筛选、基因组序列的鉴定等繁琐的实验操作，提高了工作效率。将e s t 所获数据 用生物信息学的方法直接与各公共数据库进行比较，可迅速和准确地确定基因功能。 利用e s t 发现基因的典型例子是分离参与合成不饱和脂肪酸生物合成的酶类基因。 v a nd el o o 等第一次成功地应用e s t 方法分离到蓖麻油酸( 1 2 羟基油酸) 生物合成的关键 酶基因【5 6 1 。 利用e s t 方法进行发现、分离基因的研究，不仅是人类基因组研究的热点，而且是 植物基因组研究的重要内容。但是由于植物基因数据库相对较小，e s t 研究中有相当一 7 铝胁追- - i r 玉米基因表达谱分析 部分为未知基因。随着植物基因功能鉴定工作的不断进行，利用同源比较分析基因功能 将成为未来鉴定基因功能的主要方式。 1 6 2 3 比较基因组学研究 植物比较基因组学研究是从比较不同植物的遗传图谱开始的，e s t 技术在比较基因 组学中的应用主要是进行种间同源性分析。利用e s t 中古老保守序列来研究物种之间的 进化关系【5 7 1 ，可以避免选择家系、构建群体、大量的统计分析等周期长而繁琐的遗传图 谱制作过程，其结果更加准确。利用基因组较小的模式生物( 如拟南芥) 已知功能基因 与作物的e s t 进行比较，从而推测其e s t 功能。 1 6 2 4 基因差异表达的研究 生物的生长、发育、代谢、繁殖和死亡等都由基因来控制表达，基因的表达有时空 的特异性。而e s t 技术通过对e d n a 文库随机挑选克隆进行大规模测序，可直接回答 特定组织细胞在某一时期哪些基因表达了，丰度如何等问题，从而能在基因整体水平研 究相关的功能及代谢。 w h i t e 等对发育中的拟南芥种子的1 0 5 0 0 条e s t 进行了分析，他们所得到的e s t 的4 0 为新基因，表明拟南芥种子与其他组织中的转录本不同。种子中脂类生物合成酶 基因的丰度是拟南芥非种子组织中的2 5 倍侧。o h l r o g g e 等将这些e s t 数据分析与微阵 列分析结合起来，揭示了几百个在种子中高度特异表达的新基因，从而为研究油菜籽特 异代谢调控提供了候选基因【5 9 1 。目前植物e s t 研究发展较快，基因表达谱的研究更是 其中的热点，它也广泛应用于玉米的基因表达谱的研究【鲫。 1 6 2 5 用于制备d n a 芯片 0 d n a 芯片技术是在功能基因组学发展的基础上出现的，同时也大大促进了基因组学 的发展，成为目前功能基因组学的重要研究手段。e s t 是用于制备d n a 芯片很好的基因 资源1 6 i 】，而芯片技术同样也是目前高通量筛选e s t 的有效方法。目前，利用e s t 带t 作玉 米e d n a 芯片并广泛应用到玉米基因表达的研究中，有利于进一步研究胁迫下的基因表 达情况。 虽然e s t 技术功能强大，广泛应用于基因组学研究上，但是还有一定的局限性。 e s t 仅仅是一个基因的部分序列，所以它代表的基因组信息不全，一些调控序列、内元 序列等在基因表达调控中起重要作用的信息不能体现出来f 6 2 】；e s t 是随机对大量c d n a r 广西大学硕士学位论文铝胁迫下玉米基因表达谱分析 文库克隆进行测序，高、中表达丰度基因的e s t 存在冗余性，重复测序造成了对人力和 物力的浪费，并且低丰度表达基因容易漏挑取到。随着更多e s t 数据的获得，更多己知 功能基因的累计，通过d n a 芯片技术可以直接研究基因的结构和功能关系。 1 7 基因芯片技术及其应用 基因芯片又称d n a 芯片，是一类重要的生物芯片。它是把大量已知序列探针集成 在一张基片上，然后把若干经过标记的靶基因序列与微阵列上的序列探针杂交。通过检 测已杂交的探针，便可根据碱基互补配对的原理确定靶基因的序列，从而获得细胞或组 织的大量基因表达信息，实现对基因表达信息的同步大规模快速检澳1 j 1 6 3 ；6 4 ；6 5 ；6 6 1 。 1 7 1 基因芯片技术原理 基因芯片技术是建立在基因探针和杂交测序技术上的一种高效快速的核酸序列分 析手段。它将大量的基因探针有序地、高密度地排列在一块1 - 2 c m 2 大小的玻片或胶片 上，形成可与目的分子相互作用的固相表面，然后与标记的样品进行杂交，通过检测杂 交信号的强度及分布来进行分析。它与其他分析基因表达谱的技术，如e d n a 文库序列 测定等的不同之处在于，基因芯片可以在一次试验中同时平行分析成千上万个基因。 1 7 2 基因芯片的分类 根据基因芯片所用基因探针的类型不同，可分为两种类型：寡聚核苷酸微阵y u ( o l i g o n u e l e o t i d em i c r o a r r a y s ，g e n ec h i p s ) 和e d n a 片段微阵歹i j ( c d n af r a g m e n tm i c r o a r r a y s ) 。而 e d n a 微阵列是将大量经过3 端或5 端测序的c d n a 经扩增后点在尼龙膜等聚合物基片 上或玻璃片等刚性光学基片上而制成。与其他传统的基因检测技术相比，基因芯片技术 的最大特征在于能同时定量或者定性地检测成千上网的基因信息。 根据功能基因芯片可分为基因表达谱芯片和d n a 测序芯片两类。基因表达谱芯片 可以将克隆的成千上万个基因特异的探针或其e d n a 片段固定在一块d n a 芯片上，对 来源于不同的个体、组织、细胞周期、发育阶段、分化阶段、病变的细胞内m r n a 或 者反转录后产生的e d n a 进行检测，从而对这些基因表达的个体特异性、组织特异性等 进行综合分析和判断，迅速将某个或几个基因与疾病联系起来，极大地加快这些基因功 9 铝胁追下玉米基因表达谱分析 能的确定，同时可进一步研究基因与基因间相互作用的关系。d n a 测序芯片则是基于 杂交测序发展起来的，其原理是任何线状的单链d n a 或者r n a 序列均可分解成一系列 碱基数固定、错落而重叠的寡核苷酸，又称亚序列( s u b s e q u e n c e ) ，如能把原序列所有 这些错落重叠的亚序列全部检测出来，就可据此重新组建出原序y i , j 6 7 。目前应用最为广 泛的生物芯片是基因表达谱芯片。 1 7 3d n a 微阵列的应用 1 7 3 1 基因表达水平的检测 d n a 芯片的应用方面，目前最成功的例子就是基因表达的研究。人们已经比较成 功地对多种生物包括拟南芥、酵母及人的基因组表达情况进行了研究，并且用该技术( 共 1 5 7 ，1 1 2 个探针分子) 一次性检测了酵母几种不同株问数千个基因表达谱的差异【6 剐。 s c h e n a 等采用拟南芥基因组内共4 5 个基因的c d n a 微阵y 0 ( 其中1 4 个为完全序列，3 1 个为e s t ) ，检测该植物的根、叶组织内这些基因的表达水平1 6 9 1 。用不同颜色的荧光素 标记逆转录产物后分别与该e d n a 微阵列杂交，发现该植物根和叶组织中存在2 6 个基 因的表达差异，而参与叶绿素合成的c a b l 基因在叶组织较根组织高5 0