（应用化学专业论文）微乳液介质荧光酮类试剂钼（Ⅵ）光谱探针标记蛋白质的研究与应用.pdf

济南大学颈士学位论文 摘要 蛋白质的定量测定在生化分析和临床分析中具有重要意义，研究开发新的高灵敏 测定蛋白质的方法是生化研究的一个活跃领域。本文详细地论述了蛋白质定量测定与 分析技术的发展趋势和荧光光谱法研究蛋白质与小分子的相互作用机理。论文从配合 物光谱探针标记蛋白质的角度出发，主要采用分光光度法和光散射法研究了荧光酮类 试剂一钼( v i ) b g 合物作光谱探针测定微量蛋白质的分析化学性能，旨在建立新的测定蛋 白质的分析方法，并将它们应用于蛋白质的定量测定。同时利用荧光光谱法探讨了配 合物探针与蛋白质作用的机理( 包括能量转移距离、作用力类型和结合常数等) ，从分 子角度揭示了小分子与蛋白质的作用机制，并获得了一些创新性的成果。 本论文的系统性、科学性和新颖性 1 、系统性 系统研究了具有不同取代基的荧光酮类试剂一镏( ) 配合物探针与蛋白质吸光光 度条件和光散射条件，如酸度、介质及其用量、显色剂用量等；讨论了不同取代基对 反应灵敏度的影响：测定配合物探针与蛋白质在微乳液、胶束和水相介质中的能量转 移效率和作用距离，为微乳液的增溶增敏提供有力的佐证。 2 、科学性 将建立的方法应用于尿样、人血清等样品中蛋白质的分析测定，取得了令人 满意的结果：依据非辐射能量转移，理论上确定了给体一受体之间的结合距离和能量 转移效率，并根据热力学参数确定了荧光酮类试剂m o ( v i ) 配合物与血清白蛋白之间 的作用类型。 3 、新颖性 首次选用新颖的三甲氧基苯基荧光酮试剂，系统地研究了其与蛋白质结合的光谱 条件：首次将微乳液介质引入到配合物探针中建立了目前最为灵敏的吸光光度测定 蛋白质的方法；并建立了一种青霉素中蛋白质测定的快速方法；探索了微乳液和 胶束中蛋白质分析的增敏机理。5 篇论文在国内重要的化学期刊上发表。 关键词：蛋白质共振光散射分光光度荧光光度光谱探针微乳液三羟基荧光酮 a b s t r a c t t h eq u a n t i t a t i v ea n a l y s i so fp r o t e i n si sv e r yi m p o r t a n ti nb i o a n a l y s i sa n dc l i n i c a l a n a l y s i s i ti sa na c t i v ef i e l di nb i o a n a l y s i st od e v e l o pn e wm e t h o d so fh i 【g hs e n s i t i v i t y i n t h i sp a p e r , t h ep r o g r e s so fa n a l y t i c a lt e c h n i q u ea n dq u a n t i t a t i v ed e t e r m i n a t i o no fp r o t e i n h a sb e e n r e p o r t e d i nd e t a i l ，a sw e l la st h e b i n d i n gm e c h a n i s mo fp r o t e i na n d m i c r o m o l e c u l eb yf l u o r e s c e n ts p e c t r o m e t r y o nt h eb a s i so ft h ec o m p l e xa sa s p e c i a l p r o b eo fp r o t e i nd e t e r m i n a t i o n ，f l u o r o n er e a g e n t sa n dm o ( v i ) c o m p l e x e sa r ei n t r o d u c e d a n df o r m e das e r i e so fs p e c t r a la n dr e s o n a n c er a y l e i g hs c a t t e r i n gm e t h o d s t h o s em e t h o d s h a v eb e e ns u c c e s s f u l l ya p p l i e dt ot h ep r o t e i nd e t e r m i n a t i o ni ns a m p l e s a tt h es a m et i m e ， t h e i rm e c h a n i s m sa r ea l s od i s c u s s e db yf l u o r e s c e n c em e t h o d ，i n c l u d i n gb i n d i n gc o n s t a n t ， e n e r g yt r a n s f e rd i s t a n c ea n dt h em a i ns o r t so fb i n d i n gf o r c e s o m en o v e la c h i e v e m e n t sa r e o b t a i n e d t h i sp a p e rf e a t u r e si ns y s t e m a t i c ，s c i e n t i f i ca n dc r e a t i v em e t h o d s 1 s y s t e m a t i cf e a t u r e i nt h i sp a p e r , t h er e a c t i o nc o n d i t i o n s ( s u c ha sa c i d i t y , m e d i u m ，a m o u n to fd e v e l o p e re t a 1 ) o ft r i - h y d r o x y lf l u o r o n es u b s t i t u t e dw i t hd i f f e r e n tg r o u p sa n dp r o t e i nb yr e s o n a n c e r a y l e i g l ls c a t t e r i n ga n ds p e c t r o p h o t o m e t r i cm e t h o d sh a v eb e e nr e s e a r c h e ds y s t e m a t i c a l l y , a sw e l la st h ee f f e c t so fs u b s t i t u e n t so nt h es e n s i t i v i t yo fs y s t e m w h a t sm o r e t h e d i s t a n c e sa n de n e r g yt r a n s f e re f f i c i e n c i e sb e t w e e nc o m p l e xa n dp r o t e i ni nt h em e d i ao f m i c e l l e ，m i c r o e m u l s i o na n dw a t e rh a v eb e e nd e t e r m i n e d a n dt h er e s u l t sh a v eg i v e nd i r e c t e v i d e n c e st ov e r i f yt h es o l u b i l i z a t i o no f m i c r o e m u l s i o n 2 s b i e n t i f i cf e a t u r e t h em e t h o dm e n t i o n e di nt h ep a p e rh a sb e e ns u c c e s s f u l l ya p p l i e dt ot h ed e t e r m i n a t i o n o fp r o t e i ni nb l o o da n dh a m a nu r i n es a m p l e s a n dt h eb i n d i n gd i s t a n c ea n dt h ee n e r g y t r a n s f e r e f f i c i e n c yb e t w e e nt r i - h y d r o x y lf l u o r o n e m o ( v i ) c o m p l e xa n dp r o t e i na r e o b m i n e db a s e do nt h et h e o r yo ff o r s t e rs p e c t r o s c o p ye n e r g yt r a n s f e r a c c o r d i n gt ot h e t h e r m o d y n a m i cp a r a m e t e r s ，t h em a i ns o r t so fb i n d i n gf o r c ec a nb ej u d g e d n 3 c r e a t i v ef e a t u r e t r i m e t h o x y p h e n y l f l u o r o n e ( t m p f ) h a s b e e n f i r s t l y s e l e c t e dt oi n v e s t i g a t et h e d e v e l o p i n gc o n d i t i o nw i t hp r o t e i n m i c r o e m u l s i o n ，a s t h em e d i a ，i sa l s o f i r s t l y i n t r o d u c e dt op r o t e i nd e t e r m i n a t i o na n dt h em e t h o dd e s c r i b e di nt h i sp a p e rb e c o m e sm o s t s e n s i t i v ew a yi nt h em i c r o d e t e r m i n a t i o no fp r o t e i n an e wa n a l y s i sm e t h o df o rm ef a s t d e t e r m i n a t i o no fp r o t e i ni np e n i c i l l i ns a m p l eh a sb e e nb u i l t t h ee n h a n c e ds e n s i t i v i t y m e c h a n i s mo fm i c r o e m u l s i o ni np r o t e i na n a l y s i sh a sb e e ne x p l o r e d f i v ea r t i c l e sh a v e b e e np u b l i s h e do ni m p o r t a n tc h e m i s t r yp e r i o d i c a l sa th o m e k 町w o r d s ：p r o t e i n ，r e s o n a n c er a y l e i g hs c a t t e r i n g ，s p e c t r o p h o t o m e t r y , f l u o r o p h o t o m e t r y , s p e c t r a lp r o b e ，m i c r o e m u l s i o n ，t r i h y d r o x y lf l u o r o n e 1 i i 原创性声明 本人郑重声明：所呈交的学位论文，是本人在导师的指导下， 独立进行研究所取得的成果。除文中已经注明引用的内容外，本论文 不包含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的科研成果。对本文的 研究作出重要贡献的个人和集体，均已在文中以明确方式标明。本人 完全意识到本声明的法律责任由本人承担。 驴 日， 论文作者签名：叁苎日期：至塑堡上丝 关于学位论文使用授权的声明 本人完全了解济南大学有关保留、使用学位论文的规定，同意 学校保留或向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许 论文被查阅和借鉴：本人授权济南大学可以将学位论文的全部或部分 内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或其他复制手段 保存论文和汇编本学位论文。 ( 保密论文在解密后应遵守此规定) 论文作者签名：墨墨 导师签名： 济南大学硕士学位论文 第一章前言 1 1 蛋白质定量测定与分析技术的发展趋势 蛋白质是生物最重要的基本组成成分之一，与营养、免疫、新陈代谢、生命的起 源和进化息息相关。由于蛋白质在体液中的含量可作为人体营养健康、疾病诊断的重 要指标，因此蛋白质的定量测定在生命科学、临床医学和化学研究中占有十分重要的 地位。近年来，蛋白质分离和分析方法研究的日益深入引起了科学工作者的兴趣和广 泛关注；同时用于定量测定蛋白质的一些新的分析技术，又促进了生命科学的不断发 展。所以蛋白质定量分析方法的研究在国际上一直十分活跃。 测定蛋白质含量的方法有很多。本节较全面地介绍了它的定量测定方法如最早的 浊度法、凯氏定氮法，和目前研究最多、应用最广、操作较为简便的吸光光度法、荧 光光度法，以及新发展起来的共振瑞利散射法、高效液相色谱法、毛细管电泳分析法、 电化学法和化学发光法；并着重阐述了染料、染料一金属配合物作探针的吸光光度法、 荧光光度法和近来兴起的共振瑞利散射法在蛋白质中的应用和发展动态。 1 1 1 浊度法和凯氏定氮法 浊度法 利用沉淀剂与蛋白质反应所产生的浊度与标准溶液浊度相比而定量检测未知蛋 白质浓度的一种分析方法。常用的蛋白质沉淀剂是磺基水杨酸和三氯化铁。该法操作 简便、快速、试剂易购，为临床常规检查所用，但是由于操作过程没有标准化，因此 准确度和精密度往往较差。 凯氏定氮法 该法【1 1 是利用一般蛋白质含氮量平均在1 6 ，可将测得的畲氮量折算成样品中蛋 白质的含量。凯氏法的优点是适用范围广，可用于动植物的各种组织、器官及食品等 组成复杂样品的测定，但操作比较复杂，含大量碱性氨基酸的蛋白质测定结果往往偏 高。 1 1 2 吸光光度法 测定蛋白质含量常用的吸光光度法包括经典的紫外光谱吸收法、双缩脲法、l o w r y 垡墨鎏立重茎垄里茎鋈型：塑【y 垄壁堡盐堡翌里旦耍墼互耋兰蜜旦 法、4 一喹啉甲酸法、染料探针法和染料一金属配合物探针法。 紫外光谱吸收法 蛋白质分子中所含的酪氨酸、色氨酸以及苯丙氨酸残基的芳香结构对紫外光有吸 收作用，其最太吸收峰在2 8 0n l r l 附近。当蛋白质的浓度在0 1 1 0g - l - 1 之间时，其紫 外吸光度与浓度成正比，故可用作蛋白质含量的定量测定【l 】。本法操作简单、灵敏、 快速，低浓度的盐类不干扰测定，因此广泛应用在蛋白质和酶的生化制各中，尤其适 用于层析柱洗脱液中蛋白质的快速测定。但是若样品中含有嘌呤、嘧啶等吸收紫外光 的物质，则会出现较大的干扰，而且不同种类蛋白质的上述氨基酸残基含量不同，其 差异较大，这就决定了紫外吸收光谱法的局限性。 双缩脲法 双缩脲法【2 】是基于蛋白质的双缩脲反应的方法。当含有两个或两个以上肽键的物 质和碱性的硫酸铜反应后，形成紫色的络合物，其最大的吸收峰在5 4 0n l t l ，形成络合 物的量取决于蛋白质的浓度。本法主要优点在于不同种类蛋白质产生的颜色类似，它 是最常用的血清总蛋白的测定方法，并且不受温度的影响。其缺点是灵敏度低( 约l m g m l “) ，干扰较大，且操作复杂。 劳里法 劳里法是劳里等p j 人于1 9 5 1 年建立的，是至今定量测定蛋白质的最常用方法。他 结合了双缩脲法中铜盐反应及f o l i n c i o c a l t e n 试剂( 主要是磷钼酸和磷钨酸盐) 反应的 特点，通过蛋白质分子中芳香族氨基酸残基r y r 和v r p 的迅速反应及与肽链或极性侧链 或二者的铜络台物的较慢反应，而把磷钼酸、磷钨酸发色团还原成更深的颜色( 深蓝 色) ，在7 5 0n l l l 处有最大的吸收。在一定条件下，吸光度与蛋白质浓度成正比。该方 法的线性范围宽，检出下限为0 1g - l ，灵敏度比吸光光度法a = 2 8 0n m 的灵敏度高1 0 2 0 倍，比双缩脲法高1 0 0 倍，但它基于酸试剂与蛋白质反应是非特效反应，抗干扰能 力较差。 4 一喹啉甲酸法( 简称b c a 法) b c a 法是8 0 年代发展起来的一种新的吸光光度法。1 9 8 5 年，s m i t h 等 4 1 对劳里法进 行了改良，用4 一喹啉甲酸代替了f o l i n c i o c a l t e n 试剂。4 一喹啉甲酸的钠盐是稳定的水 溶性化合物，它在碱性环境中能与一价铜离子生成紫色复合物，因此可以利用此性质 济南大学硕士学位论文 来定量蛋白质。碱性条件下，蛋白质与两价铜离子反应( 双缩脲反应) 中生成的c u + ， 可用b c a 试剂检测，读取a 5 6 2 。，以测定蛋白质的量。与l o w r y 法相比，b c a 法的常 规测定程序与l o w r y 法相近，但b c a 法抗试剂干扰的能力和工作试剂的稳定性均优于 后者。此法测定不同蛋白质时，测量值变化差别较小，除还原糖的干扰较大外，其它 干扰试剂，特别是去污剂以及3m 0 1 l 。的脲这样的变性剂均对测定无影响。 在金属作探针的蛋白质测定法中除有双缩脲法( b i u r e ta s s a y ) 、 劳里法( l o w r y ) 、 扯喹啉甲酸法( b c a ) 外，还有银染色法( s l i v e rs t a i n i n g ) 和胶体金( c o l l o i d a lg o l d ) 、银、 钯染色法。k r y s t a l 等 5 】于1 9 8 5 年发展了银染色法，该法的线性范围为1 5 2 0 0 0n g ，要 l i ：b r a d f o r d 法灵敏1 0 倍。蛋白质一银复合物形成速度快，显色稳定，且碳水化合物、 非离子表面活性剂等物质几乎不干扰测定。随后，胶体金属，如金【6 】也被用于测定微 量蛋白质。 染料结合法 染料结合法是用于蛋白质的检测最为广泛的分析方法之，现已应用于临床医学 及生命科学的研究中。现在研究较多的可作为探针的染料分子中，大部分都含有带负 电荷的亲水性基团如羟基、磺酸基、酚羟基及不带电荷的疏水性基团，如苯环。当溶 液p h 4 于蛋白质的等电点时，蛋白质的肽键亚胺基和n 端氨基质子化成阳离子，它和 带负电荷的有机小分子通过静电作用相互吸引到蛋白质的表面；同时由于一些非静电 力如疏水作用、范德华力的协同作用，使两者结合得更加紧密【7 】。该法的基础是利用 蛋白质与染料结合成沉淀或改变结合染料的光吸收特性，借助染料颜色的减退或变化 的程度来测定蛋白质的含量。染料结合法在试剂的稳定性、实验操作的简便性分析、 精密度及抗干扰能力等方面都优于l o w r y 法，但灵敏度不及l o w r y 高。从5 0 年代开始， 染料结合法测定蛋白质引起了人们的兴趣。最早用于测定蛋白质的染料是甲基橙，随 后又发展到其它偶氮类试剂、三苯甲烷类试剂以及卟啉类试剂。 ( 1 ) 倡氢差染抖 已报道的偶氮类染料除了甲基橙之外，还有钍试剂i 、氯磺酚s 4 j 等。近来李迸f 1 0 j 等人研究了十几种变色酸偶氮染料与蛋白质的作用及所引起的光谱性 能变化，详细探讨了实验条件、染料结构对其互相作用的影响。他认为含有水溶性较 好的酸性基团( 如s 0 3 h 。p 0 3 h 2 ，- a s 0 3 h 2 等) 越多，灵敏度越高，从而表明与蛋白质 的作用越强。童沈阳等i l l 】人也研究了一系列有机染料与蛋白质的相互作用如埃铬蓝 s e 、酸性铬蓝k 等，并取得了较好的成果。 ( 2 ) 三苤里煊差整抖考马斯亮蓝g - 2 5 0 ( c b b ) 是使用最为广泛的染料之一，是比较有 代表性的一种试剂。1 9 7 6 年，b r a d f o r d 1 2 1 提出了c b b 法。即在1 4 6m o l l 。h 3 p 0 4 介质 丝塾鎏立重鎏堂量耋鎏型：塑g ：2 堂堂堡盐堡望星自巫笪坚耋皇鏖旦 中，考马斯亮蓝与蛋白质结合后，最大吸收波长由4 6 5n l n 红移至5 9 5i l l n 。反应只需2 分钟，且颜色在l 小时之内稳定，其线性范围为1 2 0p g ，灵敏度比劳里法约高4 倍。 然而，该方法也存在缺点，如在强酸介质中，它很难保证蛋白质的溶解性及c b b 吸附 器皿。随后溴甲酚紫、埃铬青r 、铬天青s 、罗丹明6 g 等已见于报道 1 3 - 1 4 1 。 ( 3 ) ! b 啦羞基魁a ，1 3 ，8 - 四( 对磺苯基) 卟啉( t p p s 4 ) 和a ，p ，y ，5 - 四( 对羧苯基) 卟啉 ( t c p p ) 都可用作测定蛋白质的吸光探针。其中t p p s 4 是一个较考马斯亮蓝更为理想 的染料探针。同考马斯亮蓝比具有试剂稳定、蛋白质不易被沉淀和变性、不污染器皿 等诸多优点，线性范围为l 1 0l a g m l 一，其灵敏度不低于考马斯亮蓝法。因而它将在 蛋白质的分析中发挥重要的作用。 ( 4 ) 甚立道趔除上述染料探针外，已见报道的其它试剂还有四氯苯醌【l5 】和四碘荧光 素【1 6 1 。最近，s o e d j a k 提出了用四碘荧光索测定蛋白质的方法。其线性范围为2 1 4h g m l ，该法灵敏、快速、重现性好、抗干扰性强，对于不同的蛋白质响应差异小。 某些染料测定蛋白质的吸光光度法见表1 1 。 表1 - i 某些染料测定蛋白质的吸光光度法f 1 7 - 2 8 1 t a b l e1 1s o m e d y e ss p e c ：t r o p h o t o m e t r i c m e t h o d s f o r t h e d e t e l 1 1 1 i n a t i o no f p r o t e i n 试剂测定对象p h 怒 线性( i x g m 范围l - )( l 赢。， 配合物探针法( 金属离子一染料结合法) 金属离子染料结合法是近几年来兴起的一种新方法。1 9 8 3 年，v u j i t ay 2 9 1 等首次 提出利用金属离子染料络合物测定蛋白质。其机理为金属离子与含有羟基或羰基的 有机染料相遇时，氧原子中的孤对电子可顺利进入杂化轨道，形成稳定的配合体系， 在酸性条件下，该体系遇到结构不对称的蛋白质分子时互相极化产生静电作用而生成 新的大分子团；另外，大分子内部易形成氢键作用，蛋白质分子中的芳香氨基酸残基 与有机染料分子中的芳香结构都具有疏水作用而相互靠近，从而改变了原体系的光谱 性能，进而能定量测定蛋白质的含量。该法在灵敏度、选择性方面都较染料探针法优 越，特别是蛋白质检测量差异较小，而受到人们关注。特别是目前发现的三羟基荧光 酮这种性能良好的显色剂，已广泛地应用于对高灵敏度体系的测定d o 。它可与某些高 价金属的离子形成比较稳定的配合体系，用于对含氮、磷、硫的有机物的测定。它的 某些金属离子配合体系可作为蛋白质测定的良好吸收光谱探针和定量试剂。例如，南 开大学的沈含熙【3 1 研究了金属一咕吨类染料配合物与蛋白质结合物的吸收光谱特性。 提出了以钼( v i ) 对氯苯基荧光酮配合物作为光谱探针测定微量蛋白质的新方法。该方 法具有很高的灵敏度和选择性，检出下限可达9 0n g ，m l 。它可直接用于尿蛋白的测 定，测得结果与经典的b r a d f o r d 法基本一致，并且生物体液中常见的无机及有机物质 或离子大多数均不干扰蛋白质的测定。 国内外某些染料金属配合物测定蛋白质的吸光光度法见表1 - 2 。 表1 - 2 某些染料金属配合物测定蛋白质的吸光光度法【3 t - 3 9 1 t a b l e1 2s o m ed y e m e t a ls p e c t r o p h o t o m e t r i cm e t h o d sf o rt h ed e t e r m i n a t i o no fp r o t e i n 试剂测定对象 p h 五一 线性范甲 ( n m ) ( ”g m l 叫) p - c t ，p f - m o ( v i ) b s a2 2 3 75 3 00 - 1 2 偶氮肿i l l 一镱( i i i ) b s a2 0 - 3 36 5 0 1 - 3 5 偶氮氯膦1 i i 镧( 1 l i ) b s a2 0 - 3 56 6 91 - 2 5 4 偶氮变色酸苯基荧光酮铝( v 1 ) h s a 2 0 - - 3 6 5 3 40 - 2 0 o 磺酸基荧光酮铀( v d h s a3 8 - - - 4 35 5 52 - 5 0 邻苯二酚紫锡o v ) h s a 2 , 66 4 50 2 0 3 ，4 ，5 ，6 7 一四氯茜素紫钼( v 1 ) h s a 2 2 - 3 56 4 00 - 1 5 5 - b r - p a p s 钴( i i ) h s a 0 1t 0 0 1 l “h c l 6 3 6o 7 4 ，5 一二溪苯基荧光酮钛( i v ) b s a2 7 , - - 3 76 5 00 - - 6 总之，吸光光度法中的这些方法都各有优点及其局限性( 见表1 - 3 ) 。我们只有根据 不同情况选择适当的方法进行蛋白质的定量测定，才能得到准确的结果。 表1 - 3 常用方法的比较 t a b l el - 3t h ec o m p a r i s o no f s o m ea s s a y s 1 i 3 荧光光度法 荧光法是定量测定蛋白质的另一种常用方法，通常比分光光度法更灵敏。常用的 几种方法是内源荧光法、荧光探针法、荧光偏振、时间分辨荧光法及激光诱导时间分 辨免疫分析法。 内源荧光法 蛋白质中存在着t y r 、t r p 、p h c 残基，能够吸收2 7 0 3 0 0n n - i 的紫外光而发出紫外 荧光。当测定体系中加入小分子配体( s m ) 时，s m 与蛋白质发生相互作用，会导致蛋 白质荧光的猝灭，利用s m 对蛋白质内源荧光的猝灭这一现象可以确定蛋白质与s m 的 作用类型及其结合部位等。 外源荧光法 对于蛋白质的研究仅利用它的内源荧光是不够的，需要通过外源荧光性质的研究 才能获得更多关于蛋白质分子的各种信息，这就使得荧光探针对蛋白质分析有着极其 重要的意义，这已成为蛋白质微量检测及溶液的构象分析中不可缺少的手段之一。在 外源荧光法中，又可分为有机荧光探针法和稀土荧光探针法，作为一个好的荧光探针 应满足以下条件 a o l ：探针分子与蛋白质分子的某一微区必需有特异性的结合，并且结 合比较牢固：探针的荧光必须对环境条件敏感；蛋白质分子与探针结合后不影响其原 来的结构和特性。在满足这些条件的基础上可进行蛋白质的测定和与金属离子结合的 计量化学等。 ( 1 ) 有机荧光探针 与光度法类似，蛋白质在和某些具有荧光特性的染料结合后，能引起荧光强度的 变化，并且在一定浓度范围内与蛋白质浓度成正比，因此可用于蛋白质的测定。最常 用的有机荧光探针有1 一苯胺基萘8 磺酸( a n s ) ，2 - 对甲胺萘6 磺酸( 2 ，6 一t n s ) t 4 1 】等。利 用这些化合物在不同蛋白质分子中量子产率、峰位及谱带的变化，就可探测蛋白质分 6 济南大学硕士学位论文 子结合区的极性、疏水性的大小，从而推测构象的稳定情况及变化等。例如，a n s 在水溶液中的量子产率与荧光峰分别是0 0 0 4 和5 1 5n i r l ，与去辅基肌红蛋白结合后相 应地变成0 9 8 和4 5 4 眦。由此推断与a n s 结合的部位是疏水性很强的区域。此外，曙 红y 、吖啶红、仪，p ，y ，8 - 四( 对羧苯基) 卟啉【4 2 州等也可用作蛋白质荧光探针。 ( 2 ) 稀土荧光探针 稀土荧光探针法为蛋白质的研究工作开辟了一条新的途径。铕( i i i ) 和铽( i i i ) 是最 常用的两种稀土荧光探针。铕( i i i ) 和铽( i i i ) 荧光光谱的高灵敏性和不同环境对荧光的 影响，使得铕( i i i ) 和铽( i i i ) 成为研究蛋白质的有效探针。铕( i i i ) 或铽( i i i ) 荧光寿命的测 定能够给出蛋白质分子的构象及构象动力学方面的信息。a u s t i n 等【4 5 】使用铽( i i i ) 为探 针研究了钙调蛋白的构象动力学。 另外稀土螯合物也可以作为荧光探针进行蛋白质的分析，如铽的螯合物已用于蛋 白质的定量测定。 荧光偏振 利用荧光体在转动扩散速度上的差异而导致偏振荧光的差别，建立了荧光偏振测 定法。利用荧光偏振我们可用来研究：( 1 ) 酶与荧光底物的结合程度；( 2 ) 蛋白质聚 合与解离；( 3 ) 蛋白质从螺旋到无规卷曲的研究。另外还可得到一些通常由c d 和u v 所得不到的有关蛋白质柔性微区的信息【柏1 。 时间分辨荧光光谱法 时间分辨荧光光谱是依据待测组分荧光衰减特性的差异而进行选择性测定，可以 消除瑞利和拉曼散射的干扰，又可以根据荧光寿命的差异对荧光光谱重叠组分进行测 定，为复杂体系的荧光测量提供了选择性基础。 时间分辨一荧光免疫分析以具有较长荧光寿命的荧光基团作为免疫标记，利用时 间分辨荧光测量技术进行测定。一方面可以在荧光分子定量中获得高灵敏度，另一方 面可以通过时间分辨技术使选择性可以得到改善，这样就可以定性和定量分析微量蛋 白质。 激光诱导时间分辨免疫分析法 在稀土络合物时间分辨荧光光谱和免疫分析的基础上发展起来的激光诱导时间 分辨免疫分析法在灵敏度、专一性、稳定性等方面均可与放射免疫分析相媲美，是超 微量蛋白质免疫分析的有力手段，已用于人尿中免疫球蛋白g 的测定h 7 1 。 熊z 鎏立壅茎娄里耋彗型：塑g 坠垄翌堡盐堡望兰旦鎏墼鎏塞兰蜜星 总之，荧光法测定蛋白质含量最大的优点是灵敏度高，其测定条件更接近生命体 的生理环境，因而在蛋白质乃至生命科学研究中具有重要的意义；但它仅适用于具有 荧光的体系，因而使方法的使用范围受到限制。近几年来，又出现了磷光探针技术， 由于它在研究水溶液中蛋白质分子疏水微区内不同基团间距离、局部结构柔性、动力 学性质及构象变化等独特的优势而引起了人们的广泛关注1 4 8 1 ：但是磷光测定需苛刻的 实验条件，如测定时需专门除氧或液氮冷冻操作加之蛋白质的分离、提纯较困难，国 内相关研究工作的报道亦较为少见【4 9 i 。 测定蛋白质的某些荧光法的反应条件及分析特性列于表1 4 ： 表1 4 测定蛋白质的某些常用荧光法【4 2 4 4 ，”5 7 1 t a b l e1 - 4s o m ef l u o r e s c e n tm e t h o d sf o rt h ed e t e r m i n a t i o no f p r o t e i n 1 1 4 共振瑞利散射法 光散射是指一束通过介质时在入射光以外的方向观测到光强的现象，它是电磁辐 射与物质问相互作用的一种表现形式。根据入射光和散射光波长的不同，光散射又可 分为弹性光散射、非弹性光散射和准弹性光散射。r a y l e i g h 散射、浑浊介质的t y n d a l l 散射和透明介质的分子散射是弹性散射。瑞利光散射( r a y l e i g hl i 曲ts c a t t e r i n g ， r l s ) ，是散射波长等于入射光波长，且散射粒子( 如分子) 又远小于入射波长产生 的弹性散射，其散射强度与波长的四次方成反比。在瑞利光散射中，染料与蛋白质作 用的最佳p h 值与分光光度法测定蛋白质的酸度条件有很大出入。例如氯磺酚s 用于 分光光度法测定b s a 的最佳酸度值为p h2 4 ，而该体系瑞利光散射测定的最佳p h 值约在4 0 左右1 9 ”j 。酸度条件的较大差异与两种方法的测定机理直接相关。r l s 法 济南大学硕士学位论文 主要考虑染料与蛋白质的最大结合，而分光光度法除要求染料分子要尽可能多得与蛋 白质结合外，还要考虑染料的两种不同颜色型体发生转换时的p k a 值【5 9 1 。由两种测 定方法都可看出，静电引力在染料与蛋白质的结合中起着重要作用。另外，试剂的加 入顺序、染料浓度的太小也影响r l s 产率和测定的线性范围。瑞利散射虽然可为化 学研究提供一些有用的数据信息，诸如分子量、分子旋转半径、形状及尺寸，但却存 在着信号水平低和选择性差的缺点，这使得瑞利散射技术在研究极稀溶液和复杂混合 物中物质的浓度和结构信息时比较困难，从而限制了它的应用范围。 但是当瑞利散射位于或接近于它的吸收带时，由于电子吸收电磁波的频率与其散 射频率相同，电子因共振而强烈吸收散射光的能量发生再次散射，其散射强度通常较 单一的瑞利散射提高几个数量级，并且不再遵守散射强度与波长的四次方成反比的瑞 利散射定律。这种吸收- 再散射的过程称为共振瑞利散射，又叫共振光散射( r e s o n a n c e r a y l e i 曲s c a t t e r i n g ，r r s ) 。由于共振瑞利散射有极高的强度，因此入射光可用普通光 源，这不仅使方法更为简便，而且普通光源( 如氙灯) 通过单色器可以提供连续波长 的入射光，这就为研究共振瑞利散射光谱创造了条件。目前r r s 的分析应用主要集中 于两个方面：( 1 ) 利用某些离子缔合物络合产生强烈的r r s 用于痕量金属、非金属和 某些有机物的测定；( 2 ) 利用生色团在生物大分子上的聚集作用导致r r s 显著增强而 定量测定蛋白质、核酸等生物犬分子。文献报道铬天青s 铁( i i i ) 二元络合物能作为蛋 白质分子的吸收光谱探针，如果使用该技术研究铬天青s 一铁( 1 i d s 元络合物与蛋白质 的作用，那么可以测定0 0 2m g - l “的白蛋白，且方法灵敏度要比对应的吸光光度法高 2 个数量级。 将近几年常用的测定蛋白质的共振瑞利散射法列于表1 5 ： 表1 - 5 某些共振瑞利散射测定蛋白质的方法【5 8 ，6 0 4 埘 t a b l e l 5s o m er e s o n a n c er a y l e i g hs c a t t e r i n g m e t h o d s f o r t h ed e t e r m i n a t i o no f p r o t e i n 续表1 5 试剂测定ph z n s 线性范围检出限 对象(rim) ( 腭m l )o - t g - m l “) 钍试剂i i b s a 3 2 4 8 4 0 00 1 00 0 5 4 酸性品红h s a 4 1 02 7 70 4 00 0 0 3 铀试剂l h s a 3 2 94 0 00 1 8 0 0 6 0 铬黑t h s a4 1 03 7 5o 1 50 0 3 9 亮黄 b s a2 5 04 9 50 5 00 0 2 0 三氯乙酸h s a1 2 5t 0 0 1 l t c a 4 7 00 0 0 3 - - 4 00 0 0 1 钍试剂h s a3 7 3 3 4 52 0 1 4 00 0 5 4 四磺基铈酞菁h s a 2 0 - - 3 04 1 20 1 1 70 0 2 4 铬蓝黑r b s a4 03 9 80 1 2 50 0 3 3 镀试剂i i b s a3 8 03 8 00 1 3 2 4 0 间苯二酚黄 b s a2 3 53 4 00 0 2 4 00 0 1 0 偶氮磺i l l b s a4 2 33 6 70 3 3 0 5 一 间羧基偶氮氯瞵h s a 4 1 04 1 00 5 3 5 0 1 0 4 桑色素 b s a4 24 7 00 4 5 7 1 5 d b n 偶氮胂- a i ” b s a5 3 - - 7 ，04 7 00 3 4 4 1 7 1 0 1 0 3 d b h p f m o ( v n b s a2 85 8 60 0 5 0 7 50 0 1 3 4 偶氮变色酸苯基荧 b s ao 5 1 83 3 70 2 4 0 o 0 6 8 光酮 酸性铬蓝k b s a3 9 63 4 501 3 6 - - 1 0 8 8 橙黄g b s a1 25 4 8 o 5 0o 0 0 3 邻笨二酚紫 b s a1 4 2 03 9 90 8 000 5 2 四碘酚磺酞 b s a3 9 63 3 40 3 4 1 2 2 4 - 周绿f c f b s a4 1 02 7 90 0 3 n 1 2 50 0 0 3 5 丽春红g b s a3 8 02 8 80 - 3 5 00 0 31 m n t s p cb s a3 口4 03 4 4 0 0 1 60 0 0 8 十二烷基磺酸钠 b s a2 63 8 00 0 2 1 0o 0 1 3 丽春红2 r b s a3 5 03 5 30 2 5 1 7 5 0 0 2 1 由表1 5 可见，能用分光光度法测定的探针染料也有可能用于r l s 法测定。对于 在水溶液中无颜色变化的且用通常仪器检测不出来的探针反应，也可通过r l s 法检 测，从而扩大了生物大分子测定的探针范围，为蛋白质、核酸与小分子的机理探讨提 供了一个重要的研究手段。r r s 技术的测定灵敏度很高，可达纳克级，从而r r s 法为 生物化学及临床分析样品的微量分析测定提供了一条新的途径。 0 1 1 5 化学发光法 利用化学发光反应定量测定蛋白质也是近年来发展起来的一个新领域口“。例如李 勇新等【9 2 1 人将四磺基锰酞菁用于催化鲁米诺过氧化氢化学发光反应，在合适条件下 蛋白质可猝灭此发光反应，结合流动注射技术，建立了一种高灵敏的测定蛋白质的猝 灭化学发光新方法。 偶合反应化学发光酶联免疫分析【9 3 1 是一种测定人血清甲胎蛋白的新方法。将辣根 过氧化物酶( h r p ) 催化h 2 0 2 氧化曙红的反应和h r p 催化h 2 0 2 与发光剂鲁米诺的 化学发光反应相偶合，根据测定标记在甲胎蛋白抗体上的h r p 的量，求得发生免疫 反应的甲胎蛋白的含量。该法灵敏度要比现行的e l i s a 法高1 0 倍。 1 1 6 电化学法 近年来，电分析化学在方法、技术和应用方面得到了长足发展，并呈蓬勃上升的 趋势【9 4 】。在应用上，侧重生命科学领域中有关问题的研究，为解决生命现象中的某些 基本过程和分子识别作用显示出潜在的应用价值，已引起生物界的关注。测定生物大 分子f 核酸、蛋白质等) 是其应用的一个重要方面。 孙伟等【9 5 】人发现在p h4 2 的b r i t t o nr o b i n s o n 缓冲液中茜素红s 与牛血清白蛋白 能形成一种红色的非电活性的超分子复合物。用线性扫描二阶导数极谱法和循环伏安 法对该体系进行了研究，复合物的形成使茜素红s 的还原峰电流下降峰电流的下降 值同所加的b s a 浓度在8 ，0 x 1 0 - 8 1 1 2 1 0 七t 0 0 1 l 4 范围内呈线性关系，检测限为 4 3 l o m 0 1 i ，一。 1 1 7 高效液相色谱法 用高效液相色谱法( h i g hp e r f o r m a n c el i q u i dc h r o m a t g r a p h i c ，h p l c ) 分析蛋白质是 近年来发展较快的一种新型分析方法。b i e t z 在1 9 8 3 1 9 8 4 年就第一次对用反相( r p ) 和尺寸排阻( s e ) 高效液相色谱法来分离小麦蛋白质和玉米蛋白质的实验进行报导：由 于高效液相色谱柱的改进和h p l c 技术的迅速发展，h p l c 法在蛋白质分析研究中越趋 成熟。h p l c 分析蛋白质不仅简便快捷，而且选择性好，分离效率高，检测灵敏度高。 h p l c 的分离模式与检测方法多种多样，可以根据样品的构成与性质来选择合适的色 谱条件( 色谱柱、洗脱液、检测器等) 。根据分离机理、蛋白质的h p l c 可以分成尺寸 排阻色谱( s e c ) 、反相高效液相色谱( 王心h p l c ) 和凝胶渗透色谱( g p c ) 三大类。如c i a f f i 等用s e h p l c 来测定面粉蛋白质不同组分( 麦醇溶蛋白和麦谷蛋白) 的绝对量和相对 量与面团流变学参数之间的关系。他们在h p l c 系统上配置6 5 0 型高压泵和4 8 4 型可变 堡墨鎏盐重茎娄塑耋鎏型：塑坐垄堂丛堑望重皇重丝蟹塞兰蜜旦 波长检测器作为s e h p l c 装置，对经过超声处理的非还原全蛋白进行分离并在_ 2 1 4 n m 波长下测定其吸光度，发现在s d s 缓冲液中可溶的蛋白质占总蛋白质的比例与面团的 粘性和强度呈负相关，而不溶蛋白质的比例则与面团的这两个物理特性呈正相关i 矧。 其中，s e c 和r p - h p l c 两种色谱分离模式构成了蛋白质分析的主流，如何选择合 适的分离模式和检测方法不能单从蛋白质的分离要求和灵敏度来判断，应更侧重于实 际样品的类别。由于蛋白质往往容易吸附在o d s 柱中，这就使得测定结果的相关性较 差。所以，在很多情况下，应考虑采用复合分折方法，将用于蛋白质分析的h p l c 方 法和