（生物化学与分子生物学专业论文）锦灯笼果实水溶性多糖免疫增强作用研究.pdf

摘要 锦灯笼为茄科植物酸浆( p h y s a l i sa l k e k e n g il v a t 加n c h e t i i ) 的干燥宿萼或带果实 的宿萼。秋季果实成熟，宿萼红色或橙红色，略呈灯笼状。始载于神农本草经， 全草及果实均可入药，其果实性味甘、酸、寒，常用的清热解毒。除西藏外，全国各 地均有分布，以东北、华北产量大，品质最好。 锦灯笼果实含有多种活性成分，有降糖、抗菌、抗炎、抗癌、镇痛、利尿、抗氧 化等功效。但尚未见对其多糖免疫增强作用的研究报道。 本论文以锦灯笼果实水溶性多糖( p p s b ) 为实验材料，研究内容为：探讨p p s b 是否 具有免疫增强作用；比较p p s b 免疫增强效果是否优于铝佐剂；初步确定p p s b 作为免 疫佐剂的最佳剂量。用不同剂量的水溶性多糖p p s b 和0 v a 共同对雄性i c r 小鼠进行皮 下免疫实验( 以o v a 作为阴性对照，以铝为阳性对照) 。实验结果表明，p p s b 既能促进 细胞免疫应答又能促进体液免疫应答，特别是能促进t h 2 型细胞介导的细胞免疫应答 过程，即p p s b 具有强于铝佐剂的免疫增强作用；作为免疫佐剂的最佳剂量为1 0 0 i ，t g 只。 ( 1 ) p p s b 促进小鼠细胞免疫应答 在细胞免疫应答实验中，p p b s 能显著提高c o n a 或l p s 或o v a 诱导的小鼠淋巴细 胞的增殖。而铝佐剂不能显著提高c o n a 或l p s 或o v a 诱导的小鼠淋巴细胞的增殖； p p s b 能显著提高免疫小鼠脾细胞中c d 4 + 细胞亚群和c d 8 + 细胞亚群的数目。而铝佐剂 只能提高c d 4 + 细胞亚群数目，不能显著提高c d 8 + 细胞亚群的数目；p p s b 能显著提高 o v a 刺激的足底迟发型超敏反应，而铝佐剂对o v a 刺激的足底迟发型超敏反应没有 显著作用。 ( 2 ) p p s b 促进小鼠体液免疫应答 在体液免疫应答实验中，p p s b 能明显地促进小鼠血清中抗o v a 特异性抗体i g g ， i g g l 的产生，特别是能够促进i g g 2 b 抗体的产生。而铝佐剂只能促进抗o v a 特异性抗 体i g g ，i g g l 的产生，不能显著促进i g g 2 b 抗体的产生。p p s b 各组间比较：1 0 0 i t g 只组 效果显著优于其他各组。 该研究结果为锦灯笼果实多糖丌发为新型的免疫佐剂奠定了理论基础。 关键词：锦灯笼；多糖；迟发型超敏反应；佐剂 a b s t r a c t p h y s a l i sa l k e k e n g il o ft h ef a m i l yo fs o l a n a c e a ei sat r a d i t i o n a lc h i n e s eh e r b a lp l a n t d i s t r i b u t e da b u n d a n t l yi nt h en o r t h e a s tr e g i o no fc h i n a i th a sb e e nr e p o r t e dt oh a v em a n y e t h n o p h a r m a c o l o g i c a lp r o p e r t i e si n c l u d i n ga n t i - i n f l a m m a t o r y , a n t i c o l d ，a n t i - c o u g ha n d a n t i f u n g a la c t i v i t i e s s o m ea c t i v ec o m p o n e n t sf r o mpa l k e k e n g i ， s u c ha sp h y s a l i n ， a l k a l o i d s ，a n df l a v o n e ，h a v eb e e ni n v e s t i g a t e d h o w e v e r , n os p e c i f i cs t u d i e so n p o l y s a c c h a r i d e si s o l a t e df r o mpa l k e k e n g if r u i th a v eb e e nc a r r i e do u t i nt h i sp a p a r ：m a l ei c rm i c ew e r ei m m u n i z e ds u b c u t a n e o u s l yw i mo v aa l o n e o 、，a p p s bo ro 吼l u m a n di m m u n er e s p o n s e sa g a i n s to v aw e r ed e t e c t e d t h er e s u l t s s h o w e dp p s b s i g n i c a n t l y e n h a n c e dt h e c o n a - , l p s - 7 a n do v a i n d u c e ds p l e n o c y t e p r o l i f e r a t i o n ，e n h a n c e dt h ep r o p o r t i o no ft h ec d 4 十a n dc d 8 十tl y m p h o c y t e si ns p l e e no ft h e o v a i m m u n i z e dm i c e ，p r o m o t e dt h ed e l a y e dt y p eh y p e r s e n s i t i v i t yo fm i c ei m m u n i z e d a n de n h a n c e dt h ed 溺一s p e c i f i ca n t i b o d yt i t e r s ( i g gi g g l l i g g 2 b ) w h e nc o m p a r e dw i t h m i c ei n j e c t e dw i t ho v aa l o n e i nc o n c l u s i o n t h er e s u l t ss u g g e s tt h a tp p s bc o u l db o t h e n h a n c e dc e l l u l l a r i m m u n o l o g i cr e s p o n s ea n dh u m o r a li m m u n o r e s p o n s e e s p e c i a l l y e n h a n c e dh u m o r a li m m u n o r e s p o n s em e d i a t e db vt h lc e l l t h er e s u l t se s t a b l i s hr a t i o n a l ef o rm a k i n gp p s bb en e w t y p ei m m u n o l o g i ca d i u v a n t k e yw o r d s ：p h y s a l i sa l k e k e n g il ；p o l y s a c c h a r i d e ；d e l a y e dt y p eh y p e r s e n s i t i v i t y ；a d j u v a n t 独创性声明 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究 成果。据我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经 发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得东北师范大学或其他教育机构的学位或证 书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了 明确的说明并表示谢意。 学位论文作者签名：囊洱同期：j 轫卜工业 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解东北师范大学有关保留、使用学位论文的规定，即：东 北师范大学有权保留并向国家有关部门或机构送交学位论文的复印件和磁盘，允许论 文被查阅和借阅。本人授权东北师范大学可以将学位论文的全部或部分内容编入有关 数据库进行检索，可以采用影印、缩印或其它复制手段保存、汇编学位论文。 ( 保密的学位论文在解密后适用本授权书) 学位论文作者签名：毒知趴 日 期：训| 0 学位论文作者毕业后去向： 工作单位： 通讯地址： 指导教师签名：2 盎圣 e l 肌兰耻1 o 电话： 邮编： 东北师范大学硕士学位论文 引言 一免疫佐剂的研究 免疫佐剂是特指一种能促进、延长或加强抗原免疫原性和免疫保护效果的物质。作 用机理是免疫系统受到抗原物质刺激后，抗原可被抗原提呈细胞( a p c ) 如巨噬细胞、树突 状细胞摄取，d n - f 处理，通过m h c 或m h c 类分子途径提呈给t 淋巴细胞。t 淋巴细胞被激活、 复制、增殖、分化，成为效应t 淋巴细胞，分泌细胞毒素及诱导细胞凋亡以杀死带抗原的 靶细胞，分化为t h l 细胞或t h 2 细胞【l 翻。t h l 细胞分为介导迟发型超敏反应的t d t i 细胞和t c t l 细胞的增殖、分化、成熟，可促进细胞介导的免疫应答，也可辅助特异性i g g 2 a 亚类抗体 的产生，即t h l 应答。t h 2 细胞与b 细胞增殖、成熟和促进i g g l 亚类和l i g e 抗体生成有关，可 增强体液免疫应答，最p t h 2 应答【3 】。 传统佐剂如，核酸佐剂、细胞因子、脂质体、蜂胶等，对许多抗原具有促进免疫反应 的作用，但都有其自身的局限性，对于应用来说，亟待待于解决的缺点是：( 1 ) 毒副作用 问题如铝佐剂、q s 2 1 等；( 2 ) 免疫途径问题；( 3 ) 靶向性问题，如脂质体佐剂；( 4 ) 应用范 围( 用于不同的抗原) 问题，如铝佐剂等；( 5 ) 免疫剂量问题，女n c p g - o n d 等【4 】：( 6 ) 免疫作用 机制的不合理及作用机制不清楚问题，如铝佐剂不能诱导产生t h l 型反应，干扰细胞免疫 【5 】 o 因此随着研究的深入，免疫佐剂的研究应在体液免疫水平、细胞免疫水平及分子免 疫水平上，探讨免疫佐剂的作用机制；为进一步开发安全、低毒、高效的免疫佐剂提供 理论依据。天然药物由于自身特有的优势，必将在免疫佐剂的开发、免疫佐剂新用途的 研究中占有重要位置【6 1 。 目前对佐剂的研究主要集中在以下方面： 1 铝盐佐剂 铝盐佐剂包括硫酸钾铝、磷酸铝、钱明矾、钾明矾和氢氧化铝等，以氢氧化铝最为 常用。氢氧化铝是最早广泛用于禽类疫苗的免疫佐剂，也是唯一通过美国食品和药物管 理局( f d a ) 批准的能用于人的佐剂。现代以铝化合物为佐剂的疫苗可以分成两种，一种 是铝化合物沉淀疫苗，另一种是铝化合物吸附疫苗。后来的研究发现，氢氧化铝可以非 特异性地激活巨噬细胞，促进巨噬细胞产生，还能够激活补体系统【7 1 。但也存在许多缺 点，如只能激发体液免疫，不能诱导细胞介导的免疫反应；冷冻后胶体状态被破坏，不 能冷冻干燥，需要在低温状态下运输，造成运输的不便和成本的提高；制备的凝胶不同 批次之间差异很大，难控制质量，又难对佐剂效果做出准确评价；而且还会产生许多副 作用，如轻度局部反应、形成肉芽肿以及严重时会发生局部无菌性脓肿等【黏】。 东北师范大学硕士学位论文 2 乳油剂型佐剂 油乳剂中含有油和乳化剂。这类佐剂的作用机制是抗原包被在油相形成的微结构 内，使之形成贮存库而缓慢释放，刺激机体细胞产生抗体。油乳剂刺激局部产生肉芽肿 或炎症反应，吸引巨噬细胞等聚集，这些细胞产生大量的活性介质，这些活性物质又增 强了体液和细胞免疫。主要有弗氏佐剂、佐剂一6 5 、白油s p a n 佐剂等能增强细胞及体免 疫应答。弗氏佐剂分为弗氏完全佐剂和弗氏不完全佐剂两种。弗氏不完全佐剂是由低引 力和低粘度的矿物油及乳化剂组成的一种贮藏性佐剂。弗氏完全佐剂是在不完全佐剂的 基础上加一定量的分枝杆菌而成。弗氏佐剂可使正常状态下没有免疫原性的物质成为免 疫原，先作用于t h 。细胞，后是t h z 细胞，并能启动细胞免疫而发挥作用【1 2 】。佐剂- 6 5 在体 内可被代谢或分泌，用于人的流感疫苗，证明安全有效，但较弗氏佐剂效果稍差。白油 s p a n 佐剂是用轻质矿物油作油相，用s p a n - 8 0 或s p a n - 8 5 及t w e e n - 8 0 作为乳化剂制成的油 乳佐剂，是当前兽医生物制品中最常用最有效的佐剂之一。 3 脂质体 脂质体是人工合成的具有单层或多层单位膜样结构的脂质小囊，主要由磷酸类脂、 胆固醇、硬脂胺等组成的单层或多层双分子夹水结构，具有佐剂兼载体效应。在体内趋 向沉积于肝、脾、淋巴结等网状内皮巨噬系统内，延长在体内停留时间，减少疫苗用量、 降低毒副作用，提高免疫功能【l3 1 。j z n n 质、皂角苷、细胞因子等掺入或包被于脂质体能 引起很强的细胞免疫。其佐剂作用：增强体液免疫应答，能显著增加循环抗体滴度或 抗体形成细胞的产生；当口服免疫时，能显著增高局部i g a 的分泌，增强免疫记忆，增加 记忆细胞形成及回忆反应的强度；增强细胞免疫应答；增强巨噬细胞的吞噬作用， 增强抗原提呈作用；可作为半抗原的载体，诱发机体对半抗原的免疫应答f 1 4 1 。 4 蜂胶 蜂胶是一种有粘性、胶状、含有树脂的物质，并混入工蜂的上额腺分泌物和蜂蜡等 加工而成，具有广谱的生物学活性，是一种天然的免疫增强剂【1 5 1 。作为免疫增强剂得到 了深入研究和开发，受到医学界、兽医学界的青睐【l 引。应用蜂胶或配合抗原引入机体， 既能引起特异性免疫应答，又能启动非特异性防御机制，能刺激免疫机制和免疫球蛋白 活性，增加抗体产量，增强补体活性和吞噬细胞的吞噬能力1 1 7 】 5 免疫刺激复合物 主要适用于提高亚单位疫苗的免疫原性。它能活化免疫系统的三种抗原特异性淋巴 细胞辅助性t 细胞、细胞毒性t 细胞和b 细胞，可在增强体液免疫应答的同时诱导细胞免 疫应答。是一种全新的抗原提呈系统，具有佐剂和抗原提呈的双重功能。所以可刺激机 体产生强烈而持久的免疫应答。对于刺激机体产生对小分子量抗原或半抗原的免疫应答 尤为有效i l8 1 。应用于多种细菌、病毒和寄生虫病的疫苗，具有产生“全面”免疫应答的 效力。另外，其还能有效地通过黏膜给药，用于抗呼吸道感染。适用于传统疫苗及基因重 2 东北师范大学硕士学位论文 组亚单位疫苗的制备，其免疫活性大大高于同类产品及传统疫苗，兽用免疫刺激复合物 疫苗已在国外投放市场。 6 细胞因子类 细胞因子是由机体内免疫细胞或非免疫细胞产生，具有广泛生物学活性的异质性调 节因子，在体内能激活和调节免疫活性细胞，对免疫应答的产生和调节具有重要作用【l9 1 。 早在d n a 疫苗产生之前就有人把细胞因子作为免疫增强剂与疫苗联用，但由于细胞因子 在体内半衰期太短且造价昂贵，未能在传统疫苗中广泛应用。受d n a 疫苗以质粒作为抗 原载体的启发，以重组质粒表达的细胞因子- a g 细胞因子基因免疫增强剂，因克服了原 有的弱点而在d n a 疫苗领域中得到更多的重视和研究。已发现多种细胞因子具有佐剂效 应，在疫苗领域研究得最为活跃的是i l - 2 、i f n r 和i l 一1 2 等。 二多糖作为疫苗佐剂的可行性及存在的问题 多糖类物质作为免疫佐剂已进行了大量研究，它具有多种生物功能，如抗菌、抗病 毒、抗寄生虫、抗肿瘤、抗辐射、抗衰老【2 0 也4 】等作用，作为免疫调节剂，激活巨噬细胞、 t 淋巴细胞、n k 细胞等多种免疫细胞，促进细胞因子生成，活化补体。已有大量药理 和临床应用表明一些补益类中药多糖具有显著的免疫增强作用，这些具有明确增强机体 免疫功能的中药多糖有人参多糖、黄芪多糖、香菇多糖、银耳多糖、枸杞多糖、淫羊霍 多糖、肉苁蓉多糖、当归多糖、阿胶多糖、牛膝多糖等大约1 0 0 多种2 5 。2 8 1 。因此，越来 越受到研究人员的重视。 尽管多糖存在普遍的免疫调节与促进作用并且极有希望发展成为新型疫苗佐剂，但 还存在许多重要问题有待于深入研究。 2 1 均一性：多数多糖成分复杂且不易纯化，有些多糖含量低、分离提取困难，而 作为佐剂应提高纯度，避免其他成分的干扰，有利于从分子水平进一步研究其作用机理。 2 2 质量标准的控制：天然产物多糖成分受多种因素影响，质量标准不易控制，造 成实验重复性差，不符合国际规范，难以进入国际市场。 2 3 分子结构不明确：由于多糖及糖衍生物的结构测定因分离、纯化及研究技术的 限制仍有一定困难，使多糖结构与功能的关系、结构改善与化学合成等方面的研究受到 限制，不利于进入规模化生产。 2 4 影响多糖生物活性的因素较多：如品种、产地不同、采收时间差异，有效成分 的含量不如西药那样容易确定，甚至多糖的不同组分、亚组分的生物活性都可能会有很 大的差异，此外，多糖分子的立体构型、分子量、取代基、溶解度、粘度等也能影响其 生物活性，这给疫苗佐剂的筛选增加了难度。 2 5 量效关系：中药多糖的免疫调节作用呈一定的量效关系。一般中药多糖在小剂 量有免疫增强作用，而大剂量时有免疫抑制作用。因此要研究其作为佐剂的有效剂量范 围或最佳配比【2 9 j 。 由于多糖本身在上述方面有自身的研究难度和特殊性，因此当前的研究层次和水平 3 东北师范大学硕士学位论文 还远远落后于蛋白质和核酸这两大生命物质的研究，这给多糖的临床应用带来了很大限 制。因此，进一步探讨多糖的药理作用机制，还需要广大的化学家、生物学家和药学家 的共同努力以及发展各种先进的分离、分析、检测仪器和技术。 三、锦灯笼的研究现状及重要意义 锦灯笼为茄科植物酸浆( p h y s a l 括a l k e k e n g i 三v a r f r a n c h e t i i ) 的干燥宿萼或带果实的 宿萼。秋季果实成熟，宿萼呈红色或橙红色时采收。果实球形，果皮皱缩，宿萼微苦， 果实味甘，微酸，可作水果，营养丰富f 3 0 1 。 锦灯笼始载于神农本草经，名酸浆，在我国许多地区都有分布，各地亦有栽培， 陶弘景云：“处处人家多有，叶亦可食，子作房，房中有子如梅李大，皆黄赤色，d , j l 食之，能除热亦主黄病多效。 【3 i 】中药志中称锦灯笼味苦、性寒，有清热、利水之 功，可治疟疾、黄疸、疝气。纲目记载：“酸浆，利湿除热，除热则清肺止咳，利湿 故能化痰，治疽。州3 2 】可见，锦灯笼( 酸浆) 作为中药应用已有悠久的历史。 锦灯笼含有内酯类、黄酮类、萜类、生物碱类、甾醇类、氨基酸类及无机元素等几 大类化学成分。其中包括，酸浆苦素a ( p h y s a l i na ) ，酸浆苦素b ( p h y s s a l i nb ) ，酸浆 苦素l ( p h y s a l i nl ) ，酸浆苦素m ( p h y s a l i nm ) ，酸浆苦素r ( p h y s a l i nr ) ，木犀草素 ( l u t e o l i n ) ，木犀草素7 一p d 葡萄糖昔( l u t e o l i n 7 p d q l u c o s i d e ) ，酸浆果红素 ( p h y s a l i a n ) ，n 、p 一胡萝卜系素蕃茄烃( l y c o p e n e ) ，蓖若碱( t r o p i n e ) ，澳州蓖若碱 ( t i g l o i d i n e ) ，红古豆碱( c u s c o h y g i n e ) ，酸浆醇a ( p h y s a n o la ) 矛f l 酸浆醇b ( p h y s a n o lb ) ， 胆甾醇、豆甾醇，谷氨酸、天冬氨酸、脯氨酸及钾、磷、镁、钠、钙、锌、铁、铜、锰、 钡、铭等无机元素【3 3 3 9 1 。 据文献报道锦灯笼有多方面的药理作用。 锦灯笼多糖具有降血糖作用。本课题组多年来对锦灯笼多糖进行分离纯化，并对多 糖进行了结构分析，实验结果表明p p s b 组分均一，分子量2 7 k d a ，是一种含有g a l a 酸 性杂多糖，其单糖组成主要为a r a ，g a l ，g l c 和g a l a ，其中摩尔比依次为2 6 ：3 6 ： 2 ：1 。并对四氧嘧啶诱发的i 型糖尿病昆明小鼠有显著的治疗作用，能显著降低血糖值 及饮水量和排尿量，恢复发病小鼠体重1 4 们。 锦灯笼具有抗炎作用。酸浆苦素b ( p h y s a li n b ，p l l b ) 是锦灯笼的主要抗炎成分，常 用于上呼吸道感染疾病1 4 。 锦灯笼对心血管系统具有一定的作用。木犀草素对麻醉犬具有明显扩张冠脉血流量 及降低冠脉血管阻力的作用，对心脏耗氧量无明显影响f 4 2 】。 木犀草素具有体外抗柯萨奇b 3 病毒的作用【4 3 】。 木犀草素具较好祛痰作用。小鼠酚红试验和大鼠毛细管试验都已证明其祛痰作用， 对于咳痰，喘等症状均有较好的疗效。临床上，木犀草素为治疗慢性支气管炎的有效药 物【4 4 】。 锦灯笼宿萼和果实中含多种无机元素，其中人体宏量元素k 、p 、m g 、n a 、c a 的 含量最高，占所测无机元素的9 9 1 ，人体必需微量元素的含量顺序为f e c u z n m n 4 东北师范大学硕士学位论文 s r c r n i ，占所测无机元素的0 7 ，对人体有害的微量元素镉的含量很低，其它有害 微量元素还有铅、汞、铍、砷等一5 1 。 目前以锦灯笼为原料的食品及其药品市场上还不多见，为全面的认识和利用锦灯笼 这一广阔的植物资源，更深入了解其药理活性，我们以锦灯笼果为实验材料提取水溶性 多糖，分离纯化、对其免疫增强作用进行初步研究，为锦灯笼进一步开发和利用奠定基 础。 东北师范大学硕士学位论文 第一章实验材料 1 实验器材 c 0 2 培养箱：m c o 1 8 a i c 型 天平：f a l 0 0 4 型，上海天平仪器厂 电子天平：a b l 0 4 n 型，梅特勒一托利多集团 超净工作台：c j 2 f 型，苏州市金艳净化设备有限公司 离心机：s i g m a1 1 3 型，美国s i g m a 公司 酶标仪：e p s o ns t y l u sc 6 5 型，爱普生有限公司 显微镜：x d s 1 b 型生物倒置显微镜，重庆光学仪器厂 生化培养箱：d p x 9 0 8 2 b 1 型，上海福玛实验设备有限公司 9 6 孔培养板：美国s i g m a 公司产品 真空干燥箱：上海一恒科学仪器有限公司 旋转蒸发仪：上海亚荣化学仪器厂 流式细胞仪：美国b e c t o nd i c k n s o n 公司 游标卡尺：泰兴市三丰机械有限公司 高效液相色谱仪：日本s h i m a d z u 公司 2 主要试剂 新生小牛血清：杭州四季青生物工程有限公司，无菌 青链霉素液：s i g m ac h e m i c a lc o r p m l l 6 4 0 细胞培养液：美国s i g m a 公司产品 刀豆蛋白a ( c o n c a n a v a l i na ) ：美国s i g m a 公司产品 脂多糖( 1 i p o p o l y s a c c h a r i d e ，l p s ) ：美国s i g m a 公司产品 卵清白蛋白( o v a ) ：美国s i g m a 公司产品 噻唑蓝( 3 ，4 ，5 - d i m e t h y l t h l i a z o l 一2 ，5 - d i p e n y l t e t r a z o l i u mb r o m i d e ，m t t ) ：美国s i g m a 公司产品 过氧化脲( u r e a h y d r o g e np e r o x i d ea d d i t i o nc o m p o u n d ) ：美国s i g m a 公司产品 h r p 标记的羊抗鼠i g g l 和i g g 2 b 抗体：s b a ( s o u t h e r nb i o t e c h n o l o g ya s s o c i a t e s ， i n c ) 公司 辣根酶标记山羊抗小鼠i g g ( h + l ) 抗体：北京中杉金桥生物技术有限公司 t m b ：生工生物工程( 上海) 有限公司 盐酸异丙醇或二甲基亚砜：北京化工 c d 4 、c d 8 抗体标记物：b dp h a r m i n g e n 公司 其他所有试剂均为分析纯 6 东北师范大学硕士学位论文 3 实验材料 本实验所用材料锦灯笼购置于长春市光复路庆丰大厦 4 实验动物 清洁级i c r 纯系小鼠，体重( 2 0 士2 9 ) ，五周龄，雄性，由吉林大学公共卫生学院实 验动物中心提供，购得后饲养2 3 天进行免疫实验。 7 东北师范大学硕士堂僮迨文 第二章实验方法 1 锦灯笼果实水溶性多糖( p p s b ) 的分离纯化 1 1 锦灯笼果实水溶性粗多糖( p p s ) 的提取 将成熟的锦灯笼果实用组织破碎机破碎，沸水煮提后过滤，重复3 次，合并滤液， 浓缩，用三倍体积9 5 7 , 醇醇析过夜，离心，依次用9 5 7 , 醇、无水乙醇脱水，再用乙 醚干燥，即得粗多糖p p s ，置于盛有p 2 0 5 或n a o h 的真空干燥器内保存。 1 2 冻融分级【4 6 j 将1 1 所得粗多糖配制成5 糖液，冷冻过夜，置于室温缓慢融化，高速离心 ( 1 0 0 0 0 r p m ) 。重复数次，至基本无沉淀为止。然后用9 5 的乙醇醇析过夜，离心，常规 干燥得干燥样品。 1 3 分级醇沉 将1 2 所得粗多糖配制成5 糖液，依次用3 0 ，5 0 ，7 0 的乙醇进行分级醇沉， 取7 0 的乙醇沉淀常规干燥。 1 4 脱蛋白【4 7 】 取链蛋白酶( 按酶：蛋白= l ：2 0 0 ) ，加入到5 的多糖溶液中，加少量二甲苯防腐， 1 n a c i 作酶激活剂，3 79 c 保温2 4 小时，按糖液总体积1 4 加入s e v a g e 试剂( 氯仿：正 丁醇= 4 ：1 ) ，充分振荡1 2 小时，静置，离心，取上清，重复进行，至无游离蛋白为 止。然后用9 5 的乙醇醇析过夜，离心，常规干燥得p p s a 。 1 5s e p h a r o s ec l 一6 b 柱层析纯化 将脱蛋白后的p s p a 配成5 糖溶液经s e p h a r o s ec l 一6 b ( 2 5 x 9 0 c m ) 柱层析，酚硫 酸法测多糖分布，收集糖峰洗脱液，经浓缩、真空冷冻干燥，最终得白色粉末状多糖 p p s b 。 p p s b 提取流程图： 锦灯笼果实 j ( 水提醇沉，常规干燥，冻融) 粗多糖 j ( 分级醇沉) 较纯的糖 ( 脱蛋白，上柱制备) p p s b 8 一 奎j 量堕堇太堂亟堂焦迨窒 _ _ _ _ _ _ _ _ - _ - _ _ _ _ _ - - _ _ _ _ _ 。_ _ 一 2p p s b 的性质测定及纯度鉴定 2 1p p s b 的性质测定 2 1 1 总糖含量测定( 酚一硫酸法) j 将1 0 m g 1 0 0 m l 糖溶液，6 的苯酚溶液，浓h 2 s 0 4 依次按1 ：o 5 ：2 5 的比例加入，振 荡，静止，冷却，然后在4 9 0 n m 波长下比色，所得数值查标准曲线可得总糖含量。 2 1 2 蛋白含量测定( 凯氏定氮法) 准确称取糖样1 0 0 m g ，加入5 m l 浓硫酸，加半勺催化剂( k 2 s 0 4 ：c u s 0 4 5 h 2 0 = 3 ：1 ) 。 明火( 挚石棉网) 加热，变黑后加少许高氯酸( h c l 0 4 ) ，继续加热至溶液变浅透明( 淡绿色) 。 冷却定容至5 0 m l 。蒸馏，与硼酸反应，用0 0 1 nh c l 滴定，通过计算得总蛋白含量。 2 2p p s b 的纯度鉴定 取3 m g p p s b 溶于l m l 纯水中，用超声波处理5 m i n 以使多糖充分溶解，进行h p l c 分 析，测定其均一性和分子量。 日本s h i m a d z u 公司生产高效液相色谱仪， s h i m a d z uc l a s s v p 工作站 色谱柱：不锈钢色谱柱t s k - g 3 0 0 07 8 m m 柱温：4 0 。c柱操作压力：1 6 m p a r i d 一1 0 a 视差折射鉴定器， ( i d ) x 3 0 0 c m ( l ) 流动相：硫酸钠溶液流速：0 5 m l m i n进样量：2 0pl 2 3 气相色谱法( g c ) v a v i a n3 4 0 0 气相色谱仪附f i d 检测器h p 3 3 6 5 化学工作站 色谱柱：d m 一2 3 3 03 0 m x 0 3 2 m m x 0 2 1 t m 气化：3 0 0 检测：3 0 0 柱温：1 2 09 c ( 2 m i n ) ! ! ! 竺2 凹。c ( 3 0 m i n ) 载气：高纯氮气 3p p s b 免疫增强作用的研究1 4 啦5 9 】 3 1 动物免疫 五周龄雄性i c r 小鼠3 0 只，随机分五组，每组5 只。 分组及各组剂量如下： 第一组( s a l i n e ) ：皮下注射生理盐水，空白对照 第二组( o v a ) - 皮下注射o v al o o t , g 只，阴性对照 第三组( a l u m ) ：皮下注射( o v a10 0 肛g + a l u m2 0 0 t g ) 只，阳性对照 第四组( p p s b5 0 ) ：皮下注射( o v a10 0 i t g + p p s b5 0 t g ) 只 第五组( p p s b1 0 0 ) ：皮下注射( o v a1 0 0 t x g + p p s b1 0 0 ，t g ) 只 第六组( p p s 32 0 0 ) ：皮下注射( o v a1 0 0 9 9 + p p s b2 0 0 i t g ) 只 第一至第三组为对照组，分别用生理盐水，o v a ( 1 0 0 i t g 只) 和a l u m ( o v a1 0 0 t g + 东北师范大学硕士学位论文 a l u m2 0 0 9 9 只) 来免疫小鼠。第四全第六组为实验组，分别用o v a ( 10 0 嵋) 和各种剂量的 p p s b 共同免疫小鼠，p p s b 的剂量依次为5 0 ，1 0 0 和2 0 0 p g 只。 给药方式为背部皮下两点注射，以上各组均免疫两次，每隔1 4 天一次。第一次免 疫前，第四至第六组连续两次单独注射p p s b ( 以各组的实验剂量为准) 。第二次免疫1 4 天后眼球采血制备血清，用e l i s a 检测小鼠抗血清中抗o v a 特异性抗体( i g g ，i g g l ， i g g 2 b ) 的效价，并在无菌条件下制备小鼠脾淋巴细胞悬液，分别用于流式细胞荧光标记 选择法检测t 细胞亚群含量的变化实验，和m t t 法检测脾细胞中c o n a 、l p s 及o v a 诱导的小鼠脾淋巴细胞增殖实验。 3 2p p s b 对细胞免疫应答的影响 3 2 1 小鼠脾淋巴细胞增殖试验 3 2 1 1 脾细胞悬液的制备 将小鼠断颈处死，用7 5 的酒精浸泡消毒；无菌条件解剖小鼠取脾；用剪刀剔除结 缔组织和脂肪。将脾组织置于平皿内，用纱布轻轻研磨( 有1 6 4 0 培养液) ，用纱布过滤， 用1 6 4 0 培养液冲洗纱布。悬液收集到无菌离心管，1 5 0 0 r p m m i n ，离心5m i n ，弃上清 液，加入红细胞裂解液，l o m i n 后，1 5 0 0 r p r n m i n ，离心5m i n ，用1 6 4 0 培养液洗涤细 胞两次，用r p m l l 6 4 0 培养液稀释成l x l 0 7 个m l 单细胞悬液，用于淋巴细胞转化实验和 特异性t 淋巴细胞检测实验。 3 2 1 2p p s b 对脾淋巴细胞增殖反应实验 于9 6 孔培养板中，每孔加1 0 0 p 1 脾细胞悬液( 1 x 1 0 6 个r n l ) ，各孔加等体积的c o n a 溶液( 终浓度为5 1 t g m 1 ) ，或l p s 溶液( 终浓度为l o p g m 1 ) ，或o v a 溶液( 终浓度为 1 0 p g m 1 ) ，重复3 孔，用r p m l l 6 4 0 ( 1 0 0 i u m l 青霉素，1 0 0 p g m l 链霉素，1 0 t b 牛血清) 补到2 0 0 1 a l ，另设空白对照组( 即：不加丝分裂原培养物c o n a ，l p s ，o v a 只用r p m l l 6 4 0 补至2 0 0 i - d ) 。3 7 ( 2 、5 c 0 2 培养箱中培养6 8 h 后，各孔分别加2 0 “lm t t 溶液( 5 m g m 1 ) ， 继续培养4 小时，吸去上清，加入2 0 0 p 1 酸性二甲基亚砜( d m s o ) 溶液，振荡，于室温 放置1 5 m i n ，用酶标仪于5 7 0 n m 处测定o d 值，并按下式计算刺激指数( s 1 ) ： s i ( 束u 激指数_ ) = 加有丝分裂原培养物的o d 值环加有丝分裂原培养物的o d 值。 3 2 2p p s b 免疫小鼠特异性t 淋巴细胞检测实验 取制备好的脾细胞悬液10 0 p 1 ( 1 10 6 个细胞) 加到0 4 m l 的p b s 缓冲液中，分别加入 稀释后的c d 4 + 或c d 8 + 单克隆抗体1 0 1 t l ，4 反应1 h 后，8 0 0 9 m i n 离心5m i n ；p b s 洗3 次，每次加l m l 的p b s ，8 0 0 9 m i n ，离心5m i n ；将管内细胞用2 0 0 p 1p b s 悬浮， 待上流式细胞仪：f a c s 检测5 0 0 0 10 0 0 0 个细胞，所得数据进行统计学处理分析。 3 2 3p p s b 诱发的迟发型超敏反应实验( 6 0 】 迟发型超敏反应是检测细胞免疫的一个指标。免疫动物分组及剂量选择同3 1 ，给 药方式为皮下注射，以上各组均免疫一次，免疫一周后在每只小鼠左足脚掌二三肢之间 注射2 0 p l 浓度为1 m g m l 的o v a ，右足脚掌注射2 0 l 的生理盐水，7 2 h 后用游标卡尺 测量左右脚掌足挚的厚度，左脚脚掌足挚的厚度减右脚脚掌足垫的厚度，对差值进行显 l o 东北师范大学硕士学位论文 著性分析。 3 3p p s b 对体液免疫应答的影响 免疫小鼠抗血清中抗o v a 特异性抗体的抗体滴度测定 3 3 1 抗血清的收集 末次给药1 4 天后摘除眼球采集各组小鼠血液，置于4 。c 过夜，分离各组血清，并分 装保存，用于e l i s a 实验。 3 3 2 血清中抗o v a 特异性抗体滴度的测定 于9 6 孔酶标板上，每孔加入1 0 0 i r t l 包被液( 含5 0 p g m lo v a 的0 0 5 m ，p h 9 6 的碳 酸盐缓冲液) ，置40 c 孵育过夜，用洗涤缓冲液( p b s + t w e e n 2 0 ) 洗涤( 3 次，每次间隔3 m i n ) 。 每孔加封闭液1 0 0 1 ，于3 7 。c 孵育1 h ，洗涤，然后加1 0 0j _ t l 一系列稀释倍数的待测血清， 重复3 孔，3 7 。c 孵育l h ，洗涤。每孔加1 ：5 0 0 0 的辣根过氧化物酶标记的山羊抗小鼠( i g g 或i g g l 或i g g 2 b ) 抗体稀释液1 0 0 肛1 ，3 7 。c 孵育o 5 h ，洗涤。每孔分别加5 0 肛l 底物显色 液a 和底物显色液b ，室温放置15 m i n ，每孔加终止液( 2 mh 2 s 0 4 ) 5 0 l d 终止反应，用酶 标仪于波长4 5 0 6 3 0 n m 处测定o d 值。以生理盐水( 空白对照组) o d 值的二倍( o 0 6 ) 作为 临界值，取各稀释倍数的待测血清的o d 值超过临界值的最大稀释倍数m ，则以2 为底， m 的对数值即为抗体滴度。 3 4 统计学分析 所得数据用平均值士标准差表示，并用t 检验法比较各组间的统计学差异，显著水 平p 0 0 1 为差异极显著，p ( 0 0 5 为差异显著。 东北9 币范大学硕士学位论文 第三章结果与分析 1p p s b 的提取纯化及纯度鉴定 1 1p p s 的分离提取及单糖组分分析 将锦灯笼果实捣碎后，沸水煮提后过滤，重复3 次，合并滤液，浓缩，用三倍9 5 乙醇醇析过夜，离心后常规干燥得粗多糖p p s 。粗多糖p p s 为棕黄色粉末，易溶于水。 1 2p p s 中总糖含量及蛋白质含量 1 2 1 经苯酚一硫酸法测定，p p s 中总糖含量3 5 1 。 1 2 2 凯氏定氮法测得p p s 中蛋白质含量为2 0 1 。 1 2 3 粗多糖的s e p h a r o s ec l 6 b 柱层析 p p s 经s e p h a r o s ec l 6 b 柱( 1 5 x 9 0 c m ) 层析，苯酚硫酸法测糖分布，粗多糖分子量分 布广泛( 图1 ) 。 臂数 图1p p s 经s e p h a r o s ec l 一6 b 柱分析其成分及分布 1 3p p s b 的分离纯化 1 3 1 反复冻融 将p p s 配成5 糖液放在一8 0 。c 冷冻，室温缓慢融化，高速离心( 1 0 0 0 0 r m i n ) ， 反复多次至无沉淀为止，然后用9 5 的乙醇醇析过夜，离心，常规干燥。 1 3 2 脱蛋白 将p p s 用链霉蛋白酶与s e v a g 法联合脱蛋白，透析，醇沉；用9 5 无水乙醇、乙 醚依次脱水，真空干燥得淡黄色粉末状多糖p p s a 。紫外扫描在2 6 0 n m 、2 8 0 n m 均无吸 收峰( 图2 ) 东北师范大学硕士学位论文 图2p p s b 紫外扫描检测其蛋白含量 1 3 3 乙醇分级 将p p s a 配成5 溶液，滴加无水乙醇，使乙醇浓度分别达到3 0 ，5 0 和7 0 ， 离心分离沉淀，7 0 级分用于下述实验。 1 3 4s e p h a r o s ec l 6 b 制备柱收集 将7 0 级分经s e p h a r o s ec l 6 b 制备柱收集，纯化得到p p s b ，冷冻干燥，真空保 存。 1 4p p s b 纯度鉴定 p p s b 经h p l c 分析，为单一狭窄对称峰，分子量约为2 7 k d d a ( 1 药3 ) 。 图3h p l c 分析其均一性及分子量 1 5p p s b 组成分析 气相色谱分析表明单糖组成为a r a ；g a l ；g l c ；g a l a ，其摩尔比为2 6 ：3 6 ：2 ：1 ( 图 东北师范大学硕士学位论文 图4 p p s b 的气相色谱图 2p p s b 免疫增强作用的研究结果 该实验以p p s b ( 5 0 ，1 0 0 和2 0 0 9 9 ) 与o v a 共同对i c r 小鼠进行皮下免疫，4 周后 眼球取血，制备血清( 检测i g g 、i g g l 和i g g 2 b 抗体滴度) 。并在无菌条件下制备小鼠脾 淋巴细胞悬液，用m t t 法检测p p s b 对c o n a 、l p s 及o v a 诱导下的小鼠脾淋巴细胞 增殖的影响，用流式细胞仪检测免疫小鼠脾细胞中t 淋巴细胞亚群含量的变化；用 e l i s a 方法检测p p s b 对小鼠抗血清中抗o v a 特异性抗体i g g 、i g g l 和i g g 2 b 抗体滴 度的影响。 2 1p p s b 对细胞免疫的影响 2 1 1p p s b 对小鼠脾淋巴细胞增殖的影响 2 1 1 1p p s b 对c o na 诱导的小鼠脾淋巴细胞增殖的影响 p p s b 对c o na 诱导的小鼠脾淋巴细胞增殖反应的影响结果见表1 和图5 。结果显 示：p p s b 组中1 0 0 和2 0 0 肛g 只剂量组，与o v a 对照组相比，能显著促c o na 诱导的 小鼠脾淋巴细胞增殖反应( 依次为p 0 0 1 ，p 0 0 5 ) ；与a l u m 阳性对照组相比差异显著 ( 尸 o ol ，p 0 0 5 ) 。而铝佐剂不能显著促进c o na 诱导的小鼠脾淋巴细胞增殖反应。 表1 ：p p s b 对c o n a 诱导的小鼠脾淋巴细胞增殖反应的影响 组别 s l 值 1 5 6 + 0 0 4 2 1 5 9 + 0 0 2 0 1 6 1 + 0 0 1 2 1 6 4 + 0 0 6 0 1 8 4 士0 0 6 0 * * a 1 7 5 圭0 i1 幸8 注：实验测定值用平均值士标准差表示( n = 5 ) ，各组与o v a 对照 组比较p 0 0 1 用宰章表示，p 0 0 5 用幸表示，与a l u m 组相比 p 0 0 1 用a 表示，p 0 0 5 用a 表示。 1 4 0 0如m 加讼啪嘲啪蹦叭觚肿即即 东北师范大学硕士学位论文 2 1