（生物化学与分子生物学专业论文）桫椤种群遗传结构和系统发育地理研究.pdf

桫椤种群遗传结构和系统发育地理研究 学位申请人：杨明照 指导老师：苏应娟副教授 专业：生物化学与分子生物学 摘要 桫椤( a l s o p h i l as p i n u l o s a ( w “1 e xh o o k ) t r y o n ) 是古老的冰川孑遗植物， 属桫椤科( c y a t h e a c e a ) 桫椤属l s o p h i l a ) 。本论文以采集自中国福建、贵州、广 西、海南与重庆4 省l 直辖市的1 0 个桫椤种群的1 5 9 个个体为材料，通过p c r 产物克隆后测序的方法测定了叶绿体d n a ( c p d n a ) a t , b r b c l 非编码区序列， 序列长度介于7 2 7 b p 到7 3 2 b p 之间，具长度多态性，碱基组成a + t 含量较高， 百分比值为6 3 2 6 6 3 9 7 。 研究表明：( 1 ) 分布在大陆与海南的桫椤种群存在一定程度的遗传分化。 a m o v a 分析( 种群间遗传变异占7 5 7 4 ) ，较高的遗传分化度f s t ( 0 3 1 2 8 3 ) 和d n a 歧异度研究一致支持这一观点，琼州海峡的地理阻隔及桫椤交配系统可 能是造成遗传分化的两个主要原因。以黑桫椤为外类群构建的桫椤单倍型邻接树 表明大陆单倍型和海南单倍型各自均不构成单系分支。( 2 ) 现存于大陆的各桫椤 种群问遗传分化程度极低。根据c p d n aa t p b - r b c l 非编码区构建的u p g m a 树表 明桫椤现存于大陆种群间的遗传关系接近。大陆地区桫椤a t p b r b c l 非编码区序 列的核苷酸多样性较低，地区间分化度f s t ( 0 0 0 0 0 0 0 0 5 6 1 7 ) 很低。 a m o v a 分析( 地区间遗传变异仅占2 1 3 ) 以及d n a 歧异度结果一致显示，桫 椤分布在大陆各地区间的种群彼此不存在遗传分化。考虑到桫椤种群现代生境的 片断化，孢子有限的迁移力以及脆弱的生命力，推测统计上的高基因流并不表示 桫椤现存种群在地区间能够实现高效的基因流。桫椤单倍型在大陆的系统发育地 理式样中具“星状”特征，提示在冰期退却到“避难所”的桫椤种群遇到适宜的 气候条件曾发生过扩张。 关键词：桫椤、叶绿体d n a a t p b r b c l 基因间隔区、遗传分化、系统发育 s t u d i e so nt h ep o p u l a t i o ng e n e t i cs t r u c t u r ea n dp h y l o g e o g r a p h y o f a l s o p h i l as p i n u l o s a s p e c i a l t y ： b i o c h e m i s t r ya n dm o l e c u l a rb i o l o g y m a s t e r a lc a n d i d a t e ： y a n gm i n g z h a o s u p e r v i s o r ： a s s o c i a t ep r o f s uy m g i u a n a b s t r a c t a l s o p h i l as p i n u l o s af w a l l e xh o o k 。) t r y o n ) i sat r e ef e r nb e l o n g i n gt of a m i l y c y a t h e a c e a e s e q u e n c e so fc h l o r o p l a s td n a ( c p d n a ) a t p b - r b c li n t e r g e n l cs p a c e r s o f1 5 9a s p i n u l o s ai n d i v i d u a l sc o l l e c t e df r o mt e nr e l i c tp o p u l a t i o n sd i s t r i b u t e di n h a i n a n ，g u a n g x i ，f u j i a n ，g u i z h o u ，a n dc h o n g q ip m v i n c e s ( m u n i c i p a l i t y ) i nc h i n a , w e r ed e t e r m i n e db ys e q u e n c i n gc l o n e dp c rp r o d u c t s s e q u e n c el e n g t hv a r i e df r o m 7 2 7b pt o7 3 2b p ，s h o w i n gl e n g t hp o l y m o r p h i s m ，a n db a s ec o m p o s i t i o nw a sw i t hh i g l l a + tc o n t e a tb e t w e e n6 3 1 7 a n d6 3 9 5 t h er e s u r si n d i c a t e d ：( 1 ) s i g n i f i c a n tg e n e t i cd i f f e r e n t i a t i o nw a sd e t e c t e db e t w e e n c h i n e s em a i n l a n da n dh a i n a n a na n a l y s i so fm o l e c u l a rv a r i a n c ed e m o n s t r a t e dt h a t m o s to ft h eg e n e t i cv a r i a t i o n ( 7 5 7 4 ) w a sp a n i t i o n e da m o n gr e g i o n s f s t ( - o 312 8 3 ) a n dd n ad i v e r g e n c ea l s os h o w e dt h ee x i s t e n c eo f g e n e t i c d i f f e r e n t i a t i o n r e d u c e dg e n ef l o wb yt h eq i o n g z h o us t r a i ta n di n b r e e d i n gs y s t e m m a yr e s u l ti nt h eg e o g i a p h i c a ld i f f e r e n t i a t i o nb e t w e e nh a i n a na n dc h i n e s em a i n l a n d ( 2 ) u p g m a t r e es u g g e s t e dac l o s eg e n e t i cr e l a t i o n s h i pb e t w e e np o p u l a t i o n sw i t h i n m a i n l a n d ，w h i c hw a su p h e l db ya m o v aa n a l y s i s ( a m o n gr e g i o n s ，2 1 3 ) ， f s r ( 0 0 0 0 0 0 0 0 5 6 1 7 ) a sw e l ld n ad i v e r g e n c em e a s u r e s t h e s t a r - l i k ep a t t e r n o fp h y l o g e o g r a p h yo fh a p l o t y p e si m p l i e dap o p u l a t i o ne x p a n s i o np r o c e s sd u r i n g n t e v o l u t i o n a r yh i s t o r y g e n eg e n e a l o g i e st o g e t h e rw i t hc o a l e s c e n tt h e o r yp r o v i d e d s i g n i f i c a n ti n f o r m a t i o nf o ru n c o v e r i n gp h y l o g e o g r a p h yo f a s p i n u l o s a k e y w o r d ：a l s o p h i l as p i n u l o s a , c p d n a a t p b r b c l n o n c o d i n g r e g i o n ， g e n e t i c d i f f e r e n t i a t i o n ，p h y l o g e o g r a p h y l v 缩略词表 a m 0 蹈 a n a l y s i so fm o l e c u l a rv a r i a n c e 分子变异分析 a m pa m p i c i l l i n 氨苄青霉素 b p b a s ep a r e碱基对 c p d n ac h l o r o p l a s td n a 叶绿体d n a d n a d e o x y r i b o n u c l e i ca c i d 脱氧核糖核酸 d 册 d e o x y n u c l e o s i d et r i p h o s o h a t e 脱氧单核苷三磷酸 e be t h i d i u mb r o m i d溴化乙锭 e d l a e t h y l e n ed i a m i n e t e t r aa c e t i ca c i d 乙= 胺四乙酸 i g s i n t e r g e n i cs p a c e r 基因间隔序列 口t g i s o p r o p y l t h i o - b - d g a l a c t o s i d e 异丙基硫代b - d 一半乳糖苷 i s s r i n t e r - s i m p l es e q u e n c er e p e a t s 简单重复问区序列 l si n t e r n a lt r a n s c r i b e ds p a c e r内转录间隔区 m m m i l l i m o l a rc o n c e n t r a t i o n毫摩尔浓度 t o o lm o l a r摩尔 m t d n am i t o c h o n d r a ld n a线粒体d n a n gn a n o g r a m 纳克 n j n e i g h b o r - i o i n i n gm e t h o d 邻接法 n d n an u c l e a rd n a核基因组 p c a p r i n c i p a lc o m p o n e n t sa n a l y s i s 主成分分析 p c r p o l y m e r a s ec h a i nr e a c t i o n 聚合酶链式反应 r p m r e v o l u t i o n sp e rm i n u t e转速，分钟 s d ss o d i u md o d e c y ls u l f a t e 十二烷基磺酸钠 t a q t h e r m u sa q u a t i c u sd n ap o l y m e r s a s e栖热水生菌d n a 聚合酶 t 舡 t r i s a c e t i ca c i de l e c t r o p h o r e s i sb u f f e r 乙酸电泳缓冲液 1 e t r i s e d t ab u f f e rt r i s e d t a 缓冲液 t r i s t r i s ( h y d r o x y m e t h y l ) a m i n a m e t h a n e 三羟甲基氨基甲烷 t r i s c lt r i sh y d r o c h l o r i d et r i s 盐酸 u p o m a u n w e i g h t e dp a i rg r o u pm e t h o d 未加权配对算术平均法 u s i n ga r i t h m e t i ca v e r a g e v 中山大学硕士学位论文 第一章前言 1 1 桫椤研究进展 1 1 1 桫椤分布及生物学特性 桫椤( a l s o p h i l as p i n u l o s a ( w a l l e xh o o k ) t r y o n ) 属桫椤科( c y a t h e a c e a ) 桫 椤属似t s o p h i l a ) ，亦称树蕨、刺桫椤，是古老的冰川孑遗植物，有“活化石”之 称，早在1 9 8 7 年就被中国珍稀濒危保护植物名录( 国家环保总局) 列为国家 濒危保护植物，渐危种。 在澳大利亚、加拿大、德国南部、印度和朝鲜的侏罗纪以及捷克的早白垩世、 我国大兴安岭、松辽盆地的早白垩世均发现桫椤的孢子，这表明桫椤在距今1 8 亿年前的中生代侏罗纪时期已经存在，并且分布的范围很广，十分繁盛：经过第 四纪冰川的侵袭后，桫椤的生存受到严重的影响，现今其分布区己大大缩小 ( t r y o n ，1 9 7 0 ) ，仅分布在热带、亚热带地区( l u c a n s k y ，1 9 7 4 ；w i l l i s a n d m c e l w a i n ，2 0 0 2 ) ，中国南部、日本的南部、东南亚及东喜马拉雅山，在我国， 桫椤自然种群主要分布在广东、台湾、福建、海南、贵卅i 、四川、云南等地区( 夏 群，1 9 8 9 ；程志英等，1 9 9 0 ) 。 桫椤要求生境严格，常生于山地，山谷中沟壑，稀疏的树林等潮湿、隐蔽的 环境中( 图l - 2 ) ，这些地区海拔多在1 0 0 0 m 以下( 敖光辉，1 9 9 7 ：王俊浩，1 9 9 1 ) ， 土壤的p h 值在4 5 5 5 之间，年均气温一般在1 3 2 3 。c ，降水量大于1 0 0 0 m m ， 相对湿度在7 7 9 0 。桫椤对环境较差的适应力与其生物学特性相关，同样也 是其濒危的原因：( 1 ) 孢子寿命短，存活数量少，难萌发；( 2 ) 孢子萌发形成配 子体及胚胎建成等过程对环境要求严格，限制了其生存范围，导致在环境中的竞 争力差；( 3 ) 生活周期长，生殖过程在离体情况下进行，发育过程受到变化的环 境影响极大( 4 ) 无发达根系，输导系统极为原始( t r y o n e l a l ，1 9 9 0 ) ；( 5 ) 对生 存环境要求苛刻，需具备温暖、潮湿、隐蔽、水分充足、土壤肥厚等条件。 中山大学硕士学应论文 图l d 桫椤的形态特征 其中， a ：桫椤树干生长状况； c ：桫椤叶子生长状况； b ：桫椤叶柄生长状况 d ：桫椤孢子生长状况 中山大学硕士学位论文 图1 - 2 桫椤的生存环境 f i g1 - 2h a b i t a to f a l s o p h i l as p i n u l o s a 桫椤为树形蕨类，树干通常粗壮、直立、被鳞毛，具有复杂的网状中柱，无 中山大学硕士学位论文 分枝；叶簇生于茎顶，叶柄具密刺，叶片大，三回羽裂，羽片长圆形，羽轴及小 羽轴上疏生棕色卷毛，小羽片狭披针形，羽裂几达小羽轴，叶片长圆状披针形， 有疏锯齿；桫椤孢予囊群着生在叶片背面侧脉分叉处，靠近中肋( 如图l 一1 ) ，囊 群黄褐色、近球、膜质，每个孢子囊产1 6 个孢子，孢子四面体形，辐射对称， 每株桫椤年产孢子约1 0 1 9 2 亿粒( 张家贤等，1 9 9 2 ) 。 1 1 2 桫椤用途及研究进展 桫椤用途广泛。髓部可以药用，味辛、微苦、性平，有驱风湿，强筋骨，清 热止咳的作用；内径汁液可以治疗癣症；髓淀粉含量比较高，可以制作食品、酿 酒；此外，它树形别致，是优良的庭园观赏植物。 近年来已有从形态，孢子等分类特征对桫椤科植物进行研究的报道( d a v i d e l a 1 ，1 9 9 0 ；n a ne t a l ，1 9 9 8 ) ；毕世荣等( 1 9 8 5 ) 用桫椤的嫩叶和孢子通过组织培 养获得了桫椤小植株，首次使桫椤的人工快速繁殖成为可能；程治英等( 1 9 9 0 ) 也运用组织培养技术，通过孢子繁殖、无性融合生殖和愈伤组织分化不定芽等方 式得到桫椤孢子体幼苗；王俊浩等( 1 9 9 6 ) 进行了桫椤的引种和孢子繁殖栽培， 并模拟高湿、荫蔽的生境建立自然的生态群落进行就地保护；曾丽丽( 1 9 9 7 ) 等 做了桫椤异地引种及保护地栽培方面的研究，成功地将桫椤植株从5 0 0 m 海拔引 种到1 2 0 0 m 以上，并用引种成活植株产生的孢子进行繁殖，获得桫椤幼苗。 h a m r i c k ( 1 9 9 0 ) 2 列- 1 6 5 属4 4 9 个种植物等位酶研究的统计结果表明：植物多 态位点平均为5 0 。然而有研究表明，桫椤多态位点比率仅2 6 2 ( 王经源， 2 0 0 2 ) 、2 7 9 4 ( 王艇等，2 0 0 3 ) ，远低于植物平均多态位点，甚至低于地区种 和特有种，也低于其他珍稀濒危植物，表明其遗传多样性水平很低。王艇等( 2 0 0 3 ) 运用对p c r 产物直接测序和克隆后测序的方法测定了蚌壳蕨科1 种和桫椤科1 1 种( 其中桫椤分别测定1 9 株，小羽桫椤测定两株) 植物t r n l 基因内含子和 t r n l - t r n f 基因间隔序列，对桫椤科做了系统发育分析：王艇等( 2 0 0 4 ) 基于c p d n a t r n l f 非编码区序列变异对黑桫椤海南和广东种群的遗传结构与系统地理做了 研究，发现黑桫椤分布在海南和广东的种群彼此间不存在遗传分化，黑桫椤单倍 型的系统发育地理式样具“星状”特征，提示种群在历史上曾经发生过扩张，扩 张后的种群还未能获得足够时间去建立更加复杂的结构。 4 中山大学硕士学位论文 桫椤是研究物种形成与植物地理分布关系及地质学，古生物学的理想材料。 尽管对这一珍稀古老孑遗植物近些年在生态、形态、人工繁殖、物候等方面有不 同程度的研究，遗传学方面的研究也取得了一定进展，但其分子群体研究仍嫌不 足。 1 2 植物群体遗传学与生物多样性 群体遗传学是以个体集中的某个群体为对象，研究其遗传组成受到哪一个 遗传规律支配，以追溯其是否随时间和环境转移而变化的科学，是以阐明生物进 化机制为最终的研究目的。分析物种时通常以种的全体性质和特性作为研究对 象，在考虑到生物进化时，就自然而然的以此种群为研究对象。 生物多样性是生物自身遗传变异以及为适应环境变化而发生改变的结果，生 物多样性的研究主要包括三个层次，即遗传多样性、物种多样性和生态系统多样 性( 陈灵芝，1 9 9 3 ) 。遗传多样性是物种多样性和生态系统多样性的基础，遗传 多样性是指种内不同群体之间或一个群体内不同个体的遗传变异总和。遗传多样 性不仅包括变异水平的高低，也包括变异的分布格局，即种群的遗传结构。群体 遗传结构是一种基础的遗传信息，遗传变异是进化和适应的基础，种内遗传变异 性越丰富，物种对环境变化的适应能力越大，其进化的潜力也就越大，有助于保 持物种和整个生态系统的多样性( 施立明，1 9 9 0 ) 。物种多样性是指生命机体的 变化和多样化，是物种水平的多样性。生态系统多样性是指栖息地生物群落和生 物圈内生态过程的多样化。生物多样性是地球上生命长期进化的产物，更是人类 赖以生存的物质基础。但目前生物多样性正面临日益严重的威胁，尤其是在生 物多样性十分丰富的发展中国家，经济快速发展，人口剧增的同时也带来了生态 系统的严重破坏，大量物种灭绝或处于濒危状态。一个物种灭绝的同时，它所携 带的遗传物质或遗传信息也就自然不复存在，另外现存物种的种群数目逐渐减 少，居群规模不断变小，种内的遗传多样性会随之下降，甚至急剧丧失( 洪德元 等，1 9 9 5 ) 。 中山人学硕士学位论文 1 2 1 群体遗传结构 群体遗传结构是指物种总的遗传变异及其在种群内和不同种群间的分布模 式。影响群体遗传结构的因素有很多，主要包括：群体的地理分布、大小、繁殖 体系、祖先群体的多样性、迁移和突变等( 黄原，1 9 9 8 ) 。对现存群体的多态位 点百分数、杂合度、群体间遗传距离、基因流以及有效群体大小等方面的研究， 可以估算群体的遗传多态性和群体间的基因流的范围和方式，同时也有助于推测 祖先群体的结构，重建种内群体间的系统发育关系( j u a ne t a t ，2 0 0 0 ；c h i a n g e t a t ， 2 0 0 6 ) 。 1 2 2 分子进化 分子进化研究和系统发育研究密切相关并相互促进，分子进化特征的研究有 助于建立正确的系统发育，反之系统发育的建立将更好地理解和研究分子进化的 各种特征，在实际研究工作中这两方面的内容也往往可时进行。分子进化的研究 内容包括进化动力及其相互作用、分子进化速率及变异、级结构和高级结构的 进化及关系、分子进化与表型进化的关系及生物进化过程中分子在质和量上的改 变等，其中与系统发育关系最密切的分子进化参数有：碱基替换速率及其在不同 支系间的变化：突变在同一分子不同区域位点上的分布情况、多重替换和替换饱 和的程度、转换和颠换的比例、总体进化速率、碱基组成等进化特征。对上述问 题的研究都只能通过大分子序列数据的统计分析和立体结构分析方法来解决。 1 3 应用于分子生态学研究中的d n a 分子标记技术 广义的分子标记( m o l e c u l a rm a r k e r ) 包括可遗传的并可检测的d n a 序列或 蛋白质序列。其中，蛋白质标记是指在蛋白质多态性基础上发展的分子标记，常 见的有蛋白质电泳与染色技术，如同工酶( m a r k e r t & m o l l e ，1 9 5 9 ) 、等位酶 6 中山大学硕士学位论文 俾r a k a s h ，1 9 6 9 ) 等。狭义的分子标记只是指d n a 分子标记，是指直接在d n a 分子水平上检测生物间的差异，主要包括两种：一种是d n a 序列数据，包括核 基因、叶绿体基因以及线粒体基因的序列；另一种是在未知被研究生物基因组情 况下的全基因组扫描技术，如r a p d 、i s s r 、s s r 及a f l p 等。 1 3 1 核基因组( n d n a ) 核基因组多同时存在直系同源和异系同源拷贝，对核基因组序列的应用主要 集中在编码核糖体r n a 的重复区内( 田欣、李德铢，2 0 0 2 ) 。高等植物核核糖体 ( n r d n a ) 的每个重复单位从5 端开始，包括外转录间隔区( e t s ) 、1 8 s 基因、 第一转录问隔区( i t s l ) 、5 8 s 基因、第二内转录间隔区( i t s 2 ) 和2 6 s 基因， 重复单位之间为基因间隔区( i g s ) ，或称非编码区( n t s ) 。n r d n a 的编码区序 列( 1 8 s 、5 8 s 和2 6 s ) 属高度保守区，一般用于高级阶元的系统发育研究。非 编码区序列中i g s 是高变区，序列差异主要表现在该区上；i t s 是中度保守区， 序列的变异处于两者之间。i t s 在核基因组中高度重复，通过不等交换和基因转 换使高度重复区域发生位点内或位点之间的同步进化( n i c o l ee t a l ，2 0 0 0 ) ，n d n a 中的这些非编码区常用于较低分类阶元的系统学和群体遗传学研究。 1 3 2 线粒体基因组( m t d n a ) 目前为止对植物线粒体基因组的研究较为有限，了解的其主要特征是存在一 些重复序列。随着对植物基因组和线粒体基因研究的不断深入，人们对线粒体基 因组的认识也在加强。现今普遍认为植物线粒体基因组虽然在大小、结构和基因 层次上差异较大，但却具有已知任何主要真核基因组中最低的同义置换率( s i l e n t s u b s t i t u t i o n ) ( 田欣、李德铢，2 0 0 2 ) ，因此线粒体基因组适合于早期分化类群的 研究。1 9 sr d n a 基因( d u f f & n i c k r e n t ，1 9 9 9 ) 、n a d 5 ( w a n ge ta 1 2 0 0 0 ) 和 m a t r ( m e n ge ta 1 ，2 0 0 1 ) ，c o x 3 ( h i e s e le ta 1 ，1 9 9 4 ) 以及线粒体中的i t s 序列( d u f f e l a l ，1 9 9 9 ) 等线粒体中的基因已经用于植物分子生态学方面的研究。 中山大学硕十学位论文 1 3 3 随机扩增d n a 多态性( r a p d ，r a n d o ma m p l i f i e dp o l y m o r p h i c d n a ) r a p d 最早是由美国w i l l i a m s ( 1 9 9 0 ) 和w e l s h ( 1 9 9 0 ) 两人各自建立。r a p d 以一个1 0 碱基左右的任意序列的寡核苷酸为单引物，对序列未知的基因组d n a 进行随机的p c r 扩增，电泳分离后检测扩增产物的多态性。r a p d 方法的优点 是无需事先知道d n a 序列，就可对基因组进行扫描，其多态性和灵敏度极高， 但是它最大的一个缺陷是r a p d 是显性标记无法区分纯合和杂合基因型。自1 9 9 0 年以来r a p d 己被广泛应用与种内水平的遗传变异分析( w a n ge l a l ，1 9 9 7 ) 、遗 传图谱的构建( 陈洪等，1 9 9 5 ：尹佟明等，1 9 9 7 ) 以及分类与进化等方面的研究， 成为检测d n a 多态性的有效遗传标记。 1 3 4 限制性片段长度多态性标记( r e s t r i c t i o nf r a g m e n tl e n g t h p o l y m o r p h i c d n a m a r k e r ，r f l p ) r f l p 是最早用于群体遗传多样性分析的d n a 分子标记技术( c a n n y ，1 9 8 3 ) 其原理是用限制性内切酶切割不同个体基因组d n a 分子，因目的片段内切酶切 割位点存在差异，而表现出酶切片段在长度上的差异，这种差异可通过特定的探 针进行分子杂交，然后利用放射自显影或荧光标记显示出来。随着p c r 技术的 出现，可以先扩增某一段特定的序列，然后进行酶切分析或s o u r t h e m 杂交，而 且用l o n g - p c r 技术可以扩增出较长的目的片段用以分析，常用的探针来自于对 单拷贝或低拷贝的基因组d n a 或c d n a 克隆。r f l p 的优点：标记的数量大、标 记呈共显性、可区别纯合基因型和杂合基因型，并且标记遵循孟德尔遗传规律， 可靠性强，不受环境、组织特异性等因素的干扰，但操作复杂繁琐、工作量大、 具有放射性的危害、d n a 用量较大、纯度要求较高及可供选择的内切酶实际上 有限等因素影响了该标记的使用。 中山大学硕士学位论文 1 3 5 简单重复序列长度多态性标记( l e n g t hp o l y m o r p h i s mo f s i m p l es e q u e n c er e p e a t ，s s r ) 微卫星标记是根据生物基因组上广泛存在的简单重复序列设计而成的一种 共显性的分子标记，也称为s s r 。微卫星序列的组成多为1 个核苷酸到多个核苷 酸的简单重复。植物中常见有( a t ) n 、( g t ) n 等二核苷酸重复序列，以及( t a t ) n 等三核苷酸重复序列。微卫星序列分布于染色体上的基因编码区和非编码区，而 绝大多数分布于编码区转录产物的非翻译区( r a k o c z y - t r o j a n o w s k ae ta 1 ，2 0 0 4 ) 。 由于微卫星序列的两端常为保守的序列，因而常常根据其两端的保守序列设计引 物，用于相近物种的研究。传统的引物开发建立在构建基因组文库的基础上，而 随着s s r 研究的不断增多以及所报道的s s r 引物序列的增加，从其他物种的s s r 引物中筛选出合适的引物也成为可行的方法( r a k o c z y - t r o j a n o w s k ae la 1 ， 2 0 0 4 ) 。在微卫星分析中，不同个体由于其简单序列重复次数的不同而表现出多 态性，这一特点使微卫星标记能有效地区分显性纯合子和杂合予，所以s s r 为 共显性标记。 1 3 6 内部简单重复序列( i n t e rs i m p l es e q u e n c er e p e a t s ，i s s r ) i s s r 技术是由z i e t k i e w i c z ( 1 9 9 4 ) 在s s r 基础上发展而来的分子标记技术。 该技术根据s s r 在真核生物中广泛分布的特点，利用植物基因组中常出现的s s r 本身设计引物，无需预先克隆和测序。与序列测定相比，s s r 和i s s r 可分析整 个基因组上的信息，因而这两种分子标记被广泛地应用于动植物遗传多样性及其 它研究。用于i s s r p c r 扩增的引物长度一般为1 6 - 1 8 个碱基，由卜4 个碱基组 成的串联重复和几个非重复的锚定碱基组成，从而保证了引物与基因组d n a 中 s s r 的5 和3 末端结合，使位于间隔不太大的重复序列间的基因组片段被p c r 扩增。在真核生物中s s r 进化变异速度非常快，因而锚定引物的i s s r p c r 可以 检测到基因组许多位点的差异( 陈新民等，2 0 0 3 ；赵勇等，2 0 0 2 ) 。i s s r 的优 中山大学硕士学位论文 点是大大减少了多态性分析的复杂程度，简便、快速、高效，同时具有更高的可 重复性和稳定性( 邹喻苹，2 0 0 1 ) 。i s s r 同r a p d 一样为显性遗传标记，不能区 分显性纯合基因型和杂合基因型，但它能获得r a p d 、s s r 更高的多态性，且比 s s r 更加稳定可靠( e s s e l m a ne t a l ，1 9 9 9 ：g i l b e r te t a l ，1 9 9 9 ) ；另外，它还在缺 乏分子遗传学研究背景的濒危植物遗传多样性水平评价中显示出极大的优势 ( c a m a c h o ，2 0 0 1 ：j o n s s o n ，1 9 9 6 ) ，在植物遗传分析及群体多样性分析中得到了广 泛应用( 张立荣等，2 0 0 2 ；周晓梅等，2 0 0 3 ) 。 1 3 7 扩增片段长度多态性标记( a m p l i f i e df r a g m e n tl e n g t h p o l y m o r p h i s m ，a f l p ) a f l p 分子标记融合了r f l p 和r a p d 两种技术的特点，是由荷兰科学家 ( z a b e a u & v o s p ，1 9 9 3 ) 基于r f l p 和p c r 发展起来的一种分子标记。a f l p 的原理是通过限制性内切酶消化，再接上人工合成的双链接头后，设计与接头序 列及内切酶切割位点互补的引物序列进行预扩增和选择性扩增。由于反应使用了 两种切点不同的内切酶进行切割，并且选择性扩增引物3 端具有3 个选择性碱 基，因而能够控制扩增后的片段大小在5 0 5 0 0 b p 之间。一对引物扩增出的片 段数目在1 0 0 个左右，扩增后用聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，接着通过银染、化学 荧光法或放射自显影等方法观察结果( v o se ta 1 ，1 9 9 5 ) 。a f l p 标记具有揭示的 多态性高、可靠性与重复性好以及选择上呈中性等特点，因此被广泛应用于系统 分类及进化、遗传多样性及种群结构等方面的研究( 李珊等，2 0 0 3 ) 。 1 4 本论文研究的序列 论文所研究的序列是桫椤叶绿体基因组( c pd n a ) a t p b - r b c l 基因间隔区。 1 4 1 叶绿体基因组用于分子系统发育地理研究的优势 大部分植物的叶绿体为共价闭合的双链环状分子，仅少数为线状分子，序列 0 中山大学硕士学位论文 长度一般介于1 2 0 2 2 0 k b 之间( 黄瑶等，1 9 9 4 ) 。整个叶绿体基因组被两个长度 在6 - 7 0 k b 的反向重复序列( i r ) 分割成一个大单拷贝区( l s c ) 和一个小单拷贝区 ( s s c ) ，如图3 一l ( s u g u i r a l ，1 9 9 0 ) 。 图1 - 3 水稻叶绿体基因组 叶绿体基因的进化速率极慢，其核苷酸的同义替换比率为每年1 1 1 0 1 个 位点，叶绿体d n a ( c pd n a ) 不同区域的进化速率不同，反向重复序列的进化 速率低于单拷贝区( c u r t i se t a z 1 9 8 4 ) 。编码区和非编码区序列进化速率相差较 大，适于不同分类阶元的系统发育研究。叶绿体d n a 的这些特性使其逐渐成为 分子进化和分子系统学研究的焦董( c l e g ge t a l ，1 9 9 4 ) 。 包括桫椤在内的多数植物的叶绿体基因呈单亲母性遗传，只有2 5 的被子 植物属呈双亲遗传，仅在被子植物的m e d i c a g o 、d a u c u s 及p h a r b i t i s 等属中以及 中山大学硕士学位论文 裸子植物松柏目中呈父性遗传，( 奇文清等，1 9 9 9 ) 。此外，叶绿体基因组不发生 重组，且具有较慢的、近中性的进化速率，使其在植物种群和进化的研究中得到 广泛应用( c u f f se ta 1 ，1 9 8 4 ) 。由于叶绿体基因为单亲遗传，所以无论植物迁移 到哪里，其祖先在过去某个时空d n a 分子的突变都能得到保留，因而，现代种 群与其祖先种群间或现代种群之间，其c p d n a 序列中存在着个完整而清晰的 谱系( s i l v e r t o w ne ta l ，2 0 0 3 ) 。 1 4 2 叶绿体基因组中的编码基因 叶绿体基因组编码区的核酸替代率相对较低，可用于植物系统进化研究 ( r i t t a n d “a 1 ，1 9 8 7 ) 。c p d n a 中许多编码基因被广泛应用于不同科、目乃至整 个被子植物的系统发育研究中，如位于叶绿体基因组的大单拷贝区编码a t p 合成 酶的3 亚基a t 团基因( g a t e n b y ，1 9 8 9 ) 、应用最广泛的编码r u b i s c o 大亚基的 r b c l 基因( r i t l a n de la 1 ，1 9 8 7 ) 、位于叶绿体t r n k 基因的内含子中进化相对较 快的m a r k 基因( s u g u i r a ，1 9 8 9 ) 、位于叶绿体基因组小单拷贝区编码叶绿体n a d h 脱氢酶的一个亚基的n d hf 基因( s u g u i r a ，1 9 8 9 ：p r a t h e re ta l ，2 0 0 0 ) 等。 1 4 3 叶绿体基因组中的间隔区 目前用于系统学研究的叶绿体基因间隔区主要有a t p b - r b c l 、t r n c - r p o b 、 t r n l t r n r s 编码区等。间隔区不参加转录翻译过程，在功能上限制较少，变异较 自由，与相当长度的编码区片段相比，这些非编码区能提供更多的具系统学意义 的信息位点，故多用于较低分类阶元及近期分化类群间的系统学研究q h ( c l e g ge t a 1 1 9 9 4 ) 。近些年来，叶绿体非编码区还被用来分析现存种群的遗传多样性及其 地理亲缘关系( s c h a a le t a l ，1 9 9 8 ；h u a n ge t a l ，2 0 0 1 ；c h i a n ge t a l 2 0 0 1 ：t r e w i c k ee t a l ，2 0 0 2 ：l ue t a l ，2 0 0 2 ；h w a n ge l a l ，2 0 0 3 ) ，其单亲遗传方式及其快速近 中性的进化方式使之适用于种内地理亲缘模式的重建( f e r r i se t a l ，1 9 9 8 ) ；同时 d n a 铡序在技术上回避了r f l p 及以p c r 为基础的d n a 指纹技术无法区分具相 中山大学硕士学位论文 同长度但序列不同的片段的局限性。 r b c l 基因位于大单拷贝区上，编码1 ，5 一二磷酸核酮糖羧化酶，氧化酶大亚 基。a t p b 基因位于r b c l 基因之后，长约1 5 0 0 b p ，编码a t p 合成酶( a t ps y n t h a s e ) 的b 亚基。在叶绿体基因组中a t p b 基因与r b c l 基因相邻( 图l 一4 ) ，它们之间有一 段长度在5 0 0 9 0 0 b p 的基因间隔区相连，即盘b 十幻l 非编码区。c h i a n g ( 1 9 9 4 ) 设计了该间隔区的通用引物，将其用于种群水平系统发育的分析，使之得到广泛 的应用( c h i a n g e ta 1 ，1 9 9 8 ；s ue ta 1 ，2 0 0 5 ) 。 图1 4 a t p b r b c l 非编码区示意图 1 5论文的目的和特点 采集了分布在福建、重庆、贵州、广西等地( 大陆) 共9 个种群，海南( 岛 屿) 1 个种群，共1 0 个桫椤种群的样品。利用c p d n a 的a t p b r b c l 非编码区的 序列数据检测其种群遗传结构及地理亲缘关系，目的在于： 1 了解种群遗传结构是否存在地区间的差别； 2 检测桫椤种群遗传多样性水平及其分配状况； 3 揭示影响种群遗传结构的因素。 中山大学硕士学位论文 2 1样品的采集 第2 章材料与方法 采集了分布在福建、重庆、贵州、广西等地( 大陆) 共9 个种群，海南( 岛 屿) 1 个种群，共1 0 个桫椤种群的样品。每个种群选取2 0 个距离较远的个体( 种 群中个体数目不足2 0 的全取) 作为实验样品。采样树高0 1 5 o r n 不等，个体 之间距离大于2 0 m ，并用g p s 定位仪定位，并将采集的叶片编号，置于硅胶中密 封保存。采样种群分布如：图2 1 。 图2 1 桫椤样品采集地点分布示意图 f i g2 - 1s a m p l i n gs i t e so f a l s o p h i l as p i n u l o s a 4 中山大学硕士学位论文 采集地详细资料如表2 - 1 区域采样种群 经纬度海拔( m ) 采样试验 生境与气候 采集人鉴定人 及代号 数目用样 两岔河 e 1 0 6 。0 1 4 7 0 5 5 7 3 0 1 9 溪旁树林中或 应站明 王伯荪 ( l c h )n2 8 0 2 5 竹林中( 南弧热李振宇 带雨林气候)喻君生 贝 葫市沟 e 1 0 6 。0 l 5 5 5 6 0 25 82 0 溪边竹林中或应站明王伯荪 州 赤 ( h s g ) n2 8 鬯9 山崖下( 南亚热李振宇 水 带雨林气候)喻君生 紫荒沟 e l0 5 。5 9 4 5 9 5 4 6 3 02 0 溪边竹林或山应站明王伯荪 ( z h g ) n2 8 。2 5 崖下( 南亚热带李振宇 大 雨林气候)喻君生 陆 涪陵墨盘 e 1 0 7 。2 6 4 3 7 4 7 7 2 22 0 溪边山谷中( 亚应站明王伯荪 各 重 地 庆 沟( f l ) n2 9 0 4 l 热带季风性气李振宇 候)喻君生 区 板坪村后e 1 0 9 0 4 8 2 7 8 3 4 8 2 3 2 0公路边山谷中应站明王伯荪 广 西 山( b p ) n2 5 0 1 7 ( 亚热带季风李振宇 龙 性气候) 江 龙豆( l d ) e 1 0 9 。5 0 2 3 l 2 8 0 3 0 2 0山沟溪边( 亚热应站明王伯荪 n2 5 。1 4 带季风性气候)李振宇 龙岩新罗 e 11 6 。5 9 5 6 4 5 6 6 66 竹林边( 亚热带韦炳辉王伯荪 区赤坑n2 5 。1 0 海洋性季风气杨明照 ( c k ) 候) 龙岩米肖 e 1 1 7 0 0 i 5 2 9 5 6 51 01 0 水沟边，阴暗潮韦炳辉王伯荪 福 森林公园 n2 铲5 8 7湿 杨明照 ( d x ( 亚热带海洋 建 性季风气候) 福安瓜溪 e l1 9 0 3 1 7 2 0 4 5 7 03 02 0 山溪水边，阴暗韦炳辉王彳白荪 桫椤自然 n2 6 。5 8 潮湿( 亚热带海杨明照 保护区 洋性季风气候) ( f a ) 岛 海 坝王岭n 1 9 。0 5 1 1 2 8 1 1 5 2 4 4 山谷凹地潮湿陈国培王伯荪 屿 ( b w l ) e1 0 9 。l l ( 热带季风气应站明 南 候)杨明照 表2 - 1 桫椤样品采集资料 t a b l e 2 1s a m p l i n gd e t a i l so f a t s o p h i l a s p i n u l o s a 中山大学硕士学位论文 2 2试剂与仪器 2 2 1 主要试剂 十六烷基三甲基溴化胺( c t a b )