（生物物理学专业论文）人versican+v1全长基因的克隆、表达.pdf

摘要 摘要 细胞外基质是动物组织细胞外为细胞提供一个细胞外网架，在组织中或组 织之间起支持作用的部分。此外，它还具有其它很多重要的功能。细胞外基质 的主要成分有蛋白聚糖，糖蛋白，胶原等。v e r s i c a n 是一种属于l e c t i c a n 家 族的大型硫酸软骨素蛋白聚糖。通过选择性拼接，v e r s i c a n 存在至少四种单体 v 0 ，v l ，v 2 ，v 3 。结构上而言，v e r s i c a n 包括两个球蛋白结构域和一个硫酸软 骨素结合序列，即n 端的g 1 区和c 端的g 3 区及c s 序列。c s 序列可以分为两 种选择性拼接结构域，即c s 碲c s p 。v o 包含c s q 和c s p , v l 仅包含c s p 而v 2 包含c s a ；v 3 则没有c s 区。v e r s i c a n 分布非常广泛，它与发育及组织损伤都 有关系。现有研究显示v e r s i c a n 可以影响细胞黏附、迁移、增殖和分化等。 本研究中，首先克隆了人v e r s i c a nv l 基因及它的两个突变体。一个是缺 失c s l 3 区域的m u t e - v 3 ；另一个是缺失g 3 区域的m u t e - g 3 。构建的真核表达载 体p c d n a 3 1 - v l 瞬时转染到2 9 3 t 细胞中以证明它们可以在胞内进行有效地转 录。它为进一步研究人类v e r s i c a nv 1 基因的功能及其作用机制奠定了基础。 接着，为了研究v e r s i c a n 在细胞内的功能，本研究利用有效的r n a 干扰系 统1 s u p e r 系统来构建小干扰r n a 系统。已构建了五种不同的s i r n a ，其中 p s u p e r - 8 4 1 和p s u p e r - 2 1 0 1 干扰v e r s i c a n 的g l 区；p s u p e r 一3 9 0 1 干扰c s a 区； p s u p e r - 5 9 4 1 干扰c s p 区；p s u p e r - 1 0 3 8 1 干扰g 3 区。这为研究v e r s i c a n 不同 结构域和不同单体的功能提供了一个有效的工具。 最后，我们相继利用r t - p c r 的方法检测了在不同细胞中v e r s i c a n 各单体 的表达情况，包括2 9 3 t 细胞、n i h 3 t 3 细胞、h p f - i 细胞及间充质干细胞并发现 v e r s i c a n 在这些细胞中的表达各不相同，且在同一细胞的不同生长时期它的表 达量及单体类型也会发生变化。 关键词v e r s i c a n ；细胞外基质；小干扰r n a a b s t r a c t a b s t r a c t t h ee x t r a c e ll u l a rm a t r i x ( e c m ) ist h ee x t r a c e l l u l a rp a r to fa n i m a l t i s s u et h a tu s u a l l yp r o v i d e ss t r u c t u r a ls u p p o r tt ot h ec e l l si na d d i t i o n t op e r f o r m i n gv a r i o u so t h e ri m p o r t a n tf u n c t i o n s t h em a j o rc o m p o n e n t s o ft h ee e ma r ep r o t e 0 9 1 y c a n s ，9 1 y c o p r o t e i n s ，a n dc o l l a g e n s v e r s i c a ni s al a r g ec h o n d r o i t i n s u l f a t ep r o t e o g l y c a nb e l o n g i n gt ot h el e c t i c a n f a m i l y a l t e r n a t i v es p l i c i n go fv e r s i c a ng e n e r a t e s a tl e a s tf o u r i s o f o r m sn a m e dv o ，v l ，v 2a n dv 3 s t r u c t u r a l l y ，v e r s i c a np o s s e s s e st w o g l o b u l a rd o m a i n s ，n - t e r m i n a lg 1d o m a i na n dc - t e r m i n a lg 3d o m a i n ，a sw e l l a sac h o n d r o i t i ns u l f a t e ( c s ) a t t a c h m e n ts e q u e n c e t h ec ss e q u e n c ei s d i v i d e di n t ot w oa l t e r n a t i v e l ys p li c e dd o m a i n s ，t e r m e dc s aa n dc s p v o c o n t a i n sb o t hc s aa n d c s p ：v 1a n d v 2p o s s e s so n l yc s pa n dc s ar e s p e c ti v e l y ； v 3c o n t a i n sn e i t h e rc s an o rc s l 3 v e r s i c a ni sd i s t r i b u t e di naw i d e v a r i e t yo ft i s s u e sd u r i n gd e v e l o p m e n ta n di sa l s oa s s o c i a t e dw i t ht i s s u e i n j u r y n u m e r o u se v i d e n c e ss h o w e dt h a tv e r s i c a nc a np l a yar o l ei nc e l l a d h e s i o n ，m i g r a t i o n ，p r 0 1 i f e r a t i o n ， a n dd i f f e r e n t i a t i o n i nt h i ss t u d y ，w ec l o n e df u l ll e n g t hh u m a nv e r s i c a nv lg e n ei n t o p c d n a 3 1 ( + ) a n dm a d et w od e l e t i o nm u t a n t so fv e r s i c a nv 1t of a c i l i t a t e a n dd e e p e no u rs t u d i e s o n eo ft h e s em u t a n t si sm u t e v 3 ，w h i c hi s g e n e r a t e db yd e l e t i n gc s pd o m a i n a n o t h e rm u t a n ti sm u t e g 3g e n e r a t e d b yd e l e t i n gg 3d o m a i n e f f i c i e n tt r a n s c r i p t i o no ft h i sv lc o n s t r u c tw a s e x a m i n e di n2 9 3 tc e l l sb yr t p r ct h r o u g ht r a n s i e n tt r a n s f e c t i o n t oe n l a r g eo u rs t u d i e so nb i o l o g i c a la c t i v i t i e so fv e r s i c a n ，p s u p e r r n a is y s t e mw a sa d o p t e dt om a d e f i v es i r n a sc o n s t r u c t st a r g e t i n go n d i f f e r e n tr e g i o n so fv e r s i c a n p s u p e r 一8 4 1a n dp s u p e r - 2 1 0 1t a r g e to ng 1 d o m a i no fv e r s i c a n ；p s u p e r - 3 9 0 1 t a r g e t so nc s ad o m a i n ；p s u p e r - 5 9 4 1 t a r g e t so nt h ec s l 3d o m a i n ：p s u p e r 一1 0 3 8 1t a r g e t so ng 3d o m a i no fv e r s i c a n w ee v e n t u a ll ye n g a g e dr t p c rt oe x a m i n et h ee x p r e s s i o no fv e r s i c a n i i i 北京工业大学理学硕士学位论文 a n di t si s o f o r m si nd i f f e r e n tc e l l s ，i n c l u d i n g2 9 3 t ，n i h 3 t 3 ，h p f 一1a n d m e s e n c h y m a l s t e mc e l l w ef o u n dt h a tv e r s i c a n sd is t r i b u t i o n si nt h e s e c e l l sa r eo b v i o u s l yd i f f e r e n t m o r e o v e r ，t h ee x p r e s s i o no fv e r s i c a n i s o f o r m sa n dt h e i re p r e s s i o nl e v e l sv a r yi nd i f f e r e n tp a s s a g e s k e y w o r d sv e r s i c a n ：e c m ；s i r n a ： i v 英文缩写词 缩写词 b m s c s b p c d n a c s d m e m m 、j t p e c m + g a g k b k d l b m r n a o d p a g e 英文缩写词 英文 b o n em a r r o wm e s e n c h y m a ls t e mc e l l s b a s e p a i r c o m p l e m e n t a r yd n a c h o n d r o i t i ns u l f a t e 。 d u l b e c c o sm o d i f i e de a g l em e d i u m e o x y n u c l e o s i d et r i p h o s p h a t e e x t r o c e l l u l a rm a t r i x g l y c o s a m i n o g l y c a n k i l o b a s e l o d a l t o n s l u r i a - b e l t a i l i m e s s e n g e r 列n a o t i c a ld e n s i t y p o l y a e r y l a m i d eg e le l e c t r o p h o r e s i s 中文 骨髓来源闷充质干细胞 碱基对 甄补d 硫酸软骨索 d u l b e c c o 氏改良e a g l e 培养基 三磷酸脱氧核苷 细胞外基质 糖胺聚糖 千碱基 手道尔顿 溶菌肉汤 信使r n a 光密度 聚丙烯酰胺凝胶电泳 p b s p h o s p h a t eb u f f e r e ds a l i n e磷酸缓冲液 p c r p o l y m e r a s ec h a i nr e a c t i o n 十 r n a ir n a i n t e r f e r i n g r t - p c rr e v e r s et r a n s c r i p tp c r 多聚酶链式反应 r n a 干扰 反转录p c r r p m r o u n dp e rm i n u t e 转每分钟 s i r n as m a l li n t e r f e rr n a 小干扰r n a u m s c su m b i l i c a lc o r dm e s e n c h y m a ls t e mc e l l s 脐带来源间充质千细胞 v 独创性声明 本人声明所呈交的论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研 究成果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其 他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得北京工业大学或其它教育 机构的学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同意对本研究所做的任何 贡献均已在论文中作了明确的说明并表示了谢意。 签名：型蓥 一职期：趟：苎：趁 关于论文使用授权的说明 本人完全了解北京工业大学有关保留、使用学位论文的规定，即：学校有 权保留送交论文的复印件，允许论文被查阅和借阅；学校可以公布论文的全部 或部分内容，可以采用影印、缩印或其他复制手段保存论文。 ( 保密的论文在解密后应遵守此规定) _r 签名：一l 盗， 导师签名：园翘：越：兰：銎 第l 章绪论 i 第1 章绪论 1 1 研究背景 细胞外基质( e c m ) 是分布于细胞外空间、分布在细胞表面或细胞之间的大 分子，主要由细胞分泌的蛋白和多糖所构成的网络结构。细胞外基质将细胞粘 连在一起构成组织，同时，提供一个细胞外网架，在组织中或组织之间起支持 作用。此外，其三维结构及成分的变化，如基质金属蛋白酶等的水解作用，往 往能够通过对细胞微环境的改变从而对细胞形态、生长、分裂、分化和凋亡起 重要的调控作用。e c m 由许多不同的多功能胶原超家族分子和非胶原基质分子 组成，包括透明质酸、蛋白聚糖和糖蛋白等。 蛋白聚糖是由蛋白核心和连接在核心上的多条线性氨基葡聚糖( g l y c o s a m i n o g l y c a n ，g a g ) 链构成。g a g 侧链包括硫酸软骨素( c h o n d r o i t i o ns u l f a t e ，c s ) 、硫酸皮肤素( d e n m a t a ns u l f a t e ，d s ) 、硫酸角质素( d e r a t a ns u s f a t e ，k s ) 和硫酸肝素( h a p r i ns u l f a t e ，h s ) 等。目前已知的蛋白聚糖有3 0 多种分子， 其中细胞外基质蛋白聚糖有接近2 0 种，大多数蛋白聚糖分布于胞外基质中，近 年在细胞表面和细胞膜中甚至胞浆及核内亦发现有蛋白聚糖。基质蛋自聚糖包 括小型基质蛋白聚糖( 饰胶蛋白聚糖d e c o r i n ，双链蛋白聚糖b i g l y c a n ，纤调蛋 白聚糖f i b r o m o d u l i n ，聚集蛋白聚糖a g g r e c a n ，短小蛋白聚糖b r e v i c a n ，多 功能蛋白聚糖v e r s i c a n 或神经蛋白聚糖n e u r o c a n ) 。这些蛋白聚糖有的仅含一 条g a g 链( 例如饰胶蛋白聚糖) ，而其它一些蛋白聚糖则含i 0 0 多条侧链( 如聚 集蛋白聚糖) 。基质蛋白聚糖典型地含有c s 或d s 类g a g s ，在这一普遍性规律 中也有例外。串珠蛋白聚糖p e r l e c a n 和组合蛋白聚糖a g r i n 等h s 类蛋白聚糖 是在基底膜中发现的主要聚糖品种。而膜蛋白聚糖多含h s ( 如糖基磷脂酰肌醇 蛋白聚糖g l y p i c a n ) ，但也有许多含有c s h s 杂和结构的蛋白聚糖( 如黏结蛋 白聚糖s y n d e c a n 和b 一蛋白聚糖b e t a g l y c a n ) 。还有少数膜结合蛋白聚糖只含有 c s ( 如c d 4 4 和n g 2 ) 。 蛋白聚糖是重要的多功能分子，它在机体内所起的作用是相当广泛的。在 软骨、动脉等结缔组织的细胞外基质中，蛋白聚糖提供一种结构约束因素，起 北京工业大学理学硕士学位论文 着群分子弹簧”的作用。蛋白聚糖具有维持或抑制细胞生长的作用。在正常发 育和病理情况下，蛋白聚糖可结合、储存和向靶细胞释放生长因子。蛋白聚糖 可影响细胞的粘附，调节细胞与细胞以及细胞与基质的相互作用。在基底膜中， 蛋白聚糖可起生物过滤器的作用。此外，蛋自聚糖还具有促进血管形成、诱导 轴突生长以及参与信号传递等作用。这些功能既取决于蛋白聚糖本身的结构和 性质，也与蛋白聚糖和其它生物大分子的相互作用有密切关系。蛋白聚糖可与 成纤维细胞生长因子、转化生长因子d 等多种生长因子结合。 目前对于大分子聚集性胞外基质蛋自聚糖家族包括a g g r e c a n n 一对，v e r s i c a n ，b r e v i c a n 溯，n e u r o c a n 跚等的研究较为广泛。因为蛋白结构上的相似性，v e r s i c a n 与a g g r e c a n ，n e u r o c a n 还有b r e v i c a n 被统称为l e c t i c a n 家族蛋自口1 。 组织学分析表明a g g r e c a n 主要表达于软骨组织和大脑中，n e u r o c a n 和b r e v i c a n 主要分布于中枢神经系统。相对于它们都有主要的分布区域，v e r s i c a n 则广 泛地分布于体内许多不同的组织和器官中姆1 。 | l 。2v e r $ ic a n 的结构 细胞外基质蛋白多功能蛋白聚糖v e r s i c a n 是一种分子量很大的硫酸软骨 素蛋自聚糖，隶属予外源凝集素家族。它是壶一个蛋自核心和连接在其上的1 2 - 1 5 个硫酸软骨素侧链所构成的陬舡。v e r s i c a n 最初是从人胚肺纤维细胞系i m r - 9 0 及人类胎盘中分离褥到的瑟镞，之后陆续在其他细胞中被发现，包括角傀细 胞n 们，动脉平滑肌细胞n 。1 等。免疫组织化学实验揭示了v e r s i c a n 蛋白与血管n 幻 及其他些器官的结缔组织有密切关系，如表皮及皮肤珏羽等。其基因产物还可 能受到中枢神经系统调控n 引。此外，很多研究表明v e r s i c a n 在细胞黏附n 钉，迁 移嘲，增殖撼3 和分化瞰过程中都发挥作用。 v e r s i c a n 基因( c s p g 2 ) 位于鼠的1 3 号染色体和人的5 号染色体上n 们。它 是由9 万个碱基对的连续d n a 编码的1 5 个外显予组成。c s p g 2 的表达是由一个 位于t a t a - b o x 上的启动子和一些转录因子结合位点所调节的。这些转录因子包 括a p 2 ，c c a a t 增强子蛋爨及c a m p 应答元件等秘霸。 v e r s i c a n 与其它透明质酸和凝集素蛋白聚糖族一样，都是由一个氨基端的 g 王亚基、一个羧基端的g 3 亚基和二耆之间静c s 链结和区域所组成。g 王区包含 一个类免疫球蛋白基元、接着是两个蛋白聚糖串联重复序列，又称透明质酸结 2 第1 章绪论 合重复序列( h a b r ) 。g 3 区则由两个类表皮生长因子重复序列、一个碳水化合 物识别区域又成为类凝集素基元( c r d ) 及一个互补结合蛋白基元( c b p ) 所组 成。这样看来，g 3 与选择素家族相似，但是g 3 只有一个c b p 而选择素一般至 少有两个。 v e r s i c a n 的g a g 结合区域结合的g a g 链与结合区域长度成恒定比例。然而 g a g 链的多少及大小并不是仅由结合区域长度决定的，g 1 及g 3 区以及不同类型 的细胞和组织都有可能对其产生影响。例如：g 1 区阻止g a g 链与v e r s i c a n 的 结合，而g 3 区则相反，促进二者的结合。g a g 侧链由将近4 0 个重复元件组成， 这些链相互排斥而形成巨大的扩展结构。g a g 侧链在不同的组织和分子中都有 所不同。g a g 链的硫酸化程度在鸡脑的发育中有着显著的变化，这暗示了g a g 链的变化反映出其所包含的信息不同啪1 。这是具有非常重要意义的。 通过p c r 反应，c d n a 测序及r n a 斑点杂交等技术研究v e r s i c a nm r n a 的选 择性拼接发现选择性拼接编码g a g 链结合区的m r n a 可以产生至少四种亚型，即 v o ，v 1 ，v 2 和v 3 。它们的核心蛋白分子量分别为3 7 0 k d a ，2 6 3 k d a ，1 8 0 k d a 及7 4 一_ k d a 。每一种亚型具有不同长度的g a g 结合区，相对的也就可以结合不同数量的 g a g 链。v o 是最大的v e r s i c a n 亚型，包含两个g a g 结合区c s 丽c s p ；y l 包含， c s p 区；而v 2 包含c s l 3 l 区：v 3 则仅由g 1 和g 3 区组成，没有g a g 链结合位点瞄。 图一：y e r s i c a n 的组成结构啪1 f i g l ：t h es t r u c t u r eo fv e r s i c a n v o 丑bh l v i 芒，兰皂= = = = = = l 曲t d ef r k i m v 2 芒! 髦芝当蓝 | 1 1 l 瞳 订_ c z ：3一匹2 = = = 习c = = = = = ：= = = = j _ 盼葚冀扎峪岱1 t g 巾b 洲l e 加申 1 3v e r sic a n 的生物学功能 v e r s i c a n 在体内广泛分布于动脉，脑，软骨，胎盘，皮肤和肌腱等组织币 1 2 , 2 3 , 2 4 。研究表明v e r s i c a n 在细胞生长旺盛的区域表达增加，肿瘤组织具有旺 3 北京工业大学理学硕士学位论文 盛的细胞生长状态，v e r s i c a n 表达在肿瘤组织和肿瘤周边组织中有所增加。目 前，增强的v e r s i c a n 表达已在多种不同的人类肿瘤中检测得到，包括乳房癌、 前列腺癌、脑瘤、胃癌、肠癌和皮肤癌“4 川。 外源性的v e r s i c a nv i 单体增强表皮生长因子受体( e p i d e r m a lg r o w t hf a c t o rr e c e p t o r ，e g r r ) 的表达并激活该受体介导的m a p k 信号传导通路诱导 n i h 3 t 3 细胞生长加快。然而与此相反，外源性的v e r s i c a nv 2 单体抑制e g f r 的表达，并且同时抑制和降低m a p k 激酶活性减缓了n i h 3 t 3 细胞的生长。v e r s i c a nv 1 单体能够诱导和加快p 2 7 ”蛋白的降解，同时提高了c d k 2 ( c y c l i n - d e p e n d e n tk i n a s e ) 的激酶活性。v e r s i c a nv 2 单体对细胞周期蛋白也具有调 节功能，它能够明显地抑制c y c l i na ( 周期蛋白a ) 的表达。说明v e r s i c a n v 1 和v 2 两个单体在调节细胞生长这个环节上作用是相反的。v e r s i c a nv 1 单体 还可以降低细胞凋零相关蛋白b a d 的表达。从而赋予了v e r s i c a nv 1 单体转染 的n i h 3 t 3 细胞抵御细胞凋零的能力伫6 1 。 此外，v e r s i c a n 不仅仅能够调节细胞的生长，而且还可以通过改变细胞表 面粘性膜蛋白c a d h e r i n 的表达诱导细胞的分化。n - c a d h e r i n 是纤维细胞特有 的粘性膜蛋白，e - c a d h e r i n 是上皮细胞特有的粘性膜蛋白。有研究表明n - c a d h e r i n 的表达在v e r s i c a nv 1 转染的n i h 3 t 3 细胞中被e _ c a d h e r i n 所取代。也 就是说v e r s i c a nv 1 单体在n i h 3 t 3 细胞表达后抑制了n - c a d h e r i n 的表达却激 活了e _ c a d h e r i n 的表达。与此同时纤维细胞标志性蛋白之一的v i m e n t i n 减少 了而上皮细胞特有的标志性蛋白o c c l u d i n 却开始出现。这些都阐明v e r s i c a n v i 可以诱导n i h 3 t 3 细胞从问叶细胞到上皮细胞的分化埘。 图2 ：v e r s i c a n 单体的表选诱导n i h 3 t 3 细胞形态” f i 9 2 ：m o r p h o l o g i c a lc h a n g e so f v 啪i c a a i s o f o r t n t r a n s f e c t e d n 球1 3 t 3c e l l s v e r s i c a n 与间叶细胞的分化有紧密的关系不仅仅在n i h 3 t 3 细胞中而且在 第1 章绪论 胚胎肾组织中的间叶细胞中也得到体现。胚胎肾间叶细胞到上皮细胞转化在肾 组织的发生和发展中是关键的一步。此过程受多种因素调节，包括多种细胞因 子，膜受体和细胞外基质。胚胎肾间叶细胞体外可在多种细胞因子的联合作用 下诱导成为肾上皮细胞。采用s i r n a 技术在分离培养的胚胎肾间叶细胞中抑制 其内源的v e r s i c a n 表达，在相同的诱导条件下，缺失v e r s i c a n 表达的胚胎肾 间叶细胞丧失了被诱导成为上皮细胞的能力。在两种不同的间叶细胞中都观察 到了v e r s i c a n 参与其分化和转化过程嘲。更重要的是，迄今为止除v e r s i c a n 外还没有其他基因具有相似的能力和功能的报道。 此外，v e r s i c a nv 1 基因不仅可以参与细胞的分化，还可以通过调节间隙 连接的连接子蛋自来加强细胞间的通讯。间隙连接介导小分子和第二信使分子 在相邻细胞中的传导。研究发现，v 1 可以诱导连接子4 3 在细胞膜上的定位， 从而调节细胞通，阴性对照实验也证明了这一点啪3 。 作为一个细胞外基质蛋白，v e r s i c a n 与其它的细胞外基质蛋白和细胞膜上 的跨膜蛋白都有广泛的连接和相互作用。研究表明v e r s i c a n 的g 1 区不仅仅可 以和细胞外基质蛋白透明质酸相互作用，而且还可以和细胞膜上的跨膜蛋白整 合素p 1 相结合并与此同时调节整合素的生物学功能和由其诱导的细胞内信号 传导通路啪】。v e r s i c a n 的g 3 区域也可以同一些细胞外基质蛋白相结合和连接， 比如t e r n a s c i n - r 和f i b u li n 等及一些糖脂类蛋白。有研究表明v e r s i c a n 与糖 脂类蛋白结合与动脉硬化的发生发展有密切的关联。此外还有很多研究都表明 g 3 区与肿瘤细胞的生长有关。相对于g l 和g 3 区域，处于中间的有硫酸软骨素 附着的区域主要与带有正电荷的蛋白相结合，例如c d 4 4 ，炎症白细胞表面表达 的粘性蛋白p 一选择素和l 一选择素。有研究证明它们的结合与炎症细胞向炎症区 域的移动和聚集紧密相关啪3 。 v e r s i c a n 的结构十分复杂，在体内和体外的作用也十分复杂。研究发现， 它还与许多不同的细胞功能相关，如粘附、迁移、细胞通讯、增殖及凋亡等。 它也因此而得名。另一方面，v e r s i c a n 不是单独发挥作用的。v e r s i c a n 核心蛋 白由多个不同元件所构成，这也就导致了它可以与许多不同的分子相结合。许 多蛋白都可以与之相结合，包括e c m 蛋白如胶原等、生长因子或细胞因子、血 浆蛋白、跨膜蛋白及细胞质蛋白等。它与这些重要的决定细胞行为的分子相结 5 北京工业大学理学硕士学位论文 合来共同对细胞行为进行调控。 1 。4 研究目的及内容 本课题主要研究目的是构建v e r s i c a nv 1 基因重组表达质粒及其s i r n a 系 统，并| 以此力手段来研究v e r s i c a n ￥圭单钵的功能及生物学活缝。 v e r s i c a n 作为细胞外的大分子，编码该蛋白的基因较其他常规蛋白大的多。 例如，编码￥0 单体的基因全长达到ll k b ，编码v 王单体的基因全长接近8 k b ， 编码v 2 单体的基因也有5 k b 之多。该基因的这些自然属性为深入研究其生物学 功能形成了一道天然障碍，对它的全长基因的克隆比常规基因要露难得多。芷 是因为缺少像基因克隆这样有效的研究手段，目前人们对v e r s i c a n 的研究大多 还只处在鉴定箕在哪些组织中表达以及同哪些蛋白和细施因子结合的水平。其 生理和病理功能的研究还没有实质性的进展。因此，构建v 1 基因的熏组表达载 体是对其研究的基础。为了更深入的研究v e r s i c a nv l 及其它单体的功能，需 要构建v e r s i c a n 的r n a 干扰系统及v 1 的突变体。 - 1 5 研究技术路线 设计并合成对应于v e m i c a n 的 s i r n a 基因 使用p s u p e r 系统构建s i r n a 6 从h p f - l 细胞中提取 v c r s i c a nv lr n a r t - p c r 扩增v l 基因 山 使用p c d n a j 1 ( + ) 质粒构建重缀 表达栽体及其突变体 专 瞬时转染2 9 3 t 细胞 i r t - p c r 检测v l 基因的表达 第2 牵人v e r s i c a nv l 基因及其突变体真核表达质粒的构建 _ - _ _ i ii l l ui i i ii i 曼蔓! ! ! ! ! 兰! ! ! ! ! 出! ! ! ! ! 曼兰皇苎! ! 曼盥蔓! ! ! ! ! ! 蔓 第2 章人v e rsic a nv 1 基因及其突变体真核表达质 粒的构建 2 。1 实验材料 2 。1 。1 菌株与质粒 大肠杆菌d h 5 a 为北京工业大学生命科学与生物王程学院病毒药理实验室 ( 以下简称病毒药理室) 保存。转化用大肠杆菌d h 5 a 感受态细胞为作者本人制 备；克隆用质粒p c d n a 3 1 ( 十) 购自i n v i t r o g e n 公司。 2 1 2 工具酶与试剂 限制性内切酶a f l l i 、k p n i 、n o t i 、a p a l 、x b a i 、h p a i 、b a m h i 、e c o r v 、 h i n d l l l 、e c o r i 等以及d n am a r k e r 、t 载体购自大连宝生物工程有限公司；质 粒提取试剂盒，d n a 纯化试剂盒，d n a 琼脂糖凝胶回收试剂盒等购自天根生化科 技( j 匕京) 有限公司；质粒中提试剂盒、r n a 提取试剂盒、o m n i s c r i p t 反转录 试裁盒、h o t s t a rt a qp c r 酶购予q i a g e n 公司；篙保真a c c u p r i m e rp f u t a qp c r 酶购于i n v i t r o g e n 公司；o l i g od t 、r a n d o mp r i m e r 、d n t p 购自上海生工有限 公司；蛋白胨、酵母提取物、琼脂粉、琼脂糖、氨卞青霉素等购自北京欣经科 公司。其它分析纯试剂由病毒药理室提供。 ， 2 1 3 细胞株及细胞培养相关材料 h p f - i 细胞来源于人胚肺二倍体成纤维细胞，由病毒药理室提供；2 9 3 t 细 胞来源于人肾上皮细胞的2 9 3 细胞派生而来的细胞系，同时表达s v 4 0 大t 抗原， 由病毒药理室提供。 ， d m e m 培养基、进1 3 胎牛血清、胰酶均购自i n v i t r o g e n 公司；青链霉素溶 液、3 谷氨酰胺溶液、羔xp b s 溶液均幽瘸毒药理室配制；7 5 c m 2 细胞培养瓶，移 液管等来自病毒药理室。 2 1 。4 序列合成与测序 引物合成及基因测序由上海生工有限公司和上海英骏生物技术公司完成。 2 1 。4 主要仪器 7 北京工业大学理学硕士学位论文 紫外分光光度计 p c r 仪 低温高速离心机 台式微量高速离心机 水平离心机 恒温培养箱 恒温摇床 恒温水浴锅 凝胶成像系统 电泳仪及电泳槽 微量移液器 超净工作台 生物安全柜 倒置显微镜 c 0 ：培养箱 购自s h i m a d z u 公司，型号u v - 2 6 5 a p p l i e db i o s y s t e m s 2 7 2 0t h e r m a lc y c l e r t h e r m oe l e c t r o nc o r p o r a ti o n 北京医用离心机厂l f l 6 - w 北京医用离心机厂，型号l d z a 一0 8 上海一恒科技有限公司d h p - 9 0 5 2 型 江苏太仓市实验设备厂d d h 2 3 0 0 型 北京博医康实验仪器h x - 1 0 5 0 a l p h ai n n o t e c h 公司4 4 0 0 型 北京市六一仪器厂d y c p - 3 1 c 型 d r a g e n m e d 公司 l a b c o n c op u r i f i e rv e r t i c a lc l e a nb e a c h 哈尔滨市东联电子技术开发有限公司， 型号b h c 1 3 6 0 i i r b 30 3 1 0 0 4 重庆光学仪器厂，型号x d s 1 b i 冱v c o 公司，型号r c 0 3 0 0 0 t - 5 c 2 1 5 其它需配制的溶液 1 细菌培养基 l b ( l u r i a b e r t a n i ) 液体培养基：胰蛋白胨1 0 9 ，酵母提取物5 9 ，n a c l1 0 9 ， 去离子水定容至总体积1 l 。1 2 1 高压3 0 分钟。 l b 固体培养基：在l b 液体培养基中加入1 5 ( m v ) 的琼脂粉，1 2 1 高 压3 0 分钟。冷却至5 0 。c 左右后加入抗生素，混匀。倒入培养皿中，待冷却凝 固后4 保存备用。 1 0 0 m mc a c l 2 ：1 1 9 无水氯化钙，溶于9 0 m l 去离子水，定容至l o o m l ，高 压灭菌，4 保存。 抗生素贮液： 氨卞青霉素( a m p i c i l l i n , a m p ) ，贮液浓度1 0 0 m g m l ( 水溶) 。 2 其它试剂 a n n e a li n gb u f f e r n a c 】0 0 m m 第2 章人v e r s i c a nv 1 基因及其突变体真核表达质粒的构建 h e p e s5 0 1 1 1 m 3d n a 电泳试剂 5 0 x t a e 凝胶电泳缓冲液( 1 l ) t r i s 2 4 2 9 冰醋酸 5 7 1 i i l l e d t a ( 0 5 m ，p h 8 o ) l o o m l i o xd n a 凝胶加样缓冲液 溴酚蓝0 4 1 7 二甲苯青f f0 4 1 7 蔗糖水溶液6 6 7 2 2 实验方法 2 ，2 1h p f - 1 细胞的培养 h p f - 1 细胞培养条件为含1 0 进口胎牛血清、1 青链霉素的d m e m 培养基。 用7 5 c m 2 细胞培养瓶水平放置培养。细胞均每2 3 天换一次培养液，当长至 8 0 一- - 9 0 汇合度时使用0 2 5 的胰蛋白酶溶液进行消化传代培养。利用倒置显 微镜观察细胞生长情况。 2 2 2 人v e r s ic a nv 1 基因真核表达质粒的构建 2 2 2 1 引物设计 以i n v i t r o g e n 公司v 5 及6 x h i s 序列为模板，合成用于鉴定和纯化的v 5 及6 x h i s 。在v 5 两端分别添加n o t i 和x b a i 酶切位点，在6 x h i s 两端分别添 加x b a i 和a p a i 酶切位点。 h is x b a i - a p a i ( + ) ：5 c t a g a c a t c a t c a c c a t c a c c a t g g g c c3 h is - x b a l _ a p a i ( 一) ：5 c a t g g t g a t g g t g a t g a t g t3 v 5 - n o tl - x b a l ( + ) ： 5 g g c c g c t c g g t 从g c c t a t c c c t a a c c c t c t c c t c g g t c t c g a t t c t a c g t3 v 5 一n o tl - x b a l ( - ) ： 5 c t a g a c g t a g 从t c g a g a c c g a g g a g a g g g t t a g g g a t a g g c t t a c c g a g c3 以人v e r s i c a nv 1 基因序列为模板，设计引物扩增v 1 基因。以其中的两个 k p n i 酶切位点将v 1 基因分为三部分先后进行克隆。第一部分前面添加a f l l i 酶切位点，最后一部分后面添加n o t l 酶切位点。每部分约2 5 0 0 b p 左右，分两 9 北京工业大学理学硕士学位论文 段扩增后再融合在一起。 第一部分 a i - a f lii ( + ) ：5 g c c t t 从g c c t t c c 从g g c c 从g a t g t t c3 a 2 ( - ) ：5 t a t g t a c t g c a c a g a t g g g g t3 a 3 ( + ) ：5 a c c a g t g c g a t t a c g g g t g g c3 a 4 - k p n i ( 一) ：5 c c t g g t a c c t g a a t c a c t a g a3 第二部分 b i - k p n i ( + ) ：5 t c t a g t g a t t c a g g t a c c a g g3 b 2 ( 一) ：5 c t g g a t c t g g a g t a g a c a t g t3 b 3 ( + ) ：5 a c a t g t c t a c t c c a g a t c c a g3 b 4 - k p n i ( 一) ：5 g g t t c t g a t g g t a c c t c t g t a3 第三部分 c i - k p n i ( + ) ：5 t a c a g a g g t a c c a t c a g a a c c3 c 2 ( 一) ：5 t g c c a c t t g c t g t t c t g a t g c3 c 3 ( + ) ：5 g c a t c a g a a c a g c a a g t g g c a3 c 4 - n o ti ( 一) ：5 c g g c g g c c g c c a g c g c c t c g t c t c c t g c c a c c t3 2 2 2 2r n a 的提取 利用q i a g e n 公司的r n e a s ym i n ip r e pf o ri s o l a t i o no ft o t a lr n af r o m a n i m a lc e l l s 试剂盒提取r n a 。 吸弃细胞培养液后，用1 p b s 冲洗两次，每次5 m l 。 加入2 m 1 0 2 5 的胰蛋白酶溶液，c 0 ：孵箱孵育2 - - 一5 m i n 至细胞变圆后，用5 m l 培养基吹打细胞至全部自培养瓶脱落。 1 0 0 0 r p m 离心l o m i n 后，弃上清。 用6 0 0 p lr l t 缓冲液( 加入1 b 巯基乙醇) 重悬沉淀后，全部转移到 q i a s h r e d d e rs p i nc o l u m n 中，最大速度离心2 m i n 。 将6 0 0 b i7 0 乙醇与离心后的液体吹打混匀后，转移到r n e a s ym i n ic o l u m n 中，1 2 0 0 0 r p m 离心1 5 s