（应用化学专业论文）蛋白质在碳包镍纳米粒子修饰电极上的电化学及分析应用.pdf

i l l illi i l l1 11 1 11i llll y 17 3 7 4 2 7 e l e c t r o c h e m i s t r ya n da n a l y t i c a la p p l i c a t i o n s o fp r o t e i n so nc a r b o n - c o a t e dn i c k e l n a n o p a r t i c l e s m o d i f i e de l e c t r o d e s ad i s s e r t a t i o ns u b m i t t e df o rt h ed e g r e eo fm a s t e r c a n d i d a t e ：y a n gl i j u n s u p e r v i s o r ：p r o f w a n gs h e n g f u h u b e iu n i v e r s i t y w u h a n ，c h i n a 湖北大学学位论文原创性声明和使用授权说明 原创性声明 本人郑重声明：所呈交的论文是本人在导师的指导下独立进行研究所 取得的研究成果。除了文中特别加以标注引用的内容外，本论文不包含任 何其他个人或集体已经发表或撰写的成果作品。对本文的研究做出重要贡 献的个人和集体，均已在文中以明确方式标明。本人完全意识到本声明的 法律后果由本人承担。 论文作者签名：布移厕君 日期：加口年易月8e l 学位论文使用授权说明 本学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定，即： 按照学校要求提交学位论文的印刷本和电子版本；学校有权保存学 位论文的印刷本和电子版，并提供目录检索与阅览服务；学校可以允许 采用影印、缩印、数字化或其它复制手段保存学位论文；在不以赢利为 目的的前提下，学校可以公开学位论文的部分或全部内容。( 保密论文 在解密后遵守此规定) 作者签名： 杨厕是 指导教师签名： e l 期：2 0 ，口占b 日期：沙乡 摘要 近来，纳米材料因其独特的电学和化学性质，在多个领域吸引了人们越来越多的注 意。当物质的结构单位d , n 纳米数量级以后，物质的性质就会产生突变，这种突变具有 既不同于原来组成的原子、分子，也不同于宏观物质的特殊性能。当把纳米材料作为电 极修饰材料时，以其敏锐的电活性，它能加速电化学反应的电子传递速率。碳包镍纳米 粒子是一种由数层石墨层在外紧密环绕，核心为纳米镍颗粒的类洋葱结构，它能为电化 学反应提供大的表面积和优良的电子传导性能。碳包镍纳米粒子修饰电极能为蛋白质的 研究提供快速的电流响应、低检测限、高灵敏度以及对底物分子很好的亲和性。 本论文的具体内容包括以下几个方面： ( 1 ) 芦丁在碳包镍纳米粒子修饰电极上的电化学分析及其与牛血清白蛋白相互作 用的研究 采用循环伏安法( c 和差分脉冲伏安法( d p v ) 研究了芦丁( r u t i n ) 在碳包镍修饰玻 碳电极( c n i g c e ) 上的电化学性质及其与牛血清白蛋白( b s a ) 的相互作用。对影响该修饰 电极电流大小的主要条件如底液的p h 值、富集电位和富集时间等进行了优化。观察到 r u t i n 在c n i g c e 上有一对准可逆的氧化还原峰，其峰电流随着r u t i n 浓度的增加而增 加，并且在两段线性范围内与峰电流成线性关系：2 0 0 1 0 一2 1 2 1 0 刁m 和2 1 2 1 0 。 一1 7 2 1 0 击m ，检测限低至6 0 0 1 0 j o m ，表明该电极可以用于r u t i n 的痕量测定。当 向r u t i n 溶液中加入b s a 时，r u t i n 的氧化还原峰电流随着b s a 浓度的增加而减小，表 明r u t i n 与b s a 发生了相互作用，在电极表面生成了一种蛋白质复合物。采用电化学方 法和荧光法计算了它们相互作用的结合常数和结合位点数，两方法的计算结果基本吻 仑o：? ：一一一 ( 2 ) 基于碳包镍纳米粒子一壳聚糖复合膜的新型酪氨酸酶生物传感器的研制 构建了一个基于壳聚糖( c s ) c n i 纳米复合物膜的酪氨酸酶( t y r ) 生物传感器，并用于 酚类化合物的定量测定。t y r 能在氧气存在的条件下，催化苯酚成邻苯二酚，然后进一 步催化邻苯二酚生成邻苯二醌，生成的邻苯二醌能在没有电子媒介体的情况下，直接在 电极上被还原成邻苯二酚。用扫描电镜和交流阻抗对t y r c s c n i 复合膜进行了表征。 在p h6 5 的磷酸缓冲溶液( p b s ) 中、0 2v 的工作电位下，邻苯二酚在浓度为2 5 0 1 0 。1 0 一2 6 7 1 0 巧m 的范围内与传感器的响应电流呈现很好的线性关系，检测限低至8 3 3 1 0 0 1m 。该传感器对酚类化合物，如对甲基苯酚、间甲基苯酚和苯酚都表现出响应快速、 重现性和稳定性良好等特点。 ( 3 ) 基于硼杂碳包镍纳米粒子壳聚糖复合膜的葡萄糖氧化酶的直接电化学和分析应 用 将葡萄糖氧化酶( g o d ) 固定在c s 硼杂碳包镍( b c n i ) 复合膜修饰电极上，制备了定 量测定葡萄糖的生物电化学传感器。用扫描电镜对g o d c s b c n i 膜进行了表征，该膜 有利于酶的固定，并能最大限度地保持酶的生物活性。采用循环伏安法和计时安培法 研究了g o d 的直接电化学及其对葡萄糖的电催化作用。结果表明，g o d 在该修饰电极 上表现出一对稳定、准可逆的氧化还原峰，同时，该电极的响应电流与葡萄糖浓度在2 5 0 l o 。5 1 1 9 1 0 弓m 范围内呈现良好的线性关系，检测限为8 3 3 1 0 。6 m 。该传感器对 葡萄糖的测定表现出响应快速、亲和性高、重现性和稳定性好等特点。 关键词：碳包镍纳米粒子；芦丁；牛血清白蛋白：壳聚糖；酪氨酸酶；葡萄糖氧化酶； 生物传感器；电催化 i i a b s t r a c t r e c e n t l y s o m en e wn a n o m a t e r i a l s ，d u et ou n i q u ee l e c t r i c a la n dc h e m i c a lp r o p e r t i e s ， h a v ed r a w nm u c ha t t e n t i o ni nv a r i o u sf i e l d s w h e nt h ep h y s i c a ls t r u c t u r eo fm a t e r i a la ss m a l l a sn a m o m e t e rs c a l e ，t h ec h a r a c t e r i s t i co fm a t e r i a lw o u l db ec h a n g e dd r a s t i c a l l y t h es u b t l e e l e c t r o n i cp r o p e r t i e ss u g g e s tt h a tn a n o m a t e r i a l sh a v et h ea b i l i t yt op r o m o t ee l e c t r o n - t r a n s f e r r e a c t i o n sw h e nu s e da sa ne l e c t r o d em a t e r i a li ne l e c t r o c h e m i c a lr e a c t i o n s c a r b o n c o a t e d n i c k e ln a n o p a r t i c l e ( c n i ) h a ss o m es p e c i a lf e a t u r e sd u et ot h ee f f e c to fn iw h e nc o m p a r e d w i t hc a r b o no n i o n sc o n s i s t i n go n l yo fc a r b o nl a y e r s i tc o u l dp r o v i d eh i 曲s u r f a c ea n dg o o d e l e c t r o c a t a l y f i ca b i l i t i e sf o rt h ee l e c t r o c h e m i c a lr e a c t i o n t h ec n im o d i f i e de l e c t r o d e sc a l l p r o v i d er a p i dr e s p o n s e ，l o wd e t e c t i o nl i m i t ，h i g l ls e n s i t i v i t ya n dh i 曲a f f i n i t yf o rp r o t e i n s s t u d i e s t h em a i nc o n t e n t sa n dr e s u l t sa r es u m m a r i z e da sf o l l o w ： ： ( 1 ) e l e c t r o c h e m i c a ls t u d i e so fr u t i na n di t si n t e r a c t i o nw i t hb o v i n es e r u ma l b u m i nb a s e do n c a r b o n - c o a t e dn i c k e ln a n o p a r t i c l e sm o d i f i e de l e c t r o d e s e l e c t r o c h e m i c a lp r o p e r t i e so fr u t i na n di t si n t e r a c t i o nw i t hb o v i n es e r u ma l b u m i n ( b s a ) a t c a r b o n - c o a t e dn i c k e ln a n o p a r t i c l e sm o d i f i e dg l a s s yc a r b o ne l e c t r o d e s ( c n i g c e ) w e r e i n v e s t i g a t e db yc y c l i cv o l t a m m e t r y ( c v ) a n dd i f f e r e n t i a lp u l s ev o l t a m m e t r y ( d p v ) t h e e f f e c t so fp ho fs u p p o r t i n ge l e c t r o l y t e ，a c c u m u l a t i o np o t e n t i a l ，a c c u m u l a t i o nt i m ea n d r e a c t i o nt i m ew e r eo p t i m i z e d t h e r ew a sap a i ro fr e v e r s i b l ep e a k sa tc n i g c ei nt h e p o t e n t i a lr a n g eo f0 o 6v i np h5 0p h o s p h a t eb u f f e rs o l u t i o n ( p b s ) t w ol i n e a rs e g m e n t s w i t hd i f f e r e n ts l o p e sf o rr u t i nc o n c e n t r a t i o nw e r ep r e s e n t e d ：2 0 0 10 9t o2 12 10 7ma n d 2 1 2 1 0 。7t o1 7 2 1 0 6m t h ed e t e c t i o nl i m i tw a sl o wt o6 0 0 1 0 1 0 m ，w h i c he x h i b i t e d t h em o d i f i e de l e c t r o d ec o u l db ea p p l i e dt od e t e c tt r a c er u t i n 、m t l lt h ea d d i t i o no fb s ai n t o r u t i ns o l u t i o n ，t h ed e c r e a s eo fc u r r e n t sw a sp r o p o r t i o n a lt ob s ac o n c e n t r a t i o n a n e l e c t r o i n a c t i v ec o m p l e xo fb s aa n dr u t i nw a sp r o d u c e d t h eb i n d i n gc o n s t a n ta n db i n d i n g r a t i ow e r ec a l c u l a t e da n dt h es a m er e s u l t sw e r eo b t a i n e d ( 2 ) an o v e lt y r o s i n a s eb i o s e n s o rb a s e do nc h i t o s a n - c a r b o n - c o a t e dn i c k e ln a n o c o m p o s i t e f i l m an o v e ln a n o c o m p o s i t ef i l mo ft y r o s i n a s e - c h i t o s a n - c n in a n o p a r t i c l e sh a db e e nc o n s t r u c t e d f o rt h ed e t e c t i o no fp h e n o l i cc o m p o u n d s t y r o s i n a s ec a t a l y z e dt h eh y d r o x y l a t i o no f m o n o p h e n o l sw i t hm o l e c u l a ro x y g e nt of o r mo d i p h e n o l sw h i c ht h e nb yd e h y d r o g e n a t i o ni s t r a n s f o r m e dt oo - q u i n o n e s o q u i n o n e sw i l lt h e nb ee l e c t r o c h e m i c a l l yr e d u c e dt oo d i p h e n o l s a tal o wo v e r p o t e n t i a lw i t h o u ta n ye l e c t r o nt r a n s f e rm e d i a t o r t h et y r o s i n a s e - c h i t o s a n - c n i i i i b i o n a n o c o m p o s i t ef i l mw a sc h a r a c t e r i z e dw i t hs c a n n i n ge l e c t r o nm i c r o s c o p i c ( s e m ) a n d e l e c t r o c h e m i c a li m p e d a n c es p e c t r o s c o p y ( e i s ) i np h6 5p b s ，t h eb i o s e n s o rw a sa p p l i e dt o d e t e c tc a t e c h o lw i t hab r o a dl i n e a rr a n g ef r o m2 5 0 10 。l ot o2 6 7 10 一m t h ed e t e c t i o n l i m i tw a sb r o u g h td o w nt o8 3 3 10 。1 1ma tas i g n a lt on o i s er a t i oo f3w i t ha na p p l i e d p o t e n t i a lo f 0 2vs u c hn e wt y r o s i n a s eb i o s e n s o ra l s oe x h i b i t e de x c e l l e n ta m p e r o m e t r i c r e s p o m et oo t h e rp h e n o l i cc o m p o u n d s ，i n c l u d i n gp - c r e s o l ，m - c r e s o la n dp h e n 0 1 t h ep r o p o s e d b i o s e n s o rd e m o n s t r a t e dr a p i dr e s p o n s e ，a sw e l la sg o o dr e p r o d u c i b i l i t ya n ds t a b i l i t y ( 3 ) d i r e c te l e c t r o c h e m i s t r yo fg l u c o s eo x i d a s ea n db i o s e n s i n gf o rg l u c o s eb a s e do n b o r o n d o p e dc a r b o n c o a t e dn i c k e lm o d i f i e de l e c t r o d e an o v e lb i o s e n s o rf o rd e t e c t i n gg l u c o s eh a db e e nc o n s t r u c t e d b yi m m o b i l i z a t i o no fg l u c o s e o x i d a s e ( g o d ) o nc h i t o s a n - b o r o n - d o p e dc a r b o n - c o a t e dn i c k e l ( b c n i ) n a n o p a r t i c l e sm o d i f i e d e l e c t r o d e t h eg o d c h i t o s a n b c n ib i o n a n o c o m p o s i t ef i l mw a sc h a r a c t e r i z e dw i t hs e m t h e f i l mw a sp r o p i t i o u st ot h ei m m o b i l i z e do fg o da n dt ot h er e t e n t i o no fi t sb i o a c t i v i t yt oa l a r g ee x t e n t t h ed i r e c te l e c t r o c h e m i s t r ya n de l e c t r o c a t a l y s i so fg o do nm o d i f i e de l e c t r o d e h a db e e ni n v e s t i g a t e db yc y c l i cv o l t a m m o g r a m ( c a n da m p e r o m e t r i cm e a s u r e m e n t s t h e g o dd i s p l a y e dap a i ro fs t a b l ea n dq u a s i r e v e r s i b l er e d o xp e a k si np h7 0p b s f u r t h e r m o r e ， t h eb i o s e n s o rw a sa p p l i e dt od e t e c tg l u c o s ew i t hab r o a dl i n e a rr a n g ef r o m2 5 0 10 。t o1 19 1 0 m ，t h ed e t e c t i o nl i m i tw a sb r o u g h td o w nt o8 3 1 0 击m t h ep r o p o s e db i o s e n s o r s h o w e d r a p i dr e s p o n s e ，h i g ha f f i n i t y , s a t i s f a c t o r yr e p r o d u c i b i l i t ya n da c c e p t e ds t o r a g e s t a b i l i t y k e yw o r d s ：c a r b o n - c o a t e dn i c k e ln a n o p a r t i c l e s ；b o v i n es e r u ma l b u m i n ；c h i t o s a n ；t y r o s i n a s e ； g l u c o s eo x i d a s e ；b i o s e n s o r ；e l e c t r o c a t a l y t i c i v 目录 第一章绪论：o o o ooooooooooo oo oooo oo oo ooo 1 1 引言1 2 蛋白质的电化学研究进展1 一2 1 蛋白质的结构与功能一1 2 2 蛋白质的电化学研究基础3 2 3 蛋白质的溶液电化学研究”4 2 4 蛋白质的表面电化学研究- 4 2 4 1 蛋白质膜修饰电极”4 2 4 2 蛋白质一溶胶凝胶膜修饰电极5 2 4 3 蛋白质聚合物膜修饰电极5 2 4 4 蛋白质模拟生物膜修饰电极6 2 4 5 蛋白质纳米材料复合膜修饰电极7 3 纳米材料修饰电极的研究进展7 3 1 纳米材料的基本特性”7 3 1 1 小尺寸效应7 3 1 2 表面效应8 3 1 3 量子尺寸效应8 3 1 4 宏观量子隧道效应8 3 2 纳米材料修饰电极的应用8 3 2 1 纳米粒子修饰电极8 3 2 2 纳米线修饰电极一1 4 3 2 3 纳米管修饰电极1 4 4 论文的指导思想及主要内容1 5 4 1 指导思想l5 4 2 主要内容l6 参考文献l6 第二章芦丁在碳包镍纳米粒子修饰电极上的电化学分析及其与牛血清白蛋白相互作用 的研究一2 8 v 1 引言：- j o z ：2 8 2 实验部分”2 9 2 1 仪器与试剂2 9 2 2c n 粥c e 的制备2 9 2 3 实验方法”3 0 3 结果与讨论3 0 3 1r u t i n 在c n i g c e 上的电化学行为3 0 3 2 实验条件的优化3 1 3 2 1p h 值的影响3 1 3 2 2 扫描速度的影响3 2 3 2 3 富集电位与富集时间的影响”3 2 3 3 分析应用： 3 3 3 3 1 线性范围和检测限”3 3 3 3 2 电极的重现性和稳定性3 3 3 3 3 加标回收；3 4 3 3 4 干扰实验3 4 3 4r u t i n 与b s a 相互作用的电化学研究”3 4 3 4 1r u t i n 与b s a 相互作用的循环伏安研究3 4 3 4 2 相互作用时间的影响”3 5 3 4 3b s a 的电化学测定”3 5 3 5r u t i n 与b s a 的结合常数和结合位点数的测定”3 6 3 5 1 电化学方法3 6 3 5 2 荧光光谱法“3 7 4 结j 沧3 8 参考文献3 8 第三章基于碳包镍纳米粒子壳聚糖复合膜的酪氨酸酶传感器的研制4 2 1 弓i 言4 2 2 实验部分”4 3 2 1 仪器与试剂4 3 v i 2 2t y r - c s c n i g c e 酶传感器的制备4 3 2 3 实验方法4 3 3 结果与讨论4 3 。3 1t y r - c s c n i 膜的表征“4 3 3 2 酶传感器对酚类化合物的电化学响应4 5 3 3 实验条件的优化4 6 3 4 酶传感器对酚类化合物的响应4 6 3 5 酶传感器的重现性和稳定性4 8 4 结论i _ 4 8 参考文献4 8 第四章基于硼杂碳包镍纳米粒子壳聚糖复合膜的葡萄糖氧化酶的直接电化学及其分 析应用5l 1 引言51 2 实验部分51 2 1 仪器与试剂51 2 2g o d c s b c n i g c e 的制备5 2 2 3 实验方法5 2 3 结果与讨论”5 2 3 1g o d c s b c n i 膜的s e m 表征5 2 3 2g o d 的直接电化学5 3 3 3g o d 的电催化行为? 5 5 4 结论5 8 参考文献5 8 附勇乏6 1 致 射”6 2 v 第一章绪论 第一章绪论 1 引言 。 蛋白质是以氨基酸为基本结构单位的生物大分子，它是与生命及各种形式的生命活 动紧密联系在一起的物质，机体中的每个细胞、组织结构和所有重要的组成部分都有蛋 白质的参与，几乎没有一种生命活动能离开蛋白质。酶是最常见的一类蛋白质，它们能 催化绝大多数的生化反应，生命体内的新陈代谢几乎都是在酶的催化作用下进行的。作 为大多数生命活动的载体和执行者，蛋白质肩负着完成多种生命功能的任务：如维持机 体的新陈代谢；储存和运输各种物质；催化细胞内的生化反应；提供生命活动的能量。 因此，蛋白质的研究一直是科学家所关注的重要课题之一，我们不仅需要弄清不同类型 蛋白质结构与功能的关系，还必须了解蛋白质的存在状态及其与小分子的相互作用机 理，这在理论和实际应用方面均有重要的意义。 纳米材料是现今新材料领域中最富有吸引力、对未来经济和社会发展有着十分重要 影响的研究对象，也是纳米技术中最为活跃重要组成部分。所谓纳米材料，是指具有纳 米数量级( 1 1 0 0r i m ) 的超微粒构成的固体物质。当物质的尺寸小到纳米数量级后，物质 的性质就会产生突变，这种突变具有既不同于原来组成的原子、分子，也不同于宏观物 质的特殊性能。它们常常会表现出特异的表面效应、表面界面效应、小尺寸效应、量子 尺寸效应和宏观量子隧道效应等，其电学、磁学、力学和化学性质也会发生显著的变化， 呈现出宏观材料不具备的优越性能。正是由于纳米材料具有显然不同于宏观材料和单个 分子的独特性能，使得它在各种领域有着重要的应用价值。 ， 2 蛋白质的电化学研究进展 2 1 蛋白质的结构与功能 蛋白质是化学结构复杂的有机化合物，是类十分重要的生物大分子。大多数蛋白 质都是自然折叠的一种特定的三维结构，这一天然结构被称为天然状态。每一种天然蛋 白质都有自己特有的空间结构，通常分为一级结构( 组成蛋白质多肽链共价主链的线性 氨基酸顺序) 、二级结构( 利用不同氨基酸之间的氢键形成的稳定多肽链，这是一种在一 维方向上具有周期性结构的构象，如纤维状蛋白质中的仅螺旋和p 折叠片) 、三级结构( 多 肽链借助各种次级键在三维空间上盘绕成具有特定肽链走向的紧密球状构象，它具有稳 定作用的还有盐桥、氢键和二硫键等) 、四级结构( 寡聚蛋白质中各亚基之间在空间上相 互作用形成具有特定功能的蛋白质) 。蛋白质的一级结构即蛋白质的共价结构，有时也 湖北大学硕士学位论文 称化学结构，二、三：四级结构又称空间结构或高级结构。 生物界蛋白质的种类大约有1 0 加 - 1 0 1 2 数量级，有如此多种类的蛋白质主要是因为 有2 0 种参与蛋白质组成的氨基酸，它们在肽链中排列的不同使得蛋白质的种类也不同。 蛋白质的这种顺序异构现象是蛋白质生物功能多样性和种属特异性的结构基础。蛋白质 在生命体内主要的生物学功能有：作为有机体新陈代谢的催化剂酶，几乎所有的酶都 是蛋白质，生物体内的各种生化反应都是在相应酶的参与下进行的；作为有机体的结构 成分，细胞里的片层结构都是由不溶性蛋白质与脂质组成的；可以储存氨基酸，用作有 机体及其胚胎或幼体生长发育的原料：具有运输功能，可运输有机体内氧气、血红蛋白 和脂蛋白等；是肌肉收缩系统的必要成分，例如肌动蛋白与三磷酸腺苷相互作用可引起 机械弹性的改变；具有激素的功能，对生物体内的新陈代谢起调节作用；参与免疫反应， 这是有机体排除外来物质干扰的一种防御机能；还起着接受和传递信息的作用；以及调 节或控制细胞的生长、分化和遗传信息的表达。 牛血清白蛋白、酪氨酸酶和葡萄糖氧化酶都是结构已知的、较易获得的几种常见蛋 白质，是用来研究蛋白质电子传递反应的理想分子。下面简要介绍它们的结构与功能： ( 1 ) 牛血清白蛋白 - ， 牛血清白蛋白( b s a ) 是牛血清中的简单蛋白，是血浆中含量最丰富的重要载体蛋白， 它能与许多内源性和外源性物质广泛结合【l 】。b s a 只有一条c 端为丙氨酸，n 端为天冬 氨酸的肽链，含有5 8 2 个氨基酸残基，其中有3 5 个半胱氨酸残基，除了有一个以单个 巯基存在以外，其余都为二硫键，其中又有8 对组成交叉的二硫键【2 ，3 1 ，这种交叉的二 硫键增加了b s a 结构的刚性和稳定性【4 】。b s a 有三个类似的结构域，每个结构域又含 有两个亚结构域，它们以槽口相对的方式形成圆筒状结构，几乎所有疏水性氨基酸残基 都包埋在圆筒腔内部，构成疏水性腔【5 1 。b s a 的分子量为6 6 2 9 6 ，它不含糖也没有活性 中心，是一个惰性蛋白。我们常常研究b s a 与一些小分子特别是药物小分子的相互作 用，用以探究小分子的药效机理。 ( 2 ) 酪氨酸酶 酪氨酸酶( t 蚋，又称多酚氧化酶，是一种结构复杂的多亚基含铜氧化还原金属酶， 它广泛分布于微生物、动植物和人体中，不同生物中的t y r 氨基酸残基的数目和分子量 都有很大差异 6 1 。t y r 的催化活性中心是由连接了2 个铜离子的内源桥基以及这2 个铜 离子分别结合的组氨酸构成的 7 1 ，它具有独特的双重催化功能，首先它能催化l 酪氨酸 羟基化形成l 多巴，再氧化l 多巴形成多巴醌，多巴醌经过一系列的酶促和非酶促反 2 第一章绪论 应后，形成由5 , 6 二羟吲哚和5 , 6 二羟吲哚2 羧酸单元构成的异聚体黑色烈酊。 一 ( 3 ) 葡萄糖氧化酶 葡萄糖氧化酶( g o d ) 是一个具有刚性结构的蛋白质，由两条相同的多肽组成的二聚 体分子构成，每条肽链中包含一个氧化还原中心黄素腺嘌呤二核苷酸( f a d h 2 ) p 】。g o d 分子中含有1 6 的碳水化合物，对碳水化合物水解酶有抵抗性，天冬氨酸、谷氨酸、谷 氨酰胺、丙氨酸和亮氨酸的含量较高【1 0 1 。随来源不同，其分子量一般在1 5 2 - 1 8 6k d a 之剐1 1 】。g o d 是生物电化学研究领域中的一种理想的蛋白质，能特异地催化d 葡萄糖 与氧气反应生成过氧化氢和d 葡萄糖酸的黄素蛋白酶【1 2 】，具有较高的催化活性和稳定 性【l3 1 ，可以用它来检测血糖的浓度。 2 2 蛋白质的电化学研究基础 蛋白质的电化学研究始于2 0 世纪7 0 年代，最早是由h i l l 和k u w a n a 在1 9 7 7 年分 别发现蛋白质具有电化学活性。h i l l 1 4 1 和k u w a n a 1 5 】分别观察到马心细胞色素c 在金电 极和掺锡氧化铟电极上有直接可逆的循环伏安响应。辣根过氧化物酶与电极间的直接电 化学响应也在1 9 7 9 年报道【1 6 】出来。这些开创性的工作使得具有生物兼容性的电极受到 了人们的广泛关注，同时为用电化学手段探索生物体系打开了大门，从此这一领域的研 究蓬勃发展起来。 蛋白质与电极之间的直接电子传递过程与生物体内的氧化还原系统模型非常接近， 因而，研究蛋白质与电极表面之间的电子传递过程为揭示生命活动中氧化还原过程的机 理奠定了基础，具有重要的理论和实践意义。然而，在体外模拟蛋白质的氧化还原过程， 实现蛋白质与电极之间的直接电子传递并不是一件容易的事情。首先，绝大多数的蛋白 质是没有电活性基团的，直接用电化学方法进行研究很困难。其次，即使有些蛋白质含 有电化学活性基团，但由于它们常常被深埋在多肽链内，使得蛋白质与电极表面之间的 距离较大，难以实现电子传递。第三，有些蛋白质分子中没有电子传递通道，它们与电 极间的直接电子转移更难实现。第四，由于自然状态的蛋白质结构复杂且具有各向异性， 它们的活性中心不一定正好位于蛋白质的几何中心。第五，蛋白质分子在电极表面可能 发生吸附变性，这会阻碍它们发生电化学反应。第六，蛋白质表面还表现出电荷分布的 不均匀性，这也不利于其电化学研究的进行。以上种种因素导致用电化学方法研究蛋白 质困难重重，迄今为止，蛋白质的电化学研究工作主要集中在两个方面：蛋白质的溶液 电化学和蛋白质的表面电化学。 3 湖北大学硕七学位论文 2 3 蛋白质的溶液电化学研究 蛋白质溶液电化学主要分为蛋白质溶液在裸电极上的电化学以及蛋白质溶液在修 饰电极上的电化学。蛋白质溶液在电极上的直接电化学的研究，有利于理解和认识蛋白 质在生命体内的电子转移机制和生理作用。但到目前为止，只有少数蛋白质可以用裸电 极研究，这是因为电子在蛋白质溶液和裸电极之间的传递阻碍很大，再加上蛋白质分子 在溶液里的扩散系数很小，以及其与电极表面电子的传递速率较慢造成的。为此，常常 需要在溶液中加入一些促进剂( 在所研究的电位范围内是无电活性的) 或媒介体( 在所研 究的电位范围内是有电活性的，且能促进蛋白质的电子传递) 或在电极表面修饰一层促 进剂或媒介体来加速电子的传递，从而实现蛋白质与电极之间的电化学反应。目前使用 较多的促进剂是能在金电极表面形成自组装膜的巯基化合物，它的主要功能有：防止蛋 白质因在裸电极表面强烈吸附而变性；避免杂质吸附于电极表面阻碍电子传递；调节电 极表面蛋白质的取向以及缩短蛋白质氧化还原活性中心与电极表面的距离。常见的媒介 体如二茂铁衍生物、有机导电盐、锇或钌的配合物、吩噻嗪类和吩嗪类有机染料等，它 们常常具有以下性质：防止蛋白质变性；其氧化还原电势与蛋白质的氧化还原电势比较 接近且在电极表面的电化学反应是可逆的。采用促进剂和媒介体来修饰电极表面用以蛋 白质电化学的研究，目前已取得了很大的进展。 2 4 蛋白质的表面电化学研究+ 一 蛋白质的溶液电化学对于蛋白质的电化学行为及其与小分子的相互作用研究等方 面发挥了非常重要的作用，但是对于溶液电化学方法来说，它也有一些明显的不足之处， 如溶液的背景信号较大且干扰比较严重，同时样品的消耗量太大。为了克服这些缺点， 蛋白质修饰电极的表面电化学方法迅速发展起来，它大大改善了测定方法的灵敏度及样 品的消耗量。要进行蛋白质表面电化学的研究，首要任务就是要将蛋白质分子有效地固 定到电极上，实现蛋白质电极之间的直接电子传递。 2 4 1 蛋白质膜修饰电极 蛋白质膜伏安法是由a r m s t r o n g 等创立的，它具有以下几个优尉1 7 】：蛋白质膜电极 的制备比较简单、能使用快速扫描伏安法研究电子传递的过程、以及通过电化学方法能 分析获得丰富的生物化学信息。由于蛋白质是直接吸附到电极上的，它能很好地克服蛋 白质扩散系数较小的限制【1 8 1 ，这对于蛋白质的电化学研究是一个十分重要的创新【1 9 1 。 蛋白质膜电极的制备方法是：将棱面裂解石墨电极( p e g ) 抛光，其表面会产生较多 4 第一章绪论 的亲水含氧基团，在低温、低离子强度和共吸附剂( 在蛋白质和电极之间有传递电子的 作用) 的条件下，通过静电吸附作用，p e g 表面会形成一层蛋白质膜，这样制备的电极 即为蛋白质膜电极。目前，蛋白质膜电极已成功地应用于各种蛋白质的研究，例如：e l l i o t t 1 2 0 等详细研究了牛心线粒体中琥珀盐氧化还原酶、大肠杆菌中二甲基亚峰还原酶和琥珀 盐氧化还原酶，g w y e r l 2 1 1 研究了细胞色素c 对亚硝酸盐的催化，a r m s t r o n g t 2 2 】对铁蛋白的 氧化还原性质及其电子传递过程进行了详尽的探讨。 但是，蛋白质膜电极在重现性和稳定性方面还有些欠缺，若能在这两方面进行一 定程度的提高，蛋白质膜电极无论在理论研究上还是在生物传感器的制备方面，都将会 有长远的发展。 2 4 2 蛋白质溶胶凝胶膜修饰电极 溶胶凝胶法是一种很好的固定蛋白质的方法，它可以最大程度地保持蛋白质或酶的 活性【2 3 】。将蛋白质包埋在溶胶凝胶膜