（光学工程专业论文）微流控芯片检测仪.pdf

浙江大学硕士学位论文 摘要 本文简要介绍了微流控芯片及微流控芯片检测系统的概念、应用领域和发 展前景，并介绍了我们所研制微流控检测仪的全过程。 本文首先从理论基础方面，对检测系统进行研究和讨论，紧接着进行光学 设计、结构设计、电路设计并进行配套软件开发，设计一台集光、机、电、软件 为一体的综合仪器。当仪器装置完成以后，进行数百次的实际试验，对试验结果 进行分析，并针对分析结果研究讨论影响检测能力的各种因素，最后对此台仪器 进行总体优化。 由于微流控芯片采取微通道结构，要求对极低浓度试剂进行检测，并逐步提 出对单个分子进行检测，以此要求我们所设计的检测仪具有很高的灵敏度、信噪 比、反应速度。因此为了提高信噪比，我们在光路设计优化之外，设定特定波长 的滤光片、选择适当大小直径的针孔、对所有部件特殊处理等对检测中可能发生 的杂散光也进行了相应处理；此外设计了信号放大电路、软件滤波处理等。另外 便于操作，我们自行开发的软件除功能完成之余，设计了良好的人机界面。 到目前为止，我们所设计的微流控芯片检测仪器，已经满足微流控芯片的各 类检测要求，可直接进行生命医学、化学分析及相关检测使用。对于微流控芯片 检测技术的发展有很好的推动作用。此外，仪器具有微型化、集成化特征，并具 备了很好的检测能力，具有广阔的应用前景。 关键词：微流控芯片，检测仪，信噪比。 浙茳大学颈士学位论文 a b s t r a c t t h i sp a p e r , i n t r o d u c e st h ec o n c e p to fm i c r o f l u i d i cc h i p s ，a n di t ss y s t e m s ， a p p l i c a t i o ns c o p eb r i e f l y f u r t h e r m o r e ，t h i sp a p e ri n t r o d u c e sw h o l ed e v e l o p m e n t p r o c e s s f i r s t l y , t h ed e t e c t i o nt h e o r i e sa r ed i s c u s s e da c c o r d i n gt ov a r i o u sd e t e c t i o n p r i n c i p l e s t h e n ，t h eo p t i c a ld e s i g n ，c i r c u i td e s i g n ，s t r u c t u r ed e s i g na n d t h es o f t w a r e a r ed e v e l o p e d b yt h i sw a y , w ef i n a l l ym a n u f a c t u r e dam u l t i - d i s t i l ；，i i n a r yi n s t r u m e n t a n dm a d ee x p e r i m e n t so ni tf o rh u n d r e d so f t i m e s t h r o u g ht h ea n a l y s i sr e s u l t s ，w e s t u d i e do nt h ev a r i o u sf a c t o r st h a ti n f l u e n c et h es i g n a lt on o i s er a t i o ( s h o r t e df o r s n r ) ，a tj a s t ，t h eo v e r a l lo p t i m i z a t i o nw 猫m a d eo nt h i sj n s t r u m e n t 。 f o rt h er e a s o nt h a tm i c r o f l u i d i cc h i p sa d o p tm i c r oc h a n n e l ，d e t e c ts u p e rl o w e n s i t yr e a g e n t ，a n dd e t e c ts i n g l em o l e c u l e ，t h ei n s t r u m e n tm u s th a v et h ec h a r a c t e r i s t i c s u c ha s ：h i 曲s e n s i t i v i t y , h i g hs n r ，r e a c t i o ns p e e d f o rh i g hs n r , w eh a v ed e s i g n e d s p e c i a lf i l t e ra n ds u i t a b l ep i n h o l ei na d d i t i o n t om i t i g a t i n gt h es t r a yl i g h t f u r t h e r m o r e ，w ed e s i g n e dt h es i g n a la m p l i f i e ra n ds o f t w a r ef i l t e nf o rc o n v e n i e n c e ， w ea s od e s i g n e daf r i e n d l yo p e r a t m gs y s t e m c u r r e n t l y , o u ri n s t r u m e n th a ss a t i s f i e dt h ec h i p s v a r i o u sd e t e c t i n gr e q u i r e m e n t s t h i si n s t r u m e n tc a r ld i r e c t l yc a l t yo u tl i f es c i e n c e sd e t e c t i o n ，c h e m i c a la n a l y s i sa n d o t h e rd e t e c t i o n , a n da l s op r o m o t et h em i c r o f l m d i ct e c h n i q u e m o r e o v e lt h i s i n s t r u m e n th a sh a dc h a r a c t e r i s t i cs u c ha sm i c r o m a t i o n ，i n t e g r a t i o n ，a n de x c e l l e n t d e t e c t i n ga b i l i t y s o ，t h i si n s t r u m e n th a sa d e f i n i t ea n dp r o m i s i n ga p p l i c a t i o nf u t u r e k e yw o r d s ：m i c r o f l u i d i cc h i p s ，d e t e c t i o ni u s t m m e n t ；s i g n a lt on o i s er a t i o 2 浙江大学硕士学位论文 1 1 课题背景 第一章绪论 二十一世纪被称为“生物工程的时代”和“高信息化的时代”，科学技术将 获得更加迅猛的发展。分析化学处于广泛的、深刻的、激烈的巨大变革时期，不 断向微型化、自动化、仿生化、信息化等方向发展，微流控芯片将成为及其重要 的发展方向。 后基因时代的d n a 研究；突发公共卫生事件的检测和免疫分析；疾病的早 期诊断与临床监测。细胞水平、基因水平和蛋白质水平的研究和确认；生物与化 学武器的探测；海关和商检中的检验和分析，无一不需要先进的测试技术与装备。 微流控芯片和检测技术正是微生化的前沿检测技术，而微流控检测仪则是将此检 测技术推广的关键设备。 创新分析测试技术在人类发展的历史上对全世界的科学科技与经济发展起 到了极其重要的推动作用。近百年来的诺贝尔奖约有5 0 多项成就与创新分析测 试技术有直接关系，如x 光晶体衍射技术、质谱技术、电子显微镜技术、色谱 和电泳技术、电化学技术、光谱技术、核磁共振技术、核酸和蛋白测序技术等。 创新测试技术及在其基础上发展出的创新分析测试仪器在很大程度上代表了一 个国家的科技水平，并保证了技术先进的国家在相关领域的知识和技术的战略储 备和可持续发展能力。在以生命科学为主导的2 1 世纪，与生命科学相关的分析 测试技术集中体现了当今世界各项高新技术的综合水平、已逐渐显示出其在科技 发展中的关键作用。在人类基因组计划完成过程中，分析技术所起到的重要，甚 至关键作用已为人们所熟知；时至今日的后基因组时代，发展创新的先进生化测 试技术已成为国际生命科学领域和生物高技术的战略制高点和竞争焦点。当今的 尖端测试分析技术已成为保证经济持续高速发展、保障国家安全、实现人民生活 水平与健康水平不断提高的重要基础条件。海关和商检中的检验和分析，无一不 需要先进的测试技术与装备。在本世纪分析测试技术将空前普及，在一二十年内 将会实现分析测试仪器从实验室走进家庭、战地、甚至个人生活的目标。为实现 这一远景，新一代分析测试技术的总的发展方向是更加微型化、自动化、快速化 5 浙江大学硕士学位论文 与便携化。9 0 年代出现的微全分析系统( j n a s ) 正是为实现这一战略目标服务 的主要领域之- - ”。 1 2 微流控芯片与微阵列芯片( 生物芯片) 的区别 从历史沿革、理论基础、发展目标和体系的具体结构看，微流控芯片与微阵 列芯片均属两个不同领域。虽然它们在发展中都借助了m e m s 技术，且目前都 主要在为生命科学服务，但其学科界限是清楚的。本节之所以要对此予以特殊说 明是因为在我国，二者的界限往往在“生物芯片( b i o c h i p ) ”的含混冠名下变得有 些模糊不清。参考图1 1 。 图1 ，1 左侧，典型的微流控芯片( c a l i p e r t e c h n o l o g i e s ) 右侧。典型微阵列( 生物) 芯片 的局部多色荧光图象 从微流控芯片与微阵列芯片的结构看，前者以微通道网络及众多分析功能元 件的集成化为特征，后者则以高密度的微探针阵列为特征。微阵列芯片的发展要 稍早于1 a s 概念的提出，更早于微流控芯片。微阵列芯片的基础研究始于上世 纪8 0 年代末，它本质上是一种生物技术，主要是在生物遗传学领域发展起来的。 其发展契机主要来自于现代遗传学的一些重要发现，并直接受益予该领域的某些 重要研究成果，即在载体上固定寡核苷酸的基础上以杂交法测序的技术。为此， 在其发展的早期，微阵列芯片有时被通俗地称为“生物芯片”，且目前在媒体报 道和科普读物中仍时常使用。然而由于这一俗名在内容上的不确定性，“生物芯 片”的称谓始终未被国际学术界广泛接受。根据i s iw e bo fs c i e n c e 互联网站查 询结果：1 9 9 7 至2 0 0 4 年的主要8 年发展期，与“b i o c h i p ( 生物芯片) ”相关的学 术论文仅收录3 0 2 篇，而与“m i c r o r r a y ( 微阵列) ”【2 】一词相关的论文则高达1 1 , 2 0 7 6 浙江大学硕士学位论文 篇。为规范起见，本书各章节将避免使用“生物芯片”一词，而代之以“微阵列 芯片”。与微阵列芯片的情况不同，“生物芯片”从来不是微流控芯片的通俗称谓。 微流控技术早期是从i v i e m s 技术发展出来的，如前节所述，它服务面相当广泛， 也未必总以芯片形式出现，事实上，首先是在打印机行业取得重大进展。1 9 9 0 年在i a s 概念提出之后不久，微流控技术很快成为实现胛a s 的终极目标在微 型化的基础上实现全部分析过程的集成化的理想技术平台。在此基础上发展的 微流控芯片通过微通道中流体的控制把整个化验室的功能，包括采样、稀释、加 试剂、反应、分离、检测等集成在邮票或信用卡大小的芯片上，因而被通俗地称 为“芯片实验室”。1 3 国内在一些场合和在媒体中常有意无意地将微流控芯片与微阵列芯片混为 一谈，并统称为“生物芯片”，虽方便于宣传，但此做法在学术上欠严密，既不 利于国际交流，也不利于两个学科的健康发展。将两种芯片进行区别的认识在国 际范围内被广泛接受，如前述被列入美国分析化学鼹年一次的u t a s 综述中 明确指出该综述内容只包括“服务于分析化学的微流控系统”而不包括微阵列芯 片( 生物芯片) 。参考表1 。 微流控芯片微阵列芯片 主要依托学科分析化学、m e m s生物学、m e m s 结构特征微管道网络微探针阵列 工作原理微管道中流体控制生物杂交为主 使用次数重复使用数十至数予次一般一次 前处理功能多种技术供选择基本无 集成化对象 全部化学分析功能 高密度杂交反应阵列 应用领域全部分析领域d n a 等专用生物领域 产业化程度初始阶段深度产业化 表1 微流控芯片与微阵列芯片的比较 7 浙江大学硕士学位论文 分辨两类芯片的学科界限不等于否认二者之间的联系。微流控芯片可成为微 阵列芯片的进样与试样前处理系统，而微阵列芯片可成为微流控系统的专用传感 器。以此为指导思想将有利于两种芯片的共同协调发展。 图1 2 芯片毛细管电泳示意图 ( a ) i c e 芯片示意图 ( b ) 实验中实际使用的i c e 芯片，由浙江大学化学系提供 1 3 微流控芯片在生命科学研究中的应用 1 3 1 微流控芯片在基因分析中的应用 2 0 世纪9 0 年代，人类基因组计划高速度发展，人类对生命世界的认识达到 了前所未有的深度和广度，其划时代的研究成果一人类基因组序列草图的完成宣 告了后基因组时代的到来。人们在欢呼基因组计划辉煌业绩时，也愈来愈认识到 检测工具的重要。科学的发展能够催生新的检测手段，反过来新的检测手段的建 立又促进科学技术更迅速地向前发展。人类基因组计划的提前完成正是得益于阵 列毛细管电泳等先进检测技术的发展。在后基因组时代，新的检测技术仍将发挥 引领作用，其中微流控芯片技术将是最有发展前途的技术之一。 1 3 1 1 核酸分析 微流控芯片分析在生命科学领域的主要应用对象之一是核酸分析。由于在微 通道条件下旌加电场产生的焦耳热效应低，注入的试样量少，分子扩散程度低， 因此微流控c e 分析在核酸诊断分离中的分辨能力远远好于平板凝胶电泳。微芯 片的快速高质量的分离效能在寡核苷酸、d n a 、r n a 片段分析以及基因表型和 测序应用中得到充分反映。 8 浙江大学硕士学位论文 微芯片上的d n a 基因型分析可迅速完成基因鉴别，显著地提高其在基因组 学、诊断学、遗传药理学、法医学检验方面的性能。在芯片上已经成功地完成了 与遗传疾病，例如肌肉营养失调嗍、血色素沉蓿症嗍有关的基因鉴别工作。此外 还有用于短串联重复系列分析的超快速等位基因谱分析( a l l e l i cp r o f i l i n ga s s a y ) 的报道，在2 6l n l n 长的分离通道上不到2m i n 完成分离，其分析速度比毛细管电 泳和平板凝胶电泳分别提高1 0 和1 0 0 倍。一些已经发表的工作还证实了微流控 芯片d n a 测序嘲的优越性。使用9 6 个阵列通道可以进行高通量的d n a 测序。 根据目前报道的最好结果，每小时每个通道的测序速度大约为1 2 0 0 个碱基【7 】。 微流控芯片和荧光检测技术结合可在电泳微芯片上检测单个d n a 分子。 h a a b 等 a l 应用雪崩光电= 极管检测器，单分子荧光色同步计数技术监测微流控通 道内d n a 分离。 1 3 1 2 聚合酶链反应 台酶链反应( p o l y m e r a s ec h a i nr e a c t i o n ，p c r ) t 9 1 是一种对核酸分子进行体外 扩增的方法，已经广泛应用于生物科学各个领域，p c r 的引入给分子生物学带 来了革命性的变化。反应的主要操作过程在三个温度区间重复循环，经过酶促反 应扩增特定的d n a 片段。扩增后的反应产物可用于诊断疾病，检验组织或血样 中的特殊细菌或病毒。 1 3 1 3 基因突变检测 病态下许多突变涉及到大范围的基因缺失或复制，如杜兴肌肉萎缩症 ( d u c h e n n em u s c u l a rd y s t r o p h y ，d m d ) 就是一个典型例子。对一些敏感的突变， 基因中单个碱基插入或缺失，甚至单点替代，都会产生明显的后果，而导致各种 疾病。已有一些电泳方法用于检测突变，其中较常用的有单链构象多态性 ( s s c p ) 、等位基因特异聚合酶链反应( a s p c r ) 、及异源双链核酸分子分析。 p c r - s s c p 技术是在完成目标d n a 的p c r 扩增后进行单链d n a 多态性分析的 一种技术。其原理是：在进行不含变性剂的中性聚丙烯酰胺凝胶电泳时，单链 d n a 因碱基顺序不同所形成的构象不同，电泳迁移率也不同。通过p c r 扩增， 复制包括单个碱基置换部位及两侧d n a 片段，对其变性后进行s s c p 分析，从 9 浙江大学硕士学位论文 理论上可以分辨出单个碱基的差异，有效地检出点突变和d n a 的多态性，有利 于探测新的等位基因。 1 。3 2 微流控芯片在蛋白质和氨基酸分析中的应用 基因是遗传信息的携带者，而生命活动的执行者却是蛋白质，即基因表达的 产物。人类基因组计划的完成为生物有机体全部基因序列的测定，以及未来生命 科学的研究奠定了坚实基础，但还不能提供认识各种生命活动直接的分子基础， 因而必须研究生命活动的执行体，即蛋白质这一重要环节。以往人类对蛋白质的 研究仅限于针对生命活动中某一种或几种蛋白质，人们所熟悉的只是某一发育阶 段或特定位置的蛋白质，还缺乏对蛋白质的整体和全面认识。这种非整体的研究 难以透彻阐述生命活动的基本机制。因此，无论是从基因组计划的局限，还是从 蛋白质研究自身发展而言，大规模系统地蛋白质研究都是十分必要的。 通常的蛋白质分析方法一般包括从细胞中提取蛋白质，通过一维或二维凝胶 电泳进行分离和检测，经带切割( b a n d c u t - o u t ) 和胶内消解，使用质谱分析该过 程中生成的肽类混合物。这些传统的分析技术速度慢。劳动强度大，因此发展快 速的高通量、自动化的样品分析系统是十分必要的。在微流控毛细管电泳分析系 统中可以采用较高的场强，焦耳热效应小，在电动注射进样条件下，试样体积小。 由于上述优越性，将经典的凝胶电泳或毛缅管电泳分离方法移植到微芯片上具有 重要意义【。 1 3 3 微流控芯片在免疫检测中的应用 把抗原抗体固定在固体表面的酶联免疫分析和其它免疫吸附分析有非常高 的选择性和灵敏度，因此被广泛地用于临床诊断、环境分析和生化研究。但通常 的非均相测定时间长，涉及繁琐的溶液处理过程，消耗大量昂贵的抗体试剂。自 动化的免疫测定诊断系统装置很大，因此不适于进行现场检验( p o c t ) 。微芯片 系统有可能克服这些缺点。集成化的微流控免疫分析系统可增加反应效率，简化 操作，减少分析时间，增加分析速度，降低试剂试样和能源消耗，而且可大大减 小测定装置的体积】。 1 0 渐江大学硕士学位论文 1 3 4 微流控芯片在细胞分析中的应用 微流控芯片具有一些重要特点使其特别适合于细胞分析。其网络式二维或三 维通道结构及通道的1 0 2 0 0l a i n 级尺寸使得较易实现尺度相似的单个细胞进样 与控制，并使分离检测系统集成在一起。因此，在微流控芯片上进行细胞研究越 来越受到人们的重视。它已应用于细胞的培养、细胞计数和分类筛选、胞内成分 分析、分子离子和细胞的相互作用的研究和单细胞分析等方面i ”】。 1 4 微型全分析系统和微流控芯片发展概况 m a n z 和w i d m e r 于九十年代初首次提出微型全分析系统( m i n i a t u r i z e dt o t a l a n a l y s i ss y s t e m s ，胛a s ) 的概念f 1 3 l 。在此后十余年中该领域己发展为当前世界上 最前沿的科技领域之一，而目前其核心技术即是以微流控技术( m i c r o f l u i d i c s ) 为基础的微流控芯片。m a n z 等一开始就把当时在微电子领域已发展成熟的 m e m s 与作为加工平台来实现全部分析功能在芯片上的微型化，但最初采用单 晶硅加工形成的多层芯片t a s 装置结构复杂，因而发展前景并不很明朗。9 0 年 代初毛细管电泳技术的发展为“t a s 研究取得突破提供了重要的条件。m a n z 与 加拿大a l b e r t a 大学的h a r r i s o n 于1 9 9 2 年发表了首篇在微流控芯片上完成的毛细 管电泳分离的论文，展示了隗s 的发展潜力1 。美国橡树岭国家实验室以 r a m s e y 为首的研究组在1 9 9 4 以后作了一系列工作，改进了芯片毛细管电泳微流 控芯片的性能与实用性旧，美国加州大学b e r k e l e y 分校的m a t h i e s 研究组于1 9 9 5 年在微流控芯片上实现了高速d n a 测序1 1 q ，使学术界对微流控芯片技术引起了 更广泛的关注。1 9 9 6 年m a t h i e s 等又首次将聚合酶链反应( p c r ) 扩增与毛细管 电泳集成在一块芯片上m ，展示了微流控芯片在试样处理方面及分析功能集成化 方面的潜力。次年，他们又实现了微流控芯片上的多通道毛细管电泳d n a 测序， 从而为微流控芯片在基因分析中的实际应用提供了重要基础1 1 9 l 。 一个科学领域的发展较集中地反映在相关科学论文发表的数量上。至u 2 0 0 4 年，微流控技术已有约1 5 年的发展历程。从1 9 8 9 1 9 9 0 年最初发表的有关微流控 技术的论文和专利来看，它还只是m e m s 技术的一个分支，也基本未涉及分析应 用；9 0 年代初，s c i 收录的论文每年不过两三篇。但在1 9 9 4 年以后，在它成为实 浙江大学硕士学位论文 现以 a s 目标的主要技术平台之后，微流控技术取得了飞速发展。此时，m e m s 与微流控技术虽然仍使用许多共同的研究手段与技术平台，而有些学者也跨于两 领域间工作，但微流控技术已很快发展成为一个高度学科交叉的相对独立领域。 微流控与m e m s 技术之间的界限也日趋明显。根据i s iw e bo f s c i e n c e - f f 联网站查 询两领域在1 9 9 5 - 2 0 0 4 十年间被s c i 收录的论文数( 见图1 _ 3 ) 可看出m e m s 与微流 控技术虽然都发展很快，但在1 9 9 8 年之后微流控技术领域的发展速度明显超出了 m e m s ( 其中包括一些同时涉及微流控系统的论文) ；到2 0 0 4 年，微流控与m e m s 技术的年收录论文数分别达至i j 816 篇和9 8 3 篇。以此发展速度预测，2 0 0 6 年微流控 技术的论文数可能接近甚至超出m e m s ，而成为其发展过程中的一个重要里程 碑。这充分反映了微流控领域发展的巨大潜力和活力。 图1 31 9 9 5 - 2 0 0 4 年每年s c i 收录微流控与m e m s 技术论文数 1 4 1 微流控技术与微流控芯片的发展趋势 微流控技术( 学) 服务的范围包括了从打印机墨水喷头、化工反应过程、燃 料电池直到与生物科学密切相关的供床边检验( p o i n t - o f - c a r e - t e s t i n g ，p o c t ) 和 防生化战的便携式仪器、植入式的自动给药装置、及高通量药物筛选。从图1 3 的论文增长情况可以看出这一领域独立于m e m s 技术之外的强大发展势头。目 前全球基于微流控技术产品的年利润以2 0 的年增长率迅速突破了1 5 0 亿欧元 1 1 9 l 。当前微流控研究和发展工作的重点无疑是在直接服务于生命科学的领域；但 与打印行业相比，其他领域( 包括为生命科学服务的微流控分析芯片) 的市场仍 在初级发展阶段，因此也充满了机遇。由于应用基础研究成果的迅速积累，微流 控技术正在发展成为生命科学与信息技术的新的强大技术平台。微流控技术在喷 1 2 浙江大学硕士学位论文 墨打印领域所取得的成功已使高分辨彩色打印机进入普通家庭。预计在不久的将 来，微流控技术也将可通过微流控芯片，为分子诊断高效率地提供大量的、极其 丰富的基因信息，并最终在普通家庭中实现在分子水平上的疾病诊断，甚至治疗。 从长远看，这一目标的实现将促进把目前还主要依赖于经验的医学与药学转化为 主要基于基因信息的科学。微流控技术将发挥如同电脑外围设备键盘与监视器 的作用来获取、采集与生命有关的化学信息并传输给数据处理系统以揭示生命现 象中更深层次的规律。 1 4 2 检测系统的微型化与集成化 有关p t a s 与微流控系统的研究中，至今较多的是集中于毛细管电泳分离在 芯片上的微型化，对芯片与其他功能部件的集成化和检测器的微型化的研究还很 不足。一些已经商品化的微流控分析仪器的检测器常比芯片本身的体积大数万 倍。为了实现便携化的目标。检测系统的进一步微型化、集成化势在必行。在此 方面，最有条件首先实现突破的是荧光与电化学检测器。近年来，半导体激光器 体积的缩小、短波长二极管激光器的出现、发光二极管的发光强度不断增强、及 光电放大器件体积的缩小都为荧光检测器的微型化提供了有利条件。微加工技术 的发展为电化学检测器的集成化提供了有效的技术平台。值得注意的是：由于吸 收光程短而一直在微分析系统中处于劣势地位的吸光光度检测器，近年来在集成 于微流控芯片的应用中也有重要进展。由于吸光光度分析的广泛适用性，有关突 破将对微型便携仪器的发展发挥重要作用。 1 4 3 微流控芯片的规模集成化 微流控分析系统的重要优势之一是其能够通过m e m s 技术在集成化方面形 成一定的规模。用目前一般水平的m e m s 技术，在几平方厘米芯片上加工数百条 微米级通道或其他功能的微结构并不困难。这为微流控分析中实现多重平行测 定，以大幅度提高工作效率，降低分析成本提供了可能。这一目标的实现，其真 正的挑战可能还在于多重平行测定中所需要的检测系统与进样系统。这方面正在 取得重要进展；目前已开发出来的首批商品化微流控芯片仪器中多数反映了多重 1 3 斯江大学硕士学位论文 平行操作的设计思路。在有关研究工作中，m a t h b s 研究组与q u a k e 的研究组的工 作很有代表性。前者在直径2 0 0r a i n 圆盘玻璃芯片上加工的毛细管电泳通道多达 3 8 4 条t l ”，对3 8 4 名测试对象同时进行基因型测定，检测人类助吧基因中与常见血 色病关联的h 6 3 d 变异，仅需3 2 5s 。所建立的超高通量基因分析每一测定耗时平 均不足ls 。q u a k e 的研究组则在其创建的聚二甲基硅氧烷( p d m s ) 基质芯片上 微加工微泵、微阀的基础上把气压制动的上千个微机械阎和上百个可单个寻址的 微反应室集成在2 5 2 5c n l 的p d m s 芯片上。芯片上共集成7 2 0 5 6 个微阀和2 5 6 个 7 5 0p l 的微反应器( 图1 4 ) t 2 ，这一进展不仅对分析化学有重大意义，对组合化学、 药物高通量筛选的发展也可能产生深远影响。 图 4 集成了2 0 5 6 个微阀和2 5 6 个7 5 0p l 微反应器的徽流控芯片”1 1 4 4 微流控分析仪器的发展 任何一门分析学科的大发展都需要经过与其相关的分析仪器与装备的产业 化历程。一种仪器的大范围普及又将会给相关学科的发展带来强大的动力。与常 规分析仪器相比，微流控系统的分析原理一般并无区别，微流控分析仪器的优势 主要反映在其微型、自动、高效与低价上。不久前研制成功并上市的供糖尿病患 者使用的“葡萄糖手表”( g l u e o w a t e h ) 是典型的专用型装备【2 3 】，它也是一个实现 了从采样到报出结果的在真正意义上的便携式u t a s 。未来更多专用型的微流控 仪器将仍可能主要出现在医学应用领域。 1 4 浙江大学硕士学位论文 1 - 5 本课题主要研究内容、意义及成果 目前微流控芯片在我国的发展势头喜人，已有包括清华大学、浙江大学、武 汉大学、大连化学物理研究所等的多家科研单位投入到微流控化学分析的领域 中，并取得了初步的成绩。由于微流控芯片分析涉及到化学、徼电子加工工艺、 光学、信号处理等多个领域的交叉结合，因此需要不同专业的技术力量紧密结合。 能够进行基因分析、蛋白质检测、病菌分析、基因突变等等的通用型检测仪 器，至今尚无见报。鉴于微流控芯片以及当今病菌、基因等检测迅猛发展的需求， 研制一台超低检测下限的通用型仪器已经迫在眉睫。 我们的课题任务便是研制一台具有超低检测下限的通用型微流控芯片检测 仪器，在保证多病菌源检测能力的基础上提高系统的检测性能。 围绕这个目标本论文的主要内容如下： 第一章：简要介绍了课题背景。对微流控芯片进行了简单介绍，并对其发展 趋势和应用范围进行了阐述。 第二章：鉴于微流控芯片的应用前景以及发展需求，对芯片的检测成为了热 门话题，紧接着第二章简单介绍了对微流控芯片进行检测的理论基础。并筛选相 应的理论加以改进，理论联系实际，进行应用设计。 第三章；从实际出发，进行整台仪器的开发设计，其中包括光路设计、结构 设计、电路设计、软件开发等。此台仪器是名副其实的光机电一体化仪器。 第四章：在仪器装置设计、加工、完成组装之后，我们进行了数百次的试验， 并给出了相应的比较典型的实验结果，并对这些结果进行了分析；此外从整体结 构、主物镜、针孔、滤色片组合和电路等几个方面阐述对系统信号的影响。 第五章：在数百次试验过程中发现问题，并解决问题，逐步对系统进行改进。 第六章：本文的总结和展望。 经过了2 年多的努力之后，我们取得了以下的成果： 1 我们已经成功研制出微流控芯片检测仪，并具有很高的检测能力， 见本论文第五章。 1 5 浙江大学硕士学位论文 2 3 我们研制的此台检测仪器是一台通用型检测仪器，能够检测d n a 、 蛋白质及通用型试剂。到目前为止，具有通用检测能力的此类仪器， 尚未见报导。 此台仪器具有微型化和集成化特征，总体积为2 3 0 x 3 3 0 x 4 5 0 m m ，并 集光路、电路等为一体。 本项目已申请发明专利，并获批准。专利号 1 6 浙江大学硕士学位论文 2 1 引言 第二章理论基础 检测系统用于获取待测样品有关组份的组成及其含量等信息，是分析装置中 必不可少的部份。检测系统的微型化始终是微流控研究领域中的重点和热点【2 。 对微流控芯片系统，其检测系统与传统的分析系统中的检测器相比具有不同 的特点和要求。由于微流控系统不但总体积小，其检测的区域也非常小，故可供 检测的物质量小，样品通过检测窗口的速度快，因此必须要考虑检测器的灵敏度 和缩小其尺寸对性能的影响。具体来说，检测系统需要具备更高的灵敏度、更好 的信噪比、更快的响应速度、及便于同芯片系统的耦合等特点。同时，为了实现 全系统的便携化、小型化，还要求其可集成、性能稳定可靠、坚固耐用、体积小、 制造成本较低。此外，目前微流控芯片分析的一个优势就是芯片上的通道可形成 多个并行的分析单元或通道阵列，从而提高分析速度，在这种情况下还要求检测 系统应具有多重平行检测的功能。 基于不同检测原理的众多检测方法在微流控芯片分析系统中都获得了研究 应用。按其检测原理进行分类，微流控芯片系统中的检测器大致可以分为光学检 测、电化学检测、质谱检测等。光学检测又可根据检测的光信号来源分成检测吸 收光的吸收光谱检测，检测受激后发射光的荧光检测，检测体系自身反应发光的 化学发光检测等几类。 用于芯片的检测技术的发展初期是以光学检测中的荧光检测为主；它适合于 极小体积内试样的高灵敏度检测，因此当前荧光检测方法仍然是微流控芯片系统 中的一种重要的检测技术。一体化电化学检测近年来逐渐受到重视，因其尺寸更 利于微型化，其输出信号大小和电极表面积相关，而和样品体积无关，故浓度检 出限不会象光学检测技术一样随检测体积的减小显著下降。它的优点在于容易直 接加工电极在通道上，不需要大量的外部设备用于检测信号，故电化学检测的微 流控装置发展较快。质谱检测方法在大分子物质的检测，尤其是其化学结构检测 1 7 浙江大学硕士学位论文 中依然是不可替代的，但由于其设备的微型化比较困难，因此进展较慢，目前在 微流控芯片系统中的质谱检测主要还是使用普通质谱仪器，通过接口技术实现芯 片和检测系统的联用。此外，如折射率、发射光谱等检测技术在微流控芯片系统 中也都有应用。 图2 1 微分析系统的分类 2 2 1 微流控系统中的吸收光度检测系统 吸收光度检测是一种通用型光学检测方法，其可测定的物质种类多、结构较 简单，使用方便，是在日常分析检验中使用最为广泛的一种检测技术。由于微流 控芯片上通道检测区的体积小，故有效吸收光程非常短，检测的灵敏度低，这使 其在微流控芯片系统中的应用受到很大限制，因而目前在微流控芯片分析系统中 较少采用吸收光度检测器。但作为应用最为广泛的检测方法，将其应用在微流控 芯片系统中的研究一直受到关注。 改进微流控芯片上的检测池的设计是实现高灵敏度吸收光度检测器的关键。 总的原则是对检测池要求具有尽可能长的光程，但却不能显著增加检测体积或减 弱入射光的通量，并采用数学的和电子技术尽可能提高信噪比。吸收光度检测又 可分为短光程检测和长光程检测 1 8 浙江大学硕士学位论文 图2 2 简单的准双光路吸收光度检测器装置示意图 2 2 2 微流控系统中荧光检测系统 激光诱导荧光( l a s e ri n d u c e df l u o r e s c e n c e ，l i f ) 是目前最灵敏的检测方法 之一。l i f 具有灵敏度高、选择性好、响应速度快等诸多优点，故不但在其他研 究领域中使用广泛，也是在微流控系统研究中最先被使用而且现在仍然最常使用 的一种检测技术。目前商品化微流控分析仪器中l i f 是唯一被采用的检测器【1 3 】。 l i f 检测器的检出限一般在1 0 。9 m o l l 1 0 以2 m o l l 范围内，对于某些荧光 效率高的物质，甚至可达到单分子检测。此外，l i f 检测方法选择性好，线性范 围宽，它完全适用于微流控系统小体积、检测物质量小的高灵敏度检测的要求。 l i f 检测方法已在微流控分析中成功地用于衍生的金属离予、染料、氨基酸、d n a 等多种样品的检测。 2 2 2 1 荧光检测器的结构设计原则 在微流控系统中由于芯片上的管道结构特点，荧光检测系统大部分借鉴了毛 细管电泳系统中的结构组成。传统的毛细管电泳使用的荧光检测器根据其系统组 成结构不同，可分为共聚焦与非共聚焦型检测系统。它们均使用体积庞大的激光 器通过复杂的光学系统实现对样品荧光信号的检测。减小荧光检测系统体积和增 加集成性须从减小激发光源体积和简化光学系统两方面入手。 1 9 浙江大学硕士学位论文 减小激发光源的体积 在荧光检测系统中应用最多的是4 8 8m 的氩离子激光器，3 2 5 姗和4 4 2n m 的氦- 镉气体激光器及氦- 氖激光器也有应用。这类激光器输出的激光强度大，功 率稳定，单色性好，容易被会聚成极小的光点，故容易获得极高的检测灵敏度， 是理想的l i f 检测器的激发光源。但这些激光器及其附属电源装置往往体积很 大，功耗多，而且使用寿命短，难以集成。在微流控芯片系统的基础研究工作中， 由于更关注于全系统的分析性能，一般很少考虑激光器的这些缺点，因此在荧光 检测中这种激光器被广泛的使用，但要实现微流控分析全系统的微型化与便携 化，就必须使用小型荧光激发光源。当前文献中主要使用半导体激光器和l e d 作为小型荧光的激发光源。 光学系统的小型化 光学系统的小型化，最直接的方法就是使用微加工手段对光学元件进行集 成。将荧光检测器的一些元件集成在芯片上，可以迸步简化检测器的结构，减 小检测器的体积，同时也可减少外界杂散光的干扰。m e m s 技术在这方面发挥 了巨大作用。它主要研究加工集成无源光学器件，如反射镜、透镜、光纤等。这 种集成化光学系统的使用和小型光电元件结合可实现l i f 检测系统的小型化、集 成化。 光学系统的小型化的另一条途径就是应用芯片结构的特点对光路进行设计， 通过简化光路来简化光学系统。使用简单的光路系统实现荧光检测可减少光学元 件的数目，从而使光学系统体积大大减小。这种方法无须使用成本较高的m e m s 集成技术，但若使用时，可更大程度地减小荧光检测系统。 信号放大技术的使用 在微流控分析系统的检测中，信号的放大技术显得越发重要。由于微流控系 统中检测区域和样品量大大减小，信号响应下降，故需要高灵敏度的检测器。在 使用弱激发光源和小型光电转换元件令检测灵敏度受到一定限制时，可以考虑使 用信号增强技术。许多信号增强技术一般并不会增加检测使用的光学系统的复杂 2 0 浙江大学硕士学位论文 性，但可使检测灵敏度大大提高，如锁定放大、h a d a m a r d 变换、光子计数技术 等信号增强技术可将检测的信号噪声比提高2 3 个数量级以上。 2 2 2 2 半导体激光器作为激发光源的小型荧光检测系统 半导体激光器体积小，是一种理想的传统激光器的替代产品。它具有功耗低、 输出功率稳定、使用寿命长、价格相对便宜等优点，而光的强度和单色性完全可 达到荧光检测的需要。因此，在微流控分析系统中已经大量地使用半导体激光器 作为荧光的激发光源，从而减小检测系统体积。 目前商品化的半导体激光器的发射波长主要还在红区及红外区。在此波长范 围内，可产生荧光的物质很少，虽然这使检测的背景干扰降低，有利于分析基体 复杂的试样，但也正因为此，使标记样品可使用的荧光试剂种类少，价格昂贵， 所以其应用受到很大的限制。波长在4 0 0 5 0 0n m 范围的荧光试剂较多，随着半 导体激光器生产技术的发展，各种波长的半导体激光器不断涌现，目前已有一些 短波长的半导体激光器出现，如蓝绿范围的半导体激光器已有市售产品，日本 n i c h i a 公司已开发了波长为4 0 7n r n 的蓝紫半导体激光器。但这些短波长半导体 激光器价格较高、且使用寿命较短【2 5 l 。此外由于目前所使用的激光器主检测波长 段为4 7 0 4 8 8 n m ，所以我们采用4 7 3 n m 的固体激光器。 使用半导体激光器作为激发光源的荧光检测器根据光路结构大致可分为非 共焦型和共焦型两类。 非共焦型光路结构 用于微流控芯片系统的典型非共焦l i f 检测器结构如图2 3 【2 “，其光学系统一 般由激光聚焦透镜、反射镜、荧光收集物镜、滤光片和光电转换元件等构成。激 光束经过透镜和反射镜将激发光聚焦到通道的检测区，激发产生的荧光经物镜收 集，并由滤光片滤除激发光和其它杂散光后，用光电倍增管等元件进行检测。这 种l i f 检测器的特点是结构简单，易微型化，但激发光和杂散光的干扰较大，导 致检测的信噪比较差。为了提高检测信噪比，既要使激发光入射到芯片通道的检 测区域内的强度高，以得到高的激发效率，又必须减少激发光对荧光检测的干扰， 2 1 浙江大学硕士学位论文 同时还要尽可能提高荧光的收集效率，故通常是使激发光从与芯片平面成4 5 。 角，且垂直于通道的方向入射到检测区域，产生的荧光信号在与激发光成1 3 5 。 角的方向进行收集。两者处于垂赢于通道的同一平面内。 图2 3 非共焦型l i f 检测器结构示意图。6 在芯片上由于微通道的尺度和芯片整体厚度比较差异还是较大，故芯片外的 聚焦对检测影响较大。k a m e i 等人即认为这是影响其分辨的一个主要原因。如果 能将光路直接制作到通道附近则光的对准和采集会容易的多，同时也是对光路的 一种简化。可使用微加工工艺直接在芯片上制作光纤结构，如采用溶胶凝胶制成 的多孔硅材料【2 ”，或s i l i c a - o n s i l i c o n 技术【”捌等。但其不但需要专业成套设备， 而且现仅在硅基材料上可实现，通用性还待提高。直接使用光纤，将成品光纤集 成到芯片上是一种相对简单地替代办法。 共聚焦型光路结构 共聚焦型检测光路结构的优点是对荧光与激发光、反射光、杂散光的分离更 为完全，由此改善了检测的信噪比，使检测灵敏度和信噪比达到理想的水平，甚 至可实现分子水平的检测。同时，其激发光和对荧光的检测均使用同一个聚焦透 镜的结构特征，使其能方便地用于平板结构的微流控芯片，因此共聚焦型l i f 检 浙江太学硕士学位论文 测器是微流控电泳芯片分析系统中最常用的检测光路结构。但这种类型的检测器 结构较复杂，不易微型化，故文献中的使用方式多是借用传统的共聚焦荧光显微 镜，在其观测平台上放置微流控芯片，共聚焦的物镜处于芯片正上方或正下方， 图2 9 为典型的检测器结构。在这种类型检测系统中，激光束经扩束、准直后被 二向色镜反射，经显微物镜聚焦后垂直照射到芯片的检测区域。产生的荧光经二 向色镜透射并聚焦，使用滤光片进一步滤除背景光后被光电转换元件检测。其中 二向色镜是对激发光和荧光进行有效分离的关键光学元件。 豺辣糖 图2 9 共聚焦型l i f 检测器结构示意图1 3 田 j i a n g 等报道了【3 1 1 采用6 3 5 姗的红色半导体激光器和光电倍增管光检测元件 构成的共聚焦型高灵敏l i f 检测器，对染料c y 5 的浓度检出限可达到9p m o l l ， 相当于9 0 0 个分子的检测水平。采用这个检测器检测了经过电泳芯片免疫分离的 c y 5 标记的抗卵清蛋白。 高度集成的阵列式微流控芯片可实现高通量、高速度的检测分析，但这种结 构对检测也提出了更高的要求，需要多道扫描荧光检测系统。共聚焦结构的检测 器由于激发和检测使用同一个透镜，故便于实现移动式扫描检测。s i f t 等人【3 2 】使 用了旋转扫描的方式对9 6 通道圆盘式毛细管阵列电泳芯片进行了l i f 分析检测。 检测过程中圆盘式芯片固定不动，检测器的光学物镜由步进电机准确控制驱动在 芯片的下方作圆周运动，依次扫描芯片