（生物化学与分子生物学专业论文）纤维素酶的纯化及固定化研究.pdf

沈阳学业大学硕士学位论文 摘要 纤维素酶是降解纤维素的一组酶的总称，是起协同作用的多组份酶系， 从被发现起就受到世界各国生物界的重视。现在纤维素酶应用已扩展到医 药、纺织、日用化工、造纸、食品发酵、工业洗涤、烟草、石油开采、废水 处理及饲料等各个领域。 本文从两方面系统的对纤维素酶的利用做了实验研究。一方面是作为工 具酶，经逐步分离纯化，除去杂蛋白及色素，用于植物细胞原生质体制备方 面的科学研究；另一方面是用粗提的纤维素酶固定化后，改善酶稳定性，用 于降解纤维素。 以绿色木霉为材料，经稻草粉固体发酵、浸提得纤维素酶粗酶液，经硫 酸铵分级沉淀，超滤，s e p h a d e xg 一7 5 柱层析三种方法逐步纯化，然后，利 用逐步得到的纤维素酶，经聚丙烯酰胺凝胶电泳，检测酶的纯度变化，分别 制各幼嫩番茄叶片的原生质体。结果发现：高度纯化的纤维素酶几乎得不到 原生质体，而经超滤后的纤维素酶制备原生质体效果最佳。 自制纤维素酶粗酶液，然后，以市购壳聚糖为原料，用戊二醛作交联剂， 将纤维素酶固定于壳聚糖上，测得蛋白质的固定化率为8 9 ，c m c 酶结合 效率为4 8 ，同时探讨了一定量的壳聚糖载体与交联剂浓度、给酶量等关系 的最适固定化酶条件，并对固定化酶的热稳定性、操作稳定性、米氏常数、 最适温度、离子强度的影响等理化性质进行了探讨。 最后，将固定化的纤维素酶对经酸碱不同预处理处理后的稻草粉进行降 解，找到适于纤维素酶降解的预处理条件。然后确定了固定化纤维素酶处理 稻草粉最佳降解条件。即酶，底物的最适比率、最适温度、最适p h 值等。实 验结果表明：稻草粉以1 氢氧化钠1 0 0 煮沸l h 的预处理效果最好，底物 得糖率比未处理前的稻革粉提高了5 倍多：酶，底物比率以1 ：7 5 为最佳， 比率太低时，酶活力没有得到充分利用，比率太高时，底物又无法被酶充分 摘要 降解；酶在5 0 c 时降解效果最好，温度对酶降解效果的影响较大；缓冲溶液 的最适p h 值为5 5 。 关键词：绿色木霉：纤维素酶；戊二醛；壳聚糖；固定化；稻草粉 2 沈阳学业大学硕士学位论文 日l j舌 纤维素是地球上取之不尽，用之不竭，最丰富，可更新再生的资源之一， 全世界由光合作用产生的纤维素每年在1 0 0 0 亿吨以上。占地球总生物量的 4 0 ，与人类的生存有密切的关系。 纤维素是由2 0 0 0 至1 0 0 0 0 个葡萄糖分子组成的长链大分子，因为它是 葡萄糖b 1 , 4 糖苷键连接，所以较难降解成单个葡萄糖，因而自然界中纤维 素只有一小部分得到了利用，绝大多数纤维素被白白浪费。近年来随着人民 生活水平的提高，秸杆已不再作为燃料，大量的秸杆无法处理，各地纷纷采 用焚烧的方法来处理秸杆，破坏了土壤的理化性质和丧失了有机质成分，而 且还会造成环境污染。利用微生物生产的纤维索酶将其转化为人类急需的能 源、食物和化工原料，有利于解决日益加剧的食品和能源危机，所以，纤维 素资源的利用已引起了各国的极大关注和高度重视，可降解纤维素的酶一纤 维素酶成为研究的热点。 ( 一) 纤维素酶的发展史 纤维素酶的发现比较早，早在1 0 0 多年前( 1 8 8 6 1 8 8 8 年) ，b o o r y a 和w a r d m a r s h a l 曾报道在真菌中含有纤维素酶；1 9 0 6 年，s e i l i e r e 发现蜗牛的消化液 具有分解天然纤维素的作用( 王建荣，1 9 9 5 ) ；1 9 1 2 年p n n g s h e i m 首次从嗜热 性纤维素酶细菌中分离出纤维素酶；1 9 3 3 年g r a s s m a n 等研究了一种真菌的纤 维素酶系，分辨出2 个组分：2 0 世纪4 0 5 0 年代对产纤维素酶的微生物进行 了大量的分离筛选工作，建立起较为完整的分离筛选方法。1 9 5 4 年开始，美 军n m i e k 实验室就已研究了军用纤维素材料微生物降解的防护问题，后来发 现纤维素经微生物降解后，可产生经济、丰富的生产原料，且有望解决自然 界不断产生的固体废物问题，于是纤维素酶得到了广泛的关注( 王巧兰， 2 0 0 4 ) 。 6 0 年代后，由于分离技术的发展，推动了纤维素酶的分离纯化工作，主要 前言 工作是利用生物化学的方法对纤维素酶进行分离纯化，加快了纤维素酶的组 分、作用方式及诱导作用等方面的研究进展，并且实现了纤维素酶制剂的工 业生产，在应用上取得了一定成绩。8 0 年代，主要工作是利用基因工程的方 法对纤维素酶基因进行克隆和一级结构的测定，其中李氏木酶( t r i c h o d e r m a r e e s e i ) 的内切酶( e g i 、e g i i i ) 和外切酶( c b hi 、c b h i i ) 、粪肥纤维单胞菌 ( c e l l u l o m o n a s f i m o 的内切酶( c e n a ，c e n b ，c e n c ，c e n d ) 和外切酶( c b h a ，c b h b c e x ) 、热纤梭菌( c l o s t r i d i u mt h e r m o c e l l u m ) 的内切酶( c e l a c e l b ，c e l c ，c e i d ) 的基因己被克隆和测序，并在大肠杆菌( e s c h e r i c h i ac o t o 、酵母菌载体等中得 到表达。当前，主要是利用结构生物学及蛋白质工程的方法对纤维素酶分子 的结构和功能进行研究，包括纤维素酶结构域的拆分、解析、功能性氨基酸 的确定、水解的双置换机制的确定，分子折叠和催化机制关系的探讨。 我国早在6 0 年代就开始对纤维素酶进行研究。7 0 年代后，纤维素酶的 研究得以迅速发展。1 9 8 0 年，中科院在广州召开了“全国纤维素化学学术会 议”，把发展利用纤维素资源提到议事日程；1 9 8 5 年在陕西召开了第一届全 国纤维素酶学术会议；九十年代初期，在沈阳农业大学陈祖洁教授和曹淡君 教授的亲自指导下，建立了我国第一条纤维素酶系列产品的生产线，实现了 纤维素酶的工业化生产。 ( 二) 纤维素酶的来源及组成 纤维素酶的主要来源是微生物，自然界中大量而广泛地存在着能降解 纤维素的微生物，它们种类繁多，包括细菌、真菌和放线菌等( 肖春玲等， 2 0 0 2 ) 。目前为人们研究较多的微生物中，细菌类有红黄纤维弧菌( c e l l v i b r i o f u l v u s ) 、普通纤维弧菌( c v u l g a r i s ) 、瘤胃球菌( c v u l g a r i s ) 和荧光极毛杆 菌( p s e u d o m o n a s f l u o r e s c e n s ) 等；放线菌纲有链霉属( s t r e p t o m y c e s ) q m b 8 1 4 、 高温放线菌属( t h e r m o a c t i n o m y c e t e ) 和t h e r e m o m o n o s p o r ac u r v a t a 等；真菌 类有黑曲霉( a s p e r g i l l u sn i g e r ) 、血红酸菌( t r a m e t e s s a n g u i n e a ) 、卧孔属 4 沈阳学业大学硕士学位论文 ( p o r 抽) 、疣孢漆斑菌( m y r o t h e c i u mv e r r u c a r i a ) q m 4 6 0 、绳状青霉( p e n i c i l l i u m f u n i c u l o s u m ) 、变幻青霉( p v a r i a b i l e ) 、变色多孔霉( p o l i p o r u sv e r s i c o l o r ) 、 p t u l i o p i f e r a 、乳齿耙菌( l r p e xl a c t e u s ) 、腐皮镰孢( f u s a r i u ms o l a n i ) 、绿色 木霉( t r i c h o d e r m av i r i d e ) 、里氏木霉( t r e e s e i ) 、康氏木霉( t k o n i n g i i ) 、 嗜热毛壳菌( c h a e t o m i u mt h e r m o p h i l u m ) q m 9 3 8 1 和嗜热子囊菌( t h e r m o a s c u s a u r a n t i a c u s ) q m 9 3 8 3 等( 戴四发等，2 0 0 1 ) 。不同来源、不同组分的纤维素 酶分子量差别较大，如g e o 印w h u mc a n d i d u m 产生的一种内切葡聚糖酶，其 斜卧青霉的e g 的一个组分，分子量仅2 40 0 0d 。纤维素酶分子的一级结构 都具有类似的结构，即由球状的催化结构域、链结区和纤维素结合结构域 ( c e l l u l o s eb i n d i n gd o m a i n s ，c b d ) 三部分组成。从酶分子的高级结构来讲， 不同来源的酶分子又具有不同的高级结构。如c l o s t r i d i u me e l l u l o v o r a n s 包括 两个多纤维素酶体，每个小体又都包含9 个相同组分的亚单位，而其中一个 小体的酶活性是另- 4 , 体活性的4 倍，足以说明纤维素酶组成的复杂性。 纤维素酶包括多种水解酶成员，构成了一个复杂的纤维素酶家族，现已 确定纤维素酶含有三种主要成分：( 1 ) 内切型1 3 葡聚糖酶( e c 3 2 1 4 ) ， 也称c x 酶，c m c 酶，e g 。它能水解溶解的纤维素衍生物，以及膨胀的和 部分降解的纤维素。但不能作用于结晶的纤维素，它以随机的形式在纤维素 聚合物内部的非结晶区进行切割，对末端键的敏感性比中间键小。它的主要 产物是纤维糊精，纤维二糖和纤维三搪。( 2 ) 外切型0 葡聚糖酶( e c 3 2 1 9 1 ) ，也称c l 酶或微晶纤维素酶，c b h 。c i 酶是纤维素酶系中的重要组分， 在天然纤维素的降解过程中起主导作用，它能从纤维素链的非还原性末端切 割，生成可溶的纤维糊精和纤维二糖。( 3 ) 纤维二糖酶( e c3 2 1 2 1 ) ，也称 c b 或6 葡萄糖苷酶，b g 能水解纤维二糖和短链的纤维寡糖生成葡萄糖， 对纤维二糖和纤维三糖的水解很快，这种酶的专性较差。 纤维素酶的每一个组分又由若干亚组分组成，在将天然纤维素水解成 前言 葡萄糖的过程中，必须依靠几种组分的协同作用才能完成。8 0 年代以来，随 着分子生物学的发展，人们对纤维素酶的研究取得了突破性进展，纤维素酶 的作用方式也渐趋明朗。这三种组分虽各有专一性，但相互之间又具有协同 作用，具有结晶结构的纤维素就是在它们三者的协同作用下被降解的。 ( 三) 纤维素酶的固定化磅究 纤维素是自然界中最丰富的可再生资源之一，如将其以工业规模转化成 葡萄糖的技术开发成功，那么纤维素资源便可成为人类食粮、动物饲料、发 酵工业原料以及能源的新来源。但目前有效利用纤维素生物量的主要障碍是 纤维素酶的酶解效率低，与淀粉酶比较相差2 个数量级以上，进而导致纤维 素降解过程中纤维素酶的成本过高，约占纤维素糖化工艺的4 0 以上，从而 严重阻碍了纤维素酶在纤维素糖化中的广泛应用。酶的固定化技术为提高纤 维素酶的使用效率，降低成本，提供了可能性。因为游离酶虽然在现代化工 工业中得到了广泛应用，但是由于存在一些缺点：( 1 ) 溶液酶与产品分离困 难，无法充分利用；( 2 ) 溶液酶稳定性差；( 3 ) 溶液酶易随产品流失，并会 影响产品的质量，从而限制了它的应用范围。为了解决这些问题，2 0 世纪 6 0 年代出现了固定化技术。1 9 6 9 年干烟一郎用固定化氨基酰化酶拆分d l 一 氨基酸，并投入工业生产，成为世界上第一个将固定化酶技术得到了迅速发 展和广泛的应用。固定化酶( 罗贵民，2 0 0 2 ) 比游离酶具有较好的稳定性， 并且可以重复使用和回收，又便于连续化操作，因而可以大大降低成本。7 0 年代初，美国、日本开始进行纤维素酶固定化( i m m o b i l i z a t i o no f c e l l u l a s e ，简 称i c ) 的研究。目前已有许多不性或可融性载体被广泛用于纤维素酶的固定 化，我国对i c 的研究，只在近些年才有少量报道( 王景林，1 9 9 7 ) 。 由于纤维素酶的底物纤维素是不溶性的许多入都认为要设计一种对它 具有活性的固定化酶( i c ) 是非常困难的，但自从1 9 7 6 年美国v i e t h 用不溶 性载体胶原蛋白成功地固定纤维素酶，获得专利后，给人们带来了希望，并 开辟了纤维索酶研究的新领域。1 9 7 7 年，k a r u b e 等曾报道用胶原蛋白纤维 沈阳学业大学硕士学位论文 固定t r i c h o d e r m ar e e s e i 纤维素酶，在流动床式反应器中水解微晶纤维素， 转化率达8 0 。1 9 7 8 年，b i s s e t t 报道，他获得的固定化a s p e r g i l l u s p h o e n i e s ，b 一 葡萄糖苷酶活性半袁期从o 5h 延长到2 5 2h 。19 8 0 年，r y u 又将a p h o e n i cb - 葡萄糖苷酶用戊二醛固定在脱已酰几丁质( c h i t o s a n ) 上，再加到木霉( t r e e s e i ) 纤维素酶上，可明显提高葡萄糖的含量。还有人通过物理吸附或共价结合等 方法，将真菌纤维素酶固定在皂土( b e n - - t o n i t e ) 、矾土( a l u m i n a ) 、陶瓷 【c e r a m i c s ) 、硅石玻璃( s i l i cg l a s s ) 、海藻酸钙胶粒( c a l c i u ma l g i n a t eg e ls p h e r e ) 、 e d l l a 一纤维素和离子交换树脂等不溶性载体上，得到的固定化酶( i c ) 都 不同程度地保留了原酶的活性( 王景林，1 9 9 7 ) 。 1 固定化酶的方法 酶蛋白的构象与酶的活性密切相关，而酶的催化作用由其活性中心完 成，因此在制备固定化酶时，必须注意活性中心的氨基酸残基不发生变化， 避免那些导致酶蛋白高级结构破坏的操作( 例如高温，强酸，强碱等) ，固定 化过程应尽量在温和条件下进行。 固定化酶的制备方法可分为以下四类( 李伟，2 0 0 1 ) ：吸附法，包埋法， 共价结合法和交联法。而固定化酶载体的选择则取决于固定化方法和酶的性 质。 ( 1 ) 吸附法 吸附法分为物理吸附法和离子吸附法。 物理吸附法：这是酶被物理吸附于水不溶性载体的一种固定化方法。物理 吸附法具有酶活性中心和酶高级结构不宜被破坏的优点，但酶附着在载体 上，结合力很弱，易于脱落。 离子吸附法：离子吸附法是将酶与含有离子交换基团的水不溶性载体以静 电作用力相结合的固定化方法。作为此法的载体有多糖类离子交换剂和合成 高分子离子交换树脂。离子吸附法的操作简单，处理条件温和，酶的高级结 构和活性中心的氨基酸残基不宜被破坏，能得到酶活力回收率较高的固定化 前言 酶。但是载体和酶的结合力比较弱，容易受缓冲液种类或p h 的影响，在离 子强度高的条件下进行反应时，酶往往会从载体上脱落。 ( 2 ) 包埋法 包埋法可分为网格型和微囊型两种。将酶包埋于高分子凝胶细微网格内 的称为网格型：将酶包埋在高分子半透膜中的称为微囊型。包埋法一般不需 要与酶蛋白的氨基酸残基进行结合反应，很少改变酶的高级结构，酶活力回 收率较高。因此，可以应用于多数酶的固定化，但是若在发生化学反应时包 埋，酶容易失活，必须巧妙设计反应条件。包埋法只适合作用于小分子底物 和产物的酶，对于那些作用于大分子底物和产物的酶是不适合的，因为只有 小分子可以通过高分子凝胶的网格扩散，并且这种扩散阻力还会导致固定化 酶动力学行为的改变，最终导致酶活力降低。 ( 3 ) 共价键结合法 共价键结合法是将酶与水不溶性载体以共价键结合的固定化方法，此法 研究较为成熟。与载体共价结合的酶的功能基团包括：氨基：赖氨酸的e 一氨基和多肽键n 末端的n 一氨基；羧基：天门冬氨酸的1 3 一羧基，谷氨 酸的o - 羧基和末端的n 一羧基；酚基：酪氨酸的酚环；巯基：半胱氨 酸巯基；羟基：丝氨酸，苏氨酸和酪氨酸的羟基：咪唑基：组氨酸的咪 唑基；吲哚基：色氨酸的吲哚基。实际上，最常见的共价键结合反应包括 氨基，羧基或酪氨酸和组氨酸的芳环。此法的优点是酶与载体结合牢固，不 宜脱落；但因反应条件较为激烈，会引起酶蛋白高级结构变化，破坏酶的活 性中心，因此往往不能得到比活高的固定化酶，酶活力回收率一般为3 0 左 右，甚至底物的专一性等酶的性质也会发生变化，并且制备手续繁杂。 ( 4 ) 交联法 交联法是使用双功能试剂或多功能试剂与酶分子间进行交联的固定化 方法。作为交联剂的有形成希二碱的戊二醛，形成肽键的异氰酸脂，发生重 氮偶合反应的双重氮联苯胺或n ，n 1 乙烯双马来亚胺等，其中戊二醛最为 毫 沈阳学业大学硕士学位论文 常用。参与交联反应的酶蛋白的功能基团有氨基，酚基，巯基和咪唑基等。 由于交联反应条件比较激烈，固定化酶活力回收率一般比较低( 3 0 左右) ， 但是尽可能降低交联剂浓度和缩短反应时间将有利于固定化酶比活的提高。 上术各种方法都有其优点和缺陷，实际应用时，常将两种或数种固定 化方法并用。 2 用壳聚糖固定纤维素酶 壳聚糖( c h i t o s a n ) ，其学名为2 一氨基b 1 , 4 葡聚糖。壳聚糖的来源十分丰 富，在自然界中广泛存在于甲壳动物的外壳及昆虫的幼皮，蛹壳及一些真菌 的细胞壁中，是一种天然生物高分子材料，其用途涉及到医药保健、日用化 工、食品、纺织、印染、造纸、活鲜食品及果蔬保鲜、膜材料、农业、生化 及环保等行业和领域。 我匡i 对壳聚糖也逐渐有所认识，现在有很多文献报道壳聚糖的用途，作 为生化载体就是其中之一。聚糖是一种网状载体，具有机械性能良好、化学 性质稳定、耐热性好等优点，特别是其分子中存在的氨基，既易于与蛋白质 和酶共价结合，又可络合金属离子，使酶免受金属离子的抑制，同时它又易 于通过接枝而改性。因此，它是种良好的蛋白质和酶的载体，近年来受到 国内外不少学者的重视己成功地在壳聚糖上固定了碱性磷酸酶，酸性磷酸 酶，淀粉酶，天门冬氨酸酶及纤维素酶等十几种酶。 ( 四) 纤维素酶降解稻草粉的研究 我国是稻米的重要产地，稻草的产量很大。目前，我国稻草的利用率很 低，除少数用作饲料外，大部分被丢弃，因此，对于开发利用稻草的研究显 得很重要。稻草主要由纤维素与木质素所构成，稻草纤维素水解制备还原糖 是有效利用植物纤维素的途经之一。 纤维素酶水解纤维素的机理现已普遍接受协同作用的理论。如何提高酶 解效率及其它因子对纤维素酶水解纤维素的影响是目前研究较活跃的领域。 9 前言 粉碎处理方法对提高酶解效率具有很大的潜力，同时将稻草粉进行酸碱等预 处理，然后酶解制备还原糖，可以有效地提高酶解效率。 1 纤维素的酸水解( 汪维云等，1 9 9 8 ) 纤维素大分子中的1 3 1 ，4 糖苷键是一种缩醛键，对酸特别敏感，在适当 的氢离子浓度和时间作用下，糖苷键断裂、纤维素的平均聚合度下降、反应 能力增大、还原能力提高。 2 碱水解 碱水解就是用n a o h 、c a ( o h ) 2 或k o h 等溶液浸泡秸秆或喷洒于秸秆表 面，以打开纤维素、半纤维素和木质素之间的酯键，溶解纤维素、半纤维素 和一部分木质素及硅酸盐，使纤维素膨胀，从而提高消化率。 已有研究表明，酸性预处理的效率相对较低，碱处理优于酸处理。提高 酶解率的途径还要寻求其他有效的方法，把对酶亲和力小的物质转变为对酶 亲和力大的底物。如在培养物中添加诱导物或激活剂，对提高纤维素酶活力 有促进作用。 本文对固定化纤维素酶酶解稻草粉制备还原糖工艺条件进行研究，以期 获得纤维素酶的持续生产，为固定化纤维素酶解制备还原糖的更进一步的工 业开发提供参考。 ( 五) 纤维素酶制备原生质体的研究 随着我国农业生物技术，特别是植物基因工程和细胞工程的发展，植物 原生质体技术愈来愈受到重视，它几乎涉及植物学的所有领域，不论是基础 研究，还是应用研究都提供了强有力的实验体系。由于植物原生质体具有全 能性为分子生物学、遗传学、育种学、特别是为细胞工程和基因工程开辟了 广阔而崭新的前景。 酶法分离原生质体，不禁可以得到大量有活力的完整原生质体，而且可 以适用于草本植物的各种组织和木本植物的多种幼嫩组织。目前，广泛利用 木霉和青霉的纤维素酶和其它多糖酶酶法制备植物和真菌的原生质体。 i o 沈阳学业入学硕士学位论文 植物原生质体( p r o t o p l a s t ) - - 词始自h a n s t e i n ，即指通过质壁分离，能够 和细胞壁分开的那部分细胞物质。按照细胞全能性学说，离体的植物原生质 体和其他起源的细胞一样，在合适的离体培养条件下，具有繁殖、分化、再 生成完整植株的能力，由此表明，原生质体培养技术已日臻完善，为以后的 研究打下了基础。 1 9 1 9 年，g i a j a 用蜗牛( h e l i xp o n a t i a ) 臂液溶解酵母菌的细胞壁，首次用 酶法制得了低等植物的原生质体：1 9 6 0 年，英国学者c o c k i n g 采用疣孢漆斑 菌( m y r o t h e c i o nv e r r u e o r i a ) 中提取的粗制纤维素酶，首次用酶法从番茄根尖中 细胞中成功地分离出高等植物的大量活性的原生质体( c o c k i n g e c ，1 9 6 0 ) ，通 过培养再生出细胞壁。1 9 6 0 年，国际市场上已出现蜗牛酶制荆“g l u s u l a s e ” 商品，但其酶活力不高( 林开江等，1 9 8 9 ) ，分离植物组织原生质体的效果 欠理想，以后日本y a k u l th o n s h a 公司推出专用的植物细胞脱壁酶o n o z u k a p 1 5 0 0 ，此酶脱壁效果良好，因而促进植物原生质体分离的研究。但s c h e n k 和h i l d e b r a n d t 在利用这种酶分离植物原生质体时，发现它含有一些毒性物 质，认为过氧化物酶可能是其中的毒物之一，并提出了精制的方法( s c h o n k r u ，1 9 6 9 ) ，此后有许多文献( 那安等，1 9 8 l ；g o n gd ce ta l ，1 9 7 7 ) 报道 了纯化纤维素酶的方法。1 9 7 0 年，h e l l e t 对t r i c h o d e r m a v i r i d e ( 日j lt ，r e c s e i ) 的纤维素酶进行了提纯，去掉了一些低分子物质和杂酶，制成了纯度较高的 纤维素酶。目前分离原生质体常用的商品纤维素酶有0 n o z u k ar - 1 0 、0 n o z u k a r sme i c e l a c e 、dr i s e l a s e 、c o l o n a s ez y m o l a s e 以及s i g m a 公司生产的c e l l u l a s e 等，其中以0 n o z u k ar - 1 0 和r s 效果较好，应用最广( w a r de d 1 9 7 2 ) 。 ( 六) 纤维素酶在其他领域的应用 1 用于食品加工 用纤维素酶制备各水果汁或蔬菜汁，提高产率1 0 ，还可增加氨基酸和 有机酸的含量，制备的汁液清亮，不沉淀，用于制酒和酒精生产，产量比对 照提高3 _ 8 。 前言 2 用于服装加工 传统做的牛仔服，要用石磨处理后才能上市，用纤维素酶处理代替石磨， 合格率达1 0 0 ，防止了损伤和次品的出现。 3 用于提取中药 提取中药时，有的工艺过程需要高温高压，而且产率低。用纤维素酶可 免去某些工艺流程，还能提高得率2 0 一3 0 。 4 其它用途 纤维素酶还可用于直接发酵纤维素产生酒精，处理工业废水和工业纤维 素废渣，进行冶气发酵，提高产气率等。 ( 七) 纤维素酶的研究趋向及发展前景 随着人类社会文明的不断发展，安全、环保也被越来越多的人们所看重。 纤维素是自然界含量最多的有机物之一，同时又可再生，因此研究如何使纤 维素酶高效连续地把纤维素降解成为葡萄糖是一项意义非凡的工作，各国的 科学家及学者们都在日以继夜的工作，相信在不久的将来，纤维素将会代替 现在的很多产品，出现在人们眼前。 由于纤维素酶工业化生产的需要，人们对纤维素酶基因的兴趣主要集中 在产纤维素酶的高产真菌及耐热细菌上，它们的外分泌性及耐热性在酶工业 生产中具有重要的实用意义，所以这些菌种的基因克隆仍是纤维素酶研究的 一个热点。 纤维素酶基因在酵母中的表达是纤维素酶基因工程向应用发展的一个 重要途径( 穆小民等，1 9 9 4 ) 。三类纤维素酶基因如在酵母中能高效表达， 酵母生长将有充分的碳源供应，籍此可生产单细胞蛋白( s c p ) 。酿酒酵母具 有将葡萄糖转化为酒精的能力，若将三类主要纤维素酶基因导入酿酒酵母， 可望使纤维素一葡萄糖一酒精一燃料生产实现工艺化，前景极为诱人。存在 的问题是，酵母表达外源纤维素酶基因的水平仍然有限，故提高酵母表达纤 维素酶的产量将是一个重要的研究课题。 沈阳学业大学硕士学位论文 目前对一些纤维素酶的基本结构和活性部位己基本弄清，故可利用定点 突变方法进行纤维素酶蛋白分子的改造和设计，纤维素酶蛋白质工程方面的 研究也因此始见报道。 纤维素酶基因可用于构建高效纤维素分解工程菌。李氏木霉能合成大量 的c b h 和e g ，但b g 活力很低。黑曲霉b g 的活力很高，将黑曲霉的b g 基因在李氏木霉中表达，可提高李氏木霉纤维素酶活力，已有将克隆的李氏 木霉的b g 基因进一步转化李氏木霉而提高了其纤维素酶活力的报道。目前 木霉转化表达系统的构建日趋成熟。这方面的研究是目前纤维素酶分子生物 学研究的又一热点； 瘤胃微生物的遗传改造是纤维素酶分子生物学研究的一个重要方面，近 几年来，一些主要瘤胃微生物如产琥珀酸拟杆菌( b a c t e r o i d e ss u c c i n o g e n e s ) 、 丁酸弧酸( b u t y r i v i b r i o s p ) 、白色瘤胃球菌俾u - - m 加o c o c e u sa l b u s ) 和黄化瘤 胃球菌的纤维素酶基因已相继克隆，并在e c o l i 中得到表达。由于瘤胃微生 物种类繁多，各类微生物的生长速度随环境不同而变化，在瘤胃中滞留时间 短，所以很难建立起稳定的工程菌，今后这方面将会有更多的研究( 穆小民 等，1 9 9 4 ) 。 2 1 世纪是知识经济时代，随着人们对纤维素酶研究工作的深人，纤维素 酶必将在食品、饲料、环境保护、能源和资源开发等各个领域中发挥越来越 大的作用。如何加大对纤维素酶研究和开发的科技投人和经费投人，改变目 前规范小，工艺、设备落后、菌种酶活低、生产成本高、生产技术水平低下 的现状，尽快采用各种行之有效的高新技术，发展具有中国自己知识产权的 新酶种、新产品、新剂型、满足市场的需求，是当务之急。 ( 八) 本课题的选题依据及研究目的 纤维素酶是一组能够降解纤维素生成葡萄糖的酶的总称，在食品、饲料、 医药、制浆造纸、农业以及基础科学研究领域具有广泛的应用价值。由此可见， 前言 纤维素酶的研究和开发具有重要的经济效益和社会效益。 本文从以下几方面对纤维素酶进行了研究： 1 通过不同纯度的纤维素酶处理植物叶片，找出原生质体制备与纤维 素酶纯度的关系。 2 通过壳聚糖固定纤维素酶，测定固定化酶的生理生化特性，为酶的 固定化研究提供理论依据。 3 通过固定化纤维素酶降解稻草粉的研究，为固定化酶降解稻草粉生 产葡萄糖提供理论基础。 1 4 沈阳学业大学硕士学位论文 一、纤维素酶的纯化及原生质体制备的研究 ( 一) 材料与方法 1 材料 ( 1 ) 菌种： 绿色木霉( 由沈阳农业大学生物工程教研室提供) 。 ( 2 ) 培养基 p d a 斜面培养基 葡萄糖o 2 9 ，马铃薯2 0 一3 0 9 ，琼脂1 8g ，蒸馏水1 0 0 m l ，1 2 1 灭菌3 0 m i n ， 划线接种，3 0 。c 活化3 - 4 天备用。 液体种子培养基 豆芽1 0 0 9 ，洗净，加水煮沸3 0 分钟，过滤补足水分到1 0 0 0 毫升，分装， 1 2 1 灭菌3 0 分钟，备用。 固体发酵培养基 硫酸铵l ，磷酸二氢钾0 2 ，硫酸镁0 0 5 ，氯化钙o 0 5 ，尿素o 2 5 ， p h 自然，配成固体发酵培养液。每9 5 9 稻草粉，5 9 麸皮加3 0 0 m l 固体发酵 液。 ( 3 ) 仪器设备 电热恒温水浴锅，江苏省医疗器械厂： 立鹤牌4 2 0 型电热恒温培养箱，山东维坊医药集团股份有限公司医疗器械 厂： 相差显微镜： 超滤装置，中空纤维膜组件，天津膜天膜工程技术有限公司： 电热手提压力蒸汽消毒器y x q - s g 4 12 8 0 ，上海医用核子集仪器厂： 电热恒温鼓风干燥箱z b y l 4 9 8 3 型1 0 1 ，上海跃进医疗器械厂： 层析装置，电泳装置； 竺堡墨堕竺丝些墨堕竺堕堡型鱼塑翌筌 7 2 1 型分光光度计，上海第三分析仪器厂； l d 4 2 a 型离心机，北京医用离心机厂产品； 超净工作台，上海整新电子设备厂； ( 4 ) 试剂与配制 试剂 s e p h e d e x g 一7 5 ，中国医药( 集团) 上海化学试剂公司；半纤维素自制( 玉 米芯提取) ；甘露醇，上海试剂二厂；考马斯亮蓝r - 2 5 0 ，果胶，3 5 二硝基 水杨酸，f o l i n 一酚试剂，核糖核酸，钼酸铵等试剂均为国产分析纯试剂。 3 5 - 二硝基水杨酸( d n s ) 配制 将6 3 9 d n s 和2 6 2 m l2 m o l ln a o h 溶液，加到5 0 0 m l 含有1 8 5 9 酒石 酸钾钠的热水溶液中，再加5 9 结晶酚和5 9 亚硫酸钠，搅拌溶解，冷却后加 蒸馏水定容至1 0 0 0 m l ，贮于棕色瓶中备用。 f oi in 一酚试剂的配制 在1 5 l 容积的磨1 2 1 回流器中加入1 0 0 9 钨酸钠( n a 2 w 0 4 2 h 2 0 ) 和7 0 0 m l 蒸馏水，再加入浓度为8 5 的磷酸5 0 m l 和浓盐酸1 0 0 m l 充分混匀，接上 回流冷凝管，以小火回流1 0 h 。回流结束后，加入1 5 0 9 硫酸锂和5 0 m l 蒸馏 水及数滴液体溴，开口继续沸腾1 5m i n ，驱除过量的溴，冷却后溶液呈黄色 ( 倘若仍里绿色，再滴加数滴液体溴，继续沸腾1 5m i n ) 。然后稀释至l l ， 过滤，滤液置于棕色试剂瓶中保存，使用前大约加水1 倍，使最终浓度相当 于l m o i l 。 lm g m l 葡萄糖标准液 准确称取8 0 一1 0 0 。c 烘干至恒重的分析纯葡萄糖1 0 0 m g ，置于小烧杯中， 加少量蒸馏水溶解后，转移到1 0 0 m l 容量瓶中，用蒸馏水定容，混匀后4 冰箱保存备用。 浓度为0 0 5 m o f l 的p h5 0 柠檬酸缓冲液 a 液：称取分析纯柠檬酸( c 6 h 8 0 7 h 2 0 ，分子量2 1 0 1 4 ) 2 1 0 1 4 9 ，溶 t 6 沈阳学业大学硕士学位论文 解后定容至1 0 0 0 m l ，该溶液为0 1m o l l 柠檬酸溶液。 b 液：称取分析纯柠檬酸钠( n a 3 c 6 h s 0 7 2 h 2 0 ，分子量2 9 4 1 2 ) 2 9 4 1 9 ， 溶解后定容至1 0 0 0 m l ，该溶液为0 1m o l l 柠檬酸钠溶液。 取2 7 1 3m l a 液，2 2 2 8m lb 液，混匀后定溶至1 0 0m l ，该溶液为o 0 5 m o l lp h 5 0 柠檬酸缓冲液。 2 方法 ( 1 ) 标准曲线制作 葡萄糖标准曲线制作 取8 支洗净烘干的2 0 m l 具塞刻度试管，按表1 分别加入标准葡萄糖溶 液和蒸馏水，配制成一系列不同浓度的葡萄糖溶液。 表1葡萄糖标准曲线制作 t a b 1 p r e p a r a t i o no f s t a n d a r dc u r v eo f g l u c o s e 将溶液摇匀后。向各试管中加入1 5 m ld n s 溶液，摇匀后沸水浴加热 5 m i n ，取出冷却后用蒸馏水定容至2 0 m l ( 充分混匀) 。在5 4 0 r i m 波长下， 以1 号试管溶液调零，测定各管溶液的吸光度并记录结果。以葡萄糖含量 ( m g ) 为横坐标，以对应光密度值为纵坐标，绘制葡萄糖标准曲线。 半乳糖醛酸标准曲线的制作 取8 支洗净烘干的2 0 m l 具塞刻度试管，按表2 加入各种溶液。将溶液 混匀后，于沸水浴中煮沸5m i n ，冷却后定容至2 0 m l ( 摇匀) ，以1 号管为 空白调零，在5 4 0 n m 测其o d 值，以半乳糖醛酸含量( m g ) 为横坐标，以 对应的o d 值为纵坐标，绘制标准曲线。 纤维素酶的纯化及原生质体制备的研究 木糖标准曲线的制作 取6 支洗净烘干的2 0 m l 具塞刻度试管，按下表加入各溶液。 表3 木糖标准曲线制作 t a b 3 p r e p a r a t i o no fs t a n d a r dc u r v eo fx y l o s e 摇匀后，沸水浴3 0m i n ，以流水冷却，以1 号为空白调零，在6 7 0 n m 测 其光密度值，以木糖微克数( g ) 为横坐标，对应的o d 值为纵坐标，绘制 标准曲线。 酪氨酸标准曲线的制作 取6 支洗净烘干的2 0 m l 具塞刻度试管，按表4 加入各种溶液。摇匀后， 于4 0 c 水浴保温2 0m i n ，取出试管冷却后，以1 号为空白调零，在6 5 0 n m 测其光密度值，以酪氨酸微克数( g ) 为横坐标，对应的o d 值为纵坐标， 绘制标准曲线。 沈阳学业大学硕士学位论文 表4 酪氨酸标准曲线制作 t a b 4 p r e p a r a t i o no f s t a n d a r dg l i r v eo f t r y o s i n e ( 2 ) 半纤维素提取方法( 王雪鹏，2 0 0 3 ) 将玉米芯洗净后粉碎，1 3 5 。c 蒸煮3 0m i n ，过滤，滤渣用浓度为1 0 e f u 的 n a o h 于8 0 。c 浸提2 h ( 固液比l g ：1 5 m l ) ，过滤取滤液，用6 t 0 0 1 l 的h c i 中和，3 5 0 0r m i n 离心2 0m i n ，沉淀用9 5 乙醇浸泡过夜，离心得泥状沉淀 物备用。 ( 3 ) 各种酶活力的测定 滤纸酶活力( f p a ) 参照m a n d e l s ，蒋传葵d n s 法。取适当稀释浓度的酶液o 5 m l ，p h4 5 的柠檬酸一柠檬酸钠缓冲液1 5 m l ，加入l 6 厘米新星定量滤纸l 条，于5 0 下保温1 h 后，加入d n s 显色。于5 4 0 n m 波长下比色，在上述测定条件下 分解底物、每分钟产生l g g 分子葡萄糖为1 个酶活单位。 c m c 酶活力 取适当稀释浓度的酶液0 5 m l ，加含0 5 1 c m c 的p h 5 0 的柠檬酸缓冲 液1 5 m l ，5 0 ( 2 保温3 0r a i n 。以后步骤同f p a 测定法，测得o d 值。 c 1 酶活力 取适当稀释浓度的酶液0 5 m l ，加入p h5 0 缓冲液1 s m l 。加脱脂棉 5 0 r a g 后，于4 5 c 下保温2 4 h 。以后的测定步骤同f p a 法，测得o d 值。 0 一葡萄糖苷酶 取适当稀释浓度的酶液o 5 m l ，以o 5 水杨苷作为底物( 配制在p h 4 ，5 、 ，9 纤维紊酶的纯化及原生质体制各的研究 0 0 5 m o l l 柠檬酸缓冲液中) ，5 0 。c 保温3 0m i n ，以后的测定步骤同f p a 法， 测得o d 值。 半纤维素酶活力 取适当稀释浓度的酶液o 5 m l ，加含o 5 半纤维素一醋酸缓冲液 ( p h 4 4 ) ，4 0 c 保温1 5m i n ，用9 5 乙醇终止反应，放置6 0m i n ，离心，取 上清液，采用地衣酚酮法测定戊糖生成量，于上述条件下l h 生成1 u m o l 木 糖所需酶量定义为1 个活力单位。 果胶酶活力 参照d n s 法测半乳糖醛酸的生成量。把1 h 由底物产生l l a m o l 半乳糖醛 酸所需的酶量定义为1 个酶活单位。 蛋白酶活力 f o l i n - 酚显色法。取含l 酪蛋白，加适当稀释浓度的酶液l m l ，4 0 c 保 温1 0 m i n 后，加o 4 m o l l 三氯醋酸2 m l ，继续4 0 。c 保温】0 m i n ，离心，然 后吸滤液l m l ，加n a 2 c 0 3 溶液5 m l ，o 5 m l 福林试剂，4 0 c 保温2 0m i n ， 冷却后，在波长6 5 0 n m 处比色。在上述条件下1 h 由底物产生1 1 t m o l 酪氨酸 为1 个酶活力单位。 核糖核酸酶活力 取l m l 酶液，加入浓度为0 5 核糖核酸l m l ，3 7 。c 保温1 0m i n ，加入 2 5 钼酸铵溶液l m l ，沉淀( 4 ) ，离心取上清液，稀释l 倍，于2 6 0 n m 比 色，酶活力以上述条件下2 6 0 n m 的光密度值表示。 ( 4 ) 酶的组份分析 聚丙烯酰胺凝胶电泳法检测酶的电泳谱带。电泳采用分离胶的浓度为 7 5 ，浓缩胶的浓度为3 0 。点样后开始时电流控制在1 5 2 0 m a ，样品进 入分离胶后，电流加大到2 5 m a ，大约3 4 h ，电泳结束。取出凝胶板，在考 马斯亮兰r 2 5 0 中，于3 0 。c 下染色1 h ，然后用水冲洗去表面染料，加入脱色 液脱色，其间经常更换脱色液，直到出现清晰的电泳谱带。最后用数码相机 2 0 沈阳学业大学硕士学位论文 拍照。 ( 5 ) 纤维素酶液的处理 处理i ：稻草粉经固体发酵后，浸提得纤维素酶液，加固体硫酸铵至3 0 饱和度，, 4o c 放置3 0m i n 后，离心1 0m i n ，取上清液，再加入固体硫酸铵至 8 0 饱和度，4 放置过夜，离心2 0m i n ，沉淀用柠檬酸缓冲液溶解后，装 入透析袋中充分透析，得纤维素酶粗酶液。然后，测定纤维素酶及辅助酶和 有害酶的活力。 处理i i ：将处理i 所得浸提液沉淀溶解后，经中空纤维膜组件( 截留分 子量为2 万) 超滤，脱盐并除去了一定量小分子的杂蛋白及大量色素，使纤 维素酶进一步纯化后，测定纤维素酶及辅助酶和有害酶的活力。 处理i ：将处理i i 超滤液，上到预先用o 0 5 m o l lp h5 0 柠檬酸缓冲液 平衡好的s e p h a d e xe 一7 5 柱( 中2 0 x 4 0 ) 上，用同一缓冲液洗脱，从出峰开始 收集，每管1 0 m l ，测各个管中洗脱液的三种酶活力( c l 酶活力，c x 酶活力， 1 3 葡萄糖苷酶活力) 。 ( 6 ) 番茄原生质体的制备 将上述三种酶溶液用缓冲液稀释成不同浓度但具有相同的滤纸酶活力 的纤维素酶溶液，在超净工作台上，用无菌过滤器进行过滤后，得无菌酶液。 称取三份0 5 9 的幼嫩番茄叶片，用7 5 的酒精消毒后，无菌水冲洗，置小烧 杯中，分别加入三种处理的纤维素酶液( 含o 7 m o l l 甘露醇) 1 6 m l ，于2 8 保温3 h ，取出叶片，得原生质体。 ( 7 ) 观察原生质体 用移液枪取约4 0 微升原生质体悬液于血球计数板上，用相差显微镜( 4 0 x1 0 ) 观察原生质体并拍照。 ( 二) 结果与分析 1 纤维素酶经s e p h a d e xo 一7 5 柱层析结果 2 1 纤维素酶的纯化及原生质体制备的研究 由图1 可见，经柱层析后纤维素酶三种主要酶活力较集中，纤维素酶各 组分基本没有被分开。由于纤维素酶属复合酶类，相互之间有一定的作用， 并且层析柱的长度较短，分开三种组分有一定的难度。收集纤维素酶三种活 力较集中处的洗脱液( 3 0 6 0 m l 处) ，然后浓缩，测定纤维素酶及辅助酶和 有害酶的活力。 1 2 l 0 8 80 6 o 4 o 2 0 05 01 0 01 5 0 洗脱体积m l 一一：c l 酶：一一：c x 酶；一一：b 一葡萄糖苷酶；一。一：蛋白质 图i 纤维素酶的s e p h a d e xg 一7 5 层析 f i g 1 g e lc h r o m a t o g r a p h yo f c e l l u l a s eo ns e p h a d e xg _ 7 5 2 三种处理蛋白质组份电泳分析结果 由图2 可见，电泳图谱处理i 为粗酶液具有多条谱带，处理i i 经超滤后 谱带减少、处理i 经柱层析后的谱带数更少，仅剩两条可见谱带，可以推断 原酶所含的杂蛋白较多，经超滤，柱层析后部分杂蛋白被逐步清除，纤维素 酶被纯化。 沈阳学业大学硕士学位论文 处理处理i i 处理i 图2 聚丙烯酰胺凝胶电泳 f i g 2 t h ep i c t u r eo f g e le l e c t r o p h o r e s i s 3 三种处理纤维素酶及辅助酶和有害酶活力测定结果 表5 三种处理纤维素酶及辅助酶和有害酶的活力 t a b 5t h ea c t i v i t yo f c e l l u l a s e 、a d j u v a n te n z y m e sa n dh a r m f u le n z