（应用化学专业论文）罗丹明染料的合成及作为离子探针的应用研究.pdf

大连理工大学博士学位论文 摘要 罗丹明类荧光染料是以氧杂蒽为母体的碱性咕吨染料，由于其特殊的结构及相应的 荧光特性，使之广泛应用于化学和生物分析领域。目前，通过修饰后的罗丹明荧光染料 对小分子及离子的荧光分析正朝着高选择性、高灵敏度、生物活体内检测的方向不断的 发展。本论文总结现有的研究成果，设计合成了一系列含有活性取代基团的、方便应用 于生物标记的罗丹明类荧光染料和高选择性识别金属离子的罗丹明类荧光分子探针。 利用对位含有不同取代基的苯甲醛为原料，设计合成了六个苯环对位取代基不同的 罗丹明荧光染料。通过改变合成方法，避免了异构体的产生，获得了单一产物。光谱性 能的测定结果发现醛代替酸酐合成的染料在质子和非质子性溶剂中的摩尔消光系数变 化不大，避免了传统罗丹明b 染料在非质子溶剂中形成内酯结构所导致的光谱性能变 化。光稳定性实验显示：合成得到的染料与传统染料一样有好的稳定性。 利用“关开”荧光分子开关原理，设计合成了三个o r 3 + 荧光分子探针。吸收和荧 光光谱的测试结果表明，探针r h o c r l 在t r i s - h c i 中性缓冲溶液中能高选择性的识别c p 并产生了荧光增强，通过对探针光谱性能的测试和t e p n 滴定实验表明，探针r h 0 c r l 与c p 的络合是一个可逆的过程。此外，用化学模拟的方法将k 2 c r 2 0 7 中的c p 还原成 c ，与探针结合后荧光增强，进一步说明了r h o c r l 对c p 的识别。活体细胞p c i 2 细 胞中r h 0 c r l 对铬离子识别的荧光成像结果表明，f 计1 0 c r l 能够进入细胞并能络合c ， 后出现荧光增强。 通过乙二胺柔性链将不同的醛与罗丹明b 共价相连，设计合成了五个金属阳离子荧 光探针，在水相和有机相中对金属离子选择性的紫外吸收、荧光光谱表明，含不同取代 基的醛不同，对f e 3 + 和c ，识别的选择性也有很大差别，其中，吡啶环和氨基对c p 离 子可能有较高的选择性，而噻酚环和羟基决定了配体对f e 3 + 的络合。 设计合成了以罗丹明6 g 为荧光母体的f e 3 + 荧光探针r h 6 g f e l 、r h 6 g f e 2 、r h 6 g f e 3 和r h 6 g f e 4 。其中r h 6 g f e l 在t r i s - h c i 中性缓冲溶液中能够高选择性地络合f e 3 + 并促 进了荧光增强。加入f e 3 + 后，r h 6 g f e l 的荧光强度增大7 0 倍。活细胞h e l e 细胞和p c l 2 细胞的荧光显微成像结果表明该探针能够穿透细胞并能识别细胞内的耐+ 。以噻酚醛、 吡啶醛和水扬醛为识别基团的荧光分子探针r h 6 g f e 2 、3 、4 ，在p h 手9 的范围内对氢 质子不敏感，p k a 分别为3 7 6 ，3 8 2 ，3 7 7 。通过对探针对f 护+ 的线性滴定和络合常数计算， 表明这三个荧光分子探能够检测微摩尔浓度范围内的f e 3 + 。 关键词：罗丹明染料；荧光分子探针；细胞显微成像；c ，；f e 3 + 罗丹明染料的合成及作为荧光探针的应用研究 s t u d yo nt h es y n t h e s i so fr h o d a m i n ed y e sa n dt h e i r a p p l i c a t i o n sa sf l u o r e s c e n tp r o b e a b s t r a c t a so n ek i n do ft h ex a n t h e n e s ，r h o d a m i n ed y e sa r ew i d e l yu s e di nt h ef i d d so fc h e r n i c a l a n db i o l o g i c a la n a l y s i sb e c a u s eo ft h e i ru n i q u ec h a r a c t e r s , t o d a y , t h ef l u o r e s c e n ta n a l y s i so f i o r sa n dm o l e c u l a rb a s e do nr e v i s e dr h o d a m i n ed y e si sd e v e l o p i n gt oh i g hs e i e c t i v i t y , h i g h s e n s i t i v i t ya n df l u o r e s c e n c ei r n a ：j i n gi nc e l i ab a s e do nt h e s ep u b l i s h e dr e s u l t s , as e r i e so f r h o d a r n i n ed y e sw i t ha c t i v eg r o u p su s i n gi nb i o l o g ya n df l u o r e s c e n ts e n s o r sw i t hh i g h s e l e c t i v i t yf o rm e t a li o n s w e r e d e s i g n e da n ds y n t h e s i z e d s i xr h o d a m i b ed y r e sw i t hd i f f e r e n ts u b s t i t u e n t si np h e n y io 湘t r m o s i t i o nw e r ed e s i g n e d a n ds y n t h e s i z e db a s e do nd i f f e r e n ts u b s l i t u e n tb e n z a l d e h y d e 为r a wm a t e r i a l st h r o u g h a l t e r i n gs y n t h e s i sm e t h o d ，t h ep r o d u c t s w e r es o le ，a v o i d i n gt h ep r o d u c t i o no fi s o m e r sm i x t u r e t h e s p e c t r a lr e s u l t s s h o w e d t h a t t h e c h a n g e s o fm o l a r 。( t i n c t i o n c o e f f i c i e n t s w e r e i n d e p e n d e d u p o np r o t o na n da p r o t ics o lv e n t s , w h ic ha v o id e df lu o r e s c e n tq u e n c h in gina p r o t ics o lv e n t m a d eb yi a c t o n i cf o r n lo ft r a d i t i o n a lr h o d a m i n ebd y 簏f i 涮i y t h ep h o t o s t a b i i i t i e so ft h e s e d y e sw e r ein v e s t i g a t e d c o m p a r e dw i t ht r a d i t i o n a lr h o d a m ib ed y e s ，t h e s ed y e sw e r ef o u n dt o h a v e t h e s a m e g o o dp h o t o s t a b i i t i e s a s t h a to ft r a d i t i o n a lr h o d a r n i b e d y e s b a s e do n “o f f - o n ，f iu o r e s c e n ts w i t c hp r in c ip le , t h r e ef iu o r e s c e n tp r o b e sh a v eb e e n d e s i g n e da n ds y n t h e s i z e d i r h o c r ls i l a v v e dc a ns e l e c t i v e l yr e c o g n i z ec r i nt r i s - h c in e u t r a l b u f f e r st h r o u g ht h ea b s o r p t i o na n de m i s s i o ns p e c t r u m t h ec o o r d i n a t i o no fr h o c x lw i t hc r w a sar e v e r s i b l ep r o c e s s t h r o u g hr h o c r lw i t hc ra n dt r e nt i t r a t i o ne x p e r i m e n t m o r e o v e r t h er e c o g n i t io no fr h o c r lf o rc ，w a sf u r t h e rp r o v e db ys im u la t iv ew a yw h ic hr e d u c e dc r ink 2 c r 2 0 7t oc ra n dc o o r d in a t e dw i t hr h o c r l t h ef lu o r e s c e n c eim a g e st h a tr h o c r l c o o r d i n a t e dw i t hc ，i np c l 2c e l l ss h o w e dr h c c r lt ob ec a p a b l eo fp a n e t r a t i n gi n t oi i v i n g c e l l sa n di m a g i n gi n t r a c e l i u i a rc r + c h a n g e s f i v ep r o b e sh a v eb e e nd e s i g n e da n ds y n t h e s i z e d ，w h e r ed i f f e r e n ta l d e h y d e sw e r e c o v a l e n t l y | n k e dt or h o d a r n i n ebd y e sw i t hd i e t h y l a m i n ef l e x i b l ec h a l n s t h es e l e c t i v i t yi n a q u e o u sa n do r g a n i cs o i u t i o nw a ss t u d i e dt h r o u g ht h e ru v v i sa b s o r p t i o na n de m i s s i o n s p e c t r at h er e s u l t si n d i c a t e dt h a ts e l e c t i v i t yf o rc r + o rf 分+ w e r ed i f f e r a n tw i t hs u b s t i t u e n t s i na l d e h y d e st h ep y r i d i b ea n da m i d ow o u l di i k et oi m p r o v ec o o r d i n a t i o na f f in t yf o rc r t h e t h i o p h e n ea n dh y d r o x y lw o u l dr e f e rt oc o o r d in a t i o nw i t hf 矿 f b u rf iu o r e s c e n tp r o b e sr 1 1 6 g f 创，r h 6 g f e 2 ，r h 6 g f e 8a n dr h 6 g f e 4b a s e do n r h o d a n ib ec o gw e r ed e s i g n e da n ds y n t h e s i z e d 1nt r i s - h c ln e u t r a lb u f f e r s , r h 6 g f e l d i s p l a y e da ne x c e l l e n ts e l e c t i v i t yf o rf 矿o v e rt h eo t h e rm e t a li o n sa n das t r o n gf l u o r e s c e n c e 大连理工大学博士学位论文 a p p e a r e d u p o na d d i t i o no fs a t u r a u n gf e 3 。t h e f l u o r e s c e n c ei n t e n s i t ye n h a n c , e dn e a r l y7 c h o i d - b yu s in gf lu o r e s c e n c em ic r o s c o p yo fh e lec e llsa n dp c l2c e lls , p r o b er h 6 g f 创w a ss h o w n t ob ec a p a b l eo fp e n e t r a t i n gi n t ol i v i n gc e l l sa n di m a g i n gi n t r a c e l i u l a rf e rd i s t d b u t i o n f l u o r e s c e n tp r o b e sp j l 6 g f e 2 ，r h 6 g f e 8a n dr h 6 g f e 4b yu s i n gt h i o p h e n e - 2 - c a r b o x a l d e h y d e , p y d i n e - 2 - c a r b o x a l d e h y d ea n d2 - h y d r o x y b e n z a l d e h y d e a sc h d a t e r sf o rm e t a li o i l sw e r e p h - i n d e p e n d e n ti nt h er a n g eo fp h 5 - 9 t h e i rp k av a l u ew e r e3 7 6 ，3 8 2 ，3 7 7r e s p e c t i v e l y t h r o u g hl i n 日t i t r a t i o na n dk ad c u l a t i o n ，t h e s ep r o b e sc o u l dd e t e c tf o rf e j + a tt h el 创do f m i c r o m o l e k e yw o r d s ：r h o d a m i n ed y e s ；f l u o r e s c e n tp r o b e s ；f l u o r e s c e n c em i c r o s c o p y ；c r 3 + ；f ， 独创性说明 作者郑重声明：本博士学位论文是我个人在导师指导下进行的研究工 作及取得研究成果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外， 论文中不包含其他人已经发表或撰写的研究成果，也不包含为获得大连理 工大学或者其他单位的学位或证书所使用过的材料。与我一同工作的同志 对本研究所做的贡献均已在论文中做了明确的说明并表示了谢意。 作者签名： 大连理工大学硕士研究生学位论文 大连理工大学学位论文版权使用授权书 本学位论文作者及指导教师完全了解“大连理工大学硕士、博士学位论文版权使用 规定”，同意大连理工大学保留并向国家有关部门或机构送交学位论文的复印件和电子 版，允许论文被查阅和借阅。本人授权大连理工大学可以将本学位论文的全部或部分内 容编入有关数据库进行检索，也可采用影印、缩印或扫描等复制手段保存和汇编学位论 文。 作者签名：丞五日迭 导师签名：彳黝 f i 大连理工大学博士学位论文 1 文献综述 罗丹明类化合物是以氧杂葸为母体的碱性咕吨染料。由于其特殊的结构及相应的荧 光特性，使罗丹明类荧光染料成为化学和生物分析领域中较为广泛的研究课题【。传 统的罗丹明系列染料，如罗丹明b 、罗丹明3 b 、罗丹明6 g 等，被广泛用作碱性染料。 有关罗丹明类荧光染料的合成、离子化及结构、光学特性及分析等方面的报道已有很多 5 - 1 1 】。与其它常用的荧光染料相比，罗丹明类荧光染料具有光稳定性好、对p h 不敏感、 其吸收光谱在可见光区，发射光谱靠近红光区( 5 0 0 - - - 6 8 0n m ) 以及较高的荧光量子收率等 优点，因此被广泛应用在药理学、生理学、分子生物学【4 】、细胞生物学、分子遗传学、 环境化学、单个分子检测、信息科学、荧光标记与识别、激光染料等方面。用它1 f i n 成 的生物荧光探针可用于测定生物细胞中的离子、电荷、新陈代谢等性能，如罗丹明1 2 3 、 罗丹明6 g 可用于标记活体细胞的线粒体，罗丹明1 1 0 可用于制作蛋白酶诊断试剂。罗 丹明染料是分析化学和生物医药科学等生物技术领域中最常用的荧光染料【1 2 - 2 1 1 。 荧光分析技术和荧光检测技术是现代分析化学中的一类重要的方法。荧光分析技术 是利用带有识别基团的荧光化合物分子作为检测试剂，在与靶标物结合的前后荧光的强 度或者波长的变化来判定靶标的种类和浓度等等相关参数。近年来，随着激光、计算机 处理及荧光光谱测定等科学技术的飞速发展，极大的的推动了荧光分析法的应用。荧光 分子探针正是建立在分子识别和荧光技术两者有机结合的基础上，通过特定的受体结合 目标，实现分子的识别并得到分子信息，通过相应的荧光信号传递机制将这种分子结合 信息转换为容易检测到的荧光信号，从而实现在分子水平上的原位和实时的检测。对这 些分子水平的微观过程的观测与研究对人类认识整个世界有极其重要的意义。经过特殊 设计的荧光分子探针具有高灵敏度，高特异选择性，实时单分子检测，安全方便等特点， 可将微环境的变化信息转变为光信号，为人类搭起宏观世界与微观世界的桥梁。由此可 见，荧光分析技术在生物科学和超分子化学领域有着不可替代的重要作用，这种分析手 段的关键组成部分之一就是检测信息的传递者一荧光染料。荧光染料的特性将直接影响 到检测结果的准确性、灵敏性，因而开发适用于荧光标识的优秀荧光染料将对生物技术 的发展起到巨大的推动作用【1 - 3 钮。 目前，许多种类的荧光染料被应用于荧光分析检测领域中，然而不同的荧光染料应 用在分析过程中却表现出较大的差异，这说明并不是所有的荧光染料都适合设计成相应 的荧光探针。那么适合荧光检测领域特别是生物检测应用的荧光染料应该具有这样几个 特点：较高的荧光量子收率，最好大于0 5 ；应该有较长的最大吸收和发射波长，最好 不小于5 0 0n m ；具有较高的光稳定性以及具有较好的细胞穿透能力和细胞内的溶解能 罗丹明染料的合成及作为荧光探针的应用研究 力；染料基团对生物体应该没有或者仅有极小的毒害。而罗丹明类荧光染料正是因为具 有以上诸多的优点从而成为了生物技术和超分子领域中最广泛使用的荧光染料。 本章就荧光分子探针技术、有机荧光染料的性质和特点、罗丹明类荧光染料的性质、 合成以及作为荧光分子探针应用的研究进展展开论述。 1 1 荧光分子探针技术 随着科学的不断发展，荧光分子在信息传递过程中，由于受到不同的环境刺激如异 构体互变、离子配位、氧化还原、光电控制的电子能量转移、质子化、弱键的形成与断 裂等而发生荧光变化，可以实现荧光的开、关转换，更适合于生物微观结构的识别和标 记，因而近年来荧光分子作为探针在生命科学、环境科学、材料科学、信息科学等领域 得到了广泛的应用。 1 1 1 荧光的产生 荧光产生过程如图1 1 所示【4 - 2 2 - 2 4 。通常情况下，荧光试剂分子处于基态，吸收光 后，试剂分子的电子被激发而处于激发态，基态和激发态都有单重态和三重态两种类型， 多重态用2 s + 1 表示。s 为电子自旋量子数的代数和，其数值为0 或1 。s 为0 时，分子 内轨道中的所有电子自旋配对，自旋方向相反，此时分子处于单线态，大多数有机物分 子的基态是处于单线态。分子吸收光能后，电子跃迁到高能级，电子自旋方向不变，此 时分子处于激发单重态。s d ，& ，s 2 ，表示分子的基态和第一，第二，激发单重态， 能量由低到高。如果处于基态单重态的有机物分子的电子在跃迁过程中伴随有电子自旋 方向的变化，在激发态分子轨道中就有两个自旋不配对的电子，此时s = 1 ，表明分子 处于激发态的三重态，用t 表示，t 1 。t 2 分别表示三重态的第一第二激发态。分子中的 电子从基态岛跃迁到激发态& ，& 比较容易发生，进行很快( 约1 0 4 s ) ，而从基态单重 态到激发态三重态不易发生。高能量的单重态激发态分子( 如& ) 可以与其他同类分子 或溶剂分子碰撞通过内转换( 无辐射跃迁) 回到激发态的最低能级& ，这一过程为1o 1 2 s ， 处于激发态最低能级的分子寿命一般为10 4 1 0 - 8 s ，它们会放出光子返回基态，这时产 生的光就是荧光。即最低激发态( & ) 分子回到基态( s 0 ) 会产生荧光。从s 到t 1 能 量转化是系间跨越。从t 1 回到s 0 有两种过程，一个是系间跨越，无能量释放；另一个 是放出光子，即磷光，在1 c r 4 一l o s 间完成。 大连理工大学博士学位论文 e 胄皂量，f 荧光，p 磷光，i s c 体系间跨越，i c - 内转换 图1 1 分子荧光的产生过程 f i g1 1t h ep r o c e s s o ft h e f l u o r e s c e n t 1 1 2 荧光分子探针识别原理 荧光分子经过特殊设计引入到待测体系中，能够将分子识别的信息转换成荧光信号 传递给外界，从而使人与分子间的对话成为可能，架起宏观世界和微观世界联系的桥梁， 具有这种功能的分子称之为荧光探针分子 4 , 9 , 2 4 , 2 5 。 一隧刚l 两弱碉 j = q = - a e e 醚嘲| 确妇精蛳糟妒蜘精岫 矿、 念念 _ “麓器篡岂匕。嘲甜聊哟群 纠均b 啪嘲艟州辩。的蝴一一一一w 棚w i o a t m m h w 捌嘲f 嘲托l 嗡 d - h 斟i 蝴r 奄啪 l 卿e e m ”a l i 。n 器慧篇。测善东盟 辫拥棚雄嘲柏脯竹靠鼬 图1 2 识别阳离子的分子探针的主要组成 f i g1 2m a i na s p e c t so ff l u o r e s c e n tm o l e c u l a rs e n s o rf o rc a t i o nr e c o g n i t i o n 刍 罗丹明染料的合成及作为荧光探针的应用研究 荧光探针一般由一个荧光团连接一个离子载体组成，因此被叫做离子荧光探针。以 识别阳离子的探针为例如图1 2 ，在设计这样一种探针时，识别部分和信号部位都应加 以关注。信号部位起着信号发送器的作用。例如，它将信息( 识别事件) 转换成一个光 学信号以发色体的光物理特性的改变表现出来。作为识别部分，它要求有离子络合的选 择性和高效性。这种络合取决于配体的空间拓扑结构，阳离子本身的性质( 离子的半径、 电荷、同位键数目、键能等等) 和溶剂的性质( p h 值，在水溶液中的离子强度) 。这 些方面与超分子化学领域有关。需要注意的是信号部分能直接或经过一个空间间隔与离 子部分连接在一起。甚至在近来的研究中，荧光基团的许多原子可能参与耦合。因此， 对离子络合的选择性往往是由整个结构引起的，包括信号部分与识别部分。以下是几种 常见的离子探针机理： 1 1 2 1 光诱导电子转移p e t ( p h o t o i n d u c e de l e c t r o nt r a n s f e r ) 2 5 i 通常典型的离子荧光探针由两部分组成，用来识别和绑定客体的受体部分( r e c e p t o r ) 和发射信号的荧光团部分( f l u o r o p h o r e ) ，中间通过间隔基 ( s p a c e r ) 有效地将它们连在 一起。其作用原理如图1 3 所示，当荧光团受光激发后，受体最高占有轨道( h o m o ) 电 子便向荧光团的h o m o 转移，使得荧光团的激发态电子不能回到原来的基态，从而阻 止了荧光团的荧光发射，导致荧光淬灭。相反，当受体结合客体后，氧化电位升高，受 体的h o m o 能级低于荧光团的h o m o 能级，上述p e t 过程在热力学上变为不可能， 因此荧光得到了恢复，这样就实现了荧光的“关一开”过程。另一种情况则是当受体未 结合客体时，并没有发生p e t ，荧光保持不变，但当受体结合客体后，探针受光激发导 致了荧光团到受体部分的电子转移，荧光被淬灭，这样的过程又称为“开一关”的过程。 0 ：壶斗一u 娃翻- o 啪 毙巍曩豢缝套冀髂冀免翻箍奢蹙体 图1 3p e t 原理 f i g1 3p r i n d p l e o f 尸l 三t 一4 一 大连理工大学博士学位论文 设计这类荧光探针时要同时考虑信号发射部分与信号识别部分。一般来说发色团为 芳香共轭类化合物，受体为含有孤对电子的杂原子或者是另外一个芳香共轭体系，他们 之间由脂肪链连接。d e s i l v a 研究小组利用多种荧光团，设计了大量的该类p e t 探针。 近年来彭孝军组设计的以b o d d ii ：v 为荧光母体的离子探针，如化合物1 和化合物2 ， 在生物细胞内也得到了很好的应用( 图1 4 ) 【毓2 7 1 ，其中化合物1 是属于i c t 探针。 12 图1 4 基于b o d d i p y 染料的p e t 荧光探针 f i g1 4p e t f lu o r e s c e n tp r o b e sb a s e do i 3b o d d ip yd y e s 1 1 2 2 分子内电荷转移i c t ( i n t r a m o l e c x j l a rc h a r g e t r a n s f e r ) 2 5 典型的i c t 荧光分子探针是荧光团上分别连接有强的推电子基和吸电子基，是一个 强的推一拉电子体系，即通常所说的d - a 型分子，共扼体系的供电子部分或者是拉电子 部分是受体的一部分，当分子被光激发后会产生从电子给体向电子受体的电荷转移 ( i c to 在受体与客体结合后，作为受体的供电子部分或拉电子部分的供拉电子能力发 生了改变，整个发色体系的兀电子结构重新分布，形成前后不同的基态，从而导致了吸 收光谱、激发光谱的荧光光谱变化，如发生蓝移或是红移。一般情况下，i c t 荧光探针 对荧光强度的影响不像p e t 荧光探针那样显著。化合物3 ，4 ，5 ，6 都是典型的i c t 荧 光探针( 图1 5 ) 2 8 - 3 0 。但化合物3 与钙离子结合后荧光波长蓝移了9 5n m ；而化合物4 的荧光强度则发生了显著变化，与l + 络合荧光增强9 0 倍，与m g + 络合增加2 2 5 0 倍， 而化合物5 以二甲氨基为推电子基，当受体与碱土金属c a + 结合后，拉电子能力增强， 故荧光发生红移。化合物6 为鳌合型的i c t 荧光分子探针，可以选择性地与m 9 2 + 络合。 罗丹明染料的合成及作为荧光探针的应用研究 3456 图1 5 i c t 荧光探针 f i g1 5i c t f l u o r e s c e n tp r o b e s 1 1 2 3 单体- 激基缔合物( m o n o m e r - e x dm e r ) 激基缔合物是激发态的荧光母体和基态的荧光母体相互作用形成的缔合物【3 1 躅。即 两个以上相同的荧光团( 主要是多环芳烃) 彼此之间的位置合适，当其中一个发色团被激 发以后就会和另外一个处于基态的发色团形成激基缔合物，其荧光发射光谱的特征表现 是原有的单体的发射峰减弱或者消失，待之而起的是一个新的、强而宽的、长波长的无 结构发射峰。在很多情况下，存在激基缔合物的体系，既能观测到单体的荧光也能观测 到激基缔合物的荧光。易形成激基缔合物的分子一般是芘或蒽之类的具有兀电子平面共 轭的荧光团，同样激基缔合物的发生也需要很近的距离。形成这两种激基复合物的主要 条件是需要激发态分子和基态分子达到碰撞距离( 约3 5a ) ，因此可以通过改变两个发色 团之间的距离来调控荧光的“开”和“关”。这类荧光开关已经广泛的被用于生物体系 来研究核酸、磷脂以及小肽等在生理条件下的构型和活性变化。 在化合物7 中，金属离子与的醚链配位形成类冠醚状，改变了两个芘荧光团的位置， 导致单体和激基复合物荧光发生改变冈。与c e + 和c d 2 + 作用时两个芘被拉远，导致激 基复合物荧光下降，单体荧光增加。而与c l j z + 作用时两个芘被拉近，单体荧光下降，而 激基复合物荧光增强度增大，同时单体和激基缔合物的荧光强度比发生变化。化合物8 【列 是通过酞胺连接了四个萘分子，在乙睛中以质子化的形式存在并表现出激基缔合物荧光 光谱。当络合c d 2 + 或f 3 b 2 + 后。荧光强度降低。而化合物9 【3 5 1 则是第一个利用调控静态及 动态缔合物荧光原理设计的氟离子荧光探针。在乙腈溶液里，9 既可以发出3 8 5n m 的单 体荧光也能发出4 8 2n m 的激基缔合物荧光，但随着氟离子的加入4 8 2n m 的激基缔合 物荧光会蓝移到4 7 0n m ( 图1 6 ) 。 一6 一 替 大连理工大学博士学位论文 骨 埔th h 图1 6 基于激基缔合物原理的探针 f i g1 6 t h e l 斗o b e s b a s e d0 1 3m o n o m e r - e x c i m e rm e c h a n i s m 1 1 2 4 荧光共振能量转移( f l u o r e s c e n c er e s o 嗍e n e r g yt r a n s f e r ，f r e t ) 荧光共振能量转移是指能量给体荧光团( d o n o r ) 的发射光谱和另一个能量受体荧光 团( a c c e p t s ) 的吸收光谱有一定的重叠，当两个荧光团间的距离合适时( 一般小于i o o a ) ， 就可以可以发生从d 到a 的非辐射能量转移，又称为长距离能量转移。当受体荧光量 子收率为零时，则发生能量转移导致荧光淬灭；如果受体也是一种荧光发射体，则呈现 出受体的荧光。实际上d - a 发生能量转移的条件是很苛刻的，两者除了光谱重叠外，还 必须振动能级间的能量差相互适应，距离足够近。在识别过程中如果能改变供体和受体 之间的距离，那么两个波长的荧光强度就会发生变化，从而可以用它们的比值来表达识 别事件。 f r e t 类型荧光分子探针近年来广泛的应用在生物大分子的动态分析中。生物大分 子不仅结构复杂，而且多变。如图1 7 所示，化合物1 0 是一个检测磷酸二酯酶活性的荧 光探针，其能量供体和受体分别是香豆素和荧光素类荧光染料。化合物本身发生能量共 振转移，主要发射荧光素的荧光。当磷酸二酯被磷酸二酯酶水解后，香豆素和荧光素分 离，f r e t 停止，以发射香豆素的荧光为主【3 6 l 。而化合物1 1 是利用多肽将罗丹明b 和 氨基香豆素相连接。当加入n 2 + 后，n 2 + 与氨基酸残基结合，两个荧光团间的距离减小， f r e t 显著。当用激发波长为4 0 9n m 的光激发氨基香豆素时，随着n i 2 + 浓度的增加，在 5 8 3n m 处罗丹明b 的发射光谱开始逐渐增强闭。 罗丹明染料的合成及作为荧光探针的应用研究 1 0 图1 7 f r e t 荧光探针 f i g1 7f r e tf lu o r e s c e n tp r o b e 1 1 2 5 基于其它原理设计的荧光分子探针 大多数阳离子荧光分子探针是基于上述原理设计的，但有少量探针是按照其它原理 设计的，也许有些是意外所得，但常常有出奇制胜的效果。化合物1 2 3 8 在弱酸的缓冲 溶液中，加入c u 2 + 后，绿色荧光淬灭，溶液颜色从橙色变为黄色，该识别过程被称为光 学双通道识别( 图1 8 ) 。近年来也发现化合物1 3 在水溶液中，加入h 9 2 + 后，荧光淬灭， 溶液颜色从浅琥珀色变为红色闭。这些双通道识别具有很好的选择性，另外，也为这些 离子的检测提供了方便、直观的方法。 1 21 3 图1 8 双通道荧光探针 f i g1 8t w o - c h a n n e lf l u o r e s c e n tm o l e c u l a rp r o b e s 通常与探针结合的过渡金属离子的不同价态对荧光团的荧光影响不同，可以通过结 合的金属离子的氧化还原实现荧光分子的开关。在配合物1 4 中，三价镍离子通过激发 态丹磺酞胺荧光团向金属离子的电子转移将荧光淬灭；相应的一价配合物1 5 则不与荧 光团间发生电子转移，荧光处于“开”的状态( 图1 9 ) 【4 0 1 。铜等金属离子也广泛存在 这种现象。 一8 一 大连理工大学博士学位论文 + f ，r 1 4 1 5 图1 9 基于过渡金属氧化一还原的荧光探针 f i g1 9a t r a n s i t i o nm e t a lr e d o xb a s e df lu o r e s c e n tp r o b e 尽管前面已经叙述了很多阳离子荧光分子探针识别的作用原理和典型的探针分子， 还是有许多基于其它设计原理的探针分子具有良好的识别效果不能一一列举。例如光致 异构荧光识别、分子自组装界面膜及两亲分子溶液中自聚集荧光识别等，这些分子的设 计同样精彩，令人叹为观止【4 1 1 。 1 1 3 常见的识别基团 识别基团( 即受体) 是为实现对识别目标的选择性结合而设计合成的结构单元，它决 定了荧光分子探针和被识别客体结合的灵敏度和选择性。影响受体识别各种客体的因素 主要有：受体空穴的大小、空穴的形状、配位数、配体种类等【4 2 - 删。其中受体空穴的大小 与可能的客体之间的关系是选择性分子识别的首要标准。此外，影响选择性识别的另一 个因素是受体中所包含的配位点的数目和客体的配位数。最后一个因素是配体的种类， 其中包括配体的酸碱性。对强酸性的客体而言，具有强碱性的受体比具有弱碱性的受体 具有更强的选择性，反之亦然。另外还有配体的立体结构，所带基团等对受体选择性识 别都有影响。受体客体之间的相互作用力主要包括疏水性相互作用、静电效应、氢键 结合、配位结合，以及电荷转移、立体结构和光学活性等因素。依据受体化学的分子识 别理论，去研究发现更多的高选择性的或特异性的识别基团对于催化、环境科学以及生 命科学等领域的发展具有极其重要的意义。 在荧光分子探针中经常被应用到的识别基团有冠醚、开链聚醚、多乙烯多胺、多羧 甲基胺、环糊精、杯芳烃、多肽等等。 1 1 3 1 环糊精、冠醚与杯芳魁好4 9 i 环糊精是由淀粉经酶促水解而生成的一类低聚砒喃糖环状分子，自然界存在的环糊 精是最早被研究的受体之一，环糊精的分子结构独特，而且易于衍生，所以可以被用来 设计目的不同的具有特殊结构和高度选择性的主体分子。常见的环糊精受体主要有三种 类型：( 1 ) 简单受体；( 2 ) l a r i a t 型受体：环糊精衍生的一个支架没有客体时被包裹在 罗丹明染料的合成及作为荧光探针的应用研究 其空腔内部，当分子结合受体后，这个支架就被挤出空腔( 图1 1 0 ) ；( 3 ) 多聚体型( 两 个以上环糊精连起来形成更大的空间选择性更强的受体) 图1 1 0 简单型和l a r i a t 型环糊精受体 f i g 1 1 0s i m p l e a n dl a r i e t - t y p e0 fc y d o d e x t r i n s 冠醚由于其具有对介质的两亲性、选择性与阳离子( 中性分子、阴离子) 配位等优点， 因而是分子识别中一类最主要的受体，其配位作用主要是通过偶极一离子( 金属离子) 或 者氢键( 馁离子、有机中性分子) 等作用而形成具有一定稳定性的配合物。含有杂原子的 氮杂冠醚，由于其氮原子的可衍生性以及其对过渡金属和重金属离子的特异的络合能力 而备受瞩目。以氮杂冠醚为受体的荧光分子探针一直是分子识别领域的一个研究热点， 并且己经开发出一些成熟的识别分子应用于生物化工和医学等领域。图1 1 1 为可以选择 性结合a m p 和a d p ，以观测a t p 的水解过程而设计的六氮杂冠醚。 图1 1 1 两种氮杂冠醚类受体 f i g1 11t w o a z ac r o w n - e t h e rr e c e p t o r s 环状芳烃代表了分子识别中所用受体的主要部分，各种底物可以通过己知的分子间 相互作用和首尾相接的环状芳烃相结合。主要包括：基于丫啶的受体、基于环状双对一 苯基的受体、生物模拟受体和小肽受体( 图1 1 2 ) 。 ，羹，渤 | | 、歌 毒| = 呻厂鼯l 粤嚣 吖叶 大连理工大学博士学位论文 图1 1 2 四种环芳烃类受体 开g1 1 2f o u rc y d o p h a n er e c e p t o r s 1 1 3 2 小分子含氮杂环或类杂环【静固 小分子含氮杂环作为受体是近年来研究的一个重点，最早的应用是在催化领域。常 见的用以作为受体的杂环主要有嚼唑、噻唑、曙唑啉、吡啶、吡咯以及在识别过程中 产生的具有部分环状性质的类杂环等。单个杂环由于其氮上的富电子性，一般都是很好 的质子受体，多个杂环通过共同的连接臂连在一起可以提供多个质子受体从而起到复杂 的识别效果。小分子杂环作为受体的优势在于设计方便、合成简单，合成的受体选择性 往往很高，但是最大问题可能是设计的目的性和可预见性不强，往往不是有的放矢。 小分子含氮杂环主要有五元环、六元环以及一些识别过程中具有部分环状性质的类 杂环等。常见的五元杂环中最主要的是噻唑啉类和咪唑啉类化合物，而六元杂环类最常 见的受体是吡啶类化合物。图1 1 3 为三种识别阴离子的小分子含氮杂环类受体。 鬻蓬颡一文三森 图1 1 3 三种小分子含氮杂环类受体 f i g1 1 3t h r e e m _ a c y d os m a l lm o l e c u l a rr e c e p t o r s 1 1 3 3 其它识别基团【姆5 6 l 除了上述比较常见的几类重要识别基团外，还有很多其它类型的识别基团被用于荧 光分子探针中，如分子容器、自组合的受体、硼酸受体等等。 罗丹明染料的合成及作为荧光探针的应用研究 ab c 图1 1 4 其他识别基团：a 分子容器类受体；b 硼酸类受体；c 一种自组装的受体 f i g1 1 4o t h e rr e c e p o r ea t h em o l e c u l a rc o n t a i n e rr e c e p t o r ；b t h e b o r o n i ca c i dr e c e p t o r ；c a s e l f - a s s r n b lin gr e c e p t o r 作为超分子化学的重要组成部分，荧光分子探针受到科学家们的广泛关注。受体在 荧光分子探针中具有重要的作用，它决定分子探针与被识别客体的结合灵敏性( 强度) 和 选择性。这种结合性能是荧光分子探针对被识别客体具有选择性和灵敏性的前提。但是， 只有分子的结合事件能有效地驱动荧光信号变化时，荧光分子探针才完成了它的任务。 1 2 有机荧光染料的性质及特点 近十几年来，有机荧光染料已广泛应用于荧光颜料与涂料、塑料与人造纤维的荧光 染料、光学增白剂、有机闪烁器、火箭和轮船及大型设备的探伤、化学及电化学发光体 中的有机荧光源、荧光化学分析、生物及医学的荧光示踪以及军事等方面的荧光源等领 域。 1 2 1 有机荧光染料的分类 有机荧光染料从结构上分有荧烷衍生物类( 包括罗丹明类) 、1 ，& 萘酰亚胺类、香豆素 类、三芳甲烷类、偶氮类、葸醌类、二苯乙烯类、萘二甲酸衍生物、苯并葸酮衍生物等， 大连理工大学博士学位论文 其部分结构如图1 1 5 。根据产生荧光的物质所必须具备的基本条件如荧光团、共扼7 c 电 子体系及刚性平面结构等，可将有机荧光染料分为如下九类：一、芳香烃及其取代物， 二、芳基乙烯和芳基乙炔化合物，三、带有环外c n 基团的化合物，四、五元和六元杂 环化合物，五、羰基化合物，六、萘二甲酸衍生物，七、苯并葸酮衍生物，八、葸醌衍 生物，九、罗丹明及其衍生物。 1 2 2 结构与荧光的关系 啭茸 图1 1 5 四种典型荧光化合物 1 2 2 1 分子共轭体系大小对荧光的影响 大量事实表明，有机荧光染料分子都含有发射荧光的基团，即荧光团。荧光团必须 含有共轭大，r 键，共轭大7 c 键达到一定程度才会发射出荧光，如( 一c h = c h ) n ( n 2 ) ，苯、 萘、对苯二醌、苯并杂环等，当然也与分子结构的其他因素有关。芳环类碳氢化合物与 直链的烯烃化合物相比，激发能向振动能的转换更难，因而荧光强度大。共轭体系越大， 7 c 电子越容易激发，荧光越易产生，荧光发射峰越向长波移动，