（动物学专业论文）急慢性椎管内给予snsr激动剂对伤害性信息传递的不同作用.pdf

福建师范大学学位论文使用授权声明 福建师范大学学位论文使用授权声明 本人( 姓名) 胡志京学号2 0 0 5 9 0 2 专业动物学所呈交的论文 论文题 目 急慢性椎管内给予s n s r 激动剂对伤害性信息传递的不同作用) 是我个 人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。尽我所知，除了文 中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写 过的研究成果。本人了解福建师范大学有关保留、使用学位论文的规定， 即：学校有权保留送交的学位论文并允许论文被查阅和借阅；学校可以 公布论文的全部或部分内容：学校可以采用影印、缩印或其他复制手段 保存论文。 ( 保密的论文在解密后应遵守此规定) 学位论文作者签名 缘 瑚 、7 - - 一y 7 签名目期芝髫。善。丕 指导教师签名 掎要 摘要 感觉神经元特异性受体( s e n s o r yn e u r o n s p e c i f i cr e c e p t o r ；s n s r ) 特异性的分布 于背根神经节和三叉神经节的小型神经元。最近有研究证明连续刺激该受体能降低 吗啡的抗伤害效力，本实验应用行为学、免疫组织化学、w e s t e r n b l o t t i n g 等实验方 法研究了s n s r 参与该过程的胞内机制。我们发现鞘内注射b o v i n ea d r e n a lm e d u l l a 8 2 2 ( b a m 8 2 2 ) 和t y r 6 吖2 m s h 6 1 2 ( m s h ) 能剂量依赖的抑制n 甲基d 型天 冬氨酸( n m d a ) 诱发的急性痛行为和痛觉过敏。然而，连续6 天( 每天一次) 椎 管内给予s n s r 激动剂，能显著的降低吗啡的抗伤害效力，混合注射蛋白激酶c ( p k c ) 抑制剂白屈菜红碱( c h e l e r y t h r i n e ，c l t ) 能抑制吗啡的抗伤害效力下降。 我们进一步证实，慢性椎管内给予s n s r 激动剂能上调胞内p k c 的表达：脊髓p k c y 胞膜蛋白明显增加，大鼠背根神经节( d r g ) p k c 表达上调。另外，慢性椎管内 给予b a m 8 2 2 能增强d r g 中神经型一氧化氮合酶( n e u r o n a ln o s ，n n o s ) 的表达， 并上调痛相关肽c g r p ( c a l c i t o n i ng e n e r e l a t e dp e p t i d e ) 的表达。 关键词感觉神经元特异性受体；牛。肾上腺髓质8 2 2 肽；t y r 6 吖2 - m s h - 6 1 2 ；n 一 甲基d 型天冬氨酸；一氧化氮合酶；降钙素基因相关肽；蛋白激酶c ；吗啡 a b s t r a c t a b s t r a c t s e n s o r yn e u r o n - s p e c i f i cr e c e p t o r ( s n s r ) i su n i q u e l yl o c a t e di nt h es m a l ld i a m e t e r n e u r o n si nd o r s a lr o o tg a n g l i a ( d r g ) a n dt r i g e m i n a lg a n g l i a i th a sb e e nf o u n dr e c e n t l y t h a tc o n s e c t i v ea c t i v a t i o no ft h e s er e c e p t o r ss i g n i f i c a n t l yr e d u c e sp o t e n c yo fm o r p h i n e a n t i n o c i c e p t i o n t h ep r e s e n ts t u d i e sw a sd e s i g n e dt oi n v e s t i g a t et h eu n d e r l a yc e l l u l a r m e c h a n i s m su s i n gt e c h n i q u e so fb e h a v i o r a l a s s e s s m e n t ，i m m u n o h i s t o c h e m i s t r ya n d w e s t e r nb l o t w ef o u n dt h a ti n t r a t h e c a l ( i t ) a d m i n i s t r a t i o no fs n s ra g o n i s t s ，b o v i n e a d r e n a lm e d u l l a8 2 2 ( b a m 8 2 2 ) a n dt y r 6 - t 2 一m s h - 6 - 1 2 ，d o s e - d e p e n d e n t l yi n h i b i t e d s p o n t a n e o u sp a i na n dh y p e r a l g e s i ae v o k e db yi t n m d a ( n - m e t h y l d g a s p a r t i ca c i d ) h o w e v e r , d a i l ya d m i n i s t r a t i o no fb a m 8 2 2f o rc o n s e c t i v e6d a y sd r a m a t i c a l l ya t t e n u a t e d p o t e n c y o f m o r p h i n ea n t i n o c i c e p t i o n a n dt h i s a t t e n u a t i o nw a sa b o l i s h e d b y 一a d m i n i s t r a t i o no fp r o t e i nk i n a s ec ( p k c ) i n h i b i t o rc h e l e r y t h r i n e ( c l t ) w ef u r t h e r d e m o n s t r a t e dt h a tc o n s e c t i v ea d m i n i s t r a t i o no fb a m 8 ：2 2a c t i v a t e dp k ci nt h es p i n a l d o r s a lh o r na se n v i d e n c e db ya ni n c r e a s ei n e x p r e s s i o no fp k c ti ns o m a lm e m b r a n e f r a c t i o n so fs p i n a lc o r d ，a n dt h a tt h el e v e lo fp k c i nd r gm e m b r a n ef r a c t i o nw a s i n c r e a s e d ，i na d d i t i o n ，c h r o n i cb a m 8 - 2 2a l s oe n h a n c e de x p r e s s i o no fn e u r o n a ln i t r i c o x i d e ( n o ) s y n t h a s ea n dp a i n r e l a t e dp e p t i d ec a l c i t o n i ng e n e r e l a t e dp e p t i d e ( c g r p ) i n d r gw ec o n c l u d et h a tr e p e a t e ds t i m u l a t i o no fs n s ra c t i v a t e sc e l l u l a rp k c l e a d i n gt o a c t i v a t i o no fn os i g n a lp a t h w a ya n di n c r e a s ei nc g r p k e y w o r d s ： s e n s o r y n e u r o n - s p e c i f i cr e c e p t o r ；b o v i n e a d r e n a l m e d u l l a 8 - 2 2 ；t y r 6 - t 2 一m s h 一6 1 2 ；n - m e t h y l - d g a s p a r t i c a c i d ；n o s ； c a l c i t o n i n g e n e r e l a t e d p e p t i d e ；p r o t e i nk i n a s ec ；m o r p h i n e l i 中文文摘 中文文摘 国际疼痛研究协会( i a s p ) 对疼痛下的定义是：疼痛是伴随着现有的或潜在的 组织损伤的一种令人不愉快的感觉和情绪上的感受。 感觉神经元特异性受体( s n s r ) 是研究者在2 0 0 2 年新发现的一种新受体，该 受体的m r n a 特异性的分布于背根神经节和三叉神经节的小型感觉神经元中，而由 于这类神经元是传递伤害性信息的初级神经元，人们推测s n s r 和伤害性信息传递 的调制有关。最近，我们实验室j i a n g 等人发现，b a m 2 2 能部分翻转吗啡耐受，恢 复吗啡的抗伤害效力。提示了s n s r 在伤害性信息调制中可能存在重要作用。由于 s n s r 特异性的分布于外周神经系统，而且它的激活能部分翻转吗啡耐受，所以阐 明s n s r 生理功能对镇痛研究意义重大。 本研究中，采用了行为学、免疫组织化学、w e s t e r nb l o t t i n g 等三种实验手段， 在整体水平和细胞水平对s n s r 受体的功能进行探讨。一般情况下，通常采用该受 体的激动剂和阻断剂对该受体的功能进行研究，由于目前没有发现s n s r 的阻断剂， 所以我们选用了两种s n s r 的激动剂：牛肾上腺髓质肽8 2 2 ( b o v i n ea d r e n a lm e d u l l a 8 2 2 ，b a m 8 2 2 ) 和t y r 6 7 2 m s h 6 1 2 来研究s n s r 的功能，观察两种激动剂产 生的药理效应是否一致，从而初步判定s n s r 在伤害性信息传递中的作用。 行为学实验中，我们在椎管内给予n m d a 前给予s n s r 激动剂，观察s n s r 激动剂对n m d a 引起的自发性疼痛和痛觉过敏的影响。结果显示，n m d a 引起大 鼠出现自发性痛和痛觉过敏，而鞘内5 分钟预先给予m s h 或鞘内1 0 分钟预先给予 b a m 8 2 2 能剂量依赖的抑制n m d a 引起的自发性疼痛，并可减轻n m d a 引起的痛 觉过敏。该结果表明，s n s r 能抑制疼痛的发生，该作用至少部分通过抑制n m d a 受体实现。为了进一步揭示s n s r 的功能，我们通过慢性椎管内给予s n s r 激动剂， 发现慢性给予s n s r 激动剂，能明显降低吗啡的镇痛效力，表现为吗啡e d 5 0 值的 升高。而p k c 抑制剂c l t 能抑制慢性给予s n s r 激动剂后吗啡的镇痛效力。这个 结果表明，慢性刺激s n s r ，可能会导致胞内第二信使蛋白激酶c ( p k c ) 的激活， 从而影响吗啡的镇痛效力。 为了进一步研究慢性椎管内给予s n s r 激动剂引起的吗啡镇痛效力下降的原 因，我f f j 用w e s t e r n b l o t 方法检测了脊髓中的p k 研和背根神经节中p k c 的表达变 i i i 中文文摘 化，由于p k c 的转膜被认为是激活的标志，所以我们分别检测了p k c 胞膜蛋白和 胞浆蛋白的表达变化，发现，慢性椎管内给予s n s r 激动剂后，脊髓p k c ? 胞膜蛋 白明显上调，背根神经节中p k ce 的表达也有类似的变化，而p k c 抑制剂白屈菜红 碱( c l t ，c h e l e r y t h r i n e ) 和g f l 0 9 2 0 3 x 分别能抑制脊髓p k c y 胞膜蛋白的表达上升 和背根神经节中p k c 的上调。 免疫组织化学实验中，我们检测了慢性给予s n s r 激动剂后，大鼠背根神经节 n n o s 和c g r p 的表达变化，发现长期刺激s n s r 能引起大鼠背根神经节n n o s 和 c g r p 的表达上调，d r g 中传递伤害性信息的中、小型神经元n n o s 和c g r p 阳性 细胞明显增多。该结果能进一步解释s n s r 长期被刺激后，吗啡镇痛效力下降的原 因。 以上结果表明：在脊髓水平，急性s n s r 的激活能抑制伤害性信息的传递，该 抑制作用部分是通过抑制n m d a 受体来实现的。慢性椎管内给予s n s r 刺激，引 起吗啡镇痛效力下降，w e s t e r n b l o t t i n g 检测显示，脊髓腰膨大p k c y 蛋白和背根神经 节p k c 发生转位并被激活：免疫组织化学结果显示，l 4 l 5 d r gn n o s 和c g r p 阳性神经元明显增多。 i v 第1 章绪论 第1 章绪论 1 1 疼痛研究概述 疼痛是是一种报警信号，急性疼痛对机体是一种保护：慢性疼痛却是折磨。慢 性疼痛的临床治疗极其棘手。疼痛折磨病人，它使人的生理功能紊乱、生活品质降 低，工作能力减弱。近年来，疼痛的研究倍受国内外关注。在我国，疼痛研究历来 都受到国人重视，美国国会通过法案将2 0 0 1 至2 0 1 0 年作为疼痛控制和研究的十年【l 】o 2 0 0 4 年国际疼痛研究学会确定1 0 月1 1 日为世界镇痛日。控制疼痛，提高人的生活质 量，这是疼痛研究的意义所在。 痛觉感受器是游离的神经末梢，广泛分布于皮肤、肌肉、关节和内脏器官。特 点是兴奋阈值较高，对伤害性刺激敏感，对非伤害性刺激不敏感，伤害性刺激刺激 痛觉感受器后能引起疼痛。背根神经节( d o r s a lr o o tg a n g l i a 或d r g ) 的感觉神经元在 疼痛传递中有着重要的作用。d r g 的感觉神经元细胞主要为中、小型细胞，其中分 布了多种处理和传递伤害性信号的分子，如具抗伤害感受活性的阿片肽( o p i o i d p e p t i d e ) 等和促伤害感受性( p r o n o c i c e p t i v e ) 的谷氨酸( g l u t a m a t e ) 、p 物质( s u b s t a n c e p ) 、降钙素基因相关肽( c a l c i t o n i ng e n e r e l a t e dp e p t i d e ，c g r p ) 等1 2 3 ，4 1 ，伤害性刺激 使初级传入纤维中枢端释放促伤害性感受的递质【5 , 6 1 。d r g 神经元上的受体调制细胞 信号的传递。t r p v l ( t h et r a n s i e n tr e c e p t o rp o t e n t i a lv a n i l l o i d1 ) 1 7 1 、p r o s t a n o i de i 8 1 、 v 2 x 3 t 9 1 等受体起兴奋性调制作用；而起抑制性调制的有阿片受体【1 0 】、g a b a 和乙酰 胆碱【1 1 1 等受体。这些受体通过兴奋或抑制来调制初级传入纤维中枢端信息的传递， 表现为致痛和镇痛。脊髓背角( d o r s a lh o r n ，d h ) 浅层是伤害性信息处理的重要部位。 伤害性信息传入到d r g 的细胞体后，由初级传入纤维的中枢端( c e n t r a lt e r m i n a lo f p r i m a r ya f f e r e n t s ) 传入到脊髓背角的感觉神经元。初级传入末梢释放的物质能使脊 髓背角神经元产生兴奋性突触后电位( e x c i t a t o r yp o s t s y n a p t i cp o t e n t i a l ，e p s p s ) ，从 而实现d r g ： ：o 经元与d h 神经元之间的伤害性信息传递。 ? 目前，疼痛的治疗还是以药物为主。阿片类药物是用得最多的镇痛药物，它们 通过中枢神经系统的阿片受体发挥镇痛效应。但遗憾的是，阿片类药物除有强大的 镇痛作用外，也产生呼吸抑制、便秘、成瘾、耐受等严重副作用【1 2 】，这大大地限制 了它们的应用。研制高效能、无副作用的镇痛药来代替阿片类药物一直是药理学家 福建师范大学胡志京硕士学位论文 和临床医生们的追求。而特异性的镇痛受体或具特异性的镇痛基因或许是一条捷径。 阿片类药物镇痛和耐受的机制复杂，牵涉到机体的很多生理变化，对内源性阿片肽 及其受体的研究，有助于人们了解疼痛发生和镇痛机制。 1 2n m d a 受体 1 2 1n m d a 受体及其配体 n m d a 受体是谷氨酸受体的一种亚型，1 9 9 1 年m o r i y o s h i 首先从大鼠的脑内克 隆出一种功能性的n m d a r 亚基，叫n m d a r l 1 3 l 。很快又有人从大鼠的脑内克隆 出四种新的n m d a r 的亚基( n m d a r 2 a 、n m d a r 2 b 、n m d a r 2 c 、n m d a r 2 d ) ， 研究表明，要形成有活性的n m d a 受体通道，必需组合n r l 及n r 2 亚单位中的一 个1 1 4 1 。n r l 是形成n m d a 受体通道必需的亚单位，和配体结合能力较弱，n r 2 亚 单位含有配体结合位点，能调节通道的活性。谷氨酸和甘氨酸是n m d a 受体的两 种内源性配体，结合部位分别在n r 2 和n r l 亚单位【1 5 l 。在脊髓水平，n m d a 受体 主要分布在脊髓背角，脊髓上水平，主要分布在脑干、小脑、纹状体、丘脑、海马 及大脑皮层。n m d a 是一种人工合成的n m d a 受体激动剂；而m k 一8 0 1 和 k e t a m i n e 则是n m d a 受体的非竞争性拮抗剂1 16 1 ，能阻滞离子通道的开 副1 7 】；d a p 5 ( d g - 2 - a m i n o l 一5 - p h o s p h a t i c v a l e r i ca c i d ) 和d a p 7 ( d g 一2 - a m i n o l - 7 一p h o s p h a t i c v a l e r i c a c i d ) 是n m d a 受体的竞争性拮抗剂【1 8 l ，能竞争性的抑制n m d a 激活。 第1 章绪论 图1n m d a 受体分子结构示意图 t r a c e l l u l a r t r a c e l1 u l a r ( 肋h f i g 1s c h e m a t i cd i a g r a mo fn m d ar e c e p t o rm o l e c u l a rs t r u c t u r e e a c hs u b u n i th a sal o n g e x - c e l l u l a rn t e r m i n a l ，a ni n t r a - - c e l l u l a rc - t e r m i n a la n df o u rh y d r o p h o b i cs e g m e n t sm 1 ，m 2 ，m 3a n d m 4 i nt h e s es e g m e n t s ，m 1 ，m 3a n dm 4c r o s st h em e m b r a n ea n dm 2c o m b i n e sm 1a n dm 3 ，i n s i d et h e m e m b r a n e ，a n dm a d eu pt h ec h a n n e l si n n e rw a l l t h u st h ee x - c e l l u l a rn t e r m i n a la n dt h ee x - c e l l u l a r c i r c l eb e t w e e nm 3a n dm 4c o n t a i n st h eb i n d i n gs i t eo fl i g a n d s 3 福建师范大学胡志京硕士学位论文 _ i _ l i - - - - l _ _ _ i - _ - _ - _ - - i _ _ l - _ i ii i i - _ - - _ l _ _ _ _ _ _ - _ _ _ l - _ l _ _ _ _ _ i _ _ _ l n o c i c e p t o r t e r m i n a l p p o s t s y na i o t i c d o r s a lh o r n n e u r o n c g 酾p 。；，g 7 p 图2n m d a 受体及n o 胞内信号传递示意图【3 0 】 f i g 2t h en m d ar e c e p t o ra n dp r o d u c t i o no fn o a r ec o n s i d e r e dc r i t i c a lt od e v e l o p m e n to fc e n t r a l s e n s i t i z a t i o na n dh y p e r a l g e s i a n e u r o t r a n s m i t t e r sc o n t a i n e di nv e s i c l e sa n dr e l e a s e df r o mt h ec e n t r a l t e r m i n a l so fn o c i c e p t o r s ：c a l c i t o n i ng e n er e l a t e dp e p t i d e ( c g r p ) ，g l u t a m a t eq l u ) ，a n ds u b s t a n c ep ( s p ) w h e nr e l e a s e db yd e p o l a r i z a t i o no ft h en o c i c e p t o r , t h e s et r a n s m i t t e r sa c ta tt h e i rr e s p e c t i v e r e c e p t o r s ( n k - if o rs pa n dn m d a f o rg l u ) c o n t a i n e do nd o r s a lh o r nn e u r o n s a m o n gm a n y c o n s e q u e n c e so fr e c e p t o ra c t i v a t i o n ，c a l c i u mi ss h o w nh e r et oa c t i v a t ep r o t e i nk i n a s ec ( p k c ) a n d n i t r i co x i d es y n t h a s e ( n o s ) ，l e a d i n gt ot h es y n t h e s i so fn oa n da c t i v a t i o no fs o l u b l eg u a n y l a t ec y c l a s e ( g c s ) a n dp r o d u c t i o no fa n o t h e rm e s s e n g e r , c y c l i c g m eb o t hg i na n dn o c a na l s oa f f e c tt h e n o c i c e p t o rt e r m i n a la n dl e a dt of u r t h e rr e l e a s eo fg i n 1 2 2n m d a 受体在伤害性信息传递中的作用 在中枢神经系统，n m d a 受体参与突触可塑性和突触连接的形成，神经损伤能 力玎居t l n m d a 离子通道的开放。n m d a 受体在突触传递、神经可塑性、兴奋性神经毒 害中有重要作用1 1 9 1 。n m d a 受体的激活能引起脊髓神经元敏感，n m d a 受体通道打 开方式独特，为配体和电压依赖。电压依赖是由m 孑+ 对该离子通道的阻滞所引起， 4 第1 章绪论 i l j l ， ， ， f j f f 图3n o 反馈激活n n o s 的可能胞内途径 f i g 3ap o s t u l a t e dm e c h a n i s mo fn n o sa c t i v a t i o nb yn o a s ar e t r o g r a d em e s s e n g e r 福建师范大学胡志京硕士学位论文 1 3 一氧化氮 1 3 1n 0 的产生和作用方式 n o 由一氧化氮合成酶( n i t r i co x i d es y n t h a s e s ，n o s ) 催化l 精氨酸( l - a r g i n i n e ， l - a r g ) 而产生，它既能直接作用于其所在细胞，也能通过扩散而作用于邻近细胞。 由于n o 是气体，半衰期极短，很难直接测定其含量，研究中一般通过间接测定n o s 来反应n o 的生成量【3 1 】。n o s 一般分为3 种类型：神经元型( n e u r o n a ln o s ，n n o s ) 、 内皮型( e n d o t h e l i a ln o s ，e n o s ) 、诱导型( i n d u c i b l en o s ，i n o s ) 【翊。n n o s 和 e n o s 主要存在于脊髓和大脑中，它们合成的n o 作用持续较短；而i n o s 主要存在于 巨噬细胞、星形胶质细胞中，能较长时间产生n o 。 在中枢神经系统中，n o 即可作为神经递质，也可作为神经调质，广泛参与生理 和病理过程，如神经传递、突触可塑性、神经保护、神经毒性及神经病理性痛【3 3 ，3 4 1 。 作为一种自由的气体分子，n o 不像很多经典的神经递质，它既不储存于突触囊泡， 也不通过胞外分泌释放。在神经组织中，n o 一旦经n n o s 合成，即通过神经末梢扩 散到临近细胞发挥作用。因此，中枢神经系统中，n o 的释放主要通过n n o s 来调节。 1 3 2 n o 参与中枢神经系统的痛觉调制 在脊髓，n o 参与伤害性信息的传递。n o 的释放依赖于n m d a 受体【35 1 ，n o 能 增强脊髓兴奋性氨基酸的释放1 3 6 l 。有研究表明，n n o s 和n m d a 受体通过复杂的突 触后密度蛋白9 3 ( p o s t s y n a p t i cd e n s i t yp r o t e i n 9 3 ，p s d 9 3 ) 和突触后密度蛋白9 5 ( p o s t s y n a p t i cd e n s i t yp r o t e i n 9 5 ，p s d 9 5 ) 的p d z 结构域相偶联而发挥作用【3 7 l 。 此外，n o 参与伤害性信息传递还与c g m p 通路有关：伤害性信息到达脊髓后，脊髓 神经元兴奋性氨基酸分泌增加，兴奋性氨基酸和n m d a 受体结合后，n m d p 姻道被 打开，导致c a “内流，内流的c a 2 + 与钙调蛋白( c a m ) 结合，在还原型辅酶i i ( n a d p h ) 、 四氢生物蝶呤( t e t r a h y d r o b i o p t e r i n ，b h 4 ) 、黄素腺嘌呤二核苷酸( f l a v i na d e n i n e d i n u c l e o t i d e ，f a d ) 等辅助因子存在的条件下，n o s 以分子氧和l - a r g 为底物，合成 n o 。生成的n o 进而激活可溶性鸟苷酸环化酶( s o l u b l eg u a n y l a t ec y c l a s e ，s g c ) ， 引起细胞内环磷酸鸟苷( c y c l i cg u a n o s i n em o n o p h o s p h a t e ，c g m p ) 增加，激活蛋白 激酶、离子通道等下游信号因子j 通过蛋白磷酸化等作用，能诱导即刻早期基因大 量表达。鞘内给予n o 的供体，脊髓背角浅层c f o s 的表达增多。在皮下注射福尔马林 诱发的大鼠炎性痛模型中，应用n o s 的非选择性抑制剂l 广n g 硝基精氨酸甲酯 ( l 厂n g - n i t r oa r g i n i n em e t h y le s t e r ，l - n a m e ) ，n n o s 的选择性抑制剂7 硝基吲唑 产早心；托 ( 7 一n i t r o i n d a z o l e ，7 - n i ) 都能使脊髓背角c 1 0 s 的表达减少。在角叉菜胶( c a r r a g e e n a n ) 模型中，其引起的热痛觉过敏可以被n o s 抑制剂( i 广n 舢e ) 剂量依赖的抑制。进 一步研究发现，i n o s 在炎症后期参与该过程，而n n o s 参与了炎性痛发展的整个过 程p 引。此外，炎性因子也能促进n o 的合成与释放。炎性因子能提高神经胶质细胞 n o s m r n a 水平，n o 的增多反过来也能促使炎性因子的合成。n o 可以激活环氧合 酶2 ( c y c l o o x y g e n a s e 2 ，c o x 2 ) 合成前列腺素( p g s ) ，n o s 抑制剂l n a m e 则可 以抑制p g s 释放。 1 3 3 一氧化氮与阿片耐受 抑锘t n n o s 活性，能抑制或延缓阿片耐受。m i d a z o l a m ( 咪达唑仑，一种镇静催 眠药) 能够直接抑制大鼠脑n n o s 活性i 加1 ，降低吗啡耐受大鼠脊髓n n o s 和i n o s 的表 达，延迟耐受【3 3 】。用n o s 缺陷小鼠研究发现，持续给予吗啡后，n n o s 缺陷小鼠虽然 表现出一定的耐受，但其程度远比正常小鼠低【4 1 1 。低剂量的n o 具有止痛功能，但高 剂量的n o q l 起疼痛【1 4 3 1 。n n o s 具有n n o s 1 和n n o s 2 两种亚型，两种不同的n n o s 激活产生相反的效应【3 剐。n n o s 1 的激活减弱阿片肽的止痛效力，引起阿片耐受。相 反，n n o s 2 的激活增强阿片肽的止痛效力，并不引起阿片耐受。选择性的抑制 n n o s 1 ，能抑制吗啡耐受，相反，选择性的抑带t n n o s 2 ，则能促进吗啡耐受。这 说明很可能是n n o s 1 参与了吗啡耐受的发展【3 9 1 。 n m d a n o s 系统在吗啡耐受的形成中起重要作用。人们用n o s 抑制剂和 n m d a 受体拮抗剂或者外源性的给予n o 供体l - a r g i n i n e 来研究吗啡耐受和n o 的 关系。发现混合注射吗啡和n m d a 受体拮抗剂或n o s 抑制剂，均能减轻吗啡耐受。 相反，预先给予n o 供体l a r g i n i n e ，能提高体内n o 的浓度，导致吗啡耐受的形成 【1 4 4 1 。此外，n o s 也可通过其它途径参与吗啡耐受，如n o 能通过改变阿片受体 的功能而介导吗啡耐受，选择性n n o s 抑制剂7 n i ( 7 n i t r o i n d a z o l e ，s o d i u ms a l t ) 能 通过抑制脊髓小神经胶质细胞p 3 8 丝裂原活化蛋白激酶( p 3 8m i t o g e n - a c t i v a t e d p r o t e i nk i n a s e ，p 3 8m a p k ) 通路从而抑制吗啡耐受的发，土1 4 2 。 1 4 降钙素基因相关肽简介 1 4 1c g r p 的生物学特征及分布 降钙素基因相关肽( c a l c i t o n i ng e n e r e l a t e dp e p t i d e ，c g r p ) 是一级结构由3 7 个 氨基酸残基组成的多肽，分子量为3 7 8 6 9 1 ，其基因定位于第1 1 号染色体上，基因全 长7 6k b ，由2 8 0 0 个碱基对组成，其中含有6 个外显子, n 5 个内含子。在大鼠不同的组 福建师范大学胡志京硕士学位论文 织内，降钙素基因可转录生成2 种不同的m r n a ：在神经组织内，被剪接成编码为 c g r p 的m r n a ；而在甲状腺c 细胞，转录后的r n a 被剪接成编码为降钙素的 m r n a 。目前已失i i c g r p 有2 种类型，即q - c g r p 和b - c g r p 。q - c g r p 的m r n a 与降钙素的m r n a 来自同一基因，只是对转录后的r n a 进行了不同的加工所致，而 b - c g r p 是由独立基因编码的肽类物质【1 4 5 1 。 c g r p 广泛分布于中枢及外周神经系统，是体内一种重要的生物活性肽，对心脏、 血管、消化系统以及神经系统功能有重要的调节作用。脊髓、背根神经节和三叉神 经节内初级小型感觉神经元以及它们在脊髓和脑干中的投射纤维c g r p 密度很高 一j ，免疫组织化学结果显示，d r g 的小型神经元内c g r p 的含量较高，而中型细胞 内c g r p 的含量较少；在脊髓后角浅层可见到浓染的c g r p f i j 性纤维，而在深层、腹 角和中央管周围c g r p 表达较少【5 8 1 。c g r p 是由d r g 内发出的无髓纤维( c 纤维) 和 细的有髓纤维( a d 纤维) 的小型假单极细胞产生的。中枢和外周神经系统中的c g r p 在伤害性信息传递过程有重要作用。 1 4 2c g r p 参与痛觉信息传递的调制 c g r p 的释放及其受体的激活在慢性炎症性痛调制中至关重要。实验研究发现， 在福尔马林诱导的炎性疼痛模型中，可观察到投射到脊髓后角浅层的初级传入神经 纤维末梢中c g r p 样免疫活性物质明显增高，采用其他方法诱导慢性炎症痛时，也观 察到了同样的结果【4 5 , 4 6 , 4 7 1 。关节炎及生物因素诱导的慢性炎性模型中，l 4 , - - - l 6d r g i 内c g r p m r n a 表达增多【5 0 1 、c g r p 免疫活性物质含量升高【4 8 ，4 9 ，5 0 1 。d r g 受到慢性压 迫后，同侧脊髓背角c g r p 呈持续性升高，并与痛行为存在时间相关性【5 1 1 。免疫组 织化学结果显示，在慢性炎症痛时，c g r p 基因敲除大鼠脊髓背角和d r g 内均缺乏 c g r p 样免疫活性物质的表达【5 引。从以上事实，可以推测c g r p 参与慢性炎症性痛调 制：慢性炎症使脊髓d r g 感觉神经元内c g r p m r n a 表达上调，使神经元中c g r p 生 物合成增加，向神经纤维转运增多，并增加脊髓内c g r p 释放，激活c g r p 受体来传 递痛觉信息。 镇痛药可使d r g 内c g r p 免疫活性物质含量和脊髓内释放c g r p 明显减少，并使 痛觉过敏程度减轻【5 3 1 。应用c g r p 竞争性受体阻断齐i j c g r p 8 3 7 ，可明显延长大鼠热 和机械性刺激引起的缩爪反应潜伏期1 5 4 , 5 5 , 5 6 1 。鞘内注射抗c g r p 血i 清以去除c g r p 的 作用，发现c f a 或角又莱胶诱导的关节炎大鼠的痛阈增高。而鞘内注射c g r p 能明显 降低机械性刺激的痛阈，产生痛觉过敏，应用离子渗透技术给予c g r p ，可改变脊髓 后角神经元的兴奋性1 57 。研究发现，c g r p 基因敲除大鼠对伤害性刺激不表现出痛 觉反应，热板实验的热痛觉潜伏期延长【5 8 1 。这些结果说明，c g r p 为疼痛感觉及痛 觉过敏产生所必需。伤害性信息传入时，在脊髓背角，c g r p 由初级传入纤维末梢释 放，与突触后膜的c g r p 受体结合，导致脊髓背角神经元兴奋性增强，以介导伤害性 信息的传递。也有研究表明，c g r p 可作用于突触前膜的受体，影响其他与痛觉信息 传递有关的神经递质的释放，以促进伤害性信息在脊髓的传递过程【5 9 1 。 在脊髓以上水平，c g r p 及其受体出现于伏核( n a c ) 、杏仁核、中脑导水管周 围灰质( p a g ) 、中缝人核( n r m ) 等多个与痛觉密切相关的脑区。p e c i l e 等最早 发现大鼠脑室内注射c g r p 有镇痛效应【删。l i 等的研究结果显示：c g r p 在大鼠n a c 内的镇痛作用能被随后注射c g r p l 受体的拮抗齐u c g r p 8 3 7 所抑制，提示在大鼠n a e 内c g r p 是通过激活其c g r p l 受体而发挥作用；大鼠n a c 内单独注射c g r p 8 3 7 使其 缩爪潜伏期明显缩短，产生显著的痛敏作用，提示生理状态下，n a c 内可能就有一 定量的c g r p 分泌【6 1 1 。在大鼠n a cc g r p f l 皂弓i 起显著的镇痛作用；c g r p 8 3 7 作为阻 断剂除能阻断c g r p 的作用外，它还具有显著的诱导痛敏作用1 6 1 1 。c g r p 在p a g 中的 镇痛作用，是通过p a g 至i j 脊髓的下行痛觉抑制通路，激活脊髓的阿片肽系统而发挥 镇痛作用的。c g r p 在n r m 的镇痛效应也与内源性阿片系统有关【l 矧。综上所述，可 以看出c g r p 在脊髓以上水平是参与镇痛的。 1 4 3c g r p 与吗啡耐受 阿片耐受的机制目前还不是很清楚，大量证据显示脊髓水平痛神经递质的上调 ( 如c g r p ，s p ) ，是耐受发生的原因。脊髓水平的c g r p 上调，能引起疼痛并能减 弱阿片受体激动剂的急性抗伤害效力。研究表明，c g r p 减弱吗啡的抗伤害效力。持 续给予吗啡，引起脊髓背角浅层c g r p 表达升高，吗啡抗伤害作用减弱，表现为e d 5 0 上升。这两种反应均能被c g r p 受体竞争性抑制剂c g r p 粥7 所逆转【6 2 1 。混合应用 c g r p 受体竞争性抑制剂，能减弱吗啡耐受的发展。进一步说明了c g r p 参与了吗啡 耐受 6 3 , 6 4 1 。在阿片耐受的动物中，给予c g r p 受体拮抗剂c g r p s - - 3 7 6 2 】或 b i b n 4 0 9 6 b s l 6 5 1 ，都能够逆转阿片肽抗伤害性作用的减耕i c g r p 免疫阳性反应的增 强。用体外培养的d r g 神经元研究表明，在p k c 存在的状况下，阿片肽通过m u 一、 d e l t a 或k a p p a 阿片受体上调c g r p 的表达i 硎。体外研究表明，持续吗啡作用后，r a f - 1 在c g r p 的上游上调其表达【6 7 1 。此外，阿片类药物还可以通过激活c g r p 的转录因子 来调节c g r p 的表达【6 8 l 。综上，持续给予阿片受体激动剂后，胞内机制通过调节c g r p 福建师范大学胡志京硕士学位论文 的基因转录来增加其表达，c g r p 适应性的增多是阿片耐受产生的原因之一。 图4 慢性吗啡处理后，d r g 神经兀通过r a f 1 上调c g r p 表达可能途径【6 7 】 f i g 4p u t a t i v er o l eo fr a f - 1 m e d i a t e da cs u p e r a c t i v a t i o ni nt h er e g u l a t i o no f c g r pr e l e a s ef r o md r gn e u r o n sb ys u s t a i n e dm o r p h i n et r e a t m e n t 1 5 蛋白激酶c 与疼痛 蛋白激酶c ( p k c ) ，为丝氨酸苏氨酸激酶大家族蛋白，1 9 7 7 年被n i s h i z u k a 首 次发现，很快引起生物界和医学界的广泛兴趣。作为一种胞内第二信使，p k c 在神 经元兴奋性的调制、信号传导、神经递质的释放、突触可塑性等中起重要作用。大 量研究表明，p k c 主要通过活性或含量的变化参与伤害性信息的编码。p k c t 亚型 主要参与脊髓水平伤害性信息的传递，p k ce 亚型广泛分布于中枢和外周神经系统， 它能够增强神经细胞的兴奋性，参与伤害性信息在中枢和外周的传递。此外，长期 使用阿片类药物( 如吗啡) 后，p k c 上调，引起痛觉异常。p k c 对辣椒素受体( t r a n s i e n t r e c e p t o rp o r e n t i a lv a n i l l o i d1